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Electroforesis

• Es una técnica Separativa que se emplea para separar ácidos nucleicos y las
proteínas.

• La separación de las macromoléculas depende de 2 variables :


carga y masa.

• Se separan en función de su velocidad de migración cuando se encuentran


sometidas a la acción de un campo eléctrico→ la corriente eléctrica de un
electrodo repele las moléculas al tiempo que el otro electrodo las atrae

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Electroforesis
La mayoría de las biomoléculas:
• Poseen una carga eléctrica cuya magnitud depende del pH del medio
en el que se encuentran.

• Como consecuencia, pueden desplazarse cuando se ven sometidas a un


campo eléctrico hacia el polo de carga opuesta al de la molécula.

• También actúa la fuerza de fricción de el gel de agarosa través del cual


pasa el ADN y hará que se separen las moléculas en función de su tamaño

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Electroforesis
Por lo tanto, en una electroforesis, los
ácidos nucleicos como tienen carga
negativa migrarán hacia el polo positivo o
el ánodo.

El principio de la electroforesis
consiste en la migración
proporcional de las moléculas a
través de un gel u otro tipo de
matriz porosa, según su peso
molecular o tamaño; movimiento
generado por el campo eléctrico.

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Electroforesis
Durante la electroforesis las macromoléculas son empujadas a través de los
poros y su tasa de migración depende de ciertos factores:

1. Características del campo eléctrico(diferencia de potencial y gradiente entre


los 2 electrodos)
2. Características de la molécula a separar (tamaño, carga y
forma)
3. Características del medio(tamaño del poro, fuerza iónica del tampón,
temperatura y viscosidad del medio)

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Electroforesis
Como la mayor parte de la potencia que libera la electroforesis es en
forma de calor, esto puede producir estos efectos perjudiciales:

1. Aumento de la tasa de difusión: de los iones de la muestra y el


tampón→ ensanchamiento de las muestras
2. Formación de corrientes de convección (mezcla de muestras)
3. Inestabilidad térmica de las muestras: son sensibles al calor
4. Disminuye la viscosidad del tampón: por lo que se reduce la
resistencia al medio

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Electroforesis
La separación de acs nucleicos se puede realizar en gel de agarosa o de
acrilamida.
Los geles de agarosa se pueden hacera distintas concentraciones:

• Los geles más concentrados→ tamaño poro más pequeño por lo tanto
separan mejor los fragmentos pequeños

• Los geles menos concentrados→ tamaño poro más grande por lo


que separaran mejor los fragmentos grandes

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Componentes delaElectroforesis
AGAROSA
Polisacárido natural de cadena lineal que se extrae de algas Permiten
una electroforesis rápida pero la resolución es limitada Obtención
Suspensión de agarosa seca en polvo en un tampón acuoso se hace hervir la
muestra hasta que se disuelve la agarosa y forma una solución
transparente.
Se vierte en un molde para gel donde se ha colocado el peine para
formar los pocillos en los que posteriormente se introducirán las
muestras

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Componentes de la Electroforesis
El peine puede ser:

1. Peine Fino→ bandas bien definidas

2. Peine grueso→ que nos dará bandas de menor resolución, se retira una
vez solidificado el gel y con cuidado para que no se produzcan roturas.

El gel se enfría a temperatura ambiente hasta solidificar y su densidad viene


determinada según la concentración de la agarosa (mas agarosa mas denso)

Una concentración de un 1% es suficiente por lo general

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Componentes de la Electroforesis
1.Tampón o Buffer de electroforesis
Éste proporciona el medio para la transmisión de la corriente eléctrica y
mantiene el pH sin variaciones mientras se realiza el proceso.
Es decir aporta la fuerza iónica necesaria para que aumente la conductancia y
el ADN migre.

2.Tipos de buffer para electroforesis de ADN bicatenario:


• EDTA +tris acetato (ph 8)→TAE
• Con EDTA + tris borato (ph 7.5-7.8)→TBE

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Componentesde LaeLectroforesisen geLde agarosa

3.ADN marcador o marcador de peso


molecular
Adn de tamaño conocido en las ranuras del
extremo izquierdo y derecho del gel que nos
servirá como guía ya que la distancia de
migración depende del peso molecular.
El marcador contiene un número
determinado de fragmentos conocidos lo
cual facilita el poder determinar el tamaño
de ADN desconocido.

Y la velocidad de migración variará según la


concentración de agarosa
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Componentes de la electroforesis
4.Tampón o buffer de carga
El cual contiene por regla general agua sacarosa y algún
colorante como cianol de xileno o azul de bromofenol,
se añade junto a la muestra de ADN con tres fines:

1. Aumentar la densidad de la muestra para que la


muestra caiga uniformemente en el pocillo.
2. Añadir color a la muestra.
3. Incorporar un colorante que en un campo eléctrico
se desplace hacia el ánodo a una velocidad
previsible.

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Como se hace la
Electroforesis

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Electroforesis
Pasos:
1. Cargamos los pocillos con la muestra introduciendo un poco la
punta de la pipeta en el pocillo.
2. Se cargan ADN marcadores d tamaño conocido y un control positivo y
uno negativo
3. Se tapa la cubeta de electroforesis, se conectan los cables para
aplicar el voltaje adecuado.
4. El ADN migrará al polo positivo o ánodo y podremos observarla migración de
las muestras por el avance del colorante del tampón de carga.

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Visualización de los ácidos nucleicos
Introduciendo bromuro de etidio en el propio gel, es una sustancia que se
intercala entre las Bases Nitrogenadas del ADN y emite fluorescencia al
iluminarlo con luz UVA
Como es una sustancia tóxica y mutagénica se suele utilizar otros
colorantes fluorescentes alternativos como el Safe View que no son
nocivos.
Una vez terminada la electroforesis se desconectan lo cables y se
introduce el gel en un transiluminador UVA y se fotografía.

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A ver si lo has entendido

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