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geociencias

Artículo

Descomposición de hidrocarburos de gasolina por

microorganismos naturales en suelos japoneses

Junko Nishiwaki1, Yoshishige Kawabe2, Takeshi Komai3y Ming Zhang2,*

1 Facultad de Agricultura, Universidad de Ibaraki, 3-21-1, Chuuo, Ami, Inashiki, Ibaraki 300-0393, Japón;
junko.nishiwaki.office@vc.ibaraki.ac.jp
2 Servicio Geológico de Japón, AIST, 1-1-1, Higashi, Tsukuba, Ibaraki 305-8567, Japón; y-kawabe@aist.go.jp Escuela de
3 Posgrado de Estudios Ambientales, Universidad de Tohoku, 6-6-20, Aramaki, Aoba-ku,
Sendai 980-8579, Japón; komai@mail.kankyo.tohoku.ac.jp
* Correspondencia: m.zhang@aist.go.jp

Recibido: 4 de diciembre de 2017; Aceptado: 18 de enero de 2018; Publicado: 23 de enero de 2018

Abstracto:La caracterización de los mecanismos por los cuales los microorganismos naturales del suelo descomponen los
hidrocarburos de la gasolina es de importancia fundamental para una mejor comprensión de la atenuación natural y/o para
predecir el transporte y destino de los contaminantes en los suelos. Para examinar si los hidrocarburos de la gasolina
pueden descomponerse en condiciones ambientales generales y de qué manera, se analizó la descomposición de 10
componentes principales que generalmente se encuentran en la gasolina disponible comercialmente en tres muestras de
suelo japonesas seleccionadas arbitrariamente. Los hidrocarburos de la gasolina, especialmente los hidrocarburos
aromáticos, son fácilmente adsorbidos por los suelos japoneses analizados, y los hidrocarburos de cadena lineal se
descomponen más rápido que los hidrocarburos ramificados. Los hidrocarburos monocíclicos saturados se descompusieron
con menor facilidad que los hidrocarburos monocíclicos insaturados. La mejora de la descomposición microbiana de los
hidrocarburos de la gasolina requiere un suministro continuo de oxígeno junto con nutrientes para los microorganismos.

Palabras clave:contaminación del suelo; destino de los hidrocarburos de la gasolina; descomposición microbiana;
experimento por lotes; atenuación natural

1. Introducción

Un problema ambiental importante en la actualidad es la contaminación de suelos y/o aguas subterráneas por hidrocarburos de
petróleo. Muchos lugares, como plantas refinadoras de petróleo y gasolineras abandonadas, están contaminados por hidrocarburos de
petróleo, incluida la gasolina, resultante de fugas y derrames accidentales. Un informe de 1990 de la Agencia de Protección Ambiental
de los Estados Unidos [1] indicó que aproximadamente el 25% de todos los tanques de almacenamiento subterráneos tenían fugas. La
reglamentación de los tanques de almacenamiento subterráneos que almacenan petróleo o ciertas sustancias peligrosas se modificó
en 2015 [2], por lo que las fugas de petróleo siguen siendo un problema de gran interés. Es probable que se produzcan situaciones
similares en otros países desarrollados, incluido Japón.
La Agencia de Recursos Naturales y Energía [3] informó que, a finales de 2011, había
En Japón, había 15.078 distribuidores registrados de aceites volátiles y 31.467 gasolineras, lo que representa una
marcada disminución con respecto a los 31.599 distribuidores y 60.421 gasolineras que había a finales de 1994. Una
enmienda a la Ley del Servicio de Bomberos [4] exige que, para evitar posibles fugas, se mejoren los tanques de
almacenamiento subterráneos construidos hace 40 años, ya sea recubriendo las superficies internas de estos tanques
con plástico reforzado con fibra (FRP) o utilizando un método electroquímico para minimizar la corrosión. Es posible
que algunos concesionarios y estaciones de servicio no puedan afrontar los gastos asociados a estas mejoras y dejen
de operar en el plazo de varios años. Además, el uso generalizado de vehículos híbridos y el aumento del uso de
vehículos eléctricos, así como de vehículos con celdas de combustible de hidrógeno en todo Japón, ha reducido el
consumo de gasolina, por lo que se necesitan menos estaciones de servicio en todo el país. Por lo tanto, muchos sitios
potencialmente contaminados por hidrocarburos de gasolina se han convertido en un problema social y requieren
contramedidas adecuadas en el futuro cercano.

Geociencias2018,8, 35; doi:10.3390/geociencias8020035 www.mdpi.com/journal/geosciences

Geociencias2018,8, 35 2 de 9

Aunque se pueden utilizar algunas técnicas de remediación activa, como excavación y transporte, bombeo y
tratamiento, calentamiento y evaporación y lavado de suelos, para tratar suelos contaminados con hidrocarburos de petróleo,
estas técnicas son generalmente costosas y pueden conducir a una descomposición incompleta de los contaminantes. Sin
embargo, afortunadamente, los hidrocarburos de la gasolina son biológicamente descomponibles, y existen varias técnicas
rentables y respetuosas con el medio ambiente que se pueden aplicar para el tratamiento de sitios contaminados con
hidrocarburos, como la atenuación natural monitoreada (MNA). Se inició un programa de MNA [5], y se ha llevado a cabo de
forma continua en algunos sitios de los EE. UU. [6]. La Agencia de Protección Ambiental de Estados Unidos (US EPA) también
proporcionó una guía sobre cómo lidiar con el MNA a los ciudadanos [7] Su aplicabilidad también ha sido investigada en
Japón.8,9]. La MNA puede incluir procesos relacionados con la biodegradación, dispersión, dilución, sorción, volatilización,
descomposición, estabilización química o biológica, transformación o destrucción de contaminantes [10]. Cuando otros
procesos no son dominantes, la MNA se basa principalmente en la biorremediación intrínseca y/o pasiva, por ejemplo, [10].
Sidra de pera [11] informaron que los alcanos normales tienen mayor capacidad de descomposición, seguidos de los alcanos
ramificados, los hidrocarburos aromáticos de bajo peso molecular y los cicloalcanos. Jobson et al. [12] informaron que los
hidrocarburos saturados de cadena lineal, es decir, los n-alcanos y las n-parafinas, tienen tasas de descomposición más altas
que las de los alcanos de cadena más larga, los hidrocarburos aromáticos y los cicloalcanos. El éxito de un proceso de
biorremediación depende básicamente de la capacidad de que el contaminante pueda continuar biodegradándose. Varios
factores afectan la biorremediación en los ecosistemas del suelo [13Se sabe que las tasas de descomposición se ven afectadas
por los tipos de suelo [14]. También se encuentran disponibles algunas revisiones sobre la descomposición microbiana de los
hidrocarburos del petróleo [15–17]. Aunque la biodescomposición anaeróbica de hidrocarburos de petróleo puede ser posible
[18Es de conocimiento común que la biodescomposición aeróbica es más rápida en comparación con la biodescomposición
anaeróbica.
Para realizar un estudio preliminar que tiene como objetivo examinar si los hidrocarburos de la gasolina son
descomponibles y las diferencias entre la descomposición de diferentes compuestos en suelos japoneses como sistemas de
atenuación natural por microbios aeróbicos, se probó la descomposición de diez componentes principales contenidos en la
gasolina disponible comercialmente en tres muestras de suelo japonés seleccionadas arbitrariamente.

2. Materiales y métodos

2.1. Materiales de prueba

La gasolina es una mezcla de múltiples hidrocarburos y componentes, cada uno con un comportamiento de
descomposición diferente. En este estudio, se preparó una gasolina sintética mezclando volúmenes iguales de diez
componentes principales que generalmente se encuentran en una gasolina comercialmente disponible. Estos
componentes incluían hidrocarburos alifáticos y aromáticos, con números de carbono que van de 6 a 9 (Tabla1). Mesa
1También muestra las características estructurales de los hidrocarburos individuales.
Para los experimentos del estudio preliminar se utilizaron tres muestras de suelo japonés seleccionadas
arbitrariamente. El suelo superficial (de 0 a 5 cm de profundidad) y el suelo subterráneo (de 10 a 15 cm de profundidad) se
tomaron del campus del Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada, ciudad de Tsukuba, Japón (Tabla 1).2).
La muestra de suelo contaminado se tomó de un terreno baldío de una antigua planta refinadora de petróleo con
antecedentes de contaminación por hidrocarburos de petróleo, principalmente aceites pesados (Tabla2). El suelo superficial
estaba cubierto de hojas y ramitas, pero se retiraron durante el muestreo. Por ello, pensamos que el suelo superficial contenía
más materia orgánica que el suelo subterráneo. El suelo contaminado contenía compuestos de petróleo pesado y había
estado contaminado durante varias décadas. Todos los aparatos y viales de vidrio utilizados para el muestreo se esterilizaron
en un autoclave a 120◦C durante 20 minutos antes de su uso. Para utilizar los microorganismos del suelo en la descomposición
de hidrocarburos de petróleo, no se ajustó el contenido de agua de las muestras de suelo.
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Tabla 1.Componentes de hidrocarburos utilizados para preparar una gasolina sintética.

Composicional
Tipo Componente Número de carbono Estructura
Fórmula

n-Hexano 6 do6yo14
Cadena recta

n-Heptano 7 do6yo14
Cadena recta
Alifático n-Octano 8 do6yo14
hidrocarburos Cadena recta

Iso-octano 8 do6yo14

Cadena ramificada

n-Nonano 9 do6yo14
Cadena recta

Metilciclohexano 7 do6yo14

Monocíclico

Tolueno 7 do6yo14

Monocíclico

Etilbencina 8 do6yo14
Aromático
hidrocarburos Monocíclico

p-xileno 8 do6yo14

Monocíclico

o-xileno 8 do6yo14

Monocíclico

Tabla 2.Muestras de suelo y condiciones de prueba utilizadas para pruebas de descomposición microbiana.

Prueba No. Tipo de suelo Peso (g) Contenido de agua (%)

1 Suelo superficial 9.22 34

2 Suelo subsuperficial 9.37 33
3 Suelo contaminado 8.39 16

2.2 Método de ensayo y condiciones analíticas

Se añadieron diez gramos de cada muestra de suelo a un vial de vidrio de 110 ml y se utilizó el aire
atrapado en el espacio superior como fuente de oxígeno. Utilizando una microjeringa de pequeña capacidad, 3
µSe inyectó 1 L de gasolina sintética en cada vial de vidrio tapado y sellado. Se colocó un tapón de
politetrafluoroetileno (PTFE)/butilo entre una tapa de aluminio y los viales para evitar la sorción de petróleo. La
hermeticidad del sellado se verificó en el laboratorio. La gasolina sintética se mezcló con la muestra de suelo
agitando cada vial de vidrio durante 5 minutos, y se repitió la agitación diariamente durante la prueba. Para
evitar o eliminar posibles fugas por evaporación, los viales de vidrio tapados y sellados se colocaron boca abajo
en un baño de agua dentro de una incubadora, con la temperatura del baño de agua mantenida a 30◦C
durante toda la prueba (Figura1). Cada muestra fue probada mediante un experimento independiente para
examinar la reproducibilidad.
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Figura 1.Configuración experimental utilizada para evaluar la descomposición de hidrocarburos dentro de una incubadora con
temperatura controlada.

Para examinar el mecanismo y el proceso de biodescomposición aeróbica, los cambios dependientes del tiempo
en la concentración de los 10 hidrocarburos del petróleo, junto con los gases inorgánicos, incluido el oxígeno (O2) y
dióxido de carbono (CO2) fueron monitoreados, pero no necesariamente en los mismos días. El consumo de O2Se
utiliza generalmente como índice de biodescomposición aeróbica y producción de CO2Se debe a la oxidación de
hidrocarburos. Los componentes orgánicos, incluidos los hidrocarburos de la gasolina, se analizaron mediante
cromatografía de gases-fluoruro de hidrógeno (Shimadzu Co., GC-2010, Kioto, Japón), utilizando una columna ZB-5m
(Zebron) de 15 m con un diámetro interior de 0,25 mm y un espesor de película de 0,5µm. Las temperaturas del
inyector SPL y del detector FID se fijaron en 300 y 250◦C, respectivamente. La temperatura de la columna se mantuvo
inicialmente a 40◦C durante 10 min y luego aumentó a 220◦C a una velocidad de 5◦C por min. Se realizaron pruebas de
calibración que cubren el rango de concentraciones máximas a medir con estándares autoajustables. A 2µSe extrajo
una alícuota de gas de espacio de cabeza de cada vial de vidrio para analizar los hidrocarburos de la gasolina.
Componentes inorgánicos, incluido el O2y CO2Se analizaron mediante GC-QMS (Agilent Technologies, Agilent
6890, Santa Clara, CA, EE. UU.), utilizando una columna capilar CP-PoraBONDQ (Varian) de 25 m de largo, con un
diámetro interno de 320µm y un diámetro exterior de 500µm. La temperatura de entrada se fijó en 80◦C. La
temperatura de la columna se mantuvo a 80◦C durante 1,3 min, aumentado a 100◦C a una velocidad de 80◦C por
minuto y se mantiene a 100◦C durante 0,25 min. A 50µSe extrajo una alícuota de gas de espacio de cabeza de cada vial
de vidrio para los análisis de componentes gaseosos inorgánicos.
Los experimentos duraron aproximadamente cuatro meses y durante la etapa inicial se tomaron muestras más
densas (cada uno a tres días) para captar los cambios en las concentraciones de los componentes orgánicos e
inorgánicos. Los intervalos de muestreo se ajustaron teniendo en cuenta los resultados monitoreados asociados con
los cambios en la concentración de hidrocarburos de la gasolina.

3. Resultados y discusión

Se evaluaron los cambios dependientes del tiempo en las concentraciones de hidrocarburos de petróleo durante
las pruebas de descomposición microbiana en el suelo superficial (Figura2a), suelo subterráneo (Figura3a) y suelo
contaminado (Figura4a). Las concentraciones se normalizaron en relación con las concentraciones iniciales de los
hidrocarburos de petróleo individuales dentro de los viales de vidrio del mismo tamaño que habían sido inyectados
con el mismo volumen de hidrocarburos mixtos. Las concentraciones normalizadas de hidrocarburos de petróleo
individuales fueron mucho menores que 1 justo después del inicio de los experimentos. Además, las velocidades de
descomposición de los hidrocarburos de cadena lineal fueron más rápidas que las de otros tipos de hidrocarburos
(Figuras2a,3a y4a).
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1.00
n-hexano
isooctano
n-heptano
metilciclohexano
0,75 tolueno
n-octano
antitormenta económica y social

etilbencina
p-xileno
o-xileno
0,50 n-nonano
Neoadrlim

0,25
NormaNaolrizm

0.00
0 20 40 60 80 100 120
Tiempo de descomposición (días)

(a)

Figura 2.Concentraciones a lo largo del tiempo de (a) orgánico y (b) gases inorgánicos durante pruebas de descomposición en
suelo superficial.

1.00 n-hexano
30
isooctano
n-heptano
metilciclohexano O2
ienrtacpegenertcaegnetage

0,75 tolueno
nantioración

n-octano CO2
20
iczoeandliczceeondntrccaeotnniotcre

etilbencina
p-xileno
pag
ncn
es

o-xileno
0,50
iorapnteiiro

n-nonano
tcrenantitn
meoadrlm

ConcCeonntCrcaeotnnio

10
NaolrizN

0,25
Norma

0.00 0
0 20 40 60 80 100 120 0 20 40 60 80 100 120 140 160
Tiempo de descomposición (días) Tiempo de descomposición (días)

(a) (b)

Figura 3.Concentraciones a lo largo del tiempo de (a) orgánico y (b) gases inorgánicos durante pruebas de descomposición en
suelo subterráneo.

1.00 30
n-hexano
isooctano
ocnepneintracpegeenrtcaegnetage

n-heptano O2
antitormenta económica y social

metilciclohexano
0,75 tolueno CO2
n-octano
etilbencina 20
eantinitorpanetiirn

p-xileno
o-xileno
0,50 n-nonano
rcaeotnniotcrn
Neoadrlim
NormaNaolrizm

Conclusión

10
0,25

0.00 0
0 20 40 60 80 100 120 0 20 40 60 80 100 120 140
Tiempo de descomposición (días) Tiempo de descomposición (días)

(a) (b)

Figura 4.Concentraciones a lo largo del tiempo de (a) orgánico y (b) gases inorgánicos durante pruebas de descomposición en
suelo contaminado.
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Cambios dependientes del tiempo en las concentraciones de gases inorgánicos, especialmente los de O2y CO2, durante
las pruebas de descomposición microbiana también se analizaron en el suelo superficial (Figura2b), suelo subterráneo (Figura
3b) y suelo contaminado (Figura4b).

3.1 Efectos de la adsorción

Las disminuciones repentinas en las concentraciones (Figuras2a,3a y4a) probablemente se deban a la adsorción de
hidrocarburos individuales por la materia orgánica dentro de las muestras de suelo. La adsorción de contaminantes
orgánicos puede verse significativamente influenciada por la materia orgánica del suelo [19]. En general, los hidrocarburos
aromáticos son más adsorbentes que los hidrocarburos alifáticos, mientras que, dentro del mismo tipo de hidrocarburo,
aquellos con mayor número de carbonos se han adsorbido más fácilmente que aquellos con menor número de carbonos.
Este fenómeno es consistente con el informe que indica que la sorción está relacionada positivamente con los pesos
moleculares de las sustancias químicas [20]. La sorción puede retrasar el proceso de volatilización, pero puede afectar la
disponibilidad de nutrientes para los microorganismos y, por tanto, el proceso de descomposición biológica.
En comparación con los suelos superficiales y subterráneos (Figuras2a y3a), el suelo contaminado (Figura4a) Los componentes
que contienen petróleo pesado mostraron una mayor adsorción, una diferencia que probablemente se deba a los efectos lipofílicos de
los hidrocarburos de petróleo. Los componentes del petróleo pesado también son materia orgánica, y la cantidad de materia orgánica
muestra una correlación positiva con la adsorción del suelo a los hidrocarburos volátiles del petróleo. Estos hallazgos respaldan
nuestros resultados anteriores sobre los efectos del contenido de materia orgánica del suelo en las propiedades de volatilización de los
componentes de la gasolina en los suelos [21]. Aunque los efectos del tipo de suelo sobre la cinética de biodegradación aún no se
comprenden en detalle, la alta adsorción de arcilla y materia orgánica probablemente limita la biodisponibilidad de los hidrocarburos
de petróleo para los microorganismos del suelo [22,23].

3.2. Tasa de descomposición

Las tasas de descomposición de los hidrocarburos de cadena lineal, específicamente n-hexano, n-heptano, n-
octano y n-nonano, fueron más rápidas que las de otros tipos de hidrocarburos (Figuras2a,3a, y4a) Los alcanos
normales se descomponen más rápidamente que los alcanos ramificados y los hidrocarburos aromáticos. Estas
observaciones concuerdan con hallazgos previos, por ejemplo, [11,24,25].
Aunque el suelo contaminado (Figura4a) mostraron una mayor adsortividad de hidrocarburos de gasolina que
las otras dos muestras de suelo, las tasas de descomposición de hidrocarburos de cadena lineal fueron menores que
en los suelos superficiales y subterráneos (Figuras2a y3a). Además, la tasa de descomposición de los hidrocarburos de
cadena lineal fue menor en la superficie (Figura2a) que en el suelo subterráneo (Figura3a). Se han revisado muchos
factores que afectan la biodescomposición de hidrocarburos [15,26], el factor más importante es la presencia de
microorganismos con las capacidades metabólicas adecuadas. Si estos microorganismos están presentes, se pueden
mantener tasas óptimas de crecimiento y biodescomposición de hidrocarburos asegurando que existan
concentraciones adecuadas de nutrientes y oxígeno. Las diferencias observadas en este estudio pueden deberse a
diferencias en los microorganismos presentes en las muestras de suelo, pero se requieren más estudios para
confirmarlo en el futuro. Además, la identificación y cuantificación de las comunidades microbianas en las muestras
de suelo también son de fundamental necesidad.

3.3 Persistencia de los hidrocarburos

En correspondencia con la adsorción y degradabilidad de los hidrocarburos de petróleo individuales, las

concentraciones de isooctano se mantuvieron altas en las tres muestras de suelo (Figuras2a,3a y4a), lo que indica que los
hidrocarburos de cadena ramificada son relativamente difíciles de descomponer [11,22]. La concentración de
metilciclohexano también se mantuvo relativamente alta en estas muestras de suelo, debido a que los hidrocarburos
monocíclicos saturados son relativamente difíciles de descomponer en comparación con los hidrocarburos monocíclicos
insaturados. Además, la concentración de tolueno se mantuvo relativamente alta en comparación con otros tipos de
hidrocarburos aromáticos.
Los hidrocarburos pueden persistir en muestras de suelo debido a dificultades de descomposición y/o
degradación, el agotamiento del oxígeno, un número limitado de microorganismos útiles y el consumo de nutrientes
por estos microorganismos.
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3.4 Actividad microbiana

La disminución de O2y el aumento de CO2La concentración durante las pruebas de descomposición refleja la actividad
microbiana aeróbica. La actividad microbiana para la descomposición de los hidrocarburos de la gasolina fue mayor en los
suelos superficiales y subterráneos (Figuras2banda3b) que en suelos contaminados (Figura4b), y fue mayor en el subsuelo
(Figura3b) que en el suelo superficial (Figura2b) La mayor actividad microbiana dio como resultado un consumo más rápido de
oxígeno dentro de los viales de vidrio, que se agotó en un plazo de 1 a 2 meses. Esto puede explicar, al menos en parte, la
disminución de las tasas de descomposición después de un cierto período de tiempo. La inyección de oxígeno adicional en los
viales de vidrio daría como resultado una mayor descomposición de los componentes de hidrocarburos residuales dentro de
estos suelos.

4. Observaciones finales

El número de estaciones de servicio abandonadas en Japón seguirá aumentando en el futuro cercano debido a la
modificación de la Ley del Servicio de Bomberos, que exige mejoras en los viejos tanques de almacenamiento de combustible,
el uso generalizado de vehículos híbridos y un mayor uso de vehículos eléctricos, así como vehículos con celdas de
combustible de hidrógeno, que requieren menos gasolina. La contaminación del suelo por hidrocarburos de petróleo, como la
gasolina, es un problema social emergente y se necesitan contramedidas para limpiar y/o reducir los posibles riesgos
asociados con los hidrocarburos de petróleo. Para obtener información fundamental sobre la atenuación natural y la
biorremediación de los hidrocarburos de petróleo en suelos japoneses, se realizaron experimentos para investigar la
descomposición microbiana de los hidrocarburos de petróleo en 3 muestras de suelo japonés seleccionadas arbitrariamente.
Los resultados obtenidos en este estudio se pueden resumir de la siguiente manera:

1. Los hidrocarburos aromáticos se adsorben más fácilmente a la materia orgánica del suelo que los hidrocarburos alifáticos.
Los hidrocarburos con un mayor número de carbonos son más adsorbentes que los hidrocarburos con un menor
número de carbonos.
2. Las propiedades de descomposición dependen del tipo de hidrocarburo. Los hidrocarburos de cadena lineal se
descomponen más rápido que los hidrocarburos ramificados.
3. En comparación con los hidrocarburos monocíclicos insaturados, los hidrocarburos monocíclicos saturados son
relativamente difíciles de descomponer.
4. La actividad microbiana depende de los sitios, ya que cada uno tiene condiciones de suelo diferentes. Una mayor
actividad microbiana consume oxígeno más rápidamente. La descomposición aeróbica puede acelerarse
mediante la inyección continua de oxígeno en concentraciones adecuadas.

Para obtener información sistemática sobre la atenuación natural de los hidrocarburos de la gasolina en los suelos
japoneses, se requieren estudios más detallados. En nuestro laboratorio se están realizando estudios adicionales que
incorporan análisis de las composiciones residuales que quedan en las muestras de suelo, así como una caracterización de los
microorganismos del suelo. Se necesitan más experimentos en más muestras de suelo junto con la identificación y
cuantificación de las comunidades microbianas dentro de los suelos para comprender mejor las propiedades de
descomposición microbiana de los hidrocarburos del petróleo en los suelos.

Expresiones de gratitud:Los autores agradecen a Koichi Shiomi de Shimadzu Co. por el asesoramiento técnico sobre los análisis
químicos. También agradecemos a Keiko Ogawa de AIST, Japón, por su ayuda con los experimentos.

Contribuciones del autor:Todos los autores han contribuido activamente a este estudio y han confirmado y aprobado la
versión final para su presentación. El plan de investigación y los experimentos de laboratorio fueron planificados por los
cuatro autores. Además, Junko Nishiwaki contribuyó tanto a los trabajos experimentales como a la preparación del borrador;
Yoshishige Kawabe contribuyó al desarrollo de métodos analíticos y análisis de datos; Takeshi Komai contribuyó a la discusión;
y Ming Zhang contribuyó al examen del análisis de datos, la discusión y la finalización del manuscrito.

Conflictos de intereses:Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses. Este estudio se realizó utilizando la subvención
general otorgada por el gobierno japonés a los laboratorios nacionales para estudios fundamentales. El gobierno japonés no tuvo
ningún papel en el diseño del estudio; en la recopilación, análisis o interpretación de los datos; en la redacción del manuscrito y en la
decisión de publicar los resultados.
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Referencias

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