Guía de Trabajo Práctico 1 BIO141C-17, 18

Lunes 06 de Mayo, 2024

Microscopía como herramienta para visualización de estructuras de células y tejidos

El objetivo de este trabajo práctico es el acercamiento a la experiencia de observación de estructuras de

tejidos, células y estructuras subcelulares, mediante el uso de distintos microscopios de luz y microscopía
de fluorescencia.Lugar: Laboratorio principal de docencia.

Actividad 1. Microscopía óptica, observación de tejidos al microscopio de luz

Observación de muestras de tinciones histológicas de células y tejidos bajo el microscopio de luz.

Junto a su grupo, observe el set de muestras entregado por los ayudantes. Realice esquemas o dibujos de
lo observado. Comente sus observaciones con el grupo y responsa las preguntas de su guía de trabajo
práctico.
Realice un esquema o adquiera una imagen del microscopio de luz de su mesón de trabajo, y con
la ayuda de esta guía, indique las partes del mismo.

Actividad 2. Microscopía de Fluorescencia

Lugar: Sala de cultivo celular, laboratorio de docencia

Observación de muestras de inmunofluorescencia indirecta

bajo el microscopio de fluorescencia (imagen a la derecha). Con la
guía de su ayudante, identifique las distintas estructuras que observa
bajo el microscopio. Junto a su grupo, realice un esquema breve de
lo observado, utilizando código de colores para las distintas
estructuras subcelulares observadas.
Antecentes teóricos
Microscopía de luz y fluorescencia

Reseña histórica
El estudio de la estructura y funciones celulares ha experimentado tres períodos fundamentales
de progreso. El primer periodo se inicia a comienzos del siglo XVII y se caracteriza por el descubrimiento
de un mundo diminuto, no detectable por el ojo humano pero sí por lupas o lentes. Las primeras
observaciones fueron de glóbulos rojos sanguíneos por Pierre Borel en 1656. En 1665, Robert Hooke
introdujo el término célula para describir la estructura del corcho y en 1674, Anton van Leeuwenhoek
observó organismos unicelulares vivos. Al paso de los años, los lentes se perfeccionaron y transformaron
en microscopios ópticos. En 1838-1839, Mathias Jacob Schleiden y Theodor Schwann formularon la teoría
celular, que considera a la célula como una unidad estructural común de todos los seres vivientes, y que
una célula madre es capaz de dividirse en dos células hijas. Esto último fue un aporte hecho por Rudolph
Virchow en 1858. Ya a fines del siglo XIX se dispuso de tinción y fijación de los tejidos que permitieron una
enorme recopilación de detalles celulares como la división celular y la fecundación celular. Los fenómenos
de evolución y herencia empezaron a tener gran importancia. El segundo período, comienza a fines del
siglo XIX y se caracteriza por la tentativa de interpretar las estructuras celulares con respecto a su función.
El tercer período en cambio, acentúa el conocimiento de la función de los componentes celulares a nivel
molecular.

Descripción del instrumento:

El sistema óptico del microscopio está montado sobre un soporte o estativo que consta de una base y
una columna. Perpendicular a la columna está dispuesta la platina, donde se ubica el objeto a observar.
En la base, por debajo de la platina, se ubica el sistema de iluminación, y entre éste y la platina, el
condensador. La luz que sale del condensador incide sobre la parte inferior de la preparación, pasando a
través de un orificio presente en la platina. La muestra está sujeta por pinzas sobre la platina. Por encima
de la platina (y de la preparación) se encuentran los objetivos, que en un número de tres a cuatro están
dispuestos en un sistema mecánico llamado revólver, que facilita el cambio de objetivo y con ellos el
cambio de aumento de observación. El objetivo que se encuentra en el eje óptico del instrumento se
continúa con un tubo cuyo interior está pintado de color negro mate y que termina en el ocular. Existe
finalmente un dispositivo mecánico llamado cremallera que permite modificar la distancia existente entre
el objeto y el objetivo en uso, permitiendo así enfocar el sistema. El enfoque grueso se realiza mediante
el tornillo macrométrico y el enfoque fino con el tornillo micrométrico.
El estudio de la estructura celular o citología, está basado casi totalmente en la observación
directa con el microscopio. El Microscopio de Luz, uno de los más comúnmente usados, aumenta nuestra
visibilidad miles de veces, así que podemos observar objetos de 0.1 mm, siendo éste el tamaño de muchas
bacterias, las cuales se consideran las células más pequeñas.
El microscopio de luz consta de tres sistemas de lentes:

1. EL CONDENSADOR: proyecta una imagen disminuida de la

fuente luminosa sobre el objeto.
2. EL OBJETIVO: recoge la luz que abandona la muestra y
produce una imagen real, aumentada e invertida del objeto
(“imagen primaria”).
3. EL OCULAR: genera una imagen “final”, virtual, aumentada y
recta respecto a la imagen primaria.

Conceptos básicos

- AUMENTO: razón entre el tamaño del objeto observado y la

imagen que el microscopio produce. Se puede calcular con la
fórmula:
Figura 2: esquema del
Longitud óptica del tubo
sistema de lentes en un
Aumento= ------------------------------------
microscopio
Distancia focal
donde la longitud óptica del tubo es la distancia entre el plano focal posterior del objetivo y la posición de
la imagen real. Generalmente esta distancia es de 160 mm. Así, un objetivo de 10X tendrá una distancia
focal de 160/10. En la práctica el aumento total se calcula como Aumento del objetivo x Aumento del
ocular. Esto significa que el máximo aumento que se puede obtener es de 1000X.
- RESOLUCIÓN: es la capacidad de distinguir dos puntos vecinos como unidades independientes. La
limitante para observar objetos de magnitud muy pequeña no es el aumento que pueden generar los
sistemas ópticos, sino la resolución que ellos poseen. Por ejemplo el ojo humano tiene una resolución de
0.1 mm y el microscopio de luz una de 0.1 µm. El límite de resolución se puede calcular a partir de la
siguiente fórmula:
Constante x Longitud de onda de luz
R= --------------------------------------------------------
Apertura numérica
La constante es = 0.61
Longitud de onda luz verde = 5500 A°
Longitud de onda luz azul = 4500 A°
Apertura numérica = índice de refracción x seno del ángulo de apertura.
La apertura numérica máxima de un objetivo es de alrededor de 1.4.
De acuerdo a esta fórmula, mientras más pequeño sea el numerador y/o más grande sea el
denominador, la resolución del sistema será mejor.
El índice de refracción del medio que recorre la luz en el proceso de formación de la imagen
primaria puede ser modificado. Por ejemplo, el aceite tiene mayor índice de refracción que el aire. Si se
utiliza aceite entre el objetivo y la muestra, la imagen se resolverá mejor y permitirá el empleo de un
mayor aumento.
Para que exista una imagen clara, los lentes deben estar dispuestos de una manera precisa para
que no produzcan efectos de difracción óptica. Estos últimos son el resultado del paso, levemente
desfasado, de las ondas luminosas a través del sistema óptico. Si dos ondas están en fase se suman sus
intensidades aumentando el brillo del objeto. Al contrario, si dos ondas están desfasadas, se anularán
mutuamente. Esto es la base de la Microscopía de Contraste de Fase.

Visualizando Células y Tejidos

Para estudiar estructuras y morfología de los tejidos en el microscopio de luz normalmente se

utilizan tinciones histológicas, que se basan en el uso de colorantes específicos que tiñen distintas
moléculas presentes en las células, como ácidos nucleicos, proteínas, lípidos, etc.
Hay diferentes tipos de colorantes y se clasifican en colorantes básicos y colorantes ácidos,
basándose en su afinidad por moléculas de carga positiva o negativa.
Un colorante básico tiene una carga neta positiva y reacciona con componentes aniónicos
presentes en la célula, como grupos fosfato de ácidos nucleicos, grupos sulfato de glicosaminoglicanes, o
grupos carboxilo de algunas proteínas.
Un colorante ácido tiene una carga neta negativa y reacciona con grupos catiónicos en células y
tejidos como proteínas con aminoácidos de carga positiva, algunos componentes citoplasmáticos, etc.
Basándose en el uso de diferentes colorantes existen variados tipos de tinciones histológicas, que nos
permite identificar membranas, tipos celulares, componentes de matriz extracelular, etc. (Tabla 1).

Tabla 1: Tinciones histológicas más usadas y sus características

Tinción Usos Núcleo Citoplasma Eritrocitos Fibras de Tiñe
colágeno específicamente|
Hematoxilina Tinción Azul - - - Ácidos nucleicos,
general con azul
eosina rER, azul
Eosina Tinción - Rosado Naranjo/ Rosado Fibras elásticas y
general con Rojo reticulares, rosado
hematoxilina
Masson Tejido Negro Rojo/ Rojo Azul/ Cartílago,
Tricrómico conectivo Rosado Verde Azul/verde
Fibras musculares,
rojas
Periodic acid- Membrana Azul - - Rosado Glicógeno y otros
Schiff (PAS) basal, carbohidratos,
carbohidratos Rojo-fucsia
Microscopio de Fluorescencia
El set de filtros del microscopio de fluorescencia consiste en dos filtros de corte y un espejo
dicroico (espejo de ranuras ordenadas). El ejemplo de la Figura 3 corresponde a la molécula fluorescente
fluoresceína.
Las moléculas fluorescentes que permite observar el microscopio de fluorescencia se excitan y
emiten luz a diferentes longitudes de onda, lo que permite, en general, poder observar hasta 3 fluoróforos
al mismo tiempo. Existen diversas sondas fluorescentes de origen orgánico, con distintos máximos de
longitud de onda de excitación y emisión. Se destaca su uso en inmunofluorescencia al ser acopladas a un
anticuerpo, como también en la expresión de proteínas de fusión que poseen la secuencia de ADN de
alguna de estas moléculas y se expresan en células vivas en forma de proteína acoplada a fluoróforo. Estas
sondas tienen la desventaja de excitarse a una longitud de onda específica y perder relativamente rápido
su fluorescencia en el tiempo. En los últimos años se han desarrollado una familia diferente de fluoróforos,
los quantum dots, estas nanopartículas de cristales semiconductores tienen la propiedad de emitir luz a
una cierta longitud de onda dependiendo de su tamaño, que va desde los 2 a los 10nm. Estás moléculas
se excitan en un amplio espectro en el rango de la luz azul, y son muy estables en el tiempo.

Figura 5: esquema del sistema en un microscopio de fluorescencia

Inmunofluorescencia
Otra de las técnicas comúnmente utilizadas en células en cultivo y muestras de tejido es la tinción
por el uso de colorantes flourescentes que se unen a diferentes moléculas presentes en las células como
ácidos nucleicos, proteínas o lípidos. Además se puede realizar una tinción específica de alguna proteína
en particular mediante inmunotinción en que se utilizan anticuerpos específicos para la proteína de
interés, que están acoplados a un fluoróforo (Figura 4). Esta técnica es de gran utilidad, por ejemplo,
podemos evaluar si nuestro cultivo celular es puro evaluando marcadores de linaje celular, también se
puede observar transporte de vesículas marcando proteínas de Golgi o ER, se puede evaluar translocación
de algún factor de transcripción al núcleo, cambios cualitativos de proteínas en distintas condiciones, etc.
Figura 6: Técnica de inmunoflourescencia directa e indirecta. En el primer caso, se utiliza un anticuerpo
primario acoplado a un fluoróforo. En la inmunofluoresencia indirecta se utiliza un anticuerpo primario
que reconoce un antígeno de interés y luego se aplica un anticuerpo secundario acoplado a un fluoróforo,
que reconoce el IgG del anticuerpo primario. Se puede visualizar bajo un microscopio de fluorescencia.
Instructivo para realización de Informes de laboratorio curso BIO141c-17, 18

Entregue el informe con su nombre y sección (Ej. Juana la estudiosa, grupo 1C)
Fecha de entrega: Miércoles 14 de Mayo 2024, 23:59 hrs.
Formato: letra Arial 10, interlineado 1.15, márgenes justificados en el texto y tamaño carta.
Margen superior e inferior de 2,5 cm, margen derecho e izquierdo 3 cm.

El informe debe contener:

Título del Práctico

Introducción
Realice una breve introducción relacionada al trabajo realizado. (Máximo 15 líneas)

Objetivos
Describa los objetivos planteados en el trabajo práctico. (Máximo 5 líneas)

Metodología
Describa la metodología utilizada para resolver los objetivos planteados (Máximo 15 líneas) Por ejemplo:
“Se utilizó microscopio de luz (marca XX) y se analizó las muestras en el objetivo 10X y 20X. Para dar
contraste, las muestras fueron tenidas con azul de metileno y fueron montadas con solución de montaje
Entellan”. OJO: no copiar lo que ya está descrito en su guía de laboratorio.

Desarrollo experimental
Resuelva la siguiente guía:

Cuestionario

I. Respecto a la Actividad 1. Microscopía óptica, observación de tejidos al microscopio de luz

(1 página).
Presente 1-3 dibujos de las muestras observadas. Señale, con el mayor nivel de detalle posible, las
estructuras celulales, subcelulares observadas.
Realice un esquema o dibujo del microscopio utilizado. Señale la ubicación de la fuente de luz, el
condensador y los objetivos. Indique con qué objetivos (aumentos) cuenta su microscopio de trabajo.

II. Respecto a la Actividad 2. Microscopía de fluorescencia (1 página).

Realice un esquema de las muestras observadas bajo el microscopio de fluorescencia. Indique qué
herramientas se utilizaron para marcar cada estructura subcelular (anticuerpos primarios y secundarios,
tinciones).
Señales qué tipo de luz se utiliza para observar muestras fluorescentes. Señale qué tipo de filtros posee
el microscopio. Señale, qué longitud de onda se utilizó para cada fluoróforo evaluado.
Discusión
En esta sección analice de manera objetiva sus resultados basándose en los resultados esperados y sus
resultados obtenidos, tratando de ofrecer alguna explicación si sus resultados no fueron lo esperado.
Compare las distintas estrategias de microscopía. Sus usos y limitaciones. (Máximo 20 líneas)

Conclusiones
Describa las conclusiones más importantes de la realización del trabajo práctico. (Máximo 10 líneas)