MICROBIOLOGÍA

AMBIENTAL

GUÍA DE PRÁCTICA N° 2

Desinfección y Esterilización

ALUMNO(A): Mayerly Esther Jaramillo Mori

FECHA: 21/09/2022

1. Objetivo
Conocer los principios generales de las técnicas de desinfección y esterilización en el
laboratorio de Microbiología Ambiental.

2. Fundamento Teórico
Los microorganismos como otros seres vivos, son susceptibles a los cambios de
condiciones ambientales y en la medida en que se han podido adaptar a estos cambios,
se han distribuido en una gran diversidad de hábitats incluyendo los de condiciones
extremas sobre todo de tipo físico y químico.
Se han desarrollado y aplicado diversos procesos de desinfección y esterilización para
limitar su presencia o eliminarlos. La esterilización es un método de eliminación total
de todo tipo de organismo y que asegura la ausencia absoluta de cualquier forma
viviente, mientras que la desinfección es un proceso que solamente elimina formas
vegetativas de los microorganismos.
Existen distintos tipos de esterilización, siendo la esterilización con calor seco y
húmedo los procedimientos de mayor utilización en Microbiología. El calor seco
desnaturaliza las enzimas y destruye a los microorganismos por oxidación, por
ejemplo al ponerlos directamente a la flama de un mechero o en horno pasteur
(estufa) a 150-180°C durante 2 horas. Estos métodos se aplican principalmente en la
esterilización de asas de inoculación y todo tipo de material de vidrio y quirúrgico y
acero inoxidable.
Los procesos con calor húmedo se aplican para esterilizar medios de cultivo,
soluciones, y cultivos bacterianos que se desechan, el más recomendable es el
autoclave en el que se utiliza vapor de agua a presión para alcanzar temperaturas de
121 °C. El material se deja a esta temperatura durante 15 minutos para asegurarse de
la destrucción de endosporas, que son las estructuras bacterianas más resistentes al
calor.
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Para poder desempeñar correctamente las tareas en un laboratorio de microbiología,

es indispensable contar con conocimientos teóricos acerca de los diferentes métodos
de control del crecimiento microbiano (métodos de esterilización, desinfección, etc.).
También con un buen manejo práctico de los aparatos destinados a tal fin, del
flameado de tubos y esterilización de ansas y agujas a la llama del mechero.

3. Conceptos
Por control del crecimientos microbiano, se entiende tanto la inhibición del
“crecimiento” microbiano (evitar su multiplicación) como la destrucción de aquellos.
En este contexto se emplean una serie de término:
a) Esterilización. Es el proceso de destrucción o eliminación completa de toda
forma de vida existente en el interior o en la superficie de cualquier material, por
medio del calor, radiaciones, filtración, etc. Por lo tanto, la esterilización es un
término absoluto e incluye la destrucción de las esporas y formas vegetativas, los
virus, etc.
b) Desinfección. Es un proceso en el que se destruyen las formas vegetativas de los
microorganismos más comunes pero no las esporas. Generalmente los
desinfectantes son productos químicos excesivamente tóxicos para ser usados
directamente sobre tejidos vivos. Muy pocos desinfectantes llegan a esterilizar.
c) Antisepsia. Es un proceso en el que se destruyen las formas vegetativas de los
microorganismos patógenos más comunes, pero no necesariamente esporas,
presentes sobre el cuerpo, la piel, las mucosas, los tejidos vivos, etc. El agente
empleado se denomina antiséptico.
d) Asepsia. Se refiere a la condición de ausencia de microorganismos de un objeto o
área. Por ejemplo, las técnicas asépticas son las que evitan la contaminación
propia de otros o de los materiales durante el trabajo.
e) Microbiostasis. Es una condición por la que el crecimiento o la multiplicación de
los microorganismos están inhibidos, lo que no quiere decir que sean destruidos.
Si el agente microbiostático es eliminado, el crecimiento microbiano puede
resurgir. De igual definición pero de aplicación a la correspondiente categoría de
microorganismos son los fungistáticos y los bacteriostáticos.
f) Microbiocida. Es el agente que destruye las formas viables de los
microorganismos. De igual significado pero con ámbito más restringido son los
términos fungicida y bactericida.
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Figura 01. Diferencia entre los términos limpieza, desinfección y esterilización

La naturaleza de estos agentes en algunos casos es física y en otros química. Ejemplos

de Agentes desinfectantes y antisépticos de naturaleza química son: óxido de etileno,
formaldehído, peróxido de hidrógeno.

4. Desinfección
Recordemos que la desinfección elimina buena parte de microorganismos presentes
en superficies, pero no elimina sus formas resistentes (esporas).

Tabla 01. Agentes desinfectantes comúnmente utilizados en microbiología y su

mecanismo de acción.
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5. Esterilización
Proceso físico, mecánico o químico que destruye toda forma de vida microbiana,
incluidas las esporas. En esta práctica se hará énfasis en los métodos más comunes:
 Calor seco: Flameado, Estufa.
 Calor húmedo: Autoclave.
 Rayos Ultravioleta (UV)
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Figura 02. Métodos de esterilización según agente

5.1. Flameado
Consiste en exponer directamente a la llama el material a esterilizar, lo que se
logra por oxidación violenta. Este método se utiliza para asas, agujas, flameado de
bocas de tubos u otros recipientes y destrucción de material contaminado. En las
llamas de los mecheros Bunsen se alcanzan temperaturas superiores a los 2.500°C,
por lo que una breve exposición es suficiente. En el mechero a base de alcohol se
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recomienda exponer directamente el material hasta que este tome un color rojo
intenso.

Figura 03. Flameado de un asa de siembra microbiana.

5.2. Estufa u horno Pasteur

Se emplean las estufas de calor seco, en las que el aire caliente circula por el
espacio que existe entre la doble pared, transmitiendo así el calor a los objetos que
se encuentran en su interior. Los microorganismos se mueren por oxidación de sus
estructuras previa deshidratación, pudiéndose llegar a una ligera carbonización.

Tiempo requerido
Una hora y media a dos horas, a una temperatura de 160 a 180ºC. El tiempo se
mide desde el momento en que se alcanzó la temperatura indicada y está
condicionado por la cantidad de material y su distribución dentro de la estufa. El
aire caliente no tiene mucho poder de penetración, por esta razón es que se
requiere mayor temperatura y tiempo que con otros métodos.

Aplicación
Se utiliza preferentemente para esterilizar material de vidrio y acero inoxidable.
Recordar que todo el material debe ir perfectamente acondicionado,
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preferentemente envuelto en papel blanco o papel aluminio, de modo tal que una
vez retirado de la estufa, permanezca estéril hasta el momento de ser usado.

Descripción de la estufa
La estufa de esterilización a seco es una caja metálica de paredes triples. La pared
interior es generalmente de acero inoxidable y presenta orificios para la libre
circulación del aire caliente. La pared intermedia encierra, junto con la externa, el
material aislante, que puede ser lana de vidrio o amianto. La fuente de calor es una
resistencia eléctrica aunque también existen estufas a gas. Viene provista de un
termorregulador para graduar la temperatura deseada. En la cara superior de la
estufa existen orificios para permitir la salida de gases y vapores, pudiendo existir
otro para la colocación de un termómetro en caso de no traerlo incorporado. En el
interior posee rejillas metálicas de altura graduable para acondicionar sobre ellas
el material a esterilizar.

Uso
Esterilización de material de vidrio y otros materiales termorresistentes que
interese mantenerlos secos. Todo el material a esterilizar debe estar debidamente
empaquetado con papel de estraza o contenido dentro de cajas metálicas.

Figura 04. Corte esquemático de Estufa de esterilización

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5.3. Autoclave
Es uno de los métodos más utilizados; se emplea el autoclave para esterilizar
material en general y particularmente para medios de cultivo y otros compuestos
químicos. Este método tiene gran poder de penetración, razón por la cual la
esterilización se puede llevar a cabo a menor temperatura y tiempo que cuando se
emplea la estufa (calor seco) y está especialmente recomendado para la
eliminación de formas esporuladas.

Descripción del autoclave:

El autoclave consiste en un cilindro de bronce, horizontal o vertical, con una tapa
del mismo material que se apoya sobre una arandela de goma y se cierra por
pestillos o cerrojos quedando herméticamente cerrado. Además, posee en la parte
superior una llave de vapor (o espita), un manómetro y una válvula de seguridad.
En el interior del autoclave se coloca un volumen de agua que se hace hervir, ya
sea por medio de quemadores externos que se encuentran en la parte inferior del
aparato, o mediante calentadores eléctricos de inmersión.
Se cierra luego la tapa de forma correcta, se selecciona la presión y temperatura a
la trabajará y se enciende para dejarlo trabajar correctamente. Se debe vigilar el
proceso constantemente y no dejar sólo al autoclave.
Una vez culminado el proceso, no deben abrirse ni el autoclave ni la espita hasta
que el manómetro indique “0” (cero). Si la presión se libera violentamente los
líquidos en el interior del aparato hierven tumultuosamente, pudiendo aún reventar
los elementos de vidrio. Una vez que el manómetro indique que no hay
sobrepresión en el interior del aparato, se abre primero la llave de vapor y luego de
algunos minutos se puede levantar la tapa del autoclave. No se debe retirar el
contenido inmediatamente. Al hacerlo se debe usar guantes de calor para evitar
quemarnos con el material recientemente esterilizado.

Tiempo requerido
Usualmente, para esterilizar medios de cultivo son necesarias temperaturas de
107-121ºC durante 10 a 15 minutos. Sin embargo si se esteriliza material sucio,
como por ejemplo placas con cultivos microbianos, se debe dejar por al menos 20
minutos.
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Limitaciones
En función de la termolabilidad de ciertos materiales y componentes de medios de
cultivo. Además es inadecuado para sustancias que son inmiscibles en agua, como
las grasas, en las que la penetración del vapor es muy limitada.

Figura 05. Corte esquemático del Autoclave.

5.4. Rayos Ultravioleta (UV)

Se utiliza principalmente para la esterilización de áreas y superficies, y cuya
principal limitación es que debe ser absorbida para ser efectiva, no pasa a través
del vidrio transparente u objetos opacos e irrita los ojos y la piel.

Uso
Se puede usar para los materiales que no pueden ser esterilizados por los otros
procesos de esterilización, por ejemplo plástico no autoclavable, material textil,
papel, entre otros.

Tiempo requerido
Se recomiendo un tiempo de esterilización entre 25 a 45 minutos dependiendo del
material a esterilizar. Así mismo no se recomienda exposición directa con los
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rayos UV, sino abandonar el lugar donde se está realizando el proceso de

esterilización con UV, y dejar pasar unos minutos antes de manipular
directamente el material esterilizado.

Figura 06. Material en UV en una cámara de aislamiento.

6. Preparación de material a esterilizar:

Para esta práctica se consideró la preparación de Placas Petri previo a su esterilización
en la estufa.

a) Procedimiento (Caso: Placa Nueva):

 Desinfectar el ambiente de trabajo con alcohol de 96°.
 Colocar mechero (s) en el centro del área de trabajo.
 Desinfectar la Placa Petri con alcohol de 96° cuidadosamente, tanto en el interior
como en el exterior de este.
 Envolver cuidadosamente de dos en dos con papel bond reciclado (la parte blanca
en contacto con la placa), o papel kraft. Las placas deben ser colocadas en sentido
inverso (tapa hacia abajo).
 Colocar en estufa para su esterilización.

b) Procedimiento (Caso: Placa sucia con colonia microbiana):

 Eliminar las etiquetas y parafilm de las Placas Petri con material microbiano.
 Colocar las placas a esterilizar en una bolsa autoclavable.
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 Autoclavar las placas.

 Eliminar el agar en un frasco apto para residuos tóxicos.
 Lavar cuidadosamente las placas con abundante jabón líquido y agua.
 Dejar secar las placas a temperatura ambiente.
 Desinfectar las Placas Petri con alcohol de 96° cuidadosamente, tanto en el
interior como en el exterior de estos.
 Envolver cuidadosamente de dos en dos con papel bond reciclado (la parte blanca
en contacto con la placa), o papel kraft. Las placas deben ser colocadas en sentido
inverso (tapa hacia abajo).
 Colocar en estufa para su esterilización.

7. Material y
reactivos Material
 Placas Petri
 Papel bond reciclado
 Mechero
 Papel toalla
 Alcohol de 96°
 Encendedor

Material biológico
 Colonias de microorganismos a autoclavar
Equipo
 Autoclave

Servicios
 Electricidad
 Agua
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8. Referencias Bibliográficas
 Castañeda Briones, M. T. (2004). Microbiología aplicada: manual de laboratorio.
Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Azcapotzalco, División de Ciencias
Básicas e Ingeniería, Departamento de Ciencias Básicas.
 Cornelissen, C. N., Harvey, R. A., & Fisher, B. D. (2012). Microbiology (Vol. 3).
Lippincott Williams & Wilkins.
 Gamazo, C., López-Goñi, I., & Díaz, R. (2005). Manual práctico de
Microbiología (No. 579 G186m). Elsevier.
 Madigan, M. T., Martinko, J. M., & Parker, J. (2003). Brock. Biología de los
microorganismos 12 ed. Editorial Pearson Prentice Hall Iberia, Madrid. Pp, 1064.
 Ramírez Gama, R. M., Luna Millán, B., Velázquez Madrazo, O., & Vierna García, L.
(1998). Manual de prácticas de microbiología general (No. 576 R3.).