Sección N°: 28 REGLAS DE LAS ACTIVIDADES DE LABORATORIO
1. Todas las sesiones son OBLIGATORIAS.
2. Cada inasistencia debe ser justificada a la correspondiente Unidad Académica dentro de los plazos establecidos por la misma. Inasistencias no justificadas provocan que el alumno obtenga nota 1,0 (uno) en esa actividad.
3. El estudiante que no asista a los 2 laboratorios programados deberá rendir el examen final, independiente de si las inasistencias hayan sido justificadas.
4. Para cumplir con los objetivos de aprendizaje el alumno debe leer el material entregado previamente.
5. En todos los laboratorios se realizará una actividad escrita que será evaluada. Esta actividad consiste en un cuestionario que deberá ser contestado en grupos de 5 a 6 estudiantes durante la sesión y entregado una semana después de haber realizado el laboratorio. Las fechas de entrega serán estipuladas para cada actividad.
6. La actividad empezará puntualmente por lo que el alumno debe llegar al menos 10 minutos antes.
7. Las mochilas y otros materiales u objetos que no vayan a ser usados durante la actividad práctica deben dejarse en los casilleros que se encuentran fuera del laboratorio. Para el uso de los casilleros es necesario presentar su TUC.
8. Es OBLIGATORIO el uso de delantal de laboratorio, los alumnos que no lleven delantal NO podrán realizar el trabajo de laboratorio obteniendo la nota mínima (1.0) en esa actividad.
9. Por razones de seguridad, se prohíbe el ingreso al laboratorio de estudiantes con faldas o
pantalones cortos y calzado que no cubra el pie. Asimismo, los estudiantes de cabello largo deberán tenerlo tomado.
10. Está prohibido el consumo de alimentos y bebestibles en el laboratorio.
ACTIVIDAD 1: EXTRACCIÓN DE DNA DE FRUTA
Objetivo: Conocer las características de los ácidos nucleicos que permiten su extracción
Presentación de la estructura de los ácidos nucleicos y sus funciones.
Los ácidos nucleicos son macromoléculas biológicas que contienen la información genética necesaria para la vida. Existen dos tipos de ácidos nucleicos básicos, el DNA (ácido desoxirribonucleico) y RNA (ácido ribonucleico). El DNA en las células eucariotas (células animales y vegetales) se encuentra compartimentalizado en el núcleo celular, mientras que el DNA de las células procariontes (bacterias) se encuentra libre en el citoplasma en una región denominada nucleoide. El DNA codifica la información necesaria para la expresión de RNAs, los cuales son requeridos para la síntesis de proteínas entre otras funciones.
Los ácidos nucleicos como el DNA y RNA tienen una estructura diferente:
Las unidades fundamentales de estas macromoléculas son los nucleótidos compuestos por: - Grupos fosfatos, - Bases nitrogenadas: Adenina (A), Timina (T), Citosina (C) y Guanina (G) en el DNA. La Timina es reemplazada por Uracilo (U) en el RNA. - Pentosa: azúcar de 5 carbonos que corresponde a desoxirribosa para el DNA y ribosa para el RNA. Esta última obtiene su nombre por el grupo –OH libre que posee en el carbono 2’ y que no está presente en el DNA El DNA es una doble hélice en espiral cuyas hebras se mantienen unidas por interacciones entre las bases nitrogenadas de acuerdo con la regla de Chargaff: A=T interactúan mediante 2 puentes de hidrógeno, y C≡G mediante 3 puentes de hidrógeno. ¿Cuál de estas interacciones piensas que sería más difícil de romper y por qué?
El RNA es una hebra única que también puede formar estructuras secundarias debido a las interacciones entre sus bases nitrogenadas. Ejemplo: - RNA de transferencia (tRNA): es un RNA que participa en la síntesis de proteínas, posee una estructura secundaria en forma de trébol debido a la formación de doble hélices cortas y bucles o loops, donde uno de ellos forma el anticodón que reconocerá el codón del RNA mensajero para la síntesis de proteínas, llevando el aminoácido correspondiente (traducción).
Como se mencionó anteriormente, el DNA lo podemos encontrar en células eucariontes y
procariontes. Las células están rodeadas por una membrana plásmatica (bicapa lípidica), aunque las plantas y los hongos también están rodeados por una pared celular rígida, al igual que las bacterias.
Para poder realizar la extracción del DNA es necesario conocer la composición y estructura de los diferentes tipos de células, debido a que para poder liberar el DNA de estas células es necesario romperlas (lisarlas). Por ejemplo, si buscamos extraer el DNA de una célula que presenta una pared celular, se requiere utilizar un método mecánico, como moler con un mortero para poder romper la pared celular, debido a que esta estructura es bastante dura. En el caso de las células que no presentan pared celular como las células animales, no se requiere realizar este procedimiento. A pesar de que no todas las células eucariontes tienen pared celular, sí presentan una membrana plasmática que rodea al citoplasma y otras que forman parte de los organelos celulares, entre ellos el núcleo. Dada la composición de la membrana plasmática, para poder romperla se requiere de una solución de lisis que tenga como componente principal un detergente. El DNA, por sí solo, también tiene características que favorecen su extracción, como su carga negativa, debido a que presenta grupos fosfatos. El hecho de que el DNA tenga una carga negativa es relevante en su capacidad para ser soluble en agua.
Materiales ● Trozo de fruta (Kiwi o Plátano, los estudiantes deben llevar su fruta) ● Detergente lavalozas ● Sal de mesa ● Alcohol 100% y 70%, frío ● Papel de Cocina (Toalla Nova) ● Embudo ● Bolsa tipo Ziploc ● Tubos Falcon de 15 y 50 mL ● Palitos de brocheta
Procedimiento
1. Colocar el trozo de fruta seleccionada (aprox. 4-6 cm) en bolsa tipo Ziploc rotulada previamente con su número de grupo y triturar completamente (pueden utilizar la mano).
2. En un tubo Falcon de 50 mL vacío, preparar una solución con 2 cucharadas soperas de agua + 2 cucharadas sopera de lavalozas + una pizca de sal (media cucharadita de té), y revolver bien.
3. Abra la bolsa Ziploc con su fruta triturada y vierta el contenido del tubo Falcon preparado en el paso anterior. Asegúrese de quitar el aire de adentro y cierre la bolsa. Mezcle vigorosamente hasta obtener una mezcla de aspecto uniforme.
4. Arme un sistema de filtrado con un tubo Falcon de 50 mL, embudo y Toalla Nova. Vierta el contenido de la bolsa sobre el sistema de filtrado poco a poco hasta que tenga aproximadamente 10 mL de filtrado. Una vez realizado este proceso puede colocar el papel filtro utilizado dentro de la bolsa y descartar en el contenedor designado.
5. Solicite a su ayudante el tubo con 20 ml de alcohol 100% frío y viértalo en el tubo Falcon con el filtrado, agite suavemente y deje reposar en la gradilla por 5 minutos en hielo. (recordar tomar foto del DNA observado para la actividad). 6. Utilizando un palito de brocheta tome el precipitado y traspáselo a un tubo Eppendorf con 1 ml de ETOH 70% para observarlo. ACTIVIDAD ÁCIDOS NUCLEICOS: EXTRAE DNA DESDE FRUTA
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1. Siguiendo los pasos de extracción de DNA a partir de una fruta rellena los recuadros:
Saca fotos a los materiales utilizados para completar cada uno de los pasos y muéstranos tu DNA Cuéntanos muy brevemente cómo realizaste la extracción y qué materiales usaste exactamente (2
Paso 1:
Colocamos el plátano en una bolsa
Ziploc, y luego lo trituramos.
Paso 2:
Vertimos la solución compuesta de
agua, lavalozas y una pizca de sal en la bolsa Ziploc que contenía plátano, luego mezclamos rigurosamente.
Paso 3:
Armamos un filtro de nova que pusimos en un
embudo para filtrar el contenido de la bolsa Ziploc en el tubo Falcon. Paso 4:
Vertimos alcohol en la solución filtrada del
tubo Falcon, lo agitamos suavemente y lo dejamos reposar en hielo.
Paso 5:
Con un palito de brocheta tomamos la
muestra de DNA extraído y lo traspasamos a un tubo Eppendorf con 1 ml de ETOH 70 % para observarlo.
Los materiales que utilizamos fueron: Trozo de plátano, solución compuesta principalmente de detergente y sal, alcohol, toalla nova, embudo, bolsa tipo ziploc, tubos falcon y palitos de brocheta. CONTESTA LAS SIGUIENTES PREGUNTAS:
1. ¿Qué crees que ocurre cuando molemos el plátano durante el paso 1? (1 punto) Las paredes celulares de las células vegetales, en este caso el plátano, cuentan con una rigidez que mantiene la célula firme, por lo tanto, se necesita moler el plátano para romper esta estructura.
2. ¿Para qué sirve el lavaloza y la sal en el paso 3? (1 punto)
En el caso del lavaloza, este se ocupa como un desnaturante, ya que disuelve la membrana lipídica. Y en el caso de la sal la carga positiva atrae a la carga negativa del DNA, condensando el DNA para así poder verlo más compactado. De esta forma ayuda a mantener el DNA separado del resto de la solución. Además, es importante mencionar que el ADN es soluble en el alcohol, sin embargo, el sodio neutraliza la carga negativa de los grupos fosfatos, por lo tanto, lo vuelve insoluble en el alcohol, es por esto que agregamos la solución que contiene la sal, antes que el alcohol.
3. ¿Qué significa que la toalla nova actúe como filtro? Explícanos que ocurre en este paso. (1 punto) Permite mantener los componentes celulares más grandes (fibras del plátano restos celulares, entre otros), así mismo permite que el liquido en donde se encuentra el DNA pase a través de ella (nova), facilitando la separación del DNA ayudando a obtener una muestra mas pura de este.
4. ¿Por qué crees que el DNA no se disuelve en alcohol y nos facilita su separación de la solución? (1 punto) Porque el DNA y el alcohol son polares, pero al tener contacto la sal con el alcohol, este neutraliza las cargas negativas de los grupos fosfatos, manteniendo el DNA y los componentes celulares separados. Dicho esto, la sal evita la unión de las proteínas al DNA.
5. ¿Te imaginaste obtener DNA de esta forma? Cuéntanos tu experiencia. ¿Te resultó el experimento? Si no fue así, ¿qué crees que falló? (1 punto) No, creíamos que para el proceso de extracción del ADN necesitaríamos implementos más complejos. Si resultó lo esperado, ya que, seguimos los pasos tal cual como nos indicaron las ayudantes. ACTIVIDAD 2: ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA
Objetivo: Observar el proceso de separación de muestras de DNA mediante el método de
electroforesis en gel de agarosa.
El desarrollo de la biología molecular comenzó con la publicación de la estructura del DNA, y el
descubrimiento de las enzimas de restricción facilitó la manipulación de esta molécula y marcó el inicio de la ingeniería genética. Las enzimas de restricción cortan el DNA en secuencias de nucleótidos específicas y de esta manera permiten la generación de fragmentos de DNA de tamaño más pequeño. Estos fragmentos que pueden contener genes, partes de genes u otras secuencias de interés pueden ser clonados en plasmidios (Figura 1), los que son introducidos en bacterias permitiendo su replicación (Figura 2).
FIGURA 1
FIGURA 2
Si queremos saber, por ejemplo, si hemos logrado clonar el gen de interés en un vector podemos observar directamente los fragmentos de DNA digerido con enzimas de restricción utilizando la técnica de electroforesis en gel de agarosa.
La técnica de electroforesis se usa para separar fragmentos de DNA por tamaño (también se utiliza para separar otras moléculas como RNA y proteínas). La técnica consiste en cargar las muestras de DNA en un gel que se encuentra sumergido en una solución (buffer de electroforesis) y luego aplicar un campo eléctrico. Este campo eléctrico es generado gracias a la fuente de poder utilizada, la que genera un polo negativo cercano a los bolsillos donde se carga la muestra y un polo positivo en el otro extremo. El buffer de electroforesis contiene iones, los que permitirán la conducción de electricidad a través del gel. En consecuencia, la muestra de DNA migrará hacia el polo positivo a diferentes velocidades dependiendo de su tamaño.
Mediante esta técnica podemos observar cuántos fragmentos de DNA están presentes en una muestra y también estimar sus tamaños al incluir un estándar de tamaño molecular, que contiene fragmentos de DNA de tamaños conocidos.
Materiales
● Cámaras de electroforesis ● Micropipetas p20 ● Transiluminador ● Fuentes de poder ● Buffer TAE 1X ● Geles de agarosa 1% (2 por mesón). El gel que se utiliza es una matriz de agarosa (polisacárido). En un extremo tiene pocillos donde se cargan las muestras y ha sido preparado con un buffer (solución con sales) y un colorante (GelRed) que se unirá a las moléculas de DNA y permitirá su visualización. ● Estándar de tamaño molecular (1000 pares de bases) ● DNA plasmidial pBR322 digerido con enzimas de restricción: Tubo 1 – Enzima 1; Tubo 2 – Enzima 2; Tubo 3: Enzima 1+ Enzima 2. Procedimiento demostrativo
1. Los geles de agarosa 1% se prepararon previamente con solución buffer TAE 1X pH 8 y GelRed (1:10.000). La agarosa sólida fue masada, mezclada con la solución buffer, y calentada en microondas hasta su total disolución. Una vez disuelta se agregó el GelRed.
2. Las muestras se mezclaron con solución de carga (que incluye colorante) antes de ser depositadas en los bolsillos del gel.
3. El DNA plasmidial pBR322 fue digerido con enzimas de restricción a 37°C en baño termorregulado por 4 horas.
Procedimiento (estudiantes)
1. El/la ayudante asignado/a cargará 3uL de standard de peso molecular en el primer carril del gel de agarosa.
2. Posteriormente, un estudiante de cada mesón cargará una muestra de DNA plasmidial digerido en los pocillos contiguos. Cargue el DNA plasmidial digerido en el siguiente orden: • Carril 2 – tubo 1. • Carril 3 – tubo 2. • Carril 4 – tubo 3.
3. Con una micropipeta P20, extraiga 2 uL de muestra provista de DNA plasmidial digerido, cargue cuidadosa y lentamente en un bolsillo (pocillo) del gel de agarosa inmerso en buffer.
4. Observe la migración de la muestra cargada en el gel luego de 60 minutos. Pueden tomar
fotografías. ACTIVIDAD ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA
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Grupo: 23 Sección: 28 1. Describa qué característica del DNA permite que estas moléculas migren hacia el polo positivo (ánodo) durante la electroforesis. Una característica del DNA que permite que migren las moléculas son los grupos fosfatos, ya que, tienen cargas negativas.
2. Averigüe y escriba en la siguiente tabla cuales son las secuencias de reconocimiento y el sitio de corte de las 3 enzimas de restricción utilizadas en la actividad práctica (Google Search).
Enzima de restricción Secuencias de reconocimiento y
sitio de corte
ECOR1 Secuencia de reconocimiento:
5’-GAATTC-3´ 3´CTTAAG 5´ Sitio de corte: 5´--G / AATTC--3´ 3´-- CTTAA / G--5´ El sitio de corte siempre es entre los nucleótidos (G) y la primera (A) SAL1 Secuencia de reconocimiento: 5´-GTCGAC-3´ 3´-CAGCTG-5´ Sitio de corte: 5´--G / TCGAC--3´ 3´--CAGCT / G--5´ EL sitio de corte siempre es entre los nucleótidos (G) y la primera (T)
ECOR1 Y SAL1 Secuencia de reconocimiento: Cada
una de las enzimas (ECOR1 y SAL1) actúa sobre su propia secuencia de reconocimiento, mencionado en los cuadros de arriba. 5´-GAATTCGTCGAC-3´ 3´-CAGCTGCTTAAG-5´ Aquí están presentes ambas secuencias de reconocimiento de cada enzima en ambos sentidos.
5´--G / AATTC/TCGAC--3´ 3´--CAGCT/CTTAA / G--5´
Ambas enzimas van a dejar extremos
cohesivos de 5´ a 3´.
El Sitio de corte al igual que en cada
enzima seria entre (G) y (A) o podría ser entre (G) y (T) depende si es que actúa la ECOR1 o la SAL1 primero.
3. Con relación al tamaño ¿Qué fragmentos de DNA son los que migran más rápido y por qué? Los fragmentos más pequeños migran con mayor velocidad porque pueden atravesar los poros del gel agarosa con mayor facilidad, mientras que los fragmentos mas grandes encuentran mayor resistencia y se mueven con menor velocidad.
