Aminoácidos y Proteinas

LABORATORIO # 1
1. Título: ENSAYOS PARA PROTEÍNAS

2. Objetivos
• Reconocer proteínas y aminoácidos mediante reactivos químicos específicos.
• Comprobar el efecto de algunos factores físicos y químicos sobre la
estructura de las
proteínas.
3. Marco Teórico
En las proteínas pueden reconocerse varios niveles de organización estructural.
El primero de ellos es la estructura primaria, que consiste en arreglo
aminoacídico en la molécula. Pauling y Corey basados en estudios de rayos X,
sugirieron que la cadena peptídica puede existir en la forma de un resorte o
hélice. Dichos investigadores consideraron un buen número de formas
helicoidales, pero encontraron que solo la forma alfa-hélice llena los requisitos
de máxima estabilidad. La otra forma secundaria se conoce como hoja plegada
Beta, en la cual los puentes de hidrogeno se encuentran entre dos cadenas
peptídicas paralelas cuyos átomos de N están orientados en la misma dirección
o antiparalelos, donde solo las cadenas alternas están orientadas en la misma
posición.
La estructura terciaria es la disposición en el espacio de las hélices. O en otras
palabras la forma tridimensional de la molécula de la proteína. Muchas de las
moléculas de las proteínas se comportan como si fueran bastante compactas, y
por lo tanto se conocen como proteínas globulares. Otras proteínas son más
rígidas y forman hilos largos y se como proteínas fibrosas. La estructura
terciaria se mantiene por los enlaces que se muestran en la siguiente figura 1:
Reacción de ninhidrina.
La ninhidrina, un agente oxidante poderoso, reacciona con todos los alfa-
aminoácidos un pH entre 4 y 8 para dar un compuesto de color purpura.
Reacción xantoproteica.
Los aminoácidos que contienen un núcleo aromático forman derivados forman
derivados de color amarillo cuando se calientan con HNO 3 concentrado. Las
sales de estos derivados son de color naranja.
Reacción de Millón.
Los compuestos que contienen el radical hidroxibenceno reaccionan con el
reactivo de Millón formado compuestos rojos. Los únicos aminoácidos fenólicos
es la tirosina y sus derivados y solamente ellos dan una reacción positiva.
Prueba del nitroprusiato:
Los grupos tioles reaccionan con nitroprusiato de sodio en presencia de
amoniaco para dar un color rojo.
Prueba de Biuret para enlaces peptídicos:
El sulfato alcalino de cobre reacciona con compuestos que tengan dos o más
enlaces peptídicos produciendo un complejo de coloración violeta. La
intensidad del color obtenido es una medida de la cantidad de enlaces pépticos
presentes en la proteína. La reacción no es absolutamente específica para
enlaces peptídicos, ya que cualquier compuesto que contenga dos grupos
carbonilos unidos por un átomo de N o de C da un resultado positivo.
Desnaturalización de las proteínas.
Cuando las proteínas se exponen a valores extremos de temperatura o pH, o a
algunas sustancias que afectan sus propiedades de plegamiento, se dice que
sufren desnaturalización.
En general las propiedades biológicas de una proteína se pierden cuando se
desnaturaliza. Los enlaces peptídicos no suelen resultar afectados cuando las
proteínas se desnaturalizan y la secuencia de aminoácidos en el polipéptido
(estructura primaria) permanece por tanto inalterada. Sin embargo, la
desnaturalización ocasiona un desplegamiento en la cadena polipeptídica al
destruirse la estructura de orden superior de la molécula, en particular los
enlaces de hidrógeno.
El polipéptido desnaturalizado retiene su estructura primaria porque aquella
está mantenida por enlaces covalentes.
Dependiendo de las condiciones de desnaturalización, el polipéptido puede
volver a plegarse una vez suprimido el agente desnaturalizante. Sin embargo,
el hecho de que la desnaturalización conlleve generalmente a la pérdida de la
actividad biológica de la proteína demuestra claramente que la actividad
biológica no puede asociarse a la estructura primaria de las proteínas, sino que
es el resultado del plegamiento preciso de la molécula, eventualmente
condicionado por la estructura primaria. El plegamiento de un polipéptido
origina, por tanto, dos cosas:
(1) el polipéptido logra una forma única que es compatible con una función
biológica específica, y
(2) el proceso de plegamiento confiere a la molécula su forma química más
estable.
4. Materiales, Equipos e Insumos

• Potenciómetro (pH-metro)
• Pipeta graduada de 1 mL
• pipeta graduada de 5 mL
• vidrio reloj
• pipeteador
• beaker de 500 mL
• frasco lavador
• beaker de 50 mL
• termómetro
• espátula
• balón aforado de 50 mL
• Balanza analítica
• Bureta de mL
• Soporte universal con aro, malla y 2pinzas para bureta
• Tubos de ensayo
• Gradilla
5. Reactivos
• NaOH en lentejas
• HCl Concentrado
• KCl
• Etanol
• Cloroformo
• HNO3 concentrado
• Ninhidrina 0.2 %
• Reactivo de Millon
• Nitrito de sodio 1% p/v
 Acido pícrico 2%
• CuSO4.5H2O
• Ácido tricloroacético 20%
• Nitroprusiato de sodio 2% p/v
• Hidróxido de amonio
• Solución de albumina (*)
• Soluciones buffer patrón
(*) proporcionado por el estudiante
*(La solución de albumina se prepara batiendo una clara de huevo

durante un tiempo, y luego se mezcla con 5 veces su volumen con
agua destilada. La mezcla se filtra con una tela y el filtrado es el que
se utiliza para la realización de la práctica).
6. Procedimiento
Parte I. reacción de ninhidrina:
Colocar 1 mL de solución de aminoácido en un tubo de ensayo y ajustar el pH
cercano a 7, agregar 5 gotas de la solución de ninhidrina y dejar hervir por 2
min.
Parte II. Reacción xantoproteica.
Agregar volúmenes iguales de ácido nítrico a aproximadamente 0.5 mL de
solución de aminoácido, dejar enfriar y observar el cambio de color. Agregar
suficiente hidróxido de sodio hasta que la solución alcance alcalinidad. El
cambio de color amarillo en solución acida a naranja brillante en solución
básica, constituye un resultado positivo.
Parte III. Reacción de Millon.
A 1 mL de muestra agregar 5 gotas de reactivo de Millon y calentar en un baño
de agua hirviendo por 10 min. Dejar enfriar a temperatura ambiente y agregar
5 gotas de nitrito de sodio al 1%. La aparición de un color ladrillo da un
resultado positivo.
Parte IV. Prueba del nitroprusiato: NO
Mezclar 2 mL de la muestra con 0,5 mL de nitroprusiato de sodio al 1%.
Adicionar40 gotas de hidróxido de amonio. Observar.
Parte V. Prueba de Biuret para enlaces peptídicos:
A 2 mL de muestra agregar 5 gotas de la solución de sulfato de cobre al 10%
m/v y luego 2 mL de hidróxido de sodio 10 M; mezclar vigorosamente y
observar.
Parte VI. Reactivo de Sakaguchi para la arginina. NO
Colocar 2 mL de una muestra de proteína en un tubo de ensayo adicionarle 1
mL de hidróxido de sodio 2 N, mezclar bien y luego agregarle 2 gotas de
reactivo de Sakaguchi.
EFECTO DE LOS ÁCIDOS Y LAS BASES EN LAS PROTEÍNAS
PROCEDIMIENTO:
1. Marcar tres tubos del uno al tres respectivamente.
2. Agregar 1ml de albúmina a cada uno.
3. Añadir al tubo número uno 1ml de agua destilada, al tubo número dos 20
gotas de solución de ácido clorhídrico 1M y, al tubo número tres 20 gotas de
solución de hidróxido de sodio 1M.
4. Agitar cada tubo y hacer observaciones.
EFECTO DE LOS METALES SOBRE LAS PROTEÍNAS
PROCEDIMIENTO:
1. Marcar tres tubos del uno al tres respectivamente.
2. Agregar 1ml de albúmina a cada uno.
3. El tubo número uno es el testigo.
4. Añadir al tubo número dos, 4 gotas de solución de sulfato de cobre 0.1M, al
tubo número tres, 4 gotas de solución de acetato de plomo 0.1M.
5. Agitar los tubos y hacer observaciones comparando con el tubo testigo
7. Nivel de Riesgo
Medio. No olvidar que la eficiencia y buenos resultados en la práctica de
laboratorio,
además de la seguridad del personal que ejecuta la práctica dependen del
cumplimiento
de ciertas normas, que, aunque en su mayoría se derivan del sentido común,
es necesario
hacer nota para tenerlas presentes.
• No dejar botellas abiertas y sin marcar, limpiar cualquier derrame, disponer
de los
desechos químicos en las líneas de desecho apropiadas.
• Dejar el sitio de trabajo completamente limpio y ordenado, arrojando los
desechos
en los sitios designados para ello.
9. PREGUNTAS PARA RESPONDER
1. Haga la diferencia entre un L-aminoácido, un péptido y una proteína. Cite un
ejemplo
de cada uno.
2. Ilustre la formación de un enlace peptídico a partir de dos aminoácidos
diferentes.
3. ¿Es la nucleoproteína una proteína conjugada? ¿Por Qué? Consulte la
estructura.
4. Consulte la relación que existe entre las proteínas con el DNA, RNA.
5. Dibuje las distintas estructuras de las proteínas.

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*(La solución de albumina se prepara batiendo una clara de huevo

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