TGL TERCERA EVALUACIÓN

TEMA 5: TÉCNICAS DE SEPARACIÓN E IDENTIFICACIÓN

TEMA 6: TÉCNICAS DE MICROSCOPÍA

TEMA 8: LA VALIDACIÓN
TEMA 5: TÉCNICAS DE SEPARACIÓN E IDENTIFICACIÓN:
LAS ELECTROFORESIS:

Las electroforesis son técnicas de separación que se basan en la diferencia de movilidad

en un campo eléctrico de las moléculas presentes en la muestra.

La técnica se basa en disponer la alícuota en un soporte y aplicar un campo eléctrico.

Las diferentes partículas migrarán a distintas velocidades durante el proceso, que
dependerá de sus propiedades fisicoquímicas.

Todas las partículas deben tener la misma carga, para que todas ellas migren en la misma
dirección.

EL EQUIPO BÁSICO DE ELECTROFORESIS:

FUENTE DE ALIMENTACIÓN ELÉCTRICA

Suministra la diferencia de potencial necesaria para que migren los componentes de la

mezcla. De ella salen dos electrodos, que van uno a cada recipiente de los dos que tiene
la cubeta de electroforesis. Para hacer la conexión debemos tener en cuenta que el cable
negro va al polo negativo y el cable rojo al polo positivo.

LA CUBETA

Consta de dos recipientes y un puente entre ellos:

- Dos recipientes en los que se deposita una

solución tampón. Durante la electroforesis de
produce una electrolisis del agua por acción
del campo eléctrico. El tampón evita que el
ánodo se acidifique y el cátodo de haga más
básico.
- Un puente: sobre el que se coloca el soporte.
Los electrodos de los recipientes hacen que se cree un campo eléctrico en el
soporte, lo que hace migrar a los diferentes componentes de la muestra.
Generalmente se prefieren las cubetas de electroforesis de tamaño reducido:
• Presenta una menor superficie de evaporación
• Las diferencias de temperatura entre ambas cubetas se minimizan
• Permiten una reducción del tamaño de las aplicaciones.

EL SOPORTE:

Es la matriz donde se deposita la muestra que se va a analizar. Se coloca en el puente,

de forma que sus extremos estén en contacto con la solución tampón. Es necesario que
sea de un material inerte, sin carga eléctrica, para que no interfiera en la migración de
las moléculas.

Se distinguen dos tipos de soportes.

- No restrictivos: tamaño grande de poro, por lo que la separación solo se hace en

función de la carga eléctrica. Acetato de celulosa para proteinogramas.
- Restrictivos: tamaño de poro menor, actúa como tamiz. De modo que la
separación también depende del tamaño de las moléculas.
Puede ser:
• De gel de agarosa: para separar proteínas de ácidos nucleicos.
• De gel de poliacrilamida (PAGE): menor tamaño de poro que el gel de
agarosa, se usa para separar moléculas más pequeñas.

LA PREPARACIÓN Y USO DEL EQUIPO:

La electroforesis es una técnica compleja que requiere varios pasos;

1. Preparación:
• Preparación de la muestra: se realizan otros métodos de separación
como la centrifugación, para concentrar la sustancia/s que se desea
valorar.
• Preparación del soporte: en el caso de los geles. Se mezclan los
componentes, en las proporciones adecuadas y se disponen en un molde,
dándole grosor y la textura adecuados.
• Preparación de la solución tampón: en caso de que no se utilice una
comercial. Se coloca en los recipientes.
2. Disposición de las alícuotas: se debe tener en cuenta la carga de las moléculas;
• Carga positiva → cerca del ánodo, para que migren hacia el cátodo
• Carga negativa → cerca del cátodo, para que migren al ánodo.
Si el soporte es de gel, lo habitual es que haya unos pocillos en los que se
pipetea una pequeña cantidad de muestra. En caso de que sea de acetato
de celulosa, se deposita la gota directamente sobre el soporte.
3. Electroforesis: se seleccionan los parámetros eléctricos y el tiempo, y se pone en
marcha el equipo.
Una vez puesto el equipo en marcha, se creará una diferencia de potencial y las
sustancias comenzarán a migrar por el soporte.
El resultado que se obtiene es una serie de bandas visibles sobre el soporte, cada
una de ellas corresponde a una sustancia diferente.
4. Revelado: se ponen de manifiesto las bandas o fracciones en las que se ha
separado la muestra. Suele consistir en la adición de un colorante al soporte y
un posterior lavado.
 5. Lectura: identificar a que sustancia corresponde cada banda y cuantificarlas. El
método más habitual es mediante un espectrofotómetro o densitometría.

FACTORES QUE AFECTAN A LA VELOCIDAD DE MIGRACIÓN:

FORMA Y TAMAÑO DE LAS PARTÍCULAS:

Las moléculas de mayor tamaño presentan una mayor fricción y por tanto menor
velocidad de migración. Las moléculas con forma esférica, migran a mayor velocidad que
las que tienen formas irregulares.

SOPORTE:

- Adsorción: retención inespecífica de las moléculas sobre el soporte

- Electroendósmosis: fenómeno que se da sobre todo en los soportes no
restrictivos, en los que aparecen cargas negativas por estar en contacto con una
disolución iónica. Estas cargas hacen que la propia solución migre en el campo
eléctrico, con lo cual, se forma un flujo de cationes que se desplazan sobre la
superficie del soporte y otro de aniones que lo hace por el centro de los poros;
este flujo interfiere en la migración de los componentes de la muestra.
- Tamizado molecular: efecto debido al diámetro de los poros del soporte, el
soporte actúa como un tamiz que separa las moléculas en función de su tamaño.

TAMPÓN:

Es fundamental el uso del tampón adecuado para mantener el pH constante.

- Contribuye a paliar los efectos de la electrolisis que se produce por acción del
campo eléctrico.
- Mantiene la fuerza iónica adecuada
- Mantiene una carga neta constante en las moléculas que se van a separar.

EL CAMPO ELÉCTRICO:

El campo eléctrico es un gradiente de potencial que moviliza las moléculas cargadas. Las
magnitudes del campo eléctrico que influyen en la electroforesis son: diferencia de
potencial (V), intensidad de la corriente (I) y la resistencia (R), que se relacionan entre sí
mediante la ley de Ohm:

V=IxR

Además, hay que tener en cuenta el efecto Joule: el paso de una corriente eléctrica
produce calor. Al aumentar la temperatura se desnaturalizan las proteínas y el tampón
se evapora, lo que hace aumentar su fuerza iónica; estas dos consecuencias se combinan
para impedir una buena separación.

Este efecto es mayor cuanto mayor sea la diferencia de potencial y la resistencia del
sistema. Se soluciona con un sistema de refrigeración.

TIEMPO DE ELECTROFORESIS:

Factor que se debe combinar con el voltaje y el tamaño del soporte. Aumentando el
tiempo de la electroforesis, aumentamos la distancia de separación entre las moléculas
que migrarán a distintas velocidades.

PRINCIPALES TÉCNICAS ELECTROFORÉTICAS:

ELECTROFORESIS EN CELLOGEL:
Se utiliza para proteinogramas. El proteinograma o electroforesis de las proteínas del
suero es un método semicuantitativo de análisis de las proteínas plasmáticas.

Pasos:

1. Preparación.
• Muestra: se parte de una muestra de suero, obtenido de sangre total
mediante centrifugación.
• Soporte: las tiras de acetato de celulosa se obtienen haciendo reaccionar
la celulosa con ácido acético, aunque lo habitual es usar tiras comerciales,
estas se deben sumergir durante 10 minutos en la solución tampón para
que se rellenen sus poros; tras sacarlas de la solución, se secan
colocándolas entre dos papeles de filtro
• Solución tampón: veronal o TRIS.
• Reactivos: colorante, solución decolorante y solución tasparentizadora.
2. Disposición de la alícuota sobre el soporte: se coloca la muestra en el cátodo con
ayuda de un aplicador. Seguidamente se introduce el puente son el soporte en
la cubeta, de forma que se establezca contacto entre el cellogel y el tampón.
3. Electroforesis: se tapa y se conecta a la fuente de alimentación. Se ajustan los
parámetros (intensidad y tiempo).
4. Revelado:
• Retirar la tira de la cubeta y sumergirla en colorante durante 10 minutos
 • Decolorar, pasando la tira por tres o cuatro bateas llenas de líquido
decolorante, hasta observar las bandas en un fondo claro.
• Pasar la tira por la cubeta con la solución trasparentizadora.
• Eliminar el exceso de soluciones decolorantes situando la tira entre dos
papeles de filtro
5. Lectura:
• Espectrofotometría: se recortan las
distintas franjas y se introducen en tubos
con disolvente que saca las proteínas del
Cellogel; obtenemos así una disolución
para cada franja. Seguidamente
medimos la absorbancia de cada
disolución y se compara con la
absorbancia obtenida previamente para
el total de proteínas.
• Densitometría: un fotómetro cuantifica el colorante fijado en cada una
de las franjas, y lo representa mediante un proteinograma, nos da las
fracciones de cada componente en relación con las proteínas totales.

ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA:

El gel de agarosa es el soporte que se utiliza para la separación de los fragmentos de
ADN, se denomina electroforesis de los ácidos nucleicos.
1. Preparación:
• Muestra: se extraen los ácidos nucleicos, seguidamente, se prepara una
dilución con la muestra. Se añade sacarosa, glicerol o Ficoll, para
incrementar la densidad y facilitar la colocación en los pocillos del gel.
• Soporte: la preparación del gel se agarosa;
▪ Hidratar la agarosa con la solución tampón durante unos 10 mins
▪ Llevar la solución anterior a ebullición y dejar enfriar hasta unos
55ºC.
▪ Verter la solución en un molde. A medida que se enfría se gelifica.
▪ Hacer los pocillos de siembra con un peine. Se puede colocar el
peine antes de verter la solución.
• Solución tampón: tris acetato o TBE. Se suelen añadir uno o varios
marcadores electroforéticos.
• Reactivos:
▪ Sustancia reveladora: se trata de un producto fluorescente que se
intercala entre las bases del ADN. Cuando se ilumina con luz UV,
 la sustancia reveladora emite fluorescencia. Se puede aplicar en
la fase de revelado o en la de preparación.
▪ Marcadores de peso molecular: tienen ADN de tamaño conocido
y se usan como patrón de control.
2. Disposición de la alícuota sobre el soporte:
• Colocar el tampón en la cubeta y sumergir el gel de agarosa en él. Como
el tampón cubre totalmente el gel, se denomina electroforesis
submarina, esta disposición disipa mejor el calor generado por el paso de
la corriente y consigue un campo eléctrico muy eficaz.
• Retira el peine, quedan los pocillos descubiertos.
• Llenar los pocillos con las muestras de ADN.
• Cargar uno o dos pocillos de los extremos con marcadores de peso
molecular.
3. Electroforesis: tapamos y conectamos a la fuente de alimentación. Ajustamos los
parámetros.
La electroforesis termina cuando se ha producido la máxima separación de los
componentes de la muestra, pero sin sobrepasar los límites del soporte.
Los marcadores indican el momento de parar.
4. Revelado: una vez retirada la tira de la cubeta le añadimos sustancia reveladora
a no ser que se haya añadido al gel.
5. Lectura: se introduce el gel en un transiluminador de luz UV. Se debe fotografiar,
el transilumiador dispone de una cámara, que toma una imagen del gel irradiado
con sus bandas.
A partir de la imagen obtenida, se puede estimar la concentración de ADN
mediante un sistema de procesamiento de imágenes digitales.

ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA (PAGE):

Se utiliza para la separación de proteínas. También para fragmentos pequeños de ADN
y ARN. El procedimiento es el mismo que en la electroforesis en agarosa. El soporte debe
quedar cubierto con la solución tampón.

La solución tampón lleva incorporada alguna sustancia para aumentar su densidad,

generalmente gilcerol, y uno o carios marcadores electroforéticos, como el azul de
bromofenol, que determinará el final del proceso.

El soporte está compuesto en este caso por poliacrilamida y bisacrilamida, y puede

prepararse con un amplio intervalo de tamaños medios de poro, teniendo en cuenta:
 - La concentración de poliacrilamida proporciona al soporte entramados más o
menos densos.
- La concentración de bisacrilamida condiciona el grado de entrecruzamiento de
las cadenas.

La preparación es muy parecida a la de los soportes de agarosa, aunque en este caso se

pueden usar moldes para obtener tubos o placas. Los soportes en placa se pueden
colocar en horizontal en la cubeta, aunque lo más frecuente es hacerlo en vertical.

Una modalidad de electroforesis en vertical es la que se realiza con los geles en

gradiente, en los que la concentración de poliacrilamida aumenta progresivamente
desde la parte superior del gel hasta la inferior.

- PAGE en condiciones no desnaturalizantes: una vez finalizada se pueden realizar

estudios de funcionalidad de las proteínas. Se puede hacer cargando la muestra
directamente en el gel en el cual se va a producir una separación, por lo tanto, la
concentración del gel es uniforme y hay un único tampón. O utilizando dos
tampones, uno para los reservorios y otro para cubrir el gel.
- PAGE en condiciones desnaturalizantes: se desnaturalizan las proteínas
Un tipo de PAGE en condiciones desnaturalizantes es el PAGE-SDS, el SDS es un
detergente que se une a las zonas apolares del polipéptido en una proporción
constante de una molécula de SDS por cada dos aminoácidos. Esta unión
proporciona una carga negativa que resulta ser proporcional al número de
aminoácidos y, por tanto, a la masa molecular de la proteína.

OTROS TIPOS DE ELECTROFORESIS:

ELECTROENFOQUE: es un tipo particular de electroforesis en la que las proteínas se
separan según su punto isoléctrico (pl) en un gradiente continuo de pH.

ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL: es una sucesión de dos electroforesis distintas

realizadas sobre una misma muestra.

ELECTROFORESIS EN CAMPOS PULSANTES (PFGE): consigue la separación de grandes

fragmentos de ADN induciendo su reorientación mediante cambios periódicos en el
campo eléctrico.

INMUNOELECTROFORESIS: es una combinación de una electroforesis en gel se agarosa

seguida de una inmunodifusión.

ELECTROFORESIS CAPILAR: es una técnica que utiliza como soporte un capilar de

diámetro interno muy pequeño (75 micras) y 25 cm de longitud. Electroforesis de rutina.
LAS TÉCNICAS ESPECTROFOTOMÉTRICAS:

Las radiaciones electromagnéticas con formas de energía, que cuando se hacen incidir
sobre una muestra contiene un compuesto o molécula que se pretende analizar, ocurren
diferentes fenómenos que se pueden medir para la obtener información tanto
cualitativa como cuantitativa.

Las técnicas se basan en la medición de las radiaciones electromagnéticas por sus

propiedades de interacción con la muestra, reciben el nombre de técnicas
espectrofotométricas.

EL ESPECTROFOTÓMETRO:

El espectrofotómetro es, de forma genérica, el equipo que se utiliza en las técnicas de

espectrofotometría.

FUENTE DE RADIACIÓN:

La fuente de radiación, de luz o lámpara es el componente que proporciona la energía

radiante de forma continua y estable.

- Fuentes de espectro continuo: se utilizan en las técnicas de absorción molecular

y de emisión molecular por fluorescencia:
• Lámparas de filamento de tungsteno: se usan para longitudes de onda
del espectro visible y para el ultravioleta próximo.
• Lámparas de filamentos de haluros de tungsteno: emiten energía
radiante de mayor intensidad.
• Lámparas de hidrógeno y deuterio: espectro continuo en la región UV.
• Lámparas de arco de xenón o mercurio a elevada presión: altas
intensidades.
- Fuentes de espectros de líneas: emiten radiación en forma de líneas discretas.
Se utilizan en las técnicas de absorción atómica y de emisión molecular por
fluorescencia. Las más comunes son las lámparas de vapores de mercurio.
- Fuentes de luz láser: luz completamente monocromática, sin ancho de banda.

MONOCROMADOR:

La luz que emite la fuente atraviesa una rendija de entrada,

llega al selector de longitud de onda y sale a través de una
rendija de salida como un rayo organizado de luz paralela con
la longitud de onda deseada. El conjunto de elementos se
denomina monocromador:
 - La rendija de entrada: evita la luz difusa y hace que la luz pase como un rayo
organizado de luz paralela. Puede ser una lente colimadora que colecta los rayos
de luz y los enfoca.
- Selector de longitud de onda: el rayo de luz organizado de luz paralela pasa al
selector de longitud de onda, que modifica la longitud de onda de la radiación a
la que se haya programado. Los selectores de onda se caracterizan por el ancho
de banda que pueden seleccionar. Cuanto más estrecho sea este ancho de banda
más pura será la radiación que incida sobre la muestra y más exactos serán los
valores de absorbancia obtenidos.

El selector puede ser de dos tipos diferentes:

• Redes de difracción: están formadas por un vidrio o una superficie

metálica con un gran número de hendiduras paralelas, situadas a
distancias iguales entre sí. Cada una de ellas se comporta como un
pequeño prisma.
• Prismas: tienen anchos de banda entre 0,5 – 1,5 nm, que se consiguen
modificando la anchura de la rendija de salida.

- La rendija de salida: deja pasar la parte del abanico desplegado por la red o el
prisma que corresponde a las longitudes de onda seleccionadas y dirige este haz
sobre la cubeta.

LA CUBETA:

Es el recipiente donde se coloca la muestra para la medición. Pueden ser individuales o

agrupadas de distintos tipos y tamaños. Suelen tener un ancho de 1cm

Pueden ser de plástico (luz visible) o cuarzo (luz UV).

DETECTOR:

Está basado en el efecto fotoeléctrico: los fotones que inciden sobre un material
originan la liberación de electrones, que producen una corriente eléctrica proporcional
a los fotones recibidos. Esta señal eléctrica mínima se amplifica posteriormente. Existen
varios tipos de detectores:
 - Fototubos y fototubos multiplicadores: la luz incide sobre un cátodo fotosensible
que desprende electrones, estos electrones pasan a un ánodo o a varios dínodos
para amplificar la corriente.
- Fotodiodos: el haz de luz incide sobre un diodo. Cuando el haz tiene suficiente
energía, excita un electrodo y crea una corriente.
- Detectores de carga acoplada: son parecidos a los usados en fotografía digital.

SISTEMA DE REGISTRO Y LECTURA:

La señal eléctrica precedente del detector se amplifica y a continuación se transforma

en una señal digital. El sistema informático interpreta el resultado, y gracias a su
software, puede realizar los cálculos necesarios usando curvas de calibración, para
obtener los datos de concentración.

TIPOS DE ESPECTROFOTÓMETROS.

De forma general y según la disposición de sus componentes, se identifican tres tipos:

- Espectrofotómetro de haz simple: tienen los componentes básicos.

- Espectrofotómetros de doble haz en el tiempo: permiten estudiar dos muestras
al mismo tiempo, la muestra problema y un blanco.
Tienen un dispositivo con capacidad reflectante (chopper), que obliga a la
radiación procedente del monocromador a seguir alternativamente dos
direcciones. Una de ellas atraviesa la cubeta en que se deposita el blanco y otra
donde está la muestra. A continuación, las radiaciones separadas son
reorientadas mediante espejos para que lleguen al mismo detector, que mide las
intensidades de ambas radiaciones.
- Espectrofotómetros de doble haz en el espacio: todos los componentes están
duplicados menos la lámpara, y los dos haces de luz pasan al mismo tiempo a
través de los diferentes componentes separados en el espacio.

ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN MOLECULAR:

Se basa en la capacidad de las moléculas de absorber una parte de la radiación

electromagnética que reciben. Las longitudes de onda que cada sustancia absorbe son
características de cada molécula.

LA ABSORCIÓN MOLECULAR:
Cuando una molécula absorbe una radiación electromagnética pasa de un estado inicial
de reposo a un estado excitado o de mayor energía. El aumento de energía produce
cambios en los enlaces y movimiento de los electrones en los átomos que forman la
molécula, de manera que cambia su estructura electrónica global. Estos cambios se
denominan transiciones.
Las transiciones que pueden producirse en una molécula dependen del tipo de enlaces
que haya entre sus átomos y de si la energía absorbida es suficiente para producirlas.
Por esto, una molécula tiene la capacidad de absorben radiación electromagnética a
unas determinadas longitudes de onda, que son aquellas cuya energía es la necesaria
para pasar del estado de reposo al excitado.

Las radiaciones de mayor energía UV-VIS son capaces de producir transiciones

electrónicas entre átomos. Las infrarrojas, de menor energía, solo son capaces de
producir transiciones de vibración o rotación de las moléculas, que son muy específicas
de enlace y se usan para análisis cualitativos. Para medir la absorbancia de energía
radiante que caracteriza a una molécula se utilizan la transmitancia y la absorbancia:

- La transmitancia: es el resultado de dividir la intensidad de luz transmitida (It)

entre la intensidad de la luz incidente (I0).
La transmitancia disminuye exponencialmente a medida que aumenta la
concentración o el ancho de la cubeta. Convirtiendo la transmitancia en
absorbancia se consigue una relación lineal y positiva.
- La absorbancia: es el logaritmo inverso o negativo de la transmitancia.
El espectrofotómetro mide físicamente la transmitancia y efectúa un cálculo
matemático para obtener los valores de absorbancia
El espectro de absorción es el conjunto de bandas que indican la cantidad de luz
absorbida por la sustancia a diferentes valores de longitud de onda. El espectro
de absorción de es único y característico de una sustancia.

LA LEY DE LAMBERT-BEER:
La ley de Lambert-Beer enuncia que la absorbancia de un analito es directamente
proporcional al coeficiente de absorción de la molécula, a la distancia recorrida por el
haz de luz en la dilución y a la concentración del analito.

A=ExBxC

A: absorbancia

E: coeficiente de extinción molar o coeficiente de absorción.

B: longitud recorrida por la luz en la cubeta

C: concentración de la molécula.

Factores que pueden provocar desviaciones:

- Que la concentración esté fuera de los límites de linealidad.

- Desviaciones instrumentales: se debe a algún problema en la configuración o en
el funcionamiento del aparato.
 - Desviaciones químicas: es necesario controlar el pH de la disolución, ya que a
diferentes pH se absorben diferentes longitudes de onda.

LAS CURVAS DE CALIBRACIÓN:

Las muestras biológicas tienen muchas moléculas en dilución, además de que la que
nos interesa medir, que pueden actual como interferentes. Además, se debe tener en
cuenta la absorbancia del disolvente.

Antes de realizar una medición se deben hacer mediciones de la absorbancia que no es

debida a la sustancia que queremos estudiar. Estas son:

- La absorbancia debida a las corrientes oscuras o radiaciones, que no procede

de la fuente de luz. Corresponde a 0% de T
- La absorbancia debida a la composición de la cubeta, los disolventes y otros
reactivos usados. Corresponde al 100% de T.

Las determinaciones de estas absorbancias se conocen con el nombre de blancos, y se

corresponden con un blanco de cubeta y un blanco de reactivos.

Estos blancos establecen una línea basal de absorbancias sobre la que aplicar la ley de
Lambert-beer y desde la medición espectrofotométrica de la muestra obtener la
concentración de la molécula problema al extrapolar este valor sobre una recta de
calibración.

A=Exbxc+n

Siendo n la absorbancia de los blancos.

La calibración se puede hacer mediante un factor de calibración o construyendo una

curva de calibración.

- Calibración mediante un factor de calibración:

 - Calibración construyendo una curva de calibración: el patrón inicial se diluye
sucesivamente y se determinan los valores de absorbancia de las distintas
diluciones. Se obtienen así varios puntos que permiten trazar la curva.

MEDICIONES A PUNTO FINAL:

- Métodos colormiétricos: se hacen reaccional las moléculas (analitos) con
reactivos comerciales. La reacción química transforma el analito en una
sustancia que absorbe dentro de la región visible.
- Métodos enzimáticos: se utilizan una o varias enzimas, que transforman la
sustancia problema en un producto coloreado que absorbe en el UV-visible, de
forma que pueden leerse en el espectrofotómetro.
Un método para hacerlo es mediante el cálculo de la concentración a punto final,
cuando ya no queda sustancia problema en la dilución. En ese momento, la
concentración de la sustancia absorbente que se ha formado es directamente
proporcional a la que tenía la sustancia problema. Así, midiendo su absorbancia
y calculando su concentración, podemos obtener la concentración de la
sustancia problema
TEMA 6: LAS TÉCNICAS DE MICROSCOPIA:
LA MICROSCOPÍA Y LA ÓPTICA:

La óptica es la rama de la física que estudia la naturaleza de la luz, sus características y

sus manifestaciones.

LA LUZ:

La luz, conforme al enfoque actual, es una oscilación electromagnética que se propaga

en el vacío o en un medio transparente y que puede ser percibida por nuestro sentido
de la vista.

Las radiaciones electromagnéticas:

El espectro electromagnético es el rango de todas las radiaciones electromagnéticas

posibles

Las ondas se caracterizan por:

- La amplitud de onda: es la desviación de la onda en relación con su valor medio

- La longitud de onda: es la distancia que separa dos crestas sucesivas. Cada tipo
de radiación del espectro tiene una longitud de onda característica.
- La frecuencia de onda: es el número de oscilaciones por segundo y está
relacionado con la energía que transporta la onda; a más energía, más
frecuencia. Se expresa en hercios (Hz), y es inversamente proporcional a la
longitud de onda; a mayor frecuencia, menor longitud de onda, y viceversa.
La luz visible es la pequeña franja de radiaciones con longitudes de onda de entre 380 y
750nm.

El comportamiento de los materiales frente a la luz:

- Los materiales opacos: son aquellos que no dejan pasar la luz a través de ellos.
El color que percibimos en estos materiales, depende de las longitudes de onda
que absorban y reflejen.
• Si absorben todas las longitudes de onda de la luz blanca, lo percibimos
de color negro.
• Si refleja todas las longitudes de onda de la luz blanca, lo percibimos de
color blanco.
• Si refleja una determinada longitud de onda y absorbe las demás, se ve
del color que corresponde la longitud de onda reflejada.
- Los materiales trasparentes dejan pasar la luz y podemos ver bien a través de
ellos.
- Los materiales traslúcidos dejan pasar la luz, pero a través de ellos vemos las
cosas borrosas, debido a que transmiten la luz en varias direcciones.

LAS PROPIEDADES DE LA LUZ:

La reflexión y refracción.

- La reflexión: es el fenómeno por el cual la luz no puede penetrar en un medio,

sino que rebota en él y es dispersada. La dirección en la que sale reflejada la luz
está determinada por el tipo de superficie.
- La refracción: es un cambio de dirección de un rayo de luz que se produce al
pasar oblicuamente de un medio a otro que tenga una densidad diferente.
Otras propiedades:

- La difracción: es el fenómeno que se observa cuando la luz, al pasar por el

extremo de una superficie se dobla, desviándose del trayecto, y no sigue su
propagación en línea recta. La difracción produce una borrosidad que limita la
capacidad de aumento útil de un microscopio.
- La absorción: cuando la luz llega a un objeto, este puede absorberla toda o parte
de ella; la luz que se absorbe se convierte en calor.
- Transmisión: ocurre cuando la luz atraviesa una superficie u objeto. Hay tres
tipos de trasmisión:
• Trasmisión directa: es cuando la luz atraviesa un objeto y no se producen
cambios de dirección o calidad de la luz.
• Trasmisión difusa: se produce cuando la luz pasa a través de un objeto
trasparente o semitrasparente con textura.
• Trasmisión selectiva: se produce cuando la luz atraviesa un objeto de
color.
- Interferencia: se produce cuando dos ondas que tienen la misma longitud de
onda se superponen
• Interferencia constructiva: las ondas están en la misma fase, el resultado
es una onda cuya amplitud es la suma de las dos.
• Interferencia destructiva: las ondas están en contrafase, se cancelan.
- La polarización: en las ondas electromagnéticas no polarizadas, el campo
eléctrico oscila en todos los planos, siguiendo la dirección de propagación de la
onda.

LA VISIÓN:

Los ojos a través de los fotorreceptores de la retina, reciben la energía que llega del
exterior en forma de luz, la cual pasa por la pupila, que regula la entrada de luz y llega
al cristalino. El cristalino enfoca los rayos en la superficie de la retina, formando una
imagen invertida. Las células receptoras detectan esta imagen y la envían a través del
nervio óptico al cerebro, que la interpreta correctamente.

- Los bastones: son responsables de la visión en condiciones de baja luminosidad.

 - Los conos: son responsables de la visión en colores.

LAS LENTES:

Las lentes con instrumentos para el enfoque.

TIPOS DE LENTES:
- Convexas: convergentes, de aumento o positivas.
- Convexas: divergentes, de dispersión o negativas.

Las lentes convexas:

Cuando el objeto observado está a una distancia superior a dos veces la distancia
focal (d > 2f), la imagen que se forma es una imagen invertida y de tamaño menor al
tamaño real.

Como puedes ver en el siguiente esquema, los rayos que pasan a través de la lente
convergen al otro lado creando una imagen invertida. Esta imagen creada al otro lado
de la lente se conoce como imagen real.

Cuando la distancia entre el objeto y la lente es exactamente igual a dos veces la

distancia focal, entonces la imagen obtenida tiene exactamente el mismo tamaño que
el objeto real.

Si el objeto está situado a una distancia de entre una y dos veces la distancia focal (f < d
< 2f), entonces se forma una imagen real de tamaño superior al objeto real.

En este caso la imagen formada aparece también invertida respecto al objeto original.
El siguiente esquema muestra la trayectoria de los rayos en este caso. Dado que la
imagen del objeto se forma al otro lado de la lente se conoce también como imagen
real.

La particularidad de este caso es que la imagen obtenida tiene un tamaño real superior
al del objeto real. En consecuencia, la lente convergente actúa como una lente de
aumento, pero invirtiendo la imagen.

Existe un tercer caso en el que el objeto se encuentra a una distancia de la lente inferior
a la distancia focal (d < f).

En este caso los rayos no convergen al otro lado de la lente como puedes ver en el
siguiente esquema. En consecuencia, el objeto es observado como si sus rayos fueran
emitidos en un punto más lejano.

Existe un caso en el que el objeto se encuentra situado a una distancia exactamente

igual a la distancia focal. En este caso la imagen no puede formarse ya que como puedes
ver en el siguiente esquema los rayos no convergen en ninguno de los dos lados de la
lente.

Las imágenes reales e imágenes virtuales:

La imagen real se forma por rayos convergentes, que pueden ser recogidos sobre un
sensor de imagen.
El término virtual significa que tiene existencia aparente y no real; este tipo de imagen
se forma por los rayos divergentes. Son imágenes subjetivas, percibidas gracias a la
posibilidad que tiene el ojo de “seguir” por detrás del objeto observando la proyección
de los rayos divergentes y hacerlos confluir para constituir la imagen virtual.

Las aberraciones:

- De esfericidad: relacionadas con la forma esférica de la lente. Los rayos

luminosos que atraviesan la lente por sus extremos no convergen con los que
atraviesan por el centro. El resultado es una imagen dispersa y borrosa en lugar
de enfocada y nítida.
- Cromáticas: relacionadas con las variaciones en los índices de refracción de las
diversas frecuencias que conforman la luz blanca visible. Cuando la luz blanca
atraviesa una lente, cada color sigue un camino y un foco diferente. La
incapacidad de la lente de reunir nuevamente los rayos refractados en un punto
focal común provoca una discreta diferencia en el tamaño del objeto y en franjas
de colores rodeando la imagen.
- Otras aberraciones geométricas:
• Astigmatismo
• Coma
• Distorsión
• Curvatura del campo.

LA MICROSCOPÍA:

Un microscopio es un instrumento que permite observar estructuras demasiado

pequeñas para ser percibidas a simple vista.

Componentes del microscopio:

- Sistema óptico: conjunto de lentes que consigue el aumento y permite la

visualización o la captura en algún soporte de los rayos refractados.
- Un sistema mecánico: proporciona soporte a las lentes y demás elementos del
microscopio, y permite mover las lentes o preparaciones para conseguir el
enfoque.
 - Un sistema de iluminación: lo tradicional para visualizar estructuras
microscópicas es aplicar un haz de luz, que es el sistema que utilizan los
microscopios ópticos. Pero también se pueden aplicar otras radiaciones
electromagnéticas como luz UV o haces de electrones, que se pueden captar
mediante un sensor de imagen.

La transiluminación: la luz se proyecta a la preparación, que debe ser muy delgada y

trasparente, permite obtener un campo de visión con una cantidad de luz elevada,
resaltando la estructura observada sobre un fondo muy iluminado.

La epiiliminación: el rayo de luz incide de manera oblicua sobre la preparación, no es

necesario que sea tan fina ni trasparente.

Propiedades ópticas de los microscopios:

- Aumento: es el número de veces que se aumenta el tamaño real del objeto. Este
está determinado por el grado de curvatura de su superficie y la distancia focal.
- Poder de resolución: es la capacidad del microscopio para distinguir dos puntos
muy cercanos entre sí.
- Límite de resolución: distancia mínima a la que pueden estar dos puntos y ser
correctamente visualizados como dos imágenes separadas.
- Profundidad de foco: es la posibilidad de enfocar correctamente un objeto
teniendo en cuenta su grosor.
- Amplitud de campo: es la parte de la preparación que se ve aumentada.
LA MICROSCOPÍA ÓPTICA:

COMPONENTES BÁSICOS DEL MICROSCOPIO ÓPTICO:

EL SISTEMA MECÁNICO:
- Pie o base y columna: de peso considerable para proporcionar estabilidad al
instrumento. El pie sirve de soporte a la columna, en la cual se encuentra el
condensador y la platina.
- Mecanismo de enfoque: se logra desplazando la platina verticalmente, de modo
que se pueda centrar el punto focal del objetivo que se está utilizando.
• Tornillo macrométrico: se utiliza para el enfoque de pocos aumentos y
para subir y bajar rápidamente la platina.
• Tornillo micrométrico: permite un enfoque muy fino y se utiliza con los
objetivos de mayor aumento.
- La platina: es el soporte horizontal donde se colocan las preparaciones, lleva un
sistema de fijación para inmovilizar los portaobjetos. En el centro tiene un orificio
por el que pasa la luz o rayo de luz generado por la fuente luminosa y proviene
del condensador.
- El revólver: constituido por una semiesfera situada en la parte inferior del tubo
que posee una serie de anillos en los cuales van atornillados diversos objetivos.
La semiesfera gira alrededor de un eje, lo cual permite el intercambio rápido de
objetivos.
- El tubo: es un cilindro hueco de longitud variable que soporta la porción óptica
del microscopio, con el objetivo en un extremo y el ocular en el otro; entre ellos
existe un conjunto de lentes, espejos y prismas.

EL SISTEMA ÓPTICO: LOS OBJETIVOS:

El microscopio tiene dos sistemas de lentes, el objetivo y el ocular, y deben tener el
mismo eje óptico.

- Los aumentos y la resolución:

La resolución de un microscopio óptico es la distancia más pequeña entre dos
puntos de la preparación que puede distinguirse como dos formas separadas.
- La apertura numérica: de un sistema óptico es un número adimensional que
indica el rango de ángulos para los cuales el sistema acepta luz.
- Tipos de objetivos:
• Según el medio:
▪ Objetivos secos: se utilizan sin imponer ningún medio
▪ Objeticos de inmersión: se incorpora un líquido entre el objetivo
y la preparación, lo cual aumenta la apertura numérica del
objetivo e incrementa la resolución.
• Según las correcciones: los sistemas de lentes provocan aberraciones, y
algunos objetivos están diseñados para corregirlas.

- Nomenclatura de los objetivos:

• Aumento: desde 0.5X hasta 200X.
 Código de color Aumento
Negro 1X, 2,5X
Marrón 2X, 2,5X
Rojo 4X, 5X
Amarillo 10X
Verde 16X, 20X
Azul turquesa 25X, 32X
Azul celeste 40X, 50X
Azul cobalto 60X, 63X
Blanco, crema 100X, 250X, 200X
• Apertura numérica: junto a los aumentos
• Distancia focal: en milímetros
• Espesor de la lámina del cubreobjetos, estandarizada a 0,17.
• Longitud del tubo: con el símbolo del infinito.
• Propiedades ópticas especiales
• Medio de inmersión
• Correcciones ópticas

EL SISTEMA ÓPTICO: EL OCULAR.

El ocular es el segundo juego de lentes, a través del cual se mira.

Se trata de una lente que funciona como lupa, que aumenta la imagen que se ha
formado en el objetivo y la transforma en una imagen virtual, que está derecha con
respecto a la imagen del objetivo, pero invertida con respecto al objeto

- Las lentes del ocular: el ocular está formado por un juego de lentes montadas en
los extremos de un cilindro que va introducido en la parte superior del tubo. El
juego dispone como mínimo de dos lentes y un diafragma.
- Los aumentos: el aumento total que proporciona el microscopio se obtiene al
multiplicar el aumento del objetivo por el aumento de cada ocular.
- El campo: es la parte de la preparación que se ve aumentada.
- Clasificación de los oculares:
 • Oculares de Huygens: muy comunes en modelos antiguos. Son oculares
negativos formados por dos lentes plano-convexas cuya convexidad está
dirigida hacia el objetivo. Se utiliza con objeticos acromáticos.
• Oculares de Ramsden: formados por varias lentes unidas entre sí y
colocadas por encima del diafragma. Generalmente corrigen
aberraciones y funcionan de manera óptima con objetivos de óptica
infinita.
• Oculares compensadores: corrigen la diferencia de aumento entre los
diversos colores que se aprecia en los objetivos apocromáticos.
- Nomenclatura de los oculares:
• Aumento: el ocular produce un aumento adicional al del objetivo.
• Número de campo: es el diámetro en milímetros de la apertura fija del
diafragma.
• Información adicional.

EL SISTEMA DE ILUMINACIÓN:
Es uno de los aspectos críticos en microscopía óptica, ya que, si la muestra está mal
iluminada, la calidad de la imagen será deficiente.

- Componentes del sistema de iluminación:

• Fuente de luz: lo más habitual es la iluminación de LED, cuya luz tiene
características muy próximas a la luz monocromática.
• Condensador: está formado por una o varias lentes situadas debajo de la
platina del microscopio, colocadas entre la fuente de luz y el espécimen.
Su función es convertir la luz de la fuente de luz conos luminosos grandes,
con aperturas mayores, necesarios para ver con los objetivos de mayor
aumento.
• Diafragma o iris: dispositivo que va colocado inmediatamente debajo de
la platina. Permite cambios en la apertura y tiene diámetros variables; su
finalidad es obtener conos luminosos cada vez más estrechos y eliminar
los rayos de luz sobrantes.
EL USO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO BÁSICO:
1. Colocarnos en una postura adecuada
2. Enfocar con el objetivo de pocos aumentos:
Girar el revólver para colocar el objetivo de menos aumentos
Bajar el condensador
Bajar la platina a una distancia superior a la de trabajo
Colocar la preparación
Conectar el sistema de iluminación
Subir la platina.
Observar a través de los oculares y afinar el enfoque.
3. Cambiar a un objetivo de mayor aumento: girar el revólver sin mover la platina
y ajustar el enfoque con el tornillo micrométrico. Subir el condensador.
4. Controlar la iluminación

MODALIDADES DE MICROSCOPÍA ÓPTICA:

Microscopía óptica especial:

- Microscopía de campo oscuro

- Microscopía de contraste de fases
- Microscopía de interferencia
- Microscopía de florescencia
Un fluorocromo es un componente de una molécula que hace que esta sea
fluorescente.
- Microscopía de luz UV
- Microscopía de polarización

Otros microscopios ópticos:

- Microscopía láser confocal

- Microscopio de barrido con sonda o de sonda de barrido
- Microscopio de fluorescencia de excitación con dos fotones

LA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA:

La microscopía electrónica hace posible la toma de imágenes directas de las estructuras

celulares a niveles supramoleculares.

Se utiliza la ecuación de De Broglie para calcular la longitud de onda de los electrones:

Donde h es la constante de Planck, m la lasa de la partícula y v el voltaje aplicado

Se busca reducir la longitud de onda para aumentar la resolución, para ello se
incrementa el voltaje.

LA FORMACIÓN DE IMÁGENES:

1. Un haz de electrones se forma en el cátodo y es acelerado hacia el espécimen

gracias a un potencial eléctrico positivo.
2. El haz de electrones es enfocado mediante el empleo de lentes
electromagnéticas
3. En la muestra irradiada ocurren interacciones que afectan al haz de electrones.
Unas zonas de la muestra no dejarán pasar los electrones y otras sí.
4. Las interacciones y efectos son detectadas y transformadas en una imagen en
blanco y negro mediante un sensor digital. Al chocar con el sensor, los electrones
atraviesan una señal eléctrica de intensidad proporcional al número de
electrones que han impactado.
5. La señal del detector se envía a un ordenador, que puede asignar colores según
la gama de grises.

EL HAZ DE ELECTRONES:
El haz de electrones de alta energía puede obtenerse de varias maneras:

- Por emisión termoiónica: se realiza a partir de un delgado filamento de

tungsteno dispuesto en forma de V. El metal se calienta a una temperatura muy
alta mediante una corriente eléctrica de alto voltaje, para acelerar a un número
importante de electrones que se desprenderán del extremo de la V. Estos
electrones tienden a formar una nube próxima a la superficie del metal u con la
aplicación de un campo eléctrico entre el filamento y una porción de la columna
los electrones son acelerados.
- Por emisión de campo: se aplica un fuerte campo eléctrico para extraer los
electrones del filamento de metal. La temperatura es mucho menor que en la
emisión termoiónica. Se obtiene un haz de electrones de mayor intensidad y se
requiere un vacío absoluto.

EL SISTEMA DE VACÍO:
Los electrones, al chocar con las moléculas de aire, se dispersan y luego de repetidas
colisiones se detienen. Para evitarlo se los hace circular en un espacio vacío que se
obtiene mediante el uso de bombas mecánicas que extraen el aire del interior de la
columna del microscopio.

LAS LENTES ELECTROMAGNÉTICAS:

Son electroimanes formados por un solenoide o bobina por el cual pasa una corriente
eléctrica constante y que está alojado dentro de un contenedor de metal en forma de
anillo y con una hendidura o ranura en su cara interna.

TIPOS DE MICROSCOPIOS ELECTRÓNICOS:

- Microscopio electrónico de transmisión:

• Se observa a través del espécimen (transiluminación)
• La resolución puede ser de 0,2nm.
• El espécimen se debe cortar en láminas ultrafinas, que se colocan en una
rejilla de cobre, la cual es bombardeada con un haz de electrones
enfocado.
• Una silueta del espécimen se proyecta en una pantalla fluorescente o en
un sensor digital
- Microscopio electrónico de barrido:
• Se observa la superficie de un espécimen sólido (epiiluminación)
• Se puede lograr una resolución de 10nm y un aumento de hasta 20.000x
• Se escanea la superficie del espécimen con un haz de electrones (e
primarios) y los electrones que rebotan (secundarios) son recogidos por
un detector.
• Los átomos del espécimen producen rayos x, que también son
detectados.
• Se producen imágenes en 3D
• La señal se observa en un monitor.

MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE TRANSMISIÓN:

COMPONENTES DEL MET:

- Platina
- Columna
- Sistema óptico
- Pantalla o detector de imagen

PROCESAMIENTO DE TEJIDOS PARA MET:

1. Fijación: el tejido debe ser fijado, endurecido y preservado con tetraóxido de
osmio y glutaraldehído, con cuidadoso manejo del pH.
2. Contraste: las estructuras de interés deben ser electrón-densas y contrastar con
el fondo.
3. Deshidratación: el espécimen va a estar en el vacío y no puede contener agua,
pues esta se evaporaría y dispersaría los electrones.
 4. Inclusión: el espécimen deshidratado se coloca en óxido de propileno y resinas,
que se endurecen y forman un bloque sólido de plástico muy duro.
5. Corte: se emplea un ultramicrotomo, con una chuchilla de diamante.
6. Observación y toma de micrografías.

EL MICROTOMO ELECTRÓNICO DE BARRIDO:

Permite una visualización em 3D de las muestras.

En este caso, el haz de electrones no atraviesa la muestra, sino que incide en sobre su
superficie, lo que hace que no se requieran cortes tan finos de la muestra.

El haz de electrones primarios que incide sobre la muestra hace que esta emita
electrones secundarios, que son colectados por un detector, y que también emite rayos
X, infrarrojos u ultravioleta.

COMPONENTES DEL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE BARRIDO:

- Sistema de alto vacío
- Filamento emisor de electrones (cátodo)
- Lentes
- Generador del escaneo
- Detector de electrones secundarios
- Monitor.

PROCESAMIENTO DE TEJIDOS PARA EL MEB:

1. Fijación
2. Deshidratación
3. Corte
4. Contraste
5. Observación y toma de fotos