Teórico 4 - Técnicas Moleculares 2 - 17 Agosto

Técnicas moleculares 2
Identificando genes y su función

o Obtención y generación de mutantes para
un rasgo característico.
o Identificación de familias donde un

fenotipo segrega.
o Aislar, identificar y clonar el gen

o los genes responsables del fenotipo.
Hibridación de ácidos nucleicos
La hibridación, en relación con la genómica, es el proceso en el que
dos moléculas complementarias de una sola hebra de ADN y/o ARN
se unen y forman una molécula de doble cadena. La unión depende del
apareamiento apropiado de las bases entre las dos moléculas de una sola hebra. La
hibridación es un proceso importante en diversas técnicas de investigación y de laboratorio
clínico.
Southern Blot
El Southern Blot es una técnica de hibridación que permite
identificar fragmentos de ADN separados por electroforesis en
gel y transferidos a una membrana de nitrocelulosa o nylon.
Southern Blot
Técnica desarrollada por Edwin Southern
Pasos:
• ADN purificado es digerido con una enzima de
restricción.
• El ADN digerido es separado por tamaño en una
electroforesis de agarosa.
• Desnaturalización del ADN en el gel por solución
alcalina.
• Transferencia del ADN monocatenario a la
membrana de nylon o nitrocelulosa. Transferencia
por capilaridad
Southern Blot
Técnica desarrollada por Edwin Southern
Pasos:
• Fijación de los fragmentos desnaturalizados del ADN a la membrana. El
ADN transferido se encuentra en la misma posición relativa a lo migrado en
el gel.
• Hibridación del ADN fijado a la membrana con una sonda marcada
radioactivamente.
• Autoradiograma. La membrana hibridada se coloca junto a una película de
rayos X aislada de la luz. La película registra las posiciones donde hay
desintegración radioactiva.
Northern blot
Técnica similar al Southern blot, pero el objetivo es la identificación de ARNs
específicos usando una sonda de ADN
Western blot
Es una técnica de laboratorio utilizada para detectar
una proteína específica en una muestra biológica.
• Las proteínas de una muestras son separadas por electroforesis.
Las proteínas separadas se transfieren del gel a la superficie de
una membrana.
• La membrana se expone a un anticuerpo específico contra la
proteína en estudio.
• La unión del anticuerpo se detecta usando un marcador
radiactivo o químico.
Western blot
MLPA
Multiplex ligation-dependent probe amplification
Técnica que permite detectar cambios en el número de
copias (inserciones o deleciones) de secuencias
genómicas. También se llama amplificación múltiple de sondas
dependiente de ligamiento.
Se basa en la amplificación de hasta 60 sondas, las cuales detectan secuencias específicas
de ADN de aproximadamente 60 pb. La reacción genera amplicones de entre 64 a 500
nucleótidos de tamaño.
MLPA
Estructura de las sondas de MLPA

MLPA
1. Desnaturalización de la muestra e hibridación de las sondas

MLPA
1. Ligación de las sondas

MLPA
1. Amplificación de las sondas
MLPA
1. Amplificación de las sondas
• Las sondas son amplificadas usando un par universal de cebadores que

reconocen la sonda.
• Solo las sondas ligadas son amplificadas exponencialmente, evitando que sea
necesario eliminar las sondas no hibridadas ni ligadas.
MLPA
Protocolo de PCR
MLPA
Separación de fragmentos: los fragmentos amplificados se separan por electroforesis
capilar
MLPA
Separación de fragmentos y análisis de datos
Cromatogroma de las sondas amplificadas de una muestra de

referencia y de una muestra problema ordenada por tamaño.
Intensidad de fluorescencia calculada para cada una de las

sondas ordenada por su posición en el genoma y normalizada
por la muestra de referencia.
Herramientas para clonar y
manipular genes
o Clon viene De “klon” = rama
o Población de células u organismos genéticamente idénticos
o Copia idéntica de una molécula de ADN
Algunos pasos para el estudio de genes
o Aislamiento
o Amplificación y/o clonación
o Secuenciación
o Expresión
o Modificación
manipular genes
Aislamiento, clonación y/o amplificación.
Requerimientos
Vectores
o Segmentos de ADN (cromosomas accesorios no esenciales) a

los cuales se les puede insertar una secuencia de ADN de
interés (ADN foráneo).
o Estos vectores portando la secuencia de ADN de interés son

capaces de introducirse dentro de células procariotas o
eucariotas y este cromosoma es amplificado durante el
proceso normal de crecimiento y división de la célula.
manipular genes
Vectores
o ADN circular extra-cromosómico

o Replicación autónoma usando la maquinaria celular de la bacteria.
o Genes de resistencia a antibióticos
o 1 a 3000 copias por bacteria
o Tamaño pequeño.
manipular genes
Uso de enzimas
de restricción
para clonar genes
(From S. N. Cohen, “The Manipulation of Genes.” Copyright © 1975 by Scientific American, Inc. All rights
reserved.)
manipular genes
Amplificando el ADN
recombinante.
Se generan clones de
una secuencia de
ADN.
Los plasmidos son
introducidos dentro
de las células
bacterianas por
métodos físicos
(electroporación) o
químicos.
manipular genes
Estructura de un vector
o Origen de replicación
o Sitio de clonación
múltiple
o Marcador de selección
manipular genes
Visualización de colonias transformadas
Colonias blancas: con inserto
Colonias azules: sin inserto

manipular genes
Otros vectores
o Bacteriofago lambda
o Insertos de entre 15 y
20 kb
manipular genes
Otros vectores
Cósmidos:vectores híbridos,con secuencias
plasmídicas necesarias para la replicación y
con sitios cos de fagos necesarios para el
empaquetamiento. Insertos de 40-45kb
BACs.Bacterial artificial chromosome.

Insertosde150a300kb
manipular genes
YACs
Cromosoma
artificial de
levadura
manipular genes
¿Que podemos clonar?
o ADN genómico
o ADNc o cDNA
o Otros ARN copiados a ADN
manipular genes
Genoteca
manipular genes
CRISP-CAS9
Otras técnicas de análisis
de genética molecular
Microarray
• Arrays de SNPs
• Arrays de expresión
• Arrays de metilación
Secuenciación de nueva generación. NGS
• NGS de ADN. Exomas, Genomas, NGS de metilación, etc.
• RNAseq
Oxford Nanopore sequencing

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Técnicas moleculares 2

Identificando genes y su función

o Identificación de familias donde un

o Aislar, identificar y clonar el gen

Estructura de las sondas de MLPA

1. Desnaturalización de la muestra e hibridación de las sondas

1. Ligación de las sondas

• Las sondas son amplificadas usando un par universal de cebadores que

Cromatogroma de las sondas amplificadas de una muestra de

Intensidad de fluorescencia calculada para cada una de las

Algunos pasos para el estudio de genes

o Segmentos de ADN (cromosomas accesorios no esenciales) a

o Estos vectores portando la secuencia de ADN de interés son

o ADN circular extra-cromosómico

Colonias blancas: con inserto

Colonias azules: sin inserto

BACs.Bacterial artificial chromosome.

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