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UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA
UNIDAD XOCHIMILCO
DIVISIÓN DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD
DOCTORADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
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Casa abierta al tiempo
Estudio de la producción de enzimas, virulencia y diferenciación

fúngica en la interacción del hongo entomopatógeno
Paecilomyces fumosoroseuslmosq u ita blanca
TESIS
Que para obtener el grado de

Doctor en Ciencias Biológicas
Presenta
M. en C. Maña Judith Castellanos Moguel
Co-Directoras:
Dra. Teresa Mier González
Dra. Concepción Torieflo Nájera
Asesora:
Dra. María del Rocío Reyes Montes
México D.F.
Marzo, 2006
Ji! ffiiLCÜ CS DE
ARCHIVO J-flSTO.icí,
El Doctorado en Ciencias Biológicas de la Universidad Autónoma Metropolitana
pertenece al Padrón de Posgrados de Excelencia de CONACYT y además cuenta
con apoyo del mismo Consejo, con el convenio PFP-20-93

El jurado designado por la División de Ciencias Biológicas y de la Salud de las
Unidades Iztapalapa y Xochimilco aprobó la tesis que presentó
M. en G. Maria Judith Uastetlanos Moguel
MIEMBROS DEL JURADO
CODIRECTORAS: DRA. TERESA FRANCISCA MIER
DRA. CONCEPCIÓN TORIELLO NÁJERA
ASESORA DRA. MARÍA DEL ROCiO REYES MONTES
SINODALES DRA. LUCIA TAYLOR DA CUNHA E MELL
DR. ARMANDO PÉREZ TORRES -- ..

AGRADECIMIENTOS
A:
Dra. Teresa Mier González.
Dra. Conchita Toriello Nájera.
Dra. María del Rocío Reyes Montes.
Dra. Lucia Taylor da Cunha e Mello.
Dr. Armando Perez Torres.
Dra. Conchita Agundis.
Dr. Edgar Centeno.
Dr. Rubén Román.
Dra. Salud Pérez.
Dra. Thalía Castro Barrera.
M. en C. Karina García Gutiérrez.
Biol. Armando Zepeda.
Biol. Margarita González Barajas.
A las siguientes instituciones;

Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Xochimilco.
Universidad Nacional Autónoma de México.
CONACYT, Megaproyecto grupa¡ G31451 B, beca otorgada.
Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria, Dirección
General de Sanidad Vegetal, Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo
Rural, Pesca y Alimentación.
A los siguientes laboratorios y su personal:

Laboratorio de Micología, UAM-X.
Laboratorio de Micología Básica, Facultad de Medicina, UNAM.
Laboratorio 6 del Departamento de Bioquímica de la Facultad de Medicina, UNAM.
A la familia Castellanos.
A todas las personas que apoyaron para la realización de esta tesis.
Resumen
ntre Los factores de patogenicidad de los aislados fúngicos que atacan insectos, se
encuentran la actividad de enzimas, como proteasas y quitinasas, producidas cor,
propágulos fúngicos conocidos como blastosporas
En el presente trabajo se comprobó experimentalmente la actividad de prcteasas
totales, una proteasa tipo subtilisina (Pri) y una tipo tripsina (Pr2), la actividad de
quitinasas en tres aislados (EH-50613, EH-50313 y EH-52013) de Paecilomyces
fumosoroseus de México. También se observó la transición conidio-blastospora in
vitro en un medio de cultivo con varias fuentes de carbono y de nitrógeno (medio H),
y en un medio sintético con quitina coloidal como única fuente de carbono y de
nitrógeno. Otro parámetro observado fue la virulencia en mosquita blanca
(Trialeurodes vaporariorum) de los tres aislados, expresada a través del índice de
crecimiento y desarrollo fúngico (ICDF).
Con base en los resultados obtenidos, se seleccionaron los aislados EH-50613 (alta
virulencia y rápida colonización en la ninfa) y EH-52013 (baja virulencia y lenta
colonización de la ninfa) para infectar ninfas de mosquita blanca y dar seguimiento al
desarrollo del hongo con microscopia electrónica de barrido (MEB). Finalmente, se
realizó un estudio inmunocitoquímico por microscopía electrónica de transmisión
(MET), durante las 6 primeras horas de la infección de la mosquita blanca con el
aislado mas virulento (EH-50613).
De acuerdo con los resultados obtenidos, el aislado EH-50613 produjo más
rápidamente, la mayor cantidad de proteasas totales, PrI (745.7 UPr1/mi a las 120
h), Pr2 (251.3 UPr2!mI a las 216 h. con respecto a aislado EH-520/3 que produjo
347.3 UPr1/mi a las 216 h y 208 UPr2/ml a las 240 h del cultivo. El aisaldo EH-5031
presentó una actividad intermedia de proteasas, con 496.7 UPrI/mI a las 312 h, y
200 UPr2/ml a las 48 h. La actividad de quitinasas, en cambio, fue más alta para EH-
52013 (81 UQ/ml), comparada con EH-50613 (76 UQ/ml) y EH-50313 (61 UQ/ml). La
máxima actividad de qutinasas se observó a las 312 h de cultivo en los tres casos.
Asimismo, EH-50613 presentó una transformación dimórfica mas rápida, con respecto
a los otros dos aislados y se observó una rápida penetración al insecto, tanto
mediante la determinación del ICDF (realizado con los tres aislados) como por MEB
(realizado con EH-50613 y E1-1-52013), ya que a las 18 h, EH-50613 ya había
penetrado al hospedante, emergido nuevamente y producido conidios, mientras que
EH-52013 apenas estaba penetrando al insecto, hecho que coincide con las
observaciones obtenidas al aplicar el ICDF. Las observaciones de MET con el
aislado mas virulento (EH-50613) permitieron constatar que a las 6 h el hongo ya
había penetrado, y que se estaban produciendo quitinasas, aunque en muy baja
cantidad.
Los resultados experimentales mostraron evidencias de una aparente relación entre
Pri, velocidad del cambio dimórfico y la virulencia del hongo. Asimismo, este estudio
permitió hacer una primera descripción de la aparición de Pri y Pr2 en P.
fumosoroseus y la existencia de estructuras de infección como los apresorios en el
binomio P. fumosoroseuslmosqu ita blanca estudiado.

Abstract
Among virulence factors of entomopathogenic fungi, protease and chitinase activities
during blastospore production have been mentioned. This work describes
experimentally the total protease activity, a subtilisin-like protease (Pri) and a trypsin-
like protease (Pr2) and the chitinase activity of three Paecílomyces fumosoroseus
isolates (EH-50613, EH-50313 and EH-52013) from Mexico.
Conidia-blastospore transition is also described, in a rich culture media with severa
carbon-nitrogen sources (H media) and in a basa¡ media with chitin as sole carbon-
nitrogen source.
Virulence, expressed as the growth and developmental fungal index (GDFI) was also
measured in whitefly (Trialeurodes vaporariorum).
Results of these expenments, pointed out isolates EH-50616 (high virulence and fast
nymph colonization) and EH-52013 (10w virulence and slow nymph colonization) to
follow the GDFI by scanning electron microscopy (SEM). Finaily, an
immunocytochemical study by transmission electron microscopy (TEM) with the most
virulent isolate (EH-50613) was performed during the first 6 h of fungal infection.
Results shows EH-50613 as the isolate with a rapid high total protease production, as
well as Pri (745.7 UPr1/ml a 120 h) and Pr2 (251.3 UPr2/ml at 216 h), in contrast to
EH-52013 (347.3 UPr1/m1 at 216 h and 208 UPr2/ml at 240 h) and EH-50313 (496.7
UPr1/ml at 312 h and 200 UPr2 at 48 h). High chitinase activity was observedwith
EH-52013 (81 UQ/ml), in contrast to EH-50613 (76 UQ/ml) and EH-50313 (61 UQ/ml).
Higher activities were observed at 312 h in alI cases. Also, conidium dimorphism was
faster in EH-50613 isolate, when compared to the other two isolates, EH-20613
penetrated the insect within the first 18 h of incubation, observed by FGDI and SEM.
At this time (18 h) spores were produced. EH-52013 achieved penetration and
conidiation until 48 h.
EH-50613 TEM observations showed fungal penetration at 6 h of incubation. Low
chitinase production was also observed.
Experimental results showed an apparent relation among Pri production, dimorphic
change speed and virulence.
This study mentioned Pri and Pr2 in P. fumosoroseus for the first time and describes
infection structures that resembled appresioria in shape in the studied rejation
P. fumosoroseus/whitefly.
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ÍNDICE
Pág
Introducción 1
Marco Teórico 3
La mosquita blanca como insecto plaga 3
Ciclo de vida de la mosquita blanca 4
Uso de hongos entomopatógenos para el control de insectos 6
Mecanismos de acción de los hongos entomopatógenos 10
Reconocimiento y adhesión 12
Fuerza mecánica y formación de apresorios 17
Participación de las quitinasas y proteasas fúngicas en el mecanismo de 20
ataque a insectos
Toxinas 30
Dimorfismo fúngico 32
Justificación 35
Hipótesis 37
Objetivos 38
Objetivo general 38
Objetivos particulares 38
Metodología 40
Aislados fúngicos 40
Preparación y conteo de inóculo 40
Ensayos enzimáticos 41
Proteasas 41
Condiciones de cultivo 41
Determinación de la actividad de proteasas totales 41
Determinación de la actividad de proteasas tipo tripsina (Pri) y tipo 42
subtilisina (Pr2)
Quitinasas 43
Preparación y tinción del sustrato 43
Condiciones de cultivo 43
Determinación de la actividad de quitinasas 44
Actividad específica de proteasas y quitinasas 44
Dimorfismo fúngico 45
Cinética de la transición conidio-blastospora in vitro 45
Determinación de virulencia 46
Insectos 46
Determinación del índice de crecimiento y desarrollo fúngico 46
Pruebas de infección in vivo para microscopía electrónica 47
Inmuno-oro ultraestructural con anticuerpo biotinilado 48
Técnicas de microscopía electrónica de transmisión (MET) y de barrido 50
(MEB)
Análisis estadístico 51
Resultados 52
Estudios enzimáticos 52
Proteasas totales 52
Pág.
Estandarización de condiciones para la determinación de la actividad de 55
proteasas tipo subtilisina (Pri) y tipo tripsina (Pr2)
Determinación de la actividad de Pri y Pr2 55
Producción de quitinasas en cultivo sumergido 60
Cinética de la transición conidio-blastospora 63
Producción de propágulos en medio H 63
Producción de propágulos en medio sintético adicionado con quitina 70
coloidal
Pruebas de virulencia 78
Determinación del índice de crecimiento y desarrollo fúngico 78
Microscopía electrónica de barrido (MEB) 85
Microscopía electrónica de transmisión (MET) 95
Discusión 99
Conclusiones 119
Bibliografía 121
Artículo aceptado para su publicación 145
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura Pág
1. Ciclo de vida de la mosquita blanca 5
2. Mecanismo general de patogenicidad de los microorganismos 8
3. Modelo teórico de penetración de los hongos entomopatógenos. 11
4. Actividad volumétrica de proteasas de los aislados EH-50613, EH- 53
50313 y EH-52013 de P. fumosoroseus determinada por el método de la
azocase ma.
5. Actividad específica de proteasas (expresada como UP/L]g de 54
proteína total en el sobrenadante) de los aislados EH-50613, EH-50313
y EH-52013 de P. fumosoroseus.
6. Actividad volumétrica de proteasas tipo subtilisina Pri (determinada 58
contra el sustrato Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-Na) de los aislados EH-50613,
EH-50313 y EH-52013 de P. fumosoroseus.
7. Actividad específica de proteasas tipo subtilisina Pri (determinada 58
contra el sustrato Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-Na y expresada como UPrI/L]g
de proteína total en el sobrenadante del cultivo) de los aislados EH-
50613, EH-50313 y EH-52013 de P. fumosoroseus.
8. Actividad volumétrica de proteasas tipo tripsina Pr2 (determinada 59
contra el sustrato Bz-Phe-Va)-Arg-pNa) de los aislados EH-50613, EH-
50313 y EH-52013 de P. fumosoroseus.
9. Actividad específica de proteasas tipo tripsina Pr2 (determinada 60
contra el sustrato Bz-Phe-Val-Arg-pNa y expresada como UPrI /Llg de
proteína total en el sobrenadante del cultivo) de los aislados E1-11-50613,
EH-50313 y EH-52013 de P. fumosoroseus.
10. Actividad volumétrica de quitinasas determinada con azul brillante 61
de remazol 1 de los aislados EH-506/3. EH-50313 y EH-52013 de P.
fumosoroseus.
11. Actividad específica de quitinasas (determinada contra quitina 61
coloidal teñida con azul brillante de remazol y expresada como UQ/L]g
de proteína total en el sobrenadante del cultivo) de los aislados EH-
50613, EH-50313 y EH-52013 de P. fumosoroseus.
12. Cinética de la transición conidio-blastospora del aislado EH-50613 67
en medio H con caseína al 1%.
14. Cinética del a transición conidio-blastospora del aislado EH-52013 69
en medio sintético con quitina coloidal al 1%.
en medio sintético con quitina coloidal al 1%.
en medio sintético con quitina coloidal al 1 %.
Figura Pág.
18. Esquema general de la transición de conidio a blastospora de 77
aislados de P. fumosoroseus de México.
19. Ninfa testigo en cuarto estadio 80
20. Ninfas de Tnaleurodes vaporariorum y conidios de Paediomyces 81
fumosoroseus a las O h de incubación.
21. Ninfas de Tnaleurodes vaporanorum a las 12 h de incubación con 81
tres aislados de Paeci!omyces fumosoroseus.
22. Ninfas de Tnaleurodes vaporariorum a las 18 h de incubación con 82
tres aislados de Paeciiomyces fumosoroseus
23. Ninfas de Trialeurodes vaporariorum a las 24 h de incubación con 82
tres aislados de Paecilomyces fumosoroseus.

tres aislados de Paeciiomyces fumosoroseus.
26. Ninfas de Trialeurodes vaporanorum a las 60 h de incubación con 84
27. Ninfas de Trialeurodes vaporariorum a las 72 h de incubación con 84
28. Aspecto de las ninfas a las 96 h de incubación con los tres aislados 85
29. Ninfa testigo de Tnaleurodes vaporariorum sin inocular 88
30. Conidios de EH-50613 a O h de incubación sobre la zona del raquis 88
31. Conidios de EH-50613 a O h de incubación 89
32. Conidios de EH-52013 a O h de incubación 89
33. Conidios de EH-50613 a las 6 h de incubación 89
34. Conidios de EH-52013 a las 6 h de incubación. 90
35. Daño cuticular provocado por EH-52013 a las 6 h de incubación. 90
36. Daño cuticular provocado por EH-50613 a las 6 h de incubación. 91
37. Estructura de EH-52013 que semeja un apresorio a las 12 h de 91
incubación.
38. Hifa de EH-52013 dirigiéndose hacia un hueco de la cutícula a las 92
12 h de incubación.
39. Matriz mucilaginosa que cubre a hifas de EH-52013 a fas 12 h de 92
incubación
40. Crecimiento micelial de EH-50613 a las 18 h de incubación. 93
41, Hifas de EH-50613 a las 18 de incubación 93
42. Hifas de EH-50613 penetrando directamente la cutícula a las 24 h 93
de incubación
43. Crecimiento de EH-50613 a traves del orificio vasifornie a las 24 h 94
de incubación.
44. Crecimiento de EH-52013 a traves del orificio vasiforme a las 24 h 94
de incubación.
45. Crecimiento de EH-52013 en la superficie de la ninfa a las 24 h de 94
incubación.
Figura Pág.
46. EH-50613 creciendo en la superficie de la ninfa a 48 h de 95
incubación.
47. Penetración de EH-50613 a las 6 h de incubación 96
48. EH-50613 penetrando a la ninfa a las 6 h. 96
49. Corte transversal de las estructuras fúngicas de EH-50613 97
penetrando a ninfa de mosquita blanca.
50. Hifa de EH-50613 penetrando la cutícula de T. vaporariorum 97
51. Aspecto de las hifas de EH-50613 penetrando la mosquita blanca a 98
las 6 h de incubación.
INTRODUCCIÓN
Entre las diferentes causas de la contaminación de los ecosistemas se
encuentra el uso inadecuado de plaguicidas químicos, que originan severos daños
sobre los humanos y el ambiente. Entre las plagas más difíciles de combatir están los
insectos, que son considerados como tal cuando han rebasado su hábitat natural, se
encuentran en una situación en la que prácticamente no tienen enemigos naturales, y
si existen las condiciones ambientales adecuadas, su población se incrementa
rápidamente. Uno de tos principales problemas que presenta el control de insectos
por medios químicos, es la adquisición de resistencia, por lo que su uso frecuente
resulta ineficaz y con un fuerte impacto ambiental negativo. Por tal razón, hay una
demanda continua de métodos alternativos para el control de plagas de insectos.
Uno de estos métodos es la utilización de biorreguladores naturales de tales
insectos, que regulan poblaciones, ofrecen la posibilidad de ser utilizados para un
control selectivo, y dan tanto seguridad humana como ambiental. Entre los
organismos susceptibles a ser utilizados para el control biológico, se encuentran los
hongos microscópicos (Femández-Tavizón, 1980; Ferron et al., 1991; Wraight of al.,
2000).
Para poder utilizar de manera eficiente hongos microscópicos para el control
de plagas agrícolas, es necesario conocer los factores de patogenicidad tales como
la actividad de enzimas como proteasas y quitinasas, producidas por propágulos
fúngicos como las blastosporas, de la misma manera, es necesario conocer la
virulencia del hongo frente al insecto blanco.
1
El presente trabajo se planteé para comprobar experimentalmente
características asociadas a la virulencia no descritas previamente para P.

fumosoroseus de México, como son la actividad de proteasas totales, una
proteasa tipo subtilisina (Pri) y una tipo tripsina (Pr2), así como la actividad de
quitinasas en tres aislados. También se observó la transición conidio-blastospora

in vitro en medios de cultivo con vanas fuentes de carbono y nitrógeno, como son
la caseína y la quitina coloidal. Otro parámetro observado fue la virulencia en

mosquita blanca (Trialeurodes vaporanorum) de los tres aislados expresada a
través del índice de crecimiento y desarrollo fúngico. Se siguió el desarrollo del
hongo también por microscopia electrónica de barrido y de transmisión.
2
MARCO TEÓRICO
La mosquita blanca como insecto plaga
La mosquita blanca Tnaleumdes vaporarion.jm (Homoptera: Aleyrodidae) es
una plaga polifaga de gran importancia en nuestro país, que ataca hortalizas, plantas
ornamentales de invernadero y plantas silvestres, ocasionando grandes pérdidas
económicas, pues se calcula que anualmente daña 700,000 hectáreas de cultivos.
Actualmente existen vanos métodos de control para la mosquita blanca, los
cuales incluyen el uso de insecticidas químicos de diversos tipos, como productos
sistémicos, por ejemplo el dimetoato, fosfamidon y oxidemetonmetil (Sánchez-Potes,
1990), los cuales, a pesar de ser altamente tóxicos, tener alta persistencia en el
ambiente, ser bioacumulables y estar prohibidos por organismos internacionales
como la Agencia de Protección al Ambiente (EPA), continúan siendo utilizados en
nuestro país por disminuir rápidamente las poblaciones de mosquita blanca y evitar
así, el daño al cultivo (Greer, 2000; Mier et al., 1999; Sugavanam y Tianjian, 1998;
Toriello 2001). Otros químicos autorizados por la EPA para el control de la mosquita
blanca, son los piretroides (derivados de plantas), carbamatos, jabones insecticidas,

aceites y reguladores del crecimiento de los insectos (Greer, 2000).
Uno de los problemas que presenta el control de esta plaga por medios
químicos, además del daño al hombre y al ambiente, es que el insecto adquiere
rápidamente resistencia a los plaguicidas, por lo que existe una demanda continua
de métodos para el control de dicho organismo.
3
En la búsqueda de alternativas menos dañinas para el ambiente y el ser
humano, se han utilizado el control biológico y los insecticidas microbianos con
buenos resultados, ya que las plagas no desarrollan resistencia a estos métodos,

como sucede con los insecticidas químicos (Butt et al., 1998; Greer, 2000; Mesquita
y Lacey, 2001; Sugavanam y Tianjian, 1998).
Ciclo de vida de Ja mosquita blanca
La mosquita blanca es un insecto chupador que se localiza en el envés de las
hojas de la planta hospedante. La hembra oviposita los huevecillos en posición
vertical. Cuando están recién ovipositados son de color verde pálido y van
tomándose castaño oscuro (Figura 1); miden aproximadamente 0.186 mm de largo y
0.089 mm de ancho, y el tiempo de incubación varía de 5 a 11 días, dependiendo de
las condiciones ambientales. Pasado ese tiempo, el huevecillo eclosiona y aparecen
las ninfas de primer estadio, las cuales son ovales, aplanadas, móviles, con patas y
antenas bien desarrolladas, y miden 0.308 mm x 0.155 mm. El primer estadio dura
cinco días antes de mudar, al final de la muda, la ninfa introduce su estilete en la hoja
y se queda fija succionando la savia de la planta (Byme y Bellows, 1991).
El siguiente estadio, dos, dura de dos a cuatro días durante el cual la ninfa
mide 0.486 x 0.307 mm; el estadio tres dura de 4-6 días y la ninfa mide 0.696 x 0.458
mm. En ambos estadios los insectos tienen forma de escama aplanada, son
transparentes y las patas y antenas ya no son funcionales. El último estadio antes de
pasar a adulto es el cuatro, en el que las ninfas miden 0.805 x 0.302 mm, y es el más
corto, ya que dura de 6 a 10 h. Se divide en tres subestadjos, que se distinguen por
4
su forma. En el primero, la ninfa es aplanada y de color blanco opaco o translúcido;
en el segundo, la ninfa tiene una apariencia más engrosada, es opaca y está
recubierta por una cera; el tercero es muy similar al anterior; excepto que los ojos
rojos del adulto son claramente visibles y el cuerpo se incrementa tomando un color
amarillo. Finalmente emergen los adultos, que miden en promedio 0.933 x 0.270 mm.
Los machos tienen una longevidad de ocho semanas, mientras que las hembras
once. Presentan de 11 a 12 generaciones al año, y en cautiverio, una hembra puede
depositar hasta 300 huevecillos en toda su vida (Byrne y Bellows, 1991).
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Fotos digitales: David Basilio y Noé Robles

Figura 1. Ciclo de vida de la mosquita blanca: a) adulto; b) huevecillos; c) ninfa uno; d) ninfa dos; e)
ninfa tres, 9 ninfa cuatro, subestadio uno. Barra: 0.3 mm.
Uso de hongos entomopatógenos para el control de Insectos
Un método de control de la mosquita blanca y otras plagas insectiles, es la
utilización de biorreguladores naturales como los hongos, ya que el mecanismo de
regulación poblacional de plagas ofrece la posibilidad de ser utilizado para un control
selectivo y seguro (Mier et al., 1991). Miembros representativos de todos los grupos
fúngicos mayores tienen los mecanismos requeridos para la infección y el desarrollo
dentro de los invertebrados (Boucias y Pendland, 1991). Algunos de estos hongos
tienen espectros restringidos de hospedantes, mientras que otras especies tienen un
espectro amplio, con aislados individuales más específicos (Clarkson y Chamley,
1996). Uno de estos hongos es Paecilomyces fumosomseus (Wize) Brown y Smith,
que ha sido reportado como un regulador efectivo para el control de la mosquita
blanca (Mesquita etal., 1996; Vida¡ etal., 1996; Vida¡ etal., 1998).
Los patógenos fúngicos tienen mecanismos de infección que les permiten
colonizar al hospedante y obtener así nutrimentos necesarios para su metabolismo y
un ambiente donde el microorganismo puede obtener ciertos beneficios que
promueven su sobrevivencia, reproducción y transporte. De la misma manera, el
hongo tiene ciertos factores que le permiten neutralizar la respuesta inmune y
competir con la microflora del hospedante, rechazar los tejidos que afectarían su
eficacia como patógeno, así como resistir los inhibidores de enzimas presentes en la
hemolinfa de tos insectos (Figura 2) (Eguchi y Shomoto, 1985; Eguchi et al., 1993;
Kanost, 1999; Askary, et al., 1999; Casadevall et al., 2003). Otro factor que
determina el éxito de una invasión fúngica es la virulencia, que es una característica
microbiana expresada sólo en un hospedante susceptible y que de acuerdo con

Lipsitch et al. (1996) puede definirse como la reducción de! éxito reproductivo del
hospedante; ya que a menudo está asociada con la trasmisión del hongo que
produce la muerte de los organismos infectados (Khachatourians, 1992). Los
determinantes de virulencia son relativamente fáciles de definir cuando se habla de
patógenos obligados, ya que se expresan en el hospedante y contribuyen a la
iniciación o progresión de la enfermedad en un sitio anatómico dado (Haynes, 2001).
En la naturaleza, además de la virulencia, el éxito de un micopatógeno estará
determinado por su capacidad de producir y repartir propágulos infecciosos a
sistemas de hospedantes susceptibles. Se consideran como tales a individuos que
han sido expuestos a una gran dosis del patógeno o para quienes los hongos son
inmunológicamente nuevos (van Burik y Magee 2001).
Para que una epizootia pueda desencadenarse, debe existir una relación entre
el hospedante, el patógeno y el ambiente, si estos tres factores están combinados
adecuadamente, entonces aparecerá la enfermedad (Madigan et al., 2000). Muchos
hongos patógenos tienen un nicho en el ambiente, a menudo como saprobios en
suelos o en la vegetación (Borges-Walmsley et aL,2002). Aparentemente adquieren y
mantienen su capacidad de ser virulentos en animales independientemente del
requerimiento de un hospedante. La patogenicidad de los hongos ha resultado de la
evolución de un mecanismo que permite la transición de una fase saprobia a otra
parásita y que los adapta a su desarrollo dentro del hospedante (Knogge, 1998).
7
Exposición aí patógeno
1
di-Tencia la superñci e
A—
delhcpJant
Invasión a través del

legtr,ento
Colonización y crecimiento
(Producción de factores de virulencia)
lnvasntdad
Toxicidad
Enfermedad
Figura 2. Mecanismo general de patogenicidad de los microorganismos (Modificado de Madigan etal.,

2000).
Según Casadevail et al. (2003), los mecanismos de un microorganismo para
infectar al hospedante y la capacidad de usar dichos mecanismos para poder vivir en
el suelo sin necesidad de infectar un animal, es la virulencia preformada, término
usado para setalar el hecho de que esos microorganismos son recuperados del
ambiente con la capacidad de causar enfermedades y es posible distinguir esta
virulencia de aquélla seleccionada a partir de la dependencia o una asociación muy
cercana con el hospedante. La virulencia, puede considerarse como multifactorial
(Latgé, 2001), y los entomopatógenos pueden conservar la capacidad de infectar a
los insectos aún después de estar en cultivo ir, vitro durante vanas generaciones
(Brownbridge et al., 2001; Vandenberg y Cantone, 2004).
8
Los determinantes de virulencia son relativamente fáciles de definir cuando se
habla de patógenos obligados, ya que se encuentran en los genes expresados
durante las reacciones del metabolismo primario; para codificar un determinante de
virulencia, el gen de interés debe ser expresado en el hospedante y contribuir a la
iniciación o progresión de la enfermedad en un sitio anatómico dado (Haynes, 2001).
Hay vanas clases amplias de genes de virulencia, algunos podrían codificar
para receptores que detectan directa o indirectamente, la presencia del hospedante.
La activación de tales receptores podría iniciar una vía de transducción de señales
que resulte en la inducción de genes de virulencia general. Otros genes pueden
producir factores que inactivan las defensas del hospedante o para sintetizar toxinas
que son requeridas para la enfermedad; también otros genes de virulencia pueden
codificar para enzimas que permiten que el hongo pase la barrera del hospedante
(St. Leger, 1995).
En el caso de los entomopatógenos, Metarhizium anisop!iae es un agente de
control bien caracterizado para un amplio espectro de plagas, incluyendo insectos y
ácaros. Para identificar los genes involucrados en el proceso de infección, se han
hecho análisis de representación diferencial, se identificaron 34 secuencias y 14
Expressed sequence tag (EST) con ortólogos conocidos, casi todas las secuencias
identificadas mostraron una similitud significativa a otros genes fúngicos (Freimoser

et al., 2003), por lo que es probable que sean comunes a las otras especies de
hongos patógenos de insectos (Dutra et al., 2004).

Mecanismos de acción de los hongos entomopatógenos
El mecanismo básico de infección de los hongos entomopatógenos está
caracterizado por la penetración directa del integumento. Esta se inicia con la
adherencia de la unidad infectiva, generalmente un conidio a la cutícula del insecto
(Figura 3). El éxito de una infección fúngica radica en gran parte en esta primera
fase. La función principal de la adherencia es el anclaje del propágulo al insecto, pero
también puede ser requerida para el reconocimiento químico y topográfico (Sosa-
Gómez et al., 1997) para encontrar un microambiente adecuado para la penetración
(Fernández et al., 2001; Tucker y Talbot, 2001; Jeffs et al., 1999). Posteriormente, el
conidio germina y el proceso de penetración requiere de una combinación de fuerza
mecánica y degradación enzimática de Ja cutícula. Dependiendo de la especie del
hongo, se forma un tubo de germinación que penetra directamente, o bien se forman
los apresorios, que pueden tener diferentes formas, y se han identificado como
órganos específicos que preparan la superficie del hospedante para la invasión,
usualmente se unen a éste al secretar una goma muy potente, y al desarrollar una
clavija de penetración en su base, la fuerza es ejercida verticalmente y puede ser
dirigida eficientemente a la cutícula (Bastrneyer et al., 2002) (Figura 3).
Después de pasar la epicutícula, las estructuras penetrantes a menudo se
expanden lateralmente en las capas externas de Ja procuticula, produciendo placas
de penetración; éstas expansiones pueden causar fracturas que favorecen la
penetración. El paso del hongo a través de la procutícula puede ser más o menos
vertical, o involucrar una extensión lateral del micelio; posteriormente, las hifas
alcanzan la epidermis. Una vez en el hemocefe, el micelio se ramifica a través del
10
hospedante (Figura 3), probablemente formando blastosporas (Boucias y Pendland,
1991; Chamley y St. Leger, 1991; Askary et al., 1999; Goettel e Inglis, 1997). La
penetración, aunque de manera menos frecuente, puede ocurrir también por heridas,
a través de los órganos de los sentidos o por el tracto digestivo (Boucias y Pendland,
1991; Charnley y St. Leger, 1991; Askary et al., 1999; Goettel e Inglis, 1997). La
muerte del hospedante a menudo se debe a una acción combinada de toxinas
fúngicas, obstrucción física de la circulación sanguínea, disminución en el aporte de
nutrimentos e invasión de órganos. Después de la muerte del hospedante, las hifas
usualmente emergen del cadáver y bajo condiciones apropiadas de temperatura y
humedad, producen conidios en el exterior del hospedante (Boucias y Pendland,
1991; Chamley y St. Leger, 1991; Askary etal., 1999; Goettel e Inglis, 1997).
con id ¡o
q'
eo idermis procuticula
hemolinfa blastosnora
Figura 3. Modelo teórico de penetración de los hongos entomopatógenos. 1. apresosio. 2. clavija de
penetración. 3. clavija de penetración. Modificado de Chamley y St. Leger (1991).
Los principales factores de virulencia conocidos de los hongos comprenden las
proteínas de reconocimiento y adhesión, las características estructurales de los
11
conidios que le confieren resistencia a los mecanismos antifúngicos del hospedante,
así como aquellas proteínas que pueden promover el crecimiento micelial (Latgé,
2001); la fuerza mecánica, toxinas, melaninas y dimorfismo (Boucias y Pendland,
1991). Estos mecanismos han sido estudiados exhaustivamente en patógenos de
plantas y de mamíferos, sin embargo, en hongos entomopatógenos, algunos de
éstos son poco conocidos o no se han reportado, sin embargo, es probable que
existan mecanismos análogos, debido a la convergencia entre las estrategias
fúngicas que les confieren capacidad infectiva para la colonización de hospedantes,
aunque los genes y sus productos, que determinan resistencia o susceptibilidad de
ambos lados de la relación hospedante-parásito no estén del todo entendidos
(Casadevail etal., 2003; St. Leger et al., 1997).
Por otro lado, existen factores de virulencia como las enzimas, la producción
de conidios y su rápida germinación que han sido estudiados en los patógenos de
insectos con el objetivo de contar con agentes microbianos más efectivos para el
control de plagas de importancia agrícola (Jackson et al., 1985; Jackson et al., 1997;
Altre y Vandenberg, 2001; Vega et al., 2003).
Reconocimiento y adhesión
La adherencia de las esporas a la superficie del hospedante es el primer paso
que tiene que dar un patógeno para establecer la enfermedad, y sirve principalmente
para anclar el propágulo al insecto. También puede ser requerida para el
reconocimiento químico y topográfico (Sosa-Gómez et al., 1997) para encontrar un
microambiente adecuado para la penetración (Fernández et al., 2001) del
12
hospedante que posibilite el desarrollo fúngico subsiguiente (Tucker y Talbot, 2001;
Jeffs ef al., 1999). El fenómeno de la adhesión a los hospedantes, se ha estudiado
ampliamente en hongos fitopatógenos, patógenos de mamíferos y de menor manera
en algunos entomopatógenos, como Entomophaga maimaga, Paecilomyces,
To!ypocladium, Metarhizium y Verticillium (Jeffs et aL, 1999). La interacción conidio- -
hospedante podría involucrar un complejo de mecanismos de reconocimiento
específicos (glicoproteínas, interacciones ligando-receptor, por ejemplo lectinas) y no
específicos (electrostáticos o hidrofóbicos, fuerzas de Van de Waals) (Cotter y
Kavanagh, 2000; Doyle, 2000). En los hongos patógenos de invertebrados terrestres,
los componentes responsables de la interacción espora-cutícula son considerados
como preexistentes. Boucias ef al. (1988), demostraron que preparaciones
homogéneas de conidios de Nomuraea rileyi, Beauveria bassiana y M. anisopllae se
unían de manera no específica a la cutícula de los insectos, siempre y cuando no
estuviera expuesta la endocutícula. Aunque la adhesión a superficies de los
organismos es común entre las especies fúngicas, hay una variación significativa en
la composición aparente de los materiales con los que el hongo se fija al hospedante
y en las pistas ambientales que inducen el desarrollo de la fijación de las esporas.
Las adhesinas de los hongos fitopatógenos son típicamente glicoproteínas insolubles
en agua, aunque se han detectado en el material de adhesión lípidos y polisacáridos
que claramente contribuyen a la fijación. Sin embargo, es una composición muy
heterogénea y no hay evidencia de un compuesto de adhesión o un mecanismo de

fijación común a todos esos hongos (Knogge, 1998, Hajeck y Eastbum, 2003).
13
Los mecanismos de reconocimiento, probablemente se encuentran situados en la
superficie de las esporas. Estudios en la pared celular de los hongos han revelado
que muchas proteínas localizadas en ese sitio no tienen un papel estructural
exclusivo. Algunas proteínas secretadas juegan un papel importante en determinar
las propiedades de adhesión de los hongos, mientras que otras, incluyendo las
hidrofobirias, que son proteínas pequeñas con ocho residuos de cisteína
característicamente espaciados a lo largo de la secuencia de aminoácidos, pueden
ser requeridas para el crecimiento fúngico a través de diversos ambientes y durante
las transiciones del desarrollo (Tucker y Talbot, 2001). Kamp y Bidochka (2002)
encontraron que cada aislado tiene un perfil proteico único para cada condición de
cultivo. Jeffs of al. (1999) también reportaron diferentes proteínas (hidrofobinas) en
diferentes especies fúngicas, dependiendo de la composición de los medios de
cultivo de donde fueron obtenidas.
Otro factor determinante en la adherencia es el tipo de conidio; los

entomopatógenos, tienen dos tipos, ya sea hidrofóbicos o hidrofílicos (Wolken of al.,
2003). Los conidios hidrofóbicos (secos) tienen una capa externa de microfibrillas
muy cercanas (rodlets), esta capa parece ser única del estado conidial y no ha sido
detectada en las células vegetativas. El tamaño relativo y el arreglo de dichas
microfibrillas puede variar de acuerdo con la especie, aunque las condiciones de
cultivo también pueden influenciar dicha capa. Tratamientos fuertes ya sean físicos o
químicos son requeridos para suspender esos conidios; se cree que la resistencia de
esos conidios puede ser mayor por la presencia de pigmentos, así como por la edad
M conidio, ya que conidios de colonias jóvenes de P. fumosomseus y B. bassiana
14
son fácilmente suspendidos en agua destilada por agitación con un vórtex. Es
probable que los arreglos en las microfibrillas puedan resultar por el envejecimiento
M conidio y simplemente reflejan un proceso de desecación o endurecimiento. Sin
embargo se ha intentado degradar esta capa, pero es insoluble a detergentes,
proteasas, quitinasas, urea y mercaptoetanol entre otros. La capa de microfibrillas
está formada de residuos de glucosa, manano y N-acetilglucosamina (Boucias y
Pendland, 1991). Boucias et al. (1988), demostraron que los componentes
responsables de la interacción hidrofóbica para la adherencia del conidio están
localizados a lo largo de la pared celular de los conidios que tienen microfibrillas. Por
otro lado, Holland et al. (2002) observaron que en los conidios de P. lilacinus, la capa
de microfibrillas es tolerante a la luz UV y otras fuentes de luz. Se ha demostrado con
Beauveria, Metamizium, Paecilomyces, Tolypoc!adium y Verticillium que la capa de
microfibnllas esta formada principalmente por hidrofobinas (Kamp y Bidochka, 2002),
y se ha encontrado un gen (ssgA) que codifica para dichas proteínas en M.
anisop!iae (St. Leger et al., 1992). La hidrofobicidad de la superficie del conidio varía
entre especies, e incluso cada aislado tienen un perfil proteico único, lo mismo que la
proporción de proteínas y carbohidratos presentes en los conidios (Jeffs, 1999; Kamp

y Bidochka 2002).
Los conidios hidrofílicos de Hirsutella thompsonii, V. Iecanii y Aschersonia
aloyrodis también poseen una capa mucosa que facilita la dispersión por fa lluvia y la
adhesión a los insectos hospedantes. Se ha propuesto que la capa mucosa asociada
con los conidios hidrofflicos podría actuar como un antidesecante, proteger a los
conidios contra los polifenoles tóxicos del hospedante, contener varias actividades
15
enzimáticas y actuar como material de fijación (Boucias y Pendland, 1991). En V.
lecanji se observó ultraestructuralmente la presencia de una capa mucilaginosa,
sobre la cutícula, que se extendió entre hifas y conidios adyacentes (Askary et al.,
1999). Probablemente dicha capa mucosa pueda tener un papel en la preparación de
la superficie del hospedarite para la penetración, ya que se ha demostrado que en
especies de fitopatógenos como Uromyces viviae-fabae, dicha capa forma un tapete
de adhesión junto con la superficie de la planta, en dicho tapete se encuentran
presentes enzimas hidrolíticas, que además podrían afectar la adhesión a las células
del hospedante y así podría ayudar al hongo a persistir en la superficie del
hospedante y penetrar en tejidos más profundos, como sucede con Candida a!bicans
(Hube, 1996). La presencia de tales proteínas en el material de adhesión proporciona
un medio para asegurar que el material proveniente de la ruptura de la cutícula esté
inmediatamente disponible como nutrimento para la parte más activa del hongo
(Tucker y Talbot, 2001; Cole et al., 1998). Se ha estudiado recientemente el nivel de
control transcripcional requerido para la liberación de las adhesinas y se ha
observado que es altamente variable, haciendo de la adhesión un proceso
metabólico aparentemente pasivo o activo, dependiendo de la especie. Existen
evidencias obtenidas con hongos fitopatógenos de que la adherencia muchas veces
está estimulada primero por señalización física mas que química. Sin embargo,
patógenos vegetales como Nectria haematococca y Colletotnchum graminicola,
necesitan sintetizar proteínas, principalmente adhesinas para que las esporas
puedan fijarse al hospedante, lo que involucra un gasto energético y respiración
(Tucker y Talbot, 2001). La adhesión de la espora influencia los eventos de
16
desarrollo subsecuentes manteniendo la espora en la proximidad de la superficie del
hospedante. La unión parece a menudo ser requerida para la transmisión de señales
rnorfogenéticas para la extensión del tubo germinal y el desarrollo de las estructuras
de infección (Tucker y Talbot, 2001; Kennedy, 1990).
Fuerza mecánica y formación de apresorios
Una vez que se ha adherido el conidio al hospedante, y que ha reconocido las
señales ambientales, se produce la germinación. Este proceso involucra un
metabolismo rápido de las fuentes de carbono, ya sean endógenas o exógenas,
sobre todo azúcares corno glucosa y glucosamina, aunque los detonadores de la
germinación, podrían variar de especie a especie e incluso entre cepas (James,

2001). Según Fargues et al. (1994), la germinación de los conidios tiene tres pasos:
pregerminación, hinchamiento y emergencia de uno o varios tubos germinales, y
estos, varían fuertemente dependiendo de las condiciones ambientales, ya que la
diferenciación vegetativa de un tubo germinal podría consistir en el crecimiento
micelial en forma de hifas, o la multiplicación celular por gemación, o llevar a la
formación de conidios por conidiación microciclica. En las hifas invasivas de los
hongos patógenos expuestos a una afta resistencia mecánica, la regulación de la
fuerza de la pared celular y el turgor podrían ayudar a ejercer la fuerza localizada y
resultar en un crecimiento invasivo más eficiente. Para tal fin, los hongos tienen una
vía de señalización para mantener la integridad de la pared celular. Otros factores
involucrados en la formación de los apresorios son la humectabilidad y/o la dureza
M sustrato. Esas características pueden ser de superficie, que son congruentes con
17
otros atributos del sustrato no aparentes y posiblemente más directamente
involucrados en una base en la cual la célula fúngica pueda crecer y responder con
el desarrollo de un apresono. Por ejemplo, podría ser que la dureza de la superficie
no fuese el único factor que actúe como una señal inductiva para la iniciación de los
apresonos. Las superficies duras más estudiadas (vidrio, plásticos poliméncos,
poliestireno, teflón, polipropileno, mylar, etc) (Apoga, et al., 2004; Howard, et al.,
1991; Xavier-Santos et al., 1999), tienen características inherentes adicionales, por
ejemplo, están cubiertas de una capa de carga (iones), generalmente no son
porosas, son firmes y no flexibles en escala microscópica (Apoga et al., 2004).
Los factores asociados con la producción de apresonos in vivo han sido
estudiados, incluyendo la hidrofobicidad, topografía y químicos en la superficie de los
hospedantes, ya que se ha observado que se producen en sitios específicos como
alrededor de las setas o en las membranas intersegmentales (Hajek et al., 2002).
La producción de apresorios se ha inducido en varios hongos, entre ellos E.

maimaga (Hajek et al., 2002), M. anisopliae (Clarkson y Chamley, 1996) y M.
flavoviride (Xavier-Santos et al., 1999) (=M. anisop!iae var. acndum, Driver), en
superficies duras e hidrofóbicas. La diferenciación es estimulada por bajos niveles de
compuestos nitrogenados complejos y en muchos aislados, esta sujeta a represión
catabólica por compuestos de carbono. Sin embargo, la formación de los apresorios
no es un prerrequisito universal para una infección exitosa y algunos hongos son
capaces de penetrar la cutícula del hospedante sin diferenciación morfológica. En
contraste con otros eventos, como la producción de blastosporas, la diferenciación
18
de los apresorios no siempre aparece, pero es una reacción específica al ambiente
(ARre y Vandenberg, 2001).
Después de la formación del apresorio, se ha descrito la aparición de placas
de penetración dentro de las 30 h siguientes a la inoculación de trips (Frankliniella
occidentalis) con M. anisop!iae (Vestegaard et al., 1999). Muchos hongos patógenos
de artrópodos secretan mucílago durante la formación del tubo germinal y la
formación de los apresorios, este mucílago a menudo se puede teñir con rojo de
rutenio, lo que indica la presencia de polisacáridos ácidos. El mucílago producido por
tubos germinales y apresorios probablemente tiene funciones similares al del mucus
preformado de los conidios hidrofílicos. El mucílago producido por los tubos
germinales penetrantes o por las células de los apresonos es higroscópico y puede
crear un ambiente favorable para las enzimas extracelulares liberadas por esas
estructuras (Boucias y Pendland, 1991). Se ha reconocido que las integrinas, que
son proteínas integradoras de la matriz extracelular y el citoesqueleto, desempeñan
un papel en la adherencia de proteínas en células de mamíferos, y como la adhesión,
crecimiento y diferenciación son estadios importantes en el desarrollo de los tubos
germinales fúngicos durante la fase de pre-penetración, es plausible que un
mecanismo similar para sentir el ambiente pueda operar en los hongos. La mayoría
de las integrinas reconocen varias proteínas de la matriz extracelular, y se ha
sugerido que en algunos hongos, los componentes proteicos de la matriz extracelular
podrían estar involucrados en el reconocimiento de señales (Tucker y Talbot, 2001).
19
Participación de las quitinasas y proteasas fúngicas en el mecanismo de
ataque a insectos
Los principales componentes de la cutícula de los insectos son las proteínas,
quitina y lípidos (Andersen, 1979), por lo que los entomopatógenos deben producir al
menos proteasas (Bidochka y Khachatourians, 1994; Samuels y Patterson, 1995),

quitinasas (Liu of al., 2003) y ¡¡pasas (Sosa-Gómez y Alves, 1983; Jackson of al.,
1985) para poder penetrar al hospedante. Las actividades aftas de proteasas y
quitinasas son características de las cepas infectivas y virulentas (Bertoldo-Vargas of

al., 2003; Barranco-Florido of al., 2002; Bidochka of al., 1999; Gupta et al., 1994).
Variaciones de virulencia para M. anisopliae fueron explicadas al observar que puede
haber diferencias entre la cantidad, tipo y carga de las enzimas, así como el grado de
endurecimiento de la cutícula del hospedante, dependiendo de la cercanía en tiempo
de la muda, lo que influye en la degradación cuticular del insecto por aislados de una
misma especie, y así las propiedades de las enzimas que degradan la cutícula
pueden no ser las óptimas en todos los hospedantes (Gillespie ot al., 1998).
La relación entre enzimas y virulencia también ha sido reportado en patógenos

de nemátodos (Huang ot al., 2004), y en este modelo, las enzimas han sido
involucradas en el proceso de infección como factor de virulencia.
Observaciones ultraestructurales sugieren que la degradación enzimática es
una manera importante de perforar las barreras cuticulares (Askary et al., 1999,
Goettel of al., 1989; St. Leger of al., 1986a; St. Leger of al., 1987b; St. Leger et al.,
1996a; St. Leger e! al., 1996b).
20
En estudios previos con 18 aislados de P. fumosoroseus de México, se
observaron cantidades variables de proteasa y quitinasa (Castellanos-Moguel et al.,
2001a) que sugieren una variabilidad intraespecífica muy marcada en este hongo.
Asimismo, pudo observarse una relación entre la cantidad de proteasa o quitinasa y
la virulencia (media como la concentración letal media CL 50) del aislado, siendo ésta
última muy alta para los aislados EH-50613 y EH-50313 y media para el aislado EH-
52013 (Castellanos-Moguel et aL, 2001b). Estos datos señalan la importancia de
conocer si la producción de proteasas y quitinasas in vivo esta asociada a la
virulencia. A este respecto, existen estudios uftraestructurales en insectos diferentes
a la mosquita blanca para M. anisopliae (St. Leger et al., 1996a), V. lecanii (Askari et
al., 1999) y B. bassiana (St. Leger et al., 1996b), en los cuales se señala la aparición
de proteasas y quitinasas alrededor de las hifas penetrantes y en la vecindad de las
estructuras fúngicas. Para P. fumosomseus solamente existen estudios
ultraestructurates encaminados a evaluar la rapidez de la penetración de las hifas en
larvas de lepidópteros.
Proteasas. Las enzimas consideradas como determinantes principales de la
patogenicidad han sido las proteasas, ya que se han detectado durante el curso de la
infección al insecto (Kucera, 1981), e inician la degradación cuticular de los insectos
y permiten que el hongo colonice al hospedante (St. Leger et al., 1996b); la especie
mas estudiada es M. anisopllae, y se han caracterizado los componentes del sistema
proteolítico de dicho hongo; este sistema está conformado por endoproteasas y
exoproteasas. También se han hecho estudios de relación de enzimas y virulencia, y
se han detectado aislados de M. anisop!iae que son deficientes de proteasas y tienen
21
actividades letales reducidas con respecto a la cepa original, en bioensayos con
Tenebno molitor (Wang et al., 2002).
Las endoproteasas son enzimas que rompen los enlaces en el medio de la
cadena peptídica, y en los entomopatógenos se han caracterizado serín proteasa del
tipo subtilisina (PrI) y tripsina (Pr2) y están presentes en M. anisopliae var.
anisopliae, M. anisop!iae var. acridum, V. lecanhi y es probable que se encuentren en
otros entomopatógenos tales como Beauvena spp. o Paecilomyces spp. (St. Leger,
1995; St. Leger et al., 1996a; St. Leger et al., 1996b; Bidochka, et al., 1999; Bidochka
y Melzer, 2000; Silva-Pinto, et al., 2002). Una proteasa de V. chlamydosponum
VCPI, está cercanamente relacionada, funcional y serológicamente a Prl (Segers et
al., 1995). Aunque de acuerdo con St. Leger et al. (1997); el número y tipo de
proteasas son hasta cierto punto dependientes de la cepa.
Las subtilisinas comprenden el mayor componente de las proteasas en los
hongos entomopatógenos, nematófagos y patógenos de humanos y se encuentran
en múltiples isoformas en un mismo aislado fúngico. El espectro de las isoformas de
las subtilisinas podrían habilitar a un patógeno facultativo, por ejemplo M. anisopliae,
para explotar un amplio espectro de sustratos y poder estar involucrado en el cambio
de una fase saprobia a una patogénica, constituyendo así, un factor de virulencia
preformada (Casadevail et al., 2003; Bidochka y Melzer, 2000), como las proteasas
aspárticas secretadas de C. albicans, las cuales están reguladas diferencialmente y
distintos miembros de una familia de proteasas, son expresados bajo una variedad
de condiciones de crecimiento en laboratorio y durante infecciones experimentales in
vivo e in vitro (Hube y Naglik, 2001). Las subtilisinas de M. anisopliae están
22
intrincadamente relacionadas a las capacidades de las cepas para penetrar,
colonizar y macerar los tejidos de los insectos hospedantes, y los hongos están bajo
presión evolutiva para responder a los hospedantes que podrían presentar cambios
para tener una barrera contra la infección (Bagga et al., 2004).
La proteasa Pri es una hidrolasa muy alcalina y posee una especificidad
primaria muy amplia por los aminoácidos con un grupo lateral hidrofóbico en el
segundo átomo de carbono (fenilalanina, metionina y alariina), pero también posee
una especificidad secundaria por los péptidos hidrofóbicos. Es una buena proteasa
general con actividad contra un espectro de proteínas (caseína, elastina, albúmina
sérica bovina, colágeno) y frente a la cutícula de los insectos (Braga of al., 1994).
Peptidasas análogas han sido encontradas en filtrados de cultivo de B. bassiana, V.
Iecanii, N. rileyi y A. a!eyrodis (Chamley y St Leger, 1991). PrI es una enzima
inducible, y está sujeta a nivel transcnpcional a un mecanismo de represión-
inducción por carbono y nitrógeno. Se ha identificado un gen, crrl, que muestra una
homología de secuencia significativa al gen represor de catabolitos de carbono (crea)
de Aspergillus nidulans (Screen et al., 1997).
La proteasa Pri ocurre como múltiples isoenzimas (Joshi etal., 1997) y se han
identificado a la fecha once genes que codifican para isoformas de Pri (PrIA- PrIJ,
Pri G-K) (Freimoser et al., 2003). Éstos fueron detectados en una base de datos de
EST, indicando que todos son expresados y presumiblemente funcionales. La
presencia de un número excepcionalmente grande de isoenzimas de subtilisina está
presumiblemente relacionado a la patogenicidad de M. anisopliao. Las únicas
funciones conocidas de las subtilisinas secretadas están relacionadas con la
23
obtención de nutrimentos a partir de la cutícula y la apertura de las barreras del
hospedante. La cantidad de enzimas producidas se incrementa enormemente
durante la penetración del insecto. La presión selectiva para la capacidad de producir
grandes cantidades de subtilisínas en poco tiempo puede ser suficiente para explicar
el mantenimiento de los múltiples genes de subtilisína en el genoma de M.
anisopliae. Las múltiples Pri, podrían, sin embargo, haberse separado para realizar
diferentes funciones, presumiblemente, diversas subtilisinas podrían Jugar diferentes
papeles en la patogénesis, incrementando la adaptabilidad y el espectro de
hospedantes o tener diferentes funciones en la sobreviviencia fuera del hospedante

(Bagga etal., 2004).
La proteasa Pr2 es una tripsina de M. anisopllae que se presenta como
múltiples isoenzimas (Cole et al., 1993), con gran actividad contra proteínas
cuticulares solubilizadas y caseína (St. Leger et al., 1987), pero poca actividad contra
proteínas cuticulares unidas covalentemente (insolubles), debido probablemente a
que no se adsorbe completamente a dichas proteínas. Se ha demostrado que las
isoformas son parcialmente homólogas, lo que indica que son productos de
diferentes genes, y los primeros cuatro aminoácidos terminales son idénticos a los de
las tripsinas animales. Esto es consistente con lo asumido de que las enzimas de la
familia de las tripsinas, quimiotripsinas y serín proteasas tiene un antecesor común
con una especificidad tnpsina por los residuos de arginina y Usina y que las enzimas
de M. anísopliae y probablemente de otros entomopatógenos, como V. !ecanhi, N.
nleyi y A. a/eymdis han retenido esta condición (St. Leger, 1995). Enzimas como Pr2
podrían estar involucradas en los mecanismos de control celular, catalizando
24
procesos proteolíticos específicos de activación e inactivación, y está aparentemente
regulada por el nitrógeno presente en el medio de cultivo (Paterson et a!, 1993). En
este contexto, la inhibición de Pr2 de M. anisopliae por tiosil-lisina-clorocetona
reprime selectivamente la formación de tubos germinales o estructuras de infección,
implicando un papel de Pr2 en el control de la diferenciación (Chamley y St. Leger,
1991).
La regulación de Pri y Pr2 no son idénticas, aunque ambas son producidas
rápidamente (<2 h) en cultivo por desrepresión de carbono y nitrógeno. En medio
mínimo, la albúmina sérica bovina, que es una proteína soluble reprime la producción
de Pri, mientras que permite la síntesis aumentada de Pr2, además mientras que el
nivel extracelular de Pri en medio mínimo excede el de Pr2, la reversa es dada por
las actividades endocelulares. Un papel endocelular para Pr2, por ejemplo es la
catálisis de la activación de procesos proteollticos específicos. Probablemente esté
menos sujeta que Pri a la represión por catabolitos. Los niveles extracelulares de
Pri y Pr2 aumentaron en cultivos suplementados con cutícula de insecto y otros
polímeros insolubles que fueron insuficientes para producir represión catabólica. La
adición de metabolitos mas fácilmente utilizables como la glucosa o la alanina,
reprimió la producción de proteasas extracelulares, lo que confirma su producción
constitutiva pero reprimible (Chamley y St. Leger, 1991). Según Shimizu etal. (1993),
el mecanismo de regulación de proteasas de B. bassiana es desencadenado por los
mismos componentes cuticulares, ya que las proteasas se producen en menor
cantidad, cuando al hidrolizar la cutícula del insecto dejan al descubierto la quitina de
las mismas; probablemente las diferentes actividades enzimáticas (altas y bajas)
25
reflejan la actividad conjunta de diferentes proteasas, algunas de las cuales pueden
estar apareciendo y desapareciendo conforme el hongo va degradando el sustrato

(St. Leger etal., 1987; Chul-Kang etal., 1998).
Así, la síntesis de Pri en las estructuras de infección (apresarlos) producidos
en superficies artificiales o durante el crecimiento en la cutícula del insecto es
anulado por la adición de nutrimentos fácilmente utilizables (Chamley y St. Leger,
1991). Se ha demostrado que Pri es la mayor proteína secretada cuando M.
anisopliae produce apresonos contra el poliestireno o in situ durante la penetración
de la cutícula de del hospedante (Manduca sexta). La síntesis durante la maduración
de los apresorios y la producción de las clavijas de penetración excede por mucho la
síntesis de otras proteínas (Charnley y St. Leger, 1991). Tal síntesis rápida de
proteasas es sólo posible en los tejidos del hospedante donde la concertación de
compuestos fácilmente metabolizables es baja, este es el caso con las cutículas de
los insectos como los componentes grandemente insolubles hasta que son liberados
por las enzimas degradadoras de cutícula, sin embargo, la represión podría operar si
la liberación de los productos de degradación de la cutícula excede los
requerimientos fúngicos. Esto fue confirmado por la adición de alanina al inóculo, lo
que resultó en un crecimiento extensivo en la cutícula del insecto pero reprimió la
penetración y la síntesis de Pri (Charnley y St. Leger, 1991). Así, el proceso
patogénico que involucra morfogénesis relacionada a la infección y producción de
enzimas ocurre sólo cuando es necesario para el patógeno establecer una relación
nutricional con el hospedante (Chamley y St. Leger, 1991). Se ha aislado el gen nrrl
(Screen et al., 1997) que regula la respuesta al nitrógeno en M. anisopliae, ya que la
26
Producción de Pri esta sujeta a la desrepresión por carbono y nitrógeno, y la
producción de PrIA está inducida específicamente por un componente cuticular no

identificado (Screen et al., 1997).
Quitinasas. Las otras enzimas consideradas como determinantes de
patogenicidad son las quitinasas, debido a que la cutícula del insecto está compuesta
de fibrillas de quitina cubiertas por proteína (Anderson, 1979). Al igual que con las
proteasas, los hongos tienen un sistema quitinolítico que les permite entrar al
hospedante. Las quitinasas pueden ser clasificadas en dos categorías mayores. La
primera comprende a las endoquitinasas, que cuales cortan la quitina al azar en
sitios internos, generando multimeros de N-acetilglucosamina (NAG) de bajo peso
molecular tales como la quitotetraosa, quitotnosa y el dímero diacetilquitobiosa. La
otra categoría son las exoquitinasas, que pueden ser divididas en dos subcategorías:
las quitobiosidasas, que catalizan la liberación progresiva de diacetilquitobiosa
comenzando en el extremo no reductor de la microfibnlla de quitina y las 1-4-0-N-
acetilglucosaminidasas que cortan los productos oligoméncos de las endoquitinasas
y quitobiosidasas generando monómeros de NAG (Cohen-Kupiec y Chet, 1998;

Baratto et al., 2003).
Se ha detectado actividad de quitinasa y exoquitinasa en bajos niveles en

conidios y conidios germinantes en B. bassíana, M. anisopliae y N. rileyi (Smith y
Grula, 1983; Coudron et al., 1984). La hidrólisis de la quitina cristalina dió sólo un
producto de reacción de bajo peso molecular dentro de las primeras 24 h contra N-
acetil-glucosarninidasa La ausencia de oligómeros intermediarios entre los productos
27
de degradación de la quitina probablemente significa que la NAG es liberada
directamente de la quitina insoluble. Ya sea debido a que la quitinasa tenga un
componente que actúa de manera externa sobre la molécula de quitina; o bien la
reacción procede de un mecanismo en cadena descrito para algunas otras
endopolisacaridasas. Esto involucra la unión al azar de la enzima seguido por la
liberación de monómeros o dímeros de los lados expuestos de la cadena, tal que una
sola macromolécula es degradada completamente antes de que una nueva sea
atacada. Tal mecanismo, especialmente si involucra la digestión simultánea de varias
cadenas, podría resultar en la degradación rápida de las fibrillas de quitina y en
adición producir monómeros par la nutrición y la inducción de síntesis posterior de
enzimas (Chamley y St. Leger, 1991).
Kawachi et al. (2001), encontraron dos quitinasas en cultivos de ¡sana
japonica con quitina coloidal, que compartían homologías con las encontradas para
M. anisopliao en un 66%, asimismo, a partir de cultivos de P. lilacinus, Khan et al.
(2003) y Khan et al. (2004), encontraron seis quitinasas con actividad nematicida.
Se han caracterizado al menos seis quitinasas diferentes de M. anisopliae,
pero sólo cuatro genes han sido identificados: chítl(Resi-Bogo et al., 1998), chi2,
chi3 y chil 1. Las seis quitinasas encontradas tienen un 66% de identidad con una
quitinasa de Tnchodenna harzianum. Una de dichas quitinasas (CHIT42) también
tiene similitud con una de A. nidulans, sin embargo, este último no es un
entomopatógeno y en este organismo la quitinasa es parte del sistema enzimático
que actúa en el crecimiento celular, tal que es posible que CHIT42 de M. anisopliae
actúe en el proceso de nutrición y crecimiento celular (Baratto et al., 2003).
28
Otra enzima importante es la N-acetilglucosami nid asa, cuya actividad ha sido
parcialmente purificada de filtrados de cultivo de M. anisopllae con quitina. La enzima
mostró actividad substancial contra p-nitrofenolacetilglucosamina, así como contra
quitobiosa, quitotriosa y quitotreosa, el mayor producto en cada caso fue N-
acetilglucosamina, mostrando que la enzima es una N-acetilglucosaminidasa real
mas bien que una quitobiasa. La enzima tuvo poca actividad contra quitina coloidal o
cristalina, su tamaño es similar al de otras enzimas de otros organismos (Charnley y
St. Leger, 1991).
También se encontró una enzima tipo quitosanasa producida por B. bassiana,
que además provoca melanización en Gallena mellone!!a (Fuguet ef al., 2004).
La síntesis de quitinasa en M. anisopliae y B. bassiana es regulada por
productos de la degradación de la quitina a través de un mecanismo de represión-
inducción. El sistema está mejor entendido en M. anisop!iae. Alta actividad de
quitinasa se encontró sólo en cultivos suplementados con quitina, pero no con otros
productos tales como pectina, xilano y celulosa. Se demostró que el inductor más
efectivo de la quitinasa fue la NAG, aunque la glucosamina también permitió la
producción. Esto posiblemente se debe a una adaptación ya que la quitina de fuentes
naturales (incluyendo la cutícula de los insectos) parece estar parcialmente
desacetilada. En M. anisophae, la quitobiosa podría funcionar como un inductor
mayor de la quitinasa, de manera análoga a la celobiosa para la celulasa. La N-
acetilgiucosaminidasa podría degradar la quitina a NAG, sin embargo, el mayor
producto de la actividad de quitinasa es NAG. Interesantemente, la NAGasa fue
29
producida constitutivamente y fue muy poco afectada por la represión catabólica
(Chamley y St. Leger, 1991).
Otras enzimas. Se han reportado quimiotripsinas, meta lop roteasas,
aspa rtilproteasas, aminopeptidasas, X-prodipeptidil aminopeptidasas y
carboxipeptidasas para M. anisop!iae (Freimoser et al., 2003).
Toxinas
Otro de los mecanismos que se ha reportado en la infección de los insectos,
es la producción de toxinas, aunque su papel en el desarrollo de las micosis in vivo
ha sido discutido (Ferron et al., 1991). Existen evidencias de cepas de M. anisopliae
que al perder el gen que codifica para Pr1A y Pr18 por mutación, pierden también la
capacidad de producir destruxinas (Wang et al., 2003). Las toxinas, de manera
general, se definen como productos de los microorganismos, de bajo peso molecular
y activos a bajas concentraciones. Los hongos secretan un amplio arreglo de
compuestos con actividad biológica contra otros organismos, principalmente
productos de un metabolismo secundario, los cuales se originan como derivados de
varios intermediarios en el metabolismo primario, como el de aminoácidos, síntesis
de poliquétidos, polisacáridos y peptidopolisacándos entre otros (Vey etal., 2001).
Las especies más estudiadas de hongos entomopatógenos en cuanto a
producción de toxinas son M. anisopliae, 8. bassiana y en menor grado P.
fumosomseus, V. lecanii e Hirsutefla spp. Esos hongos secretan un arreglo de
metabolitos secundarios (Tabla 1), algunos de los cuales están restringidos a
géneros específicos, mientras que otros son más ubicuos (Vey etal., 2001).
30
Tabla 1. Metabolitos selectos de algunos hongos importantes como agentes de
control biológico (Modificado de Voy et al., 2001).
Agente Objetivo Metabolitos producidos in vivo y/o in vitro
principal
Metarhizium an isopliae insectos Destruxinas (>27 tipos), swainsionona,
citocalasina C
Beauveria bassiana insectos Bassíanina, beauvericina, bassianolido,
beauverohdo, tenelina
Beauvena brongniartii insectos Oosporeina
Paecilomyces fumosoroseus insectos Beauvericina, beauverolidos, pirid ina-2 ,6-
ácido dicarboxilico
Verticillium lecanii insectos Ácido dipicolinico, ácido hidroxicarboxilico,
ciclosponna
Tolypocladium spp. insectos Ciclosporina, efrapeptinas (cinco tipos)
Hirsutella thompsonii Insectos Hirsutelina A, hirsutelina B, phomalactona
y ácaros
Fusanum spp. Hongos, Triotecanos, beauvericina, naftazarinas (ej.
insectos, fusarubina y anhidrofusarubina), ácido
hierbas fusárico
Beauvericina, basslanolida y beauverolida. La beauvericina es un
hexadepsipéptido, previamente aislado del hongo entomopatógeno Beauveria spp. y
Paecilomyces spp. y los hongos patógenos de plantas Fusanum spp y Polyporus
fumosoroseus (Vey et al., 2001).
La beauvencina es estructural y funcionalmente similar a las eniantinas A, B y
C, antibióticos dañinos para las membranas. Difiere de esos compuestos con
respecto a los ácidos N-metilamino. La beauvencina forma complejos con el sodio y
el potasio llevando a una permeabilidad incrementada de las membranas naturales y
artificiales. La beauvencina muestra actividad antibiótica contra vanas bacterias
como Bacíllus subtilis, Escherichia cali, Micobacterium phlei, Sarcinea luta,
31
Staphylococcus aureus y Streptococcus faeca!is, además, la beauvencina tiene
propiedades insecticidas moderadas (Vey etal., 2001).
La bassianolida, induce síntomas atóxicos en larvas del gusano de seda
alimentados con dietas artificiales que contienen pequeñas cantidades de este
compuesto, pero es letal a altas dosis. La bassianolida, como la beauvericina es un
antibiótico ionofórico pero difiere en su reacción a diferentes cationes (Vey el al.,
2001).
Las especies de Beauvena y P. fumosomseus también producen
beauverolidas, que son péptidos estructuralmente relacionados a la beauvencina y a
la bassianolida (Vey etal., 2001; Jegorov etal., 1994). La basianina y la tenelina (dos
toxinas no peptídicas) también han sido aisladas de especies de Beauvena (Vey et
al., 2001).
Dimorfismo fúngico
Otra estrategia de infección en los hongos entomopatógenos es el dimorfismo,
que es la capacidad de producir células levaduriformes aisladas (tipo blastosporas) o
formas filamentosas (hifas y pseudohifas) (Charnley y St.. Leger, 1991). Se ha
sugerido que ambas, las células levaduriformes y filamentosas participan en la
patogénesis (Mitchell, 1998), ya que una vez que el hongo penetra la cutícula del
hospedante, la multiplicación fúngica tiene lugar a través de cuerpos hifales o
blastosporas (Altre y Vandenberg, 2001). Esta fase levaduriforme se ha observado
en B. bassiana cuando infecta ácaros y lepidópteros (Alves el al., 2002), y se ha
obtenido en diversos hongos, incluyendo a P. fumosoroseus en condiciones de
32
cultivo sumergido (Jackson et al., 1997). Las blastosporas, han sido descritas por
vanos autores (Samsinakova, 1966; Bidochka et al., 1987; Rombach, 1989; Jackson
et al., 1997; Zhi-Gang et al., 1999) y han sido definidas como esporas asexuales,
generadas por división esquizolítica, ya sea en el septo de las hifas, o por
fragmentación mecánica de las mismas, también pueden ser producidas por las hifas
mediante la producción de una estructura semejante a una levadura (Rombach,
1989). Dichas estructuras son similares a aquellas encontradas cuando los hongos
crecen en la hemolinfa de los insectos (Jackson, 1997).
Dichos propágulos se han estudiado para fines de obtención masiva de
unidades ¡nfectivas, ya que los procesos de cultivo sumergido tienen ventajas sobre
la producción de conidios en fermentación en estado sólido, tales como la reducción
M tiempo de la producción de propágulos y una tasa de germinación rápida en la
cutícula del insecto (Vida¡ et al., 1998; Vega et al., 1999; Altre y Vandenberg, 2001).
Poco se sabe acerca de los factores que regulan el desarrollo de los hongos
entomopatógenos en la hemolinfa del insecto, ni de la morfología que adquieren al
interior del hospedante. Sin embargo, la pérdida de virulencia en N. rileyi ha sido
correlacionada con la ausencia de una fase levaduriforme (Alves et al., 2002). Este
último fenómeno se ha demostrado con P. fannosus cuando infecta al gusano
cogollero, ya que las blastosporas de los aislados menos virulentos no proliferan tan
rápidamente como aquellas del aislado más virulento; además, las blastosporas
producidas in vivo, aparentemente evaden el reconocimiento por parte de los
hemocitos (Altre y Vandenberg, 2001).
33
La variabilidad fenotípica entre el estado micelial y el estado levaduriforme en
los hongos patógenos se ha correlacionado con la virulencia. Hasta hace poco se
han revelado los mecanismos genéticos y moleculares que intervienen en ello. En
Paracoccidioides brasilensis, un patógeno de mamíferos, la variabilidad fenotipica y
el cambio de forma representa modificaciones programadas y controladas, más que
cambios producidos al azar (San-Blas, et al., 2000). Una posible explicación para el
cambio de forma, desde el punto de vista energético, es que las blastosporas podrían
estar acumulando reservas endógenas, mientras crezcan en un medio que le da
todos los nutrimentos para desencadenar la germinación. Esos propágulos al no ser
dependientes del ambiente nutrimental externo para una rápida germinación,
conferirían a los aislados cierta virulencia aumentada debido probablemente a que
las reservas energéticas acumuladas podrían ser utilizadas una vez que el hongo se
encuentra en el hospedador (Vega et al., 1999). En otro patógeno humano,
Histoplasma capsulatum se ha donado el gen yps3 de la fase levaduriforme (Keath
et al., 1989), forma parasitaria del hongo en humanos. Dicho gen se expresó en
aislados virulentos y no se expresó en aislados avirulentos. Además se han
identificado vías de señalización dependientes del AMP cíclico para controlar el
cambio morfológico durante la infección. Un incremento en la concentración de AMP
cíclico tiene efectos diferenciales en H. capsulatum y P. brasilonsis (Borges-
Walmsley, 2002).
34
JUSTIFICACIÓN
Una alternativa para el uso de plaguicidas químicos contra la mosquita blanca,
que es una de las principales plagas insectiles en México, son los hongos
entomopatógenos reguladores poblacionales naturales; entre los que se encuentra
Paeci/omyces fumosoroseus. Para mejorar la aplicación de este agente microbiano y
aumentar su utilización masiva en el contexto de un manejo integrado de plagas, es
necesario conocer la biología básica de dicho hongo entomopatógeno. Entre los
puntos relevantes, están los mecanismos de infección ya que en etapas posteriores,
esto permitiría colectar y seleccionar aislados que mostraran características
fundamentales para el control de la plaga. Además, es importante describir la
relación hospedante/parásito in vivo. La presente investigación se planteó para
estudiar in vitro algunos de los factores de patogenicidad, concretamente, las
enzimas que intervienen en la degradación de la cutícula del insecto. Otro aspecto
estudiado fue la transición de conidio a diferentes propágulos del hongo, para
posteriormente observar la relación hospedante parásito in vivo con la prueba de
índice de crecimiento y desarrollo fúngico en tres aislados de P. fumosoroseus (EH-
50613, EH-50313 y EH-52013, de alta, mediana y baja virulencia expresada como CLo
respectivamente). La observación de la penetración y formación de estructuras
fúngicas en la superficie del insecto con dos aislados (EH-50613 y EH-52013) y el
análisis ultraestructural con inmunocitoquímica para quitinasas con el aislado más
virulento (EH-50613), permitió hacer una aproximación al modelo teórico propuesto
35
para la penetración de los hongos entomopatógenos, tomando como base el binomio
P. fumosoroseusimos quita blanca.
36
HIPÓTESIS
Los aislados de P. fumosoroseus capaces de producir rápidamente in vitro las
proteasas y quitinasas indispensables para la penetración del insecto, así como de
completar la transición de conidio a blastospora, son más virulentos en el modelo de
infección ¡n vivo.
37
OBJETIVOS
Objetivo general
Demostrar la rapidez y eficiencia tanto en la producción de proteasas y
quitinasas en sustratos sintéticos específicos e in vivo, y su relación con la transición
de conidios a diversos propágulos, como blastosporas y la virulencia, medida por el
índice de crecimiento y desarrollo fúngico, de aislados de P. fumosoroseus.
Objetivos particulares
u Llevar a cabo estudios cinéticos en cultivo sumergido de los aislados
seleccionados en medios que induzcan la producción de proteasas
u Determinar la actividad enzimática de las proteasas de P. fumosoroseus
contra los sustratos específicos (péptidos) de proteasas tipo tripsina y tipo
su bti ¡¡si na.
u Determinar la actividad enzimática de las quitinasas de P. fumosoroseus
contra quitina coloidal.
u Realizar estudios cinéticos de fa transición conidio-blastosporas in vitro de
los aislados.
u Infectar ninfas de mosquita blanca con cada uno de los aislados y detener
a diferentes tiempos para seguir el desarrollo de la penetración fúngica
mediante la aplicación del índice de crecimiento y desarrollo fúngico
(ICDF)
38
u Detener la infección a diferentes tiempos, y preparar las muestras para
microscopía de barrido (MEB) y electrónica de transmisión (MET).
u Observar la adhesión de los conidios del hongo y formación de
estructuras, en la superficie de la cutícula del insecto por MEB.
u Realizar el análisis ultraestructural convencional y con inmuno-oro de P.
fumosoroseus en su hospedante, la mosquita blanca (Homoptera:
Al eyrod idae).
u Observar la presencia de blastosporas por MET en el hemocele del
insecto, a los diferentes tiempos de infección.
u Detectar la presencia de quitinasas en las estructuras penetrantes con
inmuno-oro.
39
METODOLOGÍA
AISLADOS FÚNGICOS
Se utilizaron tres cultivos monospóricos de P. fumosoroseus (CavaUazi et aL,
2000) provenientes del Centro Nacional de Referencia en Control Biológico
(SAGARPA), Tecomán Calima. Los cultivos monospóricos EH-50613, EH-50313 y EH
520/3, obtenidos de los aislados originales PFCAM, MBP y MBP1 respectivamente,
fueron seleccionados por su grado de virulencia (expresada como la C1- 50 ) a partir de
un estudio previo (Castellanos-Moguel et al., 2001b). EH-50613, además de ser
altamente virulento tiene una actividad proteolítica alta; EH-50313, es muy virulento
con actividad quitinolítica alta y EH-52013, es poco virulento con actividad de
proteasas y quitinasas intermedia. Todos los aislados se mantuvieron en agar de
glucosa Sabouraud (Bioxón, México).
Preparación y conteo de inóculo
Los conidios para los estudios de cinética enzimática, transición conidio-
blastospora, índice de crecimiento y desarrollo fúngico (IDCF) y análisis
ultraestructural se extrajeron con Tween 80 al 0.05%, a partir de colonias de siete a
once días de incubación a 28°C. La concentración final de conidios fue ajustada a 1 x
1 06 /ml y el conteo se hizo con una cámara de Neubauer.
40
ENSAYOS ENZIMÁTICOS
Proteasas
Condiciones de cultivo
Para producir proteasas en cultivo sumergido se utilizó el medio H (en g/l:
sacarosa 10; glucosa 5; peptona 0.5; extracto de levadura 15) adicionado de caseína
(Sigma) al 1%. Se utilizaron matraces de 250 ml con 70 ml de medio de cultivo, los

1061M 1. Los
cuales fueron sembrados con una suspensión de conidios de 1 x
matraces se incubaron en agitación orbital a 28 T. A las 0, 6, 12, 18, 24, 36, 48, 60,
72, 84, 96, 120, 168, 216, 240, 264 y 312 h después de la siembra, se tomó una
alícuota de 5 ml de cada matraz y se centrifugó, colectando y congelando el
sobrenadante para su ensayo enzimático posterior.
Determinación de la actividad de proteasas totales
La actividad de las proteasas se determinó con el método de la azocaseína,
sustrato cromogénico que al ser hidrolizado libera un colorante naranja que absorbe
fuertemente a una longitud de onda de 440 nm. Este método permite detectar la
actividad de la mayoría de las proteasas presentes en el sobrenadante del cultivo
(Sarath etal., 1989). Para este ensayo, se disolvió la azocaseína al 2% en regulador
de fosfatos 0.2 M, pH 7. Se colocaron en un tubo de microcentrífuga 250 pi de
sustrato y 150 uI de enzima, los cuales se incubaron a 25°C por una hora.
Posteriormente, se detuvo la reacción con 1.2 ml de ácido tricloroacético al 10% y se
dejó reposar por 15 mm, después se centrifugó a 4000 rpm durante 30 mm, y a 1.2
4
ml del sobrenadante obtenido se le agregaron 1.4 ml de hidróxido de sodio 1.0 M.
Después se leyó la absorbencia a 440 nm. La actividad está expresada en unidades,
siendo una unidad la cantidad de enzima que origina un cambio en la absorbencia de
0.010 a 440 nm (Sarath etal., 1989).
Determinación de la actividad proteasas tipo tripsina (Pri) y tipo subtilisina
(Pr2)
Se probó la especificidad de las proteasas producidas por los aislados
estudiados contra los sustratos comerciales Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-Na y Bz-Phe-Val-
Arg-pNa (Sigma), los cuales son hidrolizados por Pri (subtilisina) y Pr2 (tripsina)
respectivamente. Los ensayos consistieron en colocar en un tubo de ensayo 50 pi de
extracto enzimático crudo y 900 l.Ll de regulador Tris 0.1 M, pH 8 (PBS, México). Dicha
mezcla se dejó equilibrar por 10 min en un baño metabólico a 23°C y posteriormente
se colocó en una celda de espectrofotómetro (Beckman, DU-600), agregándole 50 ji
de sustrato 1 mM. La actividad se expresó en unidades, siendo una unidad la
cantidad de enzima que origina un cambio de 0.001 en la absorbencia a 410 nm
durante un minuto (Gillespie etal., 1998).
Para el montaje de ía técnica, se trabajó primeramente con un aislado, EH-
506/3, con las condiciones de reacción establecidas para las enzimas tipo subtilisina
(Pri) y tipo tripsina (Pr2) de M. anisopliae (Gillespie et al., 1998). Se disolvió el
sustrato sintético para Prl (Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-Na) en amortiguador Tris-HCI o en
Tris, y la mezcla de reacción de la enzima se equilibró a 23°C, y se incubó a
42
diferentes tiempos: de 1 a 5 min directamente en la celda del espectrofotómetro
(Gillespie etal., 1998).
Quitinasas
Preparación y tinción del sustrato
Para inducir la producción de quitinasas, se utilizó quitina coloidal teñida con
azul brillante de remazol (Gómez-Ramírez, 2000). Dicho sustrato se preparó a partir
de quitina comercial en hojuelas (Sigma, México), la cual se molió en un molino Wiley
con una luz de malta de 40. Por cada 10 gramos de quitina se agregaron 100 ml de
H 3PO4 al 85% (Baker, México) y se mezclaron agitando manualmente, para
mantenerla posteriormente en refrigeración por 24 h. Después se le agregó agua en
exceso para hacerla coloidal, y se filtró a través de gasa para eliminar la acidez. Para
teñirla, se colocaron en un vaso de precipitado 7 g de quitina coloidal y 0.23 g de azul
brillante de remazol (Sigma) previamente disuelto en agua; la mezcla se calentó a
ebullición durante una hora, luego se filtró y lavó con agua fría y caliente hasta que
ya no salió color. Se escurrió y se fijó con 0.075 g de dicromato de sodio (Sigma) y
0.075 g de tartrato de sodio y potasio (Baker) por cada 5 g de quitina coloidal. La
mezcla se dejó hervir por 10 min y se lavó nuevamente. Se esterilizó en autoclave a
121°C y se refrigeró hasta su uso (Gómez-Ramírez, 2000).
Condiciones de cultivo
Las quitinasas se produjeron en medio sintético (en g/l: cloruro de sodio 0.25
fosfato monobásico de potasio, 0.375; carbonato de sodio, 0.375; sulfato de
4,
magnesio 0.275) (Chávez-Camarillo y Cruz-Camarillo, 1984), adicionado con quitina
coloidal teñida con azul brillante de remazol (Gómez-Ramírez, 2000); utilizando las
mismas condiciones de cultivo que para la producción de proteasas. A las 0, 24, 72,
120, 168, 216, 264 y 312 h se tomó una alícuota de cinco ml de cada matraz y se
centrifugó, para leer el sobrenadante a 595 nm (Gómez-Ramírez et al, 2004) y
obtener la actividad enzimática.
Determinación de la actividad de quitinasas
La actividad de quitinasas se determinó al leer la absorbencia de los cultivos
de P. fumosoroseus en medio sintético adicionado con 2% de quitina coloidal teñida
con azul brillante de remazol. Este sustrato, al ser cromogénico, libera el colorante
unido a la quitina durante la hidrólisis de la misma, y la actividad se expresa en
unidades, siendo una unidad la cantidad de enzima que origina un cambio en la
absorbencia de 0.01 a 595 nm (Gómez-Ramírez, 2000).
Actividad específica de proteasas y quitinasas
Para calcular la actividad específica de todas las enzimas ensayadas en los
sobrenadantes de todos los medios de cultivo utilizados, se determinó la cantidad de
proteína soluble en los mismos, utilizando el método de Bradford (1976), el cual se
basa en la unión de un colorante a las proteínas. Dicho complejo tiene su máxima
absorbencia a 595 nm, y las lecturas son proporcionales a la concentración de
proteína, los datos obtenidos se interpolaron en una curva tipo de albúmina sérica
44
bovina. Para este ensayo se mezcló imi de sobrenadante con 1 ml de reactivo de
Bradford y se leyó la absorbencia a 595 nm.
DIMORFISMO FÚNGICO
Cinética de la transición conidio-blastospora in vitro
Para la observación de la transición conidio-blastospora se utilizaron los
mismos medios y en las mismas condiciones de cultivo usadas para la producción de
enzimas, esto es, matraces de 250 ml con 70 ml de medio H adicionado con caseína
al 1% o bien, medio sintético adicionado con quitina coloidal sin teñir al 2%, tos
cuales fueron sembrados con una suspensión de conidios de 1 x 1061m1, y
mantenidos a 28°C con agitación orbital a 150 rpm. A las 0, 6, 12, 18, 24, 36, 48, 60,
72, 96, 120, 168, 216, 240 y 312 h después de la siembra se tomaron alícuotas de 3
ml de cada matraz y se observaron al microscopio, midiendo el largo y ancho de por
lo menos 30 estructuras, con un microscopio Olympus BX-40 con un objetivo
graduado a 40x. También se realizó un registro gráfico de los propágulos con una
cámara Olympus PM-C35 y una unidad de control de exposición Olympus PM20. La
transición fúngica se registró de acuerdo con el esquema de clasificación de
Bidochka et al. (1987), con ligeras modificaciones. Este esquema comprende seis
estados de desarrollo (ED): conidios no hinchados (1), conidios hinchados (II), tubo
germinal emergiendo (III), alargamiento del tubo germinal y formación del primer
septo (IV), alargamiento (crecimiento) polar y bipolar del micelio resultante e
iniciación de una blastospora (V) y desprendimiento de la blastospora (VI). Se calculó
la relación largo/ancho de todos los propágulos medidos.
45
DETERMINACIÓN DE VIRULENCIA
Insectos
Para la determinación del índice de crecimiento y desarrollo fúngico (ICDF) y
la microscopía electrónica de barrido y de transmisión, se utilizaron ninfas de
mosquita blanca (Trialeurodes vaporariorum), obtenidas de foliolos de frijol
(Phaseolus vulgans) o bien hojas de aretillo (Fucsia spp.) infestados con dicho
insecto. Para las pruebas de microscopía electrónica se seleccionaron ninfas de
estadio dos y tres, mientras que para el índice de crecimiento y desarrollo fúngico, se
trabajó con ninfas de cuarto estadio (García-Juárez etal., 1999), en todos los casos,
los insectos tenían un aspecto turgente y transparente, indicador de que estaban
sanos. Para todos los ensayos in vivo, se cortaron discos en los folíolos que contenía
las ninfas, y se desinfectaron sumergiéndolos en las siguientes soluciones: alcohol
al 70% (2 seg), agua destilada (40 seg), hipoclorito de sodio al 2.5% (20 seg) y tres
lavados con agua destilada de 40 seg cada uno, para luego dejar secar en un papel
filtro estéril (Vida¡ et al, 1996).
Determinación del índice de Crecimiento y Desarrollo Fúngico
Una vez desinfectadas, se seleccionaron 25 ninfas en cuarto estadio, las
cuales fueron depositadas en cajas de Petri de 3,5 cm de diámetro que contenían
agar-agua (23g11). Una suspensión conidial de 1 x10 6 conidios/ml de los aislados EH-
50613, EH-503/3 y EH-52013 fue utilizada para la infección, la cual consistió en
depositar 3il de dicha suspensión en cada ninfa. Las cajas se incubaron a 28°C y
46
con un fotoperiodo de 16:8 (luz-oscuridad). Posteriormente se hicieron observaciones
a las 0, 6 7 12, 18, 24, 36, 48, 60, 72, 84 y 96 h, que fueron los mismos tiempos que la
cinética de transición de con idio-blastospora, y se tomaron fotografías para seguir el
desarrollo de los conidios. El desarrollo fúngico en el insecto fue evaluado con base
en una escala de O a 3.0, y comparado con ninfas testigo, las cuales fueron cubiertas
solamente con tween 80 al 0.05% estéril. El ICDF correspondió a la siguiente escala:
0.0= ninfa rodeada de conidios no germinados; 0.5= germinación de conidios con
uno o dos tubos germinales en el área cercana a la ninfa; 1.0= crecimiento de tubos
germinales y presencia de hifas; 1.5= crecimiento inicial de hongo orientado al
insecto y primer contacto de las hifas con la ninfa; 2.0= crecimiento micelial dentro y
en la superficie y área alrededor de la ninfa; 2.5= inicio de la esporulación, conidios
que cubren la superficie de la ninfa. 3.0= esporulación completa, ninfa cubierta con
micelio y conidios del hongo (García-Juárez etal., 1999).
Pruebas de infección in vivo para microscopia electrónica
Una vez seleccionadas y limpias, las ninfas se infectaron con la suspensión de
conidios de EH-50613 (aislado mas virulento) o de EH-52013 (aislado menos
virulento), permitiendo que la parte del foliolo que contenía las ninfas (envés), tuviera
contacto con los conidios durante 1 mm, para después secar al aire. El disco se
colocó en cajas de Petri estériles con medio KNOP (en gil: nitrato de potasio, 0.125g;
nitrato de calcio. 0.500; sulfato de magnesio, 0.125: fosfato de potasio, 0.125 y agar
23) para evitar el marchitamiento de los discos recortados de los foliolos, o bien se
utilizó también una variante metodológica muy semejante a la descrita para el ICDF,
47
ya que a las ninfas previamente desinfectadas, se pasaron a cajas de Petri de 3.5 cm
de diámetro que contenían agar-agua (60 gIl) y se les infectó con 3 j.d de una
suspensión de 1x106 conidios/ml. Las cajas se incubaron a 26 +1- 2°C a una
humedad relativa de 60% y un fotoperiodo de 16:6 h. Inmediatamente y después de
la infección se tomaron muestras a 0, 6, 12, 24, 36, 48, 60, 96, 120 y 168 h. Las
ninfas infectadas se fijaron y procesaron para el estudio ultraestructural.
Inmuno-oro ultraestructural con anticuerpo biotinilado
Para observar la producción in situ de quitinasas en el proceso de infección
M hongo en la mosquita blanca, se utilizó una metodología inmunocitoquímica con
MET.
Se utilizó un anticuerpo monoclonal contra aglutinina de germen de trigo
(WGA, por sus siglas en inglés), la cual es una fectina con alta afinidad hacia
trisacárídos de N-acetil-D-glucosamina (componente de la quitina) (Boyer, 2000).
Dicha lectina, comparte un epítopo con la heveína, la cual es una quitinasa de tipo
dos, producida por Hevea brasilensis. Las quitinasas de tipo dos, han sido
identificadas en muchos microorganismos (Cohen-Kupiec, y Chet, 1998).
En este ensayo, las quitinasas, al actuar sobre la cutícula de los insectos,
liberaron oligómeros de quitina, entre ellos, trisacaridos de N-acetil-D-glucosamina, a
los cuales se unió la WGA, y posteriormente el anticuerpo biotinialdo. A ese
anticuerpo se unió estreptavidina-oro y fue lo que permitió observar en la MET, las
marcas de oro coloidal.
48
El anticuerpo monoclonal fue proporcionado por el Dr. Edgar Zenteno y la Dra.
Conchita Agundis del Laboratorio 6 del Departamento de Bioquímica de la Facultad
de Medicina de la UNAM.
Para la técnica de biotinilación del anticuerpo, primero se precipitaron
gammaglobulinas del suero sanguíneo murino con una solución saturada de sulfato
de amonio. Dicho procedimiento se repitió tres veces y posteriormente se dializó
extensivamente contra solución salina al 0.9 %. Se centrifugó y se determinó la
cantidad de proteína utilizando el método de Bradford (1976). Se ajustó la
concentración de anticuerpos a una solución de 1 a 3 mg/ml en amortiguador de
borato de sodio 1 M, pH 8.8. A esta solución se adicionó la biotina (N-
hidroxisuccinimida-biotina, Sigma), en una concentración de 25 jg por cada mg de
anticuerpo. Se mezcló y se dejó incubar por cuatro h a temperatura ambiente.
Posteriormente, a la solución se le agregaron 20 pi de cloruro de amonio 1 M por
cada 250 p.g de biotina. Se incubó 10 min a temperatura ambiente, y luego se dializó
extensivamente contra amortiguador de borato de sodio pH 8.8 1 M (Harlow y Lane,
1988). Para corroborar la biotinilación del anticuerpo, se hizo un ensayo de DOT-
ELISA con avidina-peroxidasa. Este método se basa en el cambio de color producto
de una reacción de óxido-reducción, cuando se une la avidina con el anticuerpo.
E Leí
Técnicas de microscopía electrónica de transmisión (MET) y de barrido
(MEB)
Para la fijación se utilizó glutaraldehido al 2.5 % en regulador de fosfatos 0.1 M

40 C. Luego se pasó a glutaraldehido al 3 % en el mismo regulador,
pH 7.2 por 48 h a
3 ha 4°C.
La posfijación se realizó con tetróxido de osmio al 1 % en regulador de

40 C (para las muestras destinadas a MET convencional
fosfatos 0.1 M, pH 7.2, 3 h a
y MEB). Entre fijación y posfijación se hicieron lavados con el mismo regulador, tres
veces de cinco min cada uno. Se procedió a la deshidratación con diferentes
concentraciones de etanol, y la desecación por punto crítico en cámara de CO 2 . Se
montaron en cilindros de aluminio con pasta de plata y se cubrieron con carbón y oro
ionizados (MEB).
Se realizaron cortes finos montados en rejillas de níquel (o de oro), se
rehidrataron por flotación en PBS, 15 min a temperatura ambiente. Se bloqueó con
PBS-ASB al 1%-Tritón X-100 0.1%, 1 h a temperatura ambiente en cama húmeda y
se escurrió (no lavar). Posteriormente, se incubó con el anticuerpo anti aglutinina de
germen de trigo biotinilado en PBS 30 mín a 23-24°C en cámara húmeda y se lavó
con el mismo regulador de dilución 3 veces 5 minutos cada una. Luego se incubó en
estreptovidina-oro y se lavó con PBS estéril a chorro con pipeta pasteur (40 ml por
rejilla), Se realizó otro lavado con agua desionizada estéril a chorro; para
posteriormente, se dejó secar, contrastar con uranilo y plomo y observar.
La inclusión de las muestras se hizo en araldita para MET convencional y en
EPON 812 para estreptavidina-oro. Los cortes semifinos (1 micra) se realizaron con
50
cuchilla de vidrio y se tiñeron con azul de toluidina acuosa al 1 %. Los cortes finos
(100 nm) se hicieron con cuchilla de diamante y se contrastaron con acetato de
uranilo y citrato acuoso de manera habitual Para observación de MEB se utilizó un
microscopio DSM 950y de MET un microscopio EM/lO.
Análisis estadístico
Se realizó un análisis de varianza (ANOVA ct =0.5), para las actividades de
proteasa, el número de propágulos y el ICDF J seguido por una comparación múltiple
de medias de Tukey (Dowdy y Wearden, 1983). Todos los análisis fueron hechos
usando el programa SPSS, versión 10, 2003.
51
RESULTADOS
ESTUDIOS ENZIMÁTICOS
Proteasas totales
La producción, tanto de proteasas como de propágulos se realizó en medio H
adicionado con caseína al 1%. La actividad proteolítica total, se detectó por el
método de la azocaseína (Sarath et al., 1989). Con esta determinación, se constató
que existía algún tipo de proteasa en el sobrenadante del cultivo de P.
fumosoroseus. Todos los aislados probados mostraron actividad, la cual se mantuvo
baja durante las primeras 96 h del cultivo en los tres casos, a partir de este momento
para EH-50613, a las 120 para EH-50313 y a las 168 h para EH-52013 comenzó a
elevarse. La máxima actividad, fue alcanzada por cada aislado a diferentes tiempos
(Figura 4): EH-50613 presentó 91 UPIml a las 216 h y 99 UP/ml a las 312 h de
incubación. EH-50313 mostró una actividad de 67.2 UP/ml a las 240 h, pero ésta se
elevó y alcanzó las 105.8 UP/ml a las 312 h de incubación. EH-52013 exhibió una
actividad de 49 UPImI a las 216 h. Se observaron diferencias significativas de
actividad (P<0.5) en todos los tiempos (tabla 2) entre los tres aislados.
52
100
80
- B-l-033
--.-
1 /
20
i1 1 1 1 1
04 r 1 TT T YT
'.D )1 CO
(N r') ,Ø 1..- cD O)
Tiempo (h)
P
igura 4. Actividad volumétrica de proteasas de los aislados EH-50613. EH-50313 y EH-520/3 de P.
fumosoroseuS determinada por el método de la azocase ma.
En cuanto a la actividad específica (Figura 5), que es la actividad enzimática
con respecto a la cantidad de proteína total presente en el sobrenadante del cultivo,
se observó una tendencia semejante a la descrita anteriormente. Sin embargo, el
máximo de actividad se observó a las 216 h para EH-50613 y para EH-52013, y hasta
las 312 h para EH-50313. En este caso, también pudo observarse una actividad baja
durante las primeras 96 h de incubación. Se registraron ligeros aumentos de
actividad a las 72 h para EH-50613 y a las 60 h para EH-52013.
53
300
250
200
/
2 /
t
Di
—.--EH.500A3
oEH-5034
-*- E41520f3
50
/
-.
rH
lit mpo (h)
Figura 5. Actividad específica de proteasas (expresada como UP/p.g de proteína total en el

sobrenadante) de los aislados EH-50613, EH-50313 y EH-52013 de P. fumosomseus.
Tabla 2. Comparación de la actividad de proteasas totales de tres aislados de

P. fumosoroseus
Tiempo Unidades de proteasa (UP/ml)
EH-506/3 EH-50313 EH-520/3
3.60 33a 805
0
36b 8.0c
6 2.1"
38b 2.oa 79C
12
37b 1.5a 8.0c
18
24 iBa 8.7G
O
36 4.4 b 2 8.6c
43b 13a 100c
48
95C
60 4.4 b 1.ga
72 56b 1.2a 8.7c
84 5. lb 1.3" 9.Oc
96 5. lb 1.5a 9.01;
120 62.4c 2.7a 8.7b
870 6.7a 36.Ob
168
216 91.0c 587b 490a
240 89.Oc 672b 468
312 990b 1050 22.4a
Cada valor representa el promedio de tres experimentos independientes entre sí. En el análisis de
valor crítico de comparación de rangos múltiples de Tukey, los promedios que comparten la misma
letra en la misma línea, no son diferentes significativamente.
54
Estandarización de condiciones para la determinación de la actividad de
proteasas tipo subtilisina (Pri) y tipo tnpsina (Pr2)
De acuerdo con los resultados obtenidos (tabla 3), se decidió utilizar
amortiguador Tris 0.1 M, pH 8, y establecer el tiempo de incubación en 1 mm.
Tabla 3. Comparación de la actividad de Pri obtenida con diferentes

condiciones para la mezcla de reacción.
Tiempo (h) UPr1/mi dependiendo del tiempo de reacción (mm)
Tris Tris HCI
1 2 34 5
66 65 65 64 64 34 35 37 38 39
0
72 93 91 91 91 63 77 94 109 123
6
63 63 63 63 62 77 78 78 78 78
12
83 83 83 83 82 100 105 105 105 106
18
181 142 143 142 142 138 138 138 139 138
24
36 143 128 128 129 130 97 45 134 134 134
48 83 68 68 66 69 42 42 45 45 46
60 57 57 58 58 58 40 47 43 43 44
72 53 54 54 54 54 46 46 48 49 50
84 68 67 67 67 68 46 38 143 48 49
96 78 84 80 84 81 51 49 50 51 51
120 746 565 570 578 584 417 464 474 490 494
168 371 454 506 526 558 301 324 337 233 367
216 620 627 648 671 671 488 503 527 527 528
240 560 506 554 610 630 435 562 557 583 583
312 585 500 511 517 517 329 395 435 446 448 -
Cada valor representa el promedio de tres experimentos independientes entre sí
Determinación de la actividad de Pri y Pr2
Una vez establecidas las condiciones de reacción, se trabajó con los tres
aislados, los cuales presentaron actividad tipo subtilisina (Prl) y tipo tripsina (Pr2)
(Figuras 6 y 7), bajo las condiciones experimentales mencionadas previamente.
Algunos de los puntos mostraron diferencia significativa, entre los tres aislados, esos
valores están señalados en la tabla 4.

Tabla 4. Actividad de proteasas Pri y Pr2 de aislados de P. fumosoroseus
Tiempo (h) Actividad de Pri (UPr1/mI) Actividad de Pr2 (UPr2/ml)
EH-50613 EH-50313 EH-52013 EH-50613 EH-50313H-52013

o 66.045 9403b 120.56c 493a 1384b 103.03v
6 72.36a 138.6b 1239b 80.3a 155.52c
12 63.5a 178.16c 9088b 76.138 133.9c
18 83.5a 17011b llo. lga 91.03a 1982b
24 179.82e 15634b 109. 11 8 863a 1787b 108.4a
36 142.98 148.98 19214b 65.88 2101' 85.1b
48 83.la 165.39b 92. 01 8 20.8a 200.4c 822b
60 5748 15660 90. 688 4398 b 70.1c
72 53.92a 8464b 108.76c 16.97a 894°
68. 6a 724a ,b 97.66° 24.5a 863° 834°
96 78.34a 941b 931b 251.78 975C 851b
120 7457b 90.11a 111.23a 23.4a 109.4c 954b
168 371.6c 105.88 2815b 65.7a 113. gb 1227b
216 62042b 391.18 34748 251.3c 1557b 92.38
240 5590 4555b 201.6a 61.5a 1396b 208c
312 585.7c 4967b 108.7a 5758 1611b 1533b
Cada valor representa el promedio de tres experimentos independientes entre si. En el análisis de
letra en la misma línea no son diferentes significativamente.
Desde las O horas del experimento, todos los aislados mostraron actividad
tanto de Pri como de Pr2 (Tabla 3), la cual fue de 49.3 UPr2Jml a 150.6 UPr1/mI. Se
observaron diferencias significativas (F 2 ,24=127.8, P<0.05), para Pri y (F2,24=184.9,
P z 0.05) para Pr2 entre los tres aislados estudiados.
En el caso de Pri, a las 0, 12, 24, 72, 168, 240 y 312 h, se observó diferencia
significativa entre los tres aislados. A las 6, 96, 120 y 216 h, la actividad de Pri de
EH-50613 fue estadísticamente diferente de los otros dos aislados. A las 18, 48 y 60
h, EH-50613 y EH-52013 no presentaron actividad de Pri estadísticamente diferente
entre ellos, mientras que EH-50313 en esos mismos tiempos de muestreo, formó un
grupo aparte. A las 36 y 84 h, la actividad de EH-50613 y EH-50313 no fue
56
estadísticamente diferente entre si, mientras que EH-52013 formó un grupo aparte en
ese tiempo de muestreo (Tabla 4).
La actividad de Pr2 de las O a las 12 h, mostró diferencia significativa entre los
tres asilados, esto se volvió a observar de las 36 a las 60 h, a las 96, 120 216 y 240
h. A las 72, 84, 168 y 312 h, la actividad de Pr2 de EH-50613 fue estadísticamente
diferente de los otros dos aislados. A las 18 y 24 h, EH-50613 y EH-52013 no
presentaron actividad de Pr2 estadísticamente diferente entre ellos, mientras que
EH-50313 en esos mismos tiempos de muestreo, formó un grupo aparte (Tabla 4).
Para los tres aislados, la actividad de Prl varió entre los 66 y las 192 Upri/mI
hasta las 96 h de incubación (Figura 6). En el aislado EH-50613, la actividad de Prl
comenzó a elevarse y alcanzó un máximo (745.7 UPr1/mi) a las 120 h, para después
descender y elevarse nuevamente para alcanzar un segundo máximo de actividad
(620.4 UPr1/mi) a las 216 h. La actividad de Pri en EH-50313, comenzó a elevarse
después de las 168 h y alcanzó un máximo (496.7 UPr1/ml) a las 312 h. La actividad
más baja de Pri fue la detectada en el aislado EH-52013 (347.3 UPr1/ml) a las 216 h
(Figura 6).
La actividad específica, en general, mostró la misma tendencia que las
actividades volumétricas antes descritas (Figura 7).
57
800
700
\ (\\\. .
600
500 -a EHSO33 w
1¡
11 --. 84523
400
00
200--
Tiempo )
Figura 6. Actividad volumétrica de proteasas tipo subtilisína Pri (determinada contra el sustrato Suc-
Ala-Ala-Pro-Phe-Na) de los aislados EH-50613, EH-50313 y EH-52013 de P. fumosomseus.
2500
2000
11500
\/ •' 1 ____
4/.
TIOMPON
Figura 7. Actividad específica de proteasas tipo subtilisina Pri (determinada contra el sustrato Suc-
Ala-Ala-Pro-Phe-Na y expresada como UPr1/4 de proteína total en el sobrenadante del cultivo) de los
aislados EH-50613, EH-50313 y EH-52013 de P. fumosoroseus.
En los tres aislados, la actividad de Pr2 fue mucho más baja que la de Pri y
relativamente constante con respecto a ésta permaneciendo así, y relativamente
constante durante todos los experimentos (Figura 8).
800
700
600
500
B-f5031?i
200
100
o
— c1 ', ç.. (O —
r
Tmpo h)
Figura 8. Actividad volumétrica de proteasas tipo tripsina Pr2 (determinada contra el sustrato Bz-Phe-
VaI-Arg-pNa) de los aislados EH-50613, EH-50313 y EH-52013 de P. fumosoroseus.
La tendencia antes descrita para Pr2, también se observó con la actividad
específica (Figura 9).
Ç9
Figura 9. Actividad específica de proteasas tipo tnpsina Pr2 (determinada contra el sustrato Bz-Phe-
Val-Arg-pNa y expresada como UPr1/g de proteína total en el sobrenadante del cultivo) de los
Producción de quitinasas en cultivo sumergido
La producción de quitinasas se realizó en medio sintético adicionado con
quitina coloidal teñida con azul brillante de remazol, y cada 48 horas se tomó una
alícuota del cultivo, se centrifugó y al sobrenadante se le leyó la absorbencia para
determinar la actividad de quitinasas. El máximo se alcanzó a las 312 horas (Figura
10), para los tres aislados con 76 UQ/ml para EH-50613, 61 UQ/ml para EH-50313 y
81 UQ/ml para EH-52013. La actividad específica de las quitinasas, presentó
tendencias diferentes para los tres aislados, señalando a EH-50613 como el mayor
productor de quitinasaslp.g de proteína, con un máximo a las 312 h, mientras que la
de EH-50313 presentó su máximo a las 264 h y EH-52013 a las 168 h (Figura 11).
60
60 ir
g —.---835c
. B-$-50313
30 ff
-k 61-52013
20
lo
o
0 24 72 120 158 216 264 312
Tiempo (h)
Figura 10. Actividad volumétrica de quitinasas determinada con azul brillante de remazol, de los
7
14W
e
12W
---B-4E1
luw
/ EH
gw
*04520/?
t1l
m
/
2W
Q-•. -e-- --t
24 72 120 186 216 264 312
TlenWo(h
Figura 11. Actividad específica de quitinasas (determinada contra quitina coloidal teñida con
azul brillante de remazol y expresada como UQ/.tg de proteína total en el sobrenadante del cultivo) de
los aislados EH-50613, EH-50313 y EH-52013 de P. fumosoroseus.
61
Algunos puntos de la curva mostraron diferencia significativa entre los tres
aislados, esos valores están señalados en la tabla 5. A las O h, se observaron
diferencias significativas (172,24 = 11.970 , P<0.05) entre los tres aislados estudiados.
Dichas diferencias permanecieron hasta las 168 h de incubación, posteriormente, no
se detectó diferencia entre la actividad de los tres aislados (Tabla 5). A pesar de que
a las 312 h, se observa un aparente aumento de actividad de EH-52013 con respecto
a los otros dos aislados, dicha elevación no fue estadísticamente diferente.
Tabla 5. Actividad de quitinasas de aislados de P. fumosoroseus
Tiempo (h) Actividad dequitinasas (UQ/ml)

EH-50613 EH-50313 EH-52013
4.0c
Oa 18b 2.1
24 08b
oa 58C
72 57a
32.0c 63b
120
168 26a 69.4c
60a 26a 62a
216 55a
75a 68a
264
76a 61a 81a
312
Cada valor representa el promedio de tres experimentos independientes entre si. En el análisis de
letra en la misma línea no son diferentes significativamente.
62
CINÉTICA DE LA TRANSICIÓN CONIDIO-BLASTOSPORA
Para la cinética de la transición conidio-blastospora y producción de
propágulos, se utilizaron los mismos medios que para la producción de enzimas y se
hicieron mediciones de por los menos 10 conidios por matraz al tiempo O del
experimento y posteriormente cada 6 h durante las primeras 24 h. A partir de las 24
h, los muestreos se realizaron cada 12 h, hasta que alcanzaron las 96 h. El
experimento se extendió hasta las 312 h, que fue el tiempo que duraron los
muestreos para las enzimas.
Producción de propágulos en medio H
Los tres aislados estudiados exhibieron una transición de conidio (ED:l) a
diferentes propágulos en diferentes tiempos. Las figuras 12-14 muestran las distintas
estructuras encontradas en los cultivos de P. fumosoroseus. En los tres casos, el
conidio se hinchó (ED: II) y comenzó a producir uno o más tubos germinales (ED: III).
Durante los primeros tiempos de muestreo, se observó un desarrollo diferencial de
los tres aislados utilizados: a las 6 h, EH-50613 ya había producido tubos germinales
(ED: III), mientras que EH-50313, comenzó a germinar entre las 6 y las 12 h, mientras
que EH-52013 lo hizo hasta las 12 h (Tabla 6). A las 36 h, los tres aislados produjeron
blastosporas primarias (ED: y); originadas de los septos y puntas de las hifas;
blastosporas gemando (ED: V) y cuerpos hifales (ED: VI). Después de 48-96 h,
fueron observadas estructuras ovales y estrechas, semejantes a hifas cortas, estas
producían blastosporas (ED: V) o conidios sumergidos. A partir de las 96 h, se

observaron pelotillas de micelio (pellets) y a las 196 h, cuerpos hifales mayores y
más abundantes fueron encontrados. A las 240 h, las blastosporas mostraron
vacuolas bien definidas y produjeron tubos germinales después de ese momento,
los propágulos fueron menos evidentes y lo que predominó en el cultivo fueron las
pelotillas de micelio.
En el caso de EH-50613 (Figura 12), a las 6 h, los tubos germinales ya eran
relativamente largos, cuando se compararon con los otros dos aislados. A las 12 h,
dichos tubos germinales continuaron creciendo, pero también se observaron
blastosporas típicas, como la señalada en la figura 12. A las 18 h, se observó que
había mayor cantidad de cuerpos hifales, los cuales continuaron apareciendo hasta
las 48 h. La relación largo-ancho, mostró que los tubos germinales alcanzaron un
tamaño máximo, y posteriormente dicha relación disminuyó, lo que también señaló la
presencia de cuerpos hifales. A las 60 h y 84 h, de nuevo comenzaron a observarse
tubos germinales, pero esta vez se originaron a partir de las blastosporas y cuerpos
hifales. Dicho crecimiento continuó hasta que se formaron pelotillas de micelio.
A las 6 h, el aislado EH-501313, presentaba conidios germinando (Figura 13),
dichos tubos germinales alcanzaron un máximo entre las 12 y 18 h del cultivo, como
lo indican los valores de relación largo-ancho enlistados en la tabla 6. A partir de las
24 h, comenzaron a observarse una gran cantidad de cuerpos hifales, a partir de los
cuales se originaron blastosporas o conidios sumergidos. A partir de éstas
estructuras, comenzaron a originarse nuevos micelios, observados a partir de las 72
h. A partir de ese momento, comenzaron a formarse pelotillas de micelio, las cuales
permanecieron hasta las 312 h del cultivo.

En el caso de EH-520/3, se observó una transición un poco más lenta, ya que
a las 6 h, se observaron conidios hinchados (Figura 14) y hasta las 12 h, se
observaron blastosporas. También se observó la aparición de hifas grandes, a partir
de las 24 h. A las 36 h, se observaron blastosporas originadas a partir de los septos
de dichas hifas. A partir de las 84 h se observó una gran concentración de cuerpos
hifales y de pelotillas de micelio, las cuales se observaron hasta las 312 h de cultivo.
Diferencias significativas en la concentración de propágulos fueron
observadas entre EH-50613 y los otros dos aislados, EH-50313 y EH-52013. Las
mayores concentraciones de propágulos ocurrieron a diferentes tiempos para cada
aislado. A las 96 h, 1.0 x10 7 propágulos/ml para EH-50613; a las 60 h, 7.7 x 107
propágulos/ml para EH-50313 y 6.4 x 107 propágulos/ml para EH-52013.
65
Tabla 6. Relación largo-ancho de los propágulos (cuerpos hifales, células
levadunformes, hifas cortas y conidios sumergidos) de P. fumosoroseus en
medio H con caseína.
Tiempo Aislado Largo/ancho Estado de desarrollo (tipo de morfología)
EH-50613 2 . Oa Conidios (1)
Oh EH-50313 2 . Oa Conidios (1)
EH-52013 2 . Oa Conidios (1)
EH-50613 2.1 (+05)a.b Conidios germinando (III)
6h EH-50313 2,3 (0,4)b Conidios germinando (III)
EH-52013 1.9 (±0 . 4)a Conidios hinchados (II)
EH-50613 8.5 (±2.57)b Cuerpos hifales, blastosporas (V, VI)
12 h EH-50313 16 (±3 . 11)c Conidios germinando (III)
EH-52013 5 (±5 . 16)a Conidios germinando (III)
EH-50613 5.1 (±2 . 16)a Cuerpos hifales, blastosporas (V, VI)
18 h EH-50313 4.5 (±2.11) a Cuerpos hifales, blastosporas (V,VI)
EH-52013 6.9 (±6 . 5)a Cuerpos hifales, blastosporas (V,VI)
EH-50613 44 (±1.5) a Cuerpos hifales, blastosporas ( y, VI)
24 h EH-50313 4.6 (±1.7)' Cuerpos hifales, blastosporas ( y, VI)
EH-52013 10.4 (±7.4)b Cuerpos hifales, blastosporas ( y, VI)
EH-506/3 44 (±1,5) a Cuerpos hifales, blastosporas ( y, VI)
36 h EH-503/3 4.6 (±1.7) a Cuerpos hifales, blastosporas ( y, VI)
EH-52013 10.4 (±7.4)b Cuerpos hifales, blastosporas ( y, VI)
EH-50613 5.4 (±2.3)b Cuerpos hifales, blastosporas (V, VI)
48 h EH-50313 3.2 (±1.2) a Cuerpos hifales, blastosporas (V, VI)
EH-52013 5.1 (±2 . 5)a Cuerpos hifales, blastosporas (V, VI)
EH-50613 5.5 (±2.4)" Cuerpos hifales, blastosporas (V, VI)
60 h EH-50313 4.1 (±1.4 la Cuerpos hifales, blastosporas ( y, VI), conidios sumergidos
EH-52013 4.6 (±j )a, Cuerpos hifales, blastosporas (y, VI), conidios sumergidos
EH-50613 4.8 (±1.2) a,b Cuerpos hifales, blastosporas (y, VI)
72 h EH-50313 4.3 (±O. 9)a Cuerpos hifales, blastosporas (y , VI), conidios sumergidos
EH-52013 55 (±1.3)b Cuerpos hifales, blastosporas ( y, VI), conidios sumergidos
EH-50613 4.5 (±09) Cuerpos hifales, blastosporas (y , VI)
96 h EH-50313 4.03 (±0.81 )a Cuerpos hifales, blastosporas ( y, VI), conidios sumergidos
4.0 (±j.j)a Cuerpos hifales, blastosporas (y, VI), conidios sumergidos
EH-52013
letra no son diferentes significativamente.
66
Oh
- 1- ED:I
ED: III
- Q6h
• -.
' ED:V.VI
ED:V.VI
12 h
84h ED:V,Vi
Oh 18h
ED:V,VI
1
ED;V.VI
)
ED:V.VI
-
ED:V,VI
36h
48h z^ Ci 2
Figura 12, Cinética de la transición conidio-bíastospora del aislado EH-50613 en medio H con caseína al 1%. Obsér
hifales (18h) y las blastosporas típicas (6h). ED: estadio de desarrollo. 1: conidios, III: conidios germinando. V: cu
blastosporas
E=:>
UN
ED: Hl
/T
CI,. 1
8h
ED:V,VI
ED: III
18 h
ED: y, VI
46 h
Figura 13. Cinética de la transición conidio-blastospora del aislado EH-50313 en medio H con caseína al 1%. Obsérves
de cuerpos hifales a partir delas 24 h. A las 80 y 96 h, se observaron conidios sumergidos (flechas). ED: estadio de de
III: conidios germinando, V: cuerpos hifales, VI: blastosporas.
68
A 5 wri E
-- I>
= l--
Oh
ED.V.VI
ED; 1
8h
ED:ll 1
12h
ED:Ill,V.Vl
V, VI
• 1 34h
ED;V,VI
fr 72b
18 h
60h ED: V, Vi
ED:V,Vl
ED:V,V
ED:V,VI
ED:V,VI
36h
48 h
Figura 14. Cinética del a transición conidio-blastospora del aislado EH-52013 en medio H con caseina al 1%. Obsérven
originadas a partir de los septos hifales a las 36 h. ED: estadio de desarrollo. 1: conidios, III: conidios germinando, V:
blastosporas.
Producción de propágulos en medio sintético adicionado con quitina coloidal
En el presente estudio, también se obtuvo una producción de propágulos en
un medio rico, similar a las condiciones nutrimentales que encuentra el hongo
cuando entra en contacto con la cutícula del insecto. Esto es, en el medio sintético
con quitina coloidal, se observaron también cuerpos hifales y blastosporas (Figuras
15-17). El conidio se hinchó (ED: II) y comenzó a producir uno o más tubos
germinales (ED: III). Durante los primeros tiempos de muestreo, se observó un
desarrollo diferencial de los tres aislados utilizados: a las 12 h, EH-50613 y EH-50313
ya habían producido tubos germinales (ED: III), mientras que EH-52013, comenzó a
germinar hasta las 24 h, (Tabla 7). A las 36 h, los tres aislados produjeron
blastosporas primarias (ED: y); originadas de los septos y puntas de las hifas; así
como gran cantidad de blastosporas gemando (ED: V) y en menor medida cuerpos
hifales (ED: VI). Después de 48-96 h, estructuras ovales y estrechas, semejantes a
hitas cortas fueron observadas, éstas producían principalmente blastosporas (ED: y).
A partir de las 96 h, se observaron pelotillas de micelio (pellets) rodeando las
partículas de quitina del medio, lo que predominó hasta las 196 h en el cultivo fueron
las pelotillas de micelio. Después de las 196 h, prácticamente había desaparecido
todo el material particulado del medio.
A las 6 h, el aislado EH-50613, ya había comenzado a producir cuerpos hifales
(Figura 15), los cuales se alargaron y alcanzaron su máximo tamaño entre las 12 y
24 h de acuerdo con la relación largo-ancho mencionada en la tabla 6. A las 24 h, se
observó una mayor cantidad de cuerpos hifales largos, que estaban asociados a las
partículas de quitina, después de ese tiempo, se observó una gran cantidad de
70
cuerpos hifales y al mismo tiempo, pelotillas de micelio que englobaron a las
partículas de quitina, dicha quitina, fue desapareciendo progresivamente del medio
de cultivo.
El aislado EH-50313 produjo blastosporas típicas a las 12 h de cultivo (Figura
16), las cuales continuaron apareciendo hasta las 24 h, también se observó ¡a
presencia de pelotillas de micelio asociadas a la quitina. A partir de las 36 h, se
observaron conidios sumegidos y a las 72 h, tubos germinales originados de dichos
conidios.
El aislado EH-52013, presentó conidios hinchados (Figura 17) y blastosporas
típicas a las 6 h. Este aislado presentó blastosporas con varias yemas, así como
conidios sumergidos originados a partir de cuerpos hifales cortos. También se
observaron, como con los otros dos aislados, pelotillas de micelio asociadas a la
quitina.
Las concentraciones de propágulos fueron, para EH-50613, 1.1 x 10

105 propágulos/ml a las
propágulos/ml a las 36 h de incubación, para EH-50313, 1.3 x
72 h y para EH-52013, 6.4 x 10 5 propágulos/ml a las 12 h.
71
• / 1
4 1
Oh
96h ED:I
ED:V,Vl
8h
D:$ll.V.VI
12h
ED:VVI
84 h
FO V. VI
VI iJ\
¡
72h EV VI
60 h
•p
24h
- - *- 1
48h 36 h
FO: V,VI FO V. VI
E0:V,VI
Figura 15. Cinética de la transición conidio-blastospora del aislado EH-506/3 en medio sintético con quitina coloidal a
cuerpos hifales orientados hacia la quitina a las 36 h. ED: estadio de desarrollo. 1: conidios, III: conidios germinando, y
blastosporas.
72
0001 - '---
=:^ M
__
-i^
Oh
ED:i
- 915 h
ED:V,VI
ED:IIIV.VI
- 72 h
ED: VVI
ú7> ED:V,V
::v1
ED:V,VI
_.1!]
38 h
Ef' V. VI
49 h
18h
ED: V.VI
24h
<^D
Figura 16. Cinética de la transición conidio-blastospora del aislado EH-50313 en medio sintético con quitina coloidal al
conidios sumergidos (flecha) a las 36 y 48 h. ED: estadio de desarrollo. 1: conidios, III: conidios germinando, V: c
blastosporas.
73
I>
96 h eh
Oh JT
EO:V.VI ED: 1
EO:V.VI
ED: ILVI
84h
ED: V. \11 h
l2h
E O: V. VI
18h
ED;V.VI
60h ED: V. Vi
EO:V,VI
48h
ED:V,VI
36 h
Figura 17. Cinética de la transición conidio-blastospora del aislado EH-52013 en medio sintético con quitina cooidil al 1
conidios sumergidos originados a partir de cuerpos hifales cortos a las 36 h. ED: estadio de desarrollo. 1: conidios, III co
V: cuerpos hifales, VI: blastosporas.
74
El tamaño de los conidios aéreos usados para la inoculación y medidos
después de la incubación por 10 días a 28°C en medio H sólido fue de 5± 0¡am de
largo y 2.5 ± O p.m de ancho. El tamaño de los propágulos se determinó al dividir
largo/ancho en cada tiempo de muestreo (Tabla 6 y 7).
De manera general, la relación largo/ancho obtenidos en medio H fueron
mayores a aquellos obtenidos en medio sintético. A las 12 h, EH-50313 mostró un
relación largo/ancho de 16 cuando se cultivó en medio H, este tamaño corresponde a
hifas cortas. Para las 24 h, todos los propágulos sumergidos, excepto los obtenidos
con EH-52013 en medio sintético, mostraron relaciones largo/ancho más altas que los
conidios aéreos. Diferencias significativas (P<O.05) fueron observadas entre el
tamaño de los propágulos (Tabla 6 y 7) en casi todos los tiempos de muestreo.
75
Tabla 7. Relación largo/ancho de los propágulos (cuerpos hifales, células
levaduriformes, hifas cortas y conidios sumergidos) de P. fumosoroseus en
sintético con quitina coloidal.
Tiempo Aislado largo/ancho Estado de desarrollo (tipo de morfología)
EH-50613 2. oa Conidios (1)
Oh EH-50313 2.0a Conidios (1)
EH-52013 2.0 Conidios (1)
EH-50613 2.23 (±1.1)a Conidios germinando (UI)
6h EH-50313 2.2 (±1.1)a Conidios germinando (III)
EH-52013 2.07 (±1.1)a Conidios hinchados, blastosporas (II, VI)
EH-50613 4.4 (+034) Cuerpos hifales, blastosporas ( y, VI)
12 h EH-50313 4.45 (±0.34) Cuerpos hifales (V)
EH-52013 2 (±0.34)a Cuerpos hifales(V)
EH-50613 71(064)b Cuerpos hifales, blastosporas (V, VI)
18 h EH-50313 59(+064)b Cuerpos hifales, blastosporas (V,VI)
EH-52013 2.23(±0.64)' Cuerpos hifales, blastosporas (V,Vl)
EH-50613 4 . 6(±0. 65)b Cuerpos hifales, blastosporas ( y, VI)
24 h EH-50313 2.67(±0.65)a Cuerpos hifales, blastosporas (V. VI)
EH-52013 47(±065)b Cuerpos hifales, blastosporas ( y, VI)
EH-50613 3.77(±0.26)' Cuerpos hifaLes, blastosporas ( y, VI)
36 h EH-50313 2.4(±0.26)a Cuerpos hifales, blastosporas (V, VI)
EH-52013 2.33(±0.26)a Cuerpos hifales, blastosporas (V, VI)
EH-50613 4.3(±0.41 )b Cuerpos hifales, blastosporas (V, VI)
48 h EH-50313 2.58(±0.41)a Cuerpos hifales, blastosporas ( y, VI)
EH-52013 388(041)b Cuerpos hifales, blastosporas (V, VI)
EH-50613 3. 33(±O . 44) ab Cuerpos hifales, blastosporas (V, VI)
EH-52013 4•03(044)b Cuerpos hifales, blastosporas (V, VI)
EH-50613 38(049)ab Cuerpos hifales, blastosporas ( y, VI)
EH-52013 485(+049)b Cuerpos hifales, blastosporas (V, VI)
EH-50613 463(+047)b Cuerpos hifales, blastosporas (V, VI)
EH-52013 3.31(±0.47) a Cuerpos hifales, blastosporas ( y, VI)
Con base en las observaciones obtenidas en ambos medios de cultivo, se
propone un esquema general de la transición de conidio a blastospora de aislados de
P. fumosoroseus de México (Figura 18). Dicho esquema, comprende el hinchamiento
76
del conidio, el cual puede producir un tubo germinal que a su vez generará una
blastospora o bien, producir directamente una levadura, posteriormente, dicha
blastospora germina y da lugar a un cuerpo hifal o a hitas cortas, estas estructuras,
pueden dar origen a su vez, a blastosporas secundarias o a conidios sumergidos, los
cuales, al germinar, generarán nuevos cuerpos hifales, conforme el cultivo envejece,
comenzarán a desaparecer las blastosporas y cuerpos hifales, para encontrar en su
lugar, pelotillas de micelio.
c o d
b
y72 -
4
e
/
1
g
f
Figura 18. Esquema general de la transición de conidio a blastospora de aislados de P. fumosoroseus

de México. a) conidios sin germinar. b) conidio produciendo un tubo germinal. c) hifas producienou
blastosporas. d) cuerpos hifales. e) cuerpos tiifales produciendo conidios sumergidos. 1) conidio
produciendo una levadura. g) blastospora típica originada a partir de un conidio. ti) cuerpos hifales
originados de conidios.
77
Pruebas de virulencia
Determinación del índice de Crecimiento y Desarrollo Fúngico
El IDCF proporcionó una perspectiva de los eventos cronológicos de la
infección de P. fumosoroseus hacia la mosquita blanca. La tabla 8 describe el ICDF
para los tres aislados. Entre las 6 y las 24 h del ensayo, se observaron diferencias
(P<0.05) entre los aislados. A las 6 y 12 h, los valores del ICDF para las ninfas
tratadas con EH-50613 fueron significativamente diferentes de aquellos observados
en las ninfas tratadas con EH-50313 y EH-52013. A las 18 y 24 h, los tres aislados
mostraron diferencias significativas entre ellos. A las 36 y 48 h, los valores del ICDF
para las ninfas tratadas con EH-50613 y EH-50313 fueron los mismos, y fueron
significativamente diferentes de los obtenidos en las ninfas tratadas con E1-1-52013. A
las 60h los tres aislados alcanzaron el mismo valor de ICDF. La figura 19 muestra
una ninfa 4 sana y la 20, ninfas a las O h de incubación
El aislado EH-50613, germinó y colonizó más rápidamente las ninfas, que los
otros dos, señalándolo como el más virulento. A las 6 h, este aislado mostró
germinación de los conidios en el área cercana a la ninfa (ICDF0.5), mientras que
este valor fue alcanzado por los otros dos aislados hasta las 12 h (Tabla 8). A las 12
h (Figura 21), el micelio de EH-50613 estaba creciendo en la superficie del
hospedante (ICDF=2.0), aparentemente, ya había emergido del mismo. En este
mismo tiempo, los otros dos aislados, comenzaban la germinación en el área
cercana a la ninfa y en el caso de E1-1-52013, lo que se observaba principalmente
eran conidios hinchados. A las 18 h de incubación (Figura 22), las ninfas tratadas con
EH-50613 mostraban unos pocos conidiáforos en su superficie, con la esporulación
78
característica de Paecilomyces (ICDF2.5). A este mismo tiempo de incubación, las
ninfas tratadas con EH-50313 mostraban hifas orientadas hacia la ninfa, y algunas de
ellas ya tenían un contacto con el cuerpo del hospedante (ICDF = 1.5). A las 18 h, el
aislado EH-52013 desarrolló uno o más tubos germinales en la cercanía de la ninfa
(ICDF = 0.5). A las 24 h (Figura 23), EH-50613 mostraba el mismo ICDF (2.5) y EH-
50313 desarrollaba un crecimiento micelial denso en la ninfa, sugiriendo emergencia
de las hifas a partir del hospedante. En este mismo tiempo, el ICDF para EH-52013
era de 1, ya que los conidios estaban germinando, y muy pocos tubos germinales
mostraban contacto primario con la ninfa. A las 36 h (Figura 24), EH-50613
continuaba esporulando y EH-50313 iniciaba la esporulación en la superficie de las
ninfas (ICDF = 2.5). EH-50313 continuó con un crecimiento micelial denso, y las ninfas
tratadas con este aislado, mostraban daño estructural, así como cambio de forma.
Las ninfas testigo o tratadas con los otros das aislados, conservaron la forma típica
del insecto, aún durante el proceso de manipulación. A este mismo tiempo (36 h), las
ninfas tratadas con EH-52013 mostraban un ICDF de 1.5, ya que las hifas
comenzaban a colonizar el hospedante. A las 48 h (Figura 25) , las ninfas tratadas
con EH-50613 estaban completamente cubiertas de micelio (ICDF=3.0), pero no se
observó nuevamente esporulación; por otro lado, EH-50313 mostraba una
esporulación profusa, y se notaban conidióforos prácticamente en toda la superficie
de los insectos. EH-52013 creció más despacio en comparación con los otros dos
aislados, y alcanzó el máximo del ICDF hasta las 60 h (Figura 26) , mostrando
también esporulación profusa que continuó hasta las 72 h (Figura 27). Todas las
ninfas fueron incubadas hasta las 96 h (Figura 28) para seguir el proceso de
79
infección, y en este momento, los tres aislados mostraron una colonización completa
de la superficie del hospedante. Las ninfas tratadas con EH-50313 mostraron grandes
alteraciones en la cutícula, en algunos casos, perforaciones mayores; este fenómeno
no fue observado con los otros dos aislados, por lo que dicho daño pudo atribuirse a
la acción del aislado sobre la cutícula.
Tabla 8. índice de Crecimiento y Desarrollo Fúngico de tres aislados de

Paecílomyces fumosoroseus.
Tiempo (h) EH-50613 (± DS) EH-50313 (±DS) EH-52013 (±DS) --

o o o
6 0(±0.14)a 0(±0.9)a
12 2.0(± 03)b 0.5(±0.23)a 0.5(± 0.18)a
18 2.5(±0.13)0 1,5(±0.2 1 b 0-5(± 0.15)a
24 2.5(± 0.1)° 2.0(±0.32) 1.0(± 0.21)a
36 2.5(± 006)b 2.5(± 018)b 1.5(± 0.25)a
48 3.0(± 0.13)b 30(+016)b 2.0(± 0.34)a
60 3.0(± 0.08)a 3.0(± 0.09) 3.0(± 0.19)a
valor crítico de comparación de rangos múltiples de Tukey, los promedios que comparten ¿a misma
- r
• - ,.
•,
.3 mm
Figura 19. Ninfa testigo en cuarto estadio.
80
a b c
-.
-5am 0.3 mm
Figura 20. Ninfas de Trialeurodes vaporariorum y conidios de Paecilomyces fumosoroseus a las O II de
incubación, a) Aspecto de los conidos de EH-50613. b) Ninfa en cuarto estadio recién infectada con
EH-50313. c) Conidios de E1-1-52013, al ser depositados sobre las ninfas.
LA
b
-
r
0.1 mm
1 0.1 mm
Ü1mm
Olmm
Figura 21. Ninfas de Trialeurodes vaporariorum a las 12 h de incubación con tres aislados de
Paecilomyces fumosoroseus. a) Hitas de EH-50613 emergiendo de la ninfa, ICDF 2. b) Tubos
germinales de EH-503/3 alcanzando la ninfa a las 12 ti de incubación (ICDF0.5). c) Conidios de EH-
52013 con uno o varios tubos germinales, ICDF=0.5.
81
b C
1'
•
0
, '
___0.1 mm 0.1 mm •..i!'fl1

-- ..
C
0.1mm U.] MM
Paecilomyces fumosoroseus. a) Hifas de EH-506/3 emergiendo de la ninfa, con conidióforos y
conidios (ICDF= 2,0 y 2.5, respectivamente). b) Tubos germinales de EH-50313 en contacto con la
ninfa a las 18 h de incubación (COF=t 5). c) EH-52013 con uno o varios tubos germinales, ICDF 0.5.
d) Conidióforos de EH-50613 ampliados.
a a
O. 1 mm ç(i yn
c
AY
Figura 23. Ninfas de Tnaleurodes vaporariorum a las 24 h de incubación con tres aislados de
Paediomyces fumosoroseus. a) y b ) Ninfa con crecimiento micelial de EH-506/3y EH-50313
respectivamente, dentro y en su superficie (ICDF=2.0) a las 24 h de incubación. c) EH-520/3 con un
crecimiento de tubos germinales y presencia de hifas, ICDF=1
82
a
•,
L1L
0.1 mm u.i mm
C
OIM, M m
Figura 24. Ninfas de Trialeurodes vaporanorum a las 36 h de incubación con tres aislados de
Paediomyces fumosoroseus. a) Esporulación completa de EH-50613 en la ninfa a las 36 h de
incubación (ICDF= 3.0) b) Ninfa cubierta por completo de micelio de EH-50313 a las 36 h de
incubación (ICDF=2.5). c) Tubos germinales de EH-52013 haciendo contacto con la ninfa de mosquita
blanca (ICDF=1 .5) d) Conidióforo de EH-50613 ampliado, señalado en la figura a con un círculo.
a C
- 0.1 im 0.1i ___ 0.1 mm

Figura 25. Ninfas de Trialeurodes vaporanorum a las 48 Ii de incubación con tres aislados de
Paecilomyces fumosoroseus. a) Ninfa completamente esporulada con EH-50613 (ICDF 3.0). b)
Aspecto de la ninfa a las 48 h de incubación con EH-50313 (ICDF= 3.0). La flecha señala el daño
cuticular producido presumiblemente por las quitinasas del hongo. c) crecimiento micelial de EH-52013
dentro y sobre la superficie de la ninfa (ICDF= 2.0).
83
.1 mm 0.1 mm
C d
5mm
Figura 26. Ninfas de Trialeurodes vaporariorum a las 60 Ii de incubación con tres aislados de
Paeciiomyces fumosoroseus, Aspecto de las ninfas a las 60 h de incubación con los tres aislados a)
EH-50613, b) EH-503/3 c) EH-52013, hasta este momento se alcanzó el ICDF de 3.0. d) Conidióforo
de EH-52013 ampliado.
M4^ MM
1! -5 Mm
Paecilomyces fumosoroseus. a) EH-50613, b)EH-50313. El círculo señala el hueco en la cutícula
provocado por la acción del hongo. c) El-1-52013, d) Conidióforo ampliado de EH-52013.
84
a
- 1
- k
"
C
rr .. ; O.1 mm
Figura 28. Aspecto de las ninfas a las 96 ti de incubación con los tres aislados a) Conidioforo de EH-
06I3 emergiendo de la ninfa. b)EH-50313. La flecha señala el hueco de la cutícula provocado por la
acción del hongo. c) Micelio de EH-52013.
Microscopía electrónica de barrido (MEB)
La MEB mostró que tos conidios de ambos aislados de P. fumosoroseus son
capaces de adherirse en cualquier tipo de la superficie de la ninfa, especialmente en
la zona del raquis y del orificio vasiforme. En general, EH-50613 mostró menos
crecimiento micelial, pero un daño cuticular más severo en la vecindad de las
estructuras fúngicas, comparado con EH-52013.
La figura 29 muestra una ninfa testigo, que permaneció con su forma intacta y
sin daño cuticular después de la manipulación. En las ninfas testigo, no se observó
crecimiento fúngico, casi todos los insectos de este lote experimental alcanzaron el
último estadio de desarrollo (ninfa cuatro en subestadio tres).
Todas las ninfas tratadas con EH-50613 y EH-52013 mostraron señales de
infección. En la mayoría de los casos, un solo tubo germinal emergió de cada conidio
y se alejó cierta distancia del mismo antes de penetrar. A las 0 h, los conidios de EH-
50613 y EH-52013 (Figuras 30 a 32) fueron encontrados en la superficie de la ninfa, y
cerca del orificio vasiforme del insecto. Se observó también la microbiota natural de
la ninfa (bacterias). Los conidios adheridos de EH-50613 fueron más abundantes
8
comparados con EH-52013. A las 6 h (Figuras 33 a 35), los conidios de los dos
aislados mostraron una matriz extracelular que aparentemente les dió una mayor
capacidad de adherencia. Las ninfas tratadas con EH-52013 mostraron una mayor
cantidad de matriz, aún lejos de los conidios, en la zona del orificio vasiforme. Dicha
matriz contenía pequeñas piezas de la cutícula que ya había sido degradada.
También pudieron observarse conidios que habían comenzado a germinar. Las
ninfas tratadas con EH-50613, mostraron un gran daño cuticular en el área cercana al
sitio donde fueron depositados los conidios. Asimismo, a las 6 h, las ninfas tratadas
con EH-52013 mostraron también daño cuticular, pero menos severo que el mostrado
por las ninfas tratadas con EH-50613. Para las 12 h, las ninfas tratadas con EH-50613
(Figura 36) continuaron mostrando daño cuticular, e incluso huecos en la superficie
de la ninfa, la cual estaba cubierta por una matriz extracelular, producida
probablemente por este aislado, así como una gran cantidad de desechos cuticulares
depositados en la superficie de la ninfa. El desarrollo de las hifas continuó y fue más
rápido y denso que el observado para EH-52013.
A las 12 h, EH-52013 (Figura 37-40) formó estructuras en la punta de las hifas
que eran morfológicamente semejantes a los apresorios. Esas estructuras fueron
observadas principalmente cuando las hifas se desarrollaron en el raquis, donde la
cutícula cercana a las hífas y a los apresorios estaba acompañada con una delgada
matriz extracelular. En esa misma zona, se observó que los tubos germinales
estaban orientados hacia huecos de la cutícula. Una capa mucilaginosa fue
observada en la cercanía de las hifas y de las estructuras parecidas a apresiorios, a
las 12 h de incubación con EH-52013. También se observó la penetración de la
86
cutícula y una zona ligeramente más clara rodeando el apresorio. A las 18 h. EH-
50613 mostró crecimiento micelial y conidios con tubos germinales largos, embebidos
en una matriz mucilaginosa (Figura 41). También se observó crecimiento hifal de EH-
52013 (Figura 42 y 43) hacia el orificio vasiforme, y penetración de las hifas a través
de dicha área. En algunos casos pudo observarse la penetración directa de la
cutícula sin estructuras semejantes a apresorios. Una matriz mucilaginosa también
se observó cubriendo las hifas. A las 24 h, las hifas y los apresorios de EH-50613
(Figura 44) aparentemente penetraron a través de la zona del orificio vasiforme. Las
ninfas tratadas con EH-52013 (Figura 45) mostraron un crecimiento hifal denso,
cubierto con la misma matriz mucilaginosa de la superficie de la ninfa. En la zona del
orificio vasiforme se observaron apresorios bien desarrollados, así como hifas
penetrantes, así como fiálides en la punta de las hifas de ambos aislados.
A las 48 h, las ninfas tratadas con EH-50613, estaban densamente colonizadas
con micelio, debajo del cual, podía verse una matriz mucilaginosa delgada, así como
daño y huecos en la cutícula. Interesantemente, pudo observarse la producción de
conidios (Figura 46).
El mismo tipo de crecimiento se observó con EH-52013. A las 60 h, los
aislados habían completado su ciclo de vida y el hongo había emergido de los
cadáveres de las ninfas.
87
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vasiforrne
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Raquis
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Figura 29. Ninfa testigo de Trialeurodes vaporanorum sin inocular
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Figura 30 - Conidios de EH-50613 a O h de incubación sobre la zona del raquis.
88
Figura 31. Conidios de EH-50613 a O h de incubación. Obsérvese la presencia de una ligera capa de
mucilago sobre los conidios (en un círculo). La flecha muestra la microflora de la mosquita.
¿.
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Figura 32. Conidios de EH-52013 a O h de incubación. Los conidios se encuentran en la zona del
orificio vasiforme. La flecha señala su posición exacta.
Figura 33. Conidios de EH-50613 a las 6 h de incubación. Obsérvese una gran cantidad de conidios,
presumiblemente adheridos ya a la cutícula (en el círculo).
89
Figura 34. Conidios de EH-52013 a las 6 h de incubación. La flecha señala una ligera capa de
mucílago adyacente a los conidios.
Figura 35 Daño cuticular provocado por EH-52013 a las 6 ti de incubación. La flecha señala huecos
producidos presumiblemente por las enzimas del hongo. El círculo muestra la capa mucilaginosa
producida por el hongo.
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Figura 36. Daño cuticular provocado por EH-506/3 a las 6 h de incubación. Las estructuras fúngicas
no son visibles, con excepción del apresorio señalado con la flecha azul. Sin embargo, puede
observarse la presencia de una capa de mucílago (círculo), así como huecos (flecha en blanco),
presumiblemente provocados por la acción enzimática.
Figura 37. Estructura de EH-52013 que semeja un apresorio a las 12 h de incubación. El apresoirio se
formó un pliegue de la zona del raquis.
Figura. 38. Hifa de EH-52013 dirigiéndose hacia un hueco de la cutícula a las 12 h de incubación. La
flecha señala el hueco. El círculo señala un daño cutícular aparentemente producido por el hongo.
Figura 39. Matriz mucilaginosa que cubre a hitas de EH-52013 a las 12 h de incubación. El recuadro
señala la hifa cubierta de la matriz, así como una extensión de ésta sobre la cutícula del insecto,
relativamente lejana de la estructura fúngica.
92
pr
Figura 40. Crecimiento miceliai de EH-Cí a as 18 h de incubación. Observése la penetración del

hongo a traces del orificio vasiforme (flecha).
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Figura 41. Hifas de EH-50613 a las 18 de incubación Id flecha muestra una capa de mucílago sobre
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las hifas
Figura 42. Hitas de EH-50613 penetrando directamente la cutícula a las 24 h de incubación. El círculo
señala el sitio donde una hifa está penetrando.
93
Figura. 43. Crecimiento de EH-50613 a traves del orificio vasiforme a las. 24 h de incubación. El círuclo
señala una estructura semejante a una fiIide.
iA
Figura 44. Crecimiento de EH-52013 a traves del orificio vasiforme a las 24 h de incubación La flecha
señala una estructura semejante a una fiálide.
W
IVA IL
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1
Figura 45. Crecimiento de EH-52013 en la superficie de la ninfa a las 24 h de incubación. Obsérvese la

orientación de las hitas hacia la superficie de la ninfa
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Figura 46. EH-50613 creciendo en la superficie de la ninfa a 48 h de incubación, Obsérvense los

huecos y la presencia de mucílago sobre la cutícula. Sobre el micelio pueden conidios desprendidos
Microscopia electrónica de Transmisión (MET)
Se corroboró la unión al anticuerpo monoclonal contra la aglutinina de germen
de trigo, al hacer ensayos de DOT ELISA y obtener resultados positivos al reaccionar
el anticuerpo con avidina-peroxidasa y no obtener reacción con las proteínas de
referencia utilizadas. El anticuerpo entonces se utilizó para detectar las quitinasas de
EH-50613.
A las 6 h de incubación, el hongo había penetrado la pared de la ninfa (Figura
47-51), y se pudo observar claramente la presencia de hifas que estaban más allá de
la pared de la mosquita (figura 49), así como estructuras esféricas, probablemente
blastosporas en el tejido de la ninfa. Sin embargo, no se observó una gran cantidad
de marcas de oro coloidal que señalaran la quitinasa.
95
-
EH-506
.t.
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Figura 47. Penetración de EH-50613 a las 6 h de incubación. Obsérvese la estructura fúngica

adyacente a la pared de la ninfa.
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cavidad
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Figura 48. EH-50613 penetrando a la ninfa a las 6 h. Las flechas señalan el sitio de unión del
anticuerpo biotinilado con la quitinasa. Las puntas de las flechas señalan estucturas fúngicas cercanas
a la cavidad de la ninfa.
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EH-506 1 6 h
Figura 51 Aspecto de las hfas de EH- 15 0613 penetrando la mosquita blanca a las 6 h de incubación.
98
DISCUSIÓN
Debido a que es la primera vez que se determinan proteasas tipo tripsina (Pri)
y tipo subtilisina (Pr2) en P. fumosoroseus (Castellanos-Moguel et al., 2006), se
tuvieron que adaptar y modificar las condiciones de medición de estas enzimas
descritas para otros hongos entomopatógenos, en especial para M. anísopliae
(Gillespie etal., 1998).
La actividad proteolítica total se detectó por el método de la azocaseína
(Sarath et al., 1989), ya que este es un método colorimétrico que permitió detectar la
presencia de cualquier tipo de proteasas en el sobrenadante del cultivo. Este
método, por tener su máxima absorbencia a los 440 nm, no mostró interferencias
causadas por compuestos que pudiera haber producido el hongo al mismo tiempo,
como la toxina beauvericina (Kleinkauf y van Dóren, 1987).
Se tomaron muestras cada 6 h durante las primeras 24 h del experimento,
debido a que en la literatura consultada (St. Leger et aL, 1987), se menciona que las
primeras horas de cultivo es el momento en el que aparecen las proteasas en el
sobrenadante, posteriormente, las muestras se espaciaron a cada 12 h hasta las 96,
y a partir de ese momento, se tomaron cada 24 h, debido a que no se detectaba una
actividad proteolítica alta. Durante las primeras 96 h, dicha actividad se mantuvo más
o menos constante para los tres aislados y osciló entre las 3 y 10 UP/ml. Esta
actividad relativamente baja, pudo deberse a los componentes del medio de cultivo,
ya que las proteasas de M. aniso pliae están sujetas a la represión por la cantidad de
nitrógeno presente en el medio de cultivo (Paterson et al. 1993, 1994a y 1994b). Por
99
otra parte, las proteasas extracelulares de ciertos hongos, se producen tardíamente,
como lo señala López-Llorca (1990) para V. suchlasponum, el cual produce
proteasas alcalinas con un máximo de actividad a los 12-14 días de incubación.
Debido a que en la bibliografía consultada no se encontró una técnica para
medir la actividad de Pri y Pr2 específicamente en P. fumosoroseus, se montó la
técnica de acuerdo a lo propuesto por Gillespie et al. (1998) para la Pri y Pr2 de M.
anisopliae. El montaje de la técnica se realizó con un solo aislado, EH-50613, ya que
presentó la actividad de proteasas totales más rápidamente. Se hicieron algunas
modificaciones, como el uso de Tris en la mezcla de reacción de la determinación de
la actividad, ya que las propiedades de las enzimas que degradan la cutícula pueden
no ser las óptimas para todos los hospedantes o medios donde se están produciendo
(Gillespie et al., 1998). La actividad de Pri y Pr2 también es sensible a los cambios
de pH, ya que M. anisopliae presenta disminuciones de actividad enzimática
conforme el pH baja (St. Leger et al., 1998), de ahí la importancia de elegir el
amortiguador mas adecuado para determinar la actividad de P. fumosoroseus.
Los resultados obtenidos de las dos composiciones de la mezcla de reacción
(con Tris y Tris-HCI), mostraron una mayor actividad cuando la enzima estuvo en
presencia de Tris, por lo que se decidió utilizar dicho amortiguador para las
determinaciones de Pri y Pr2 con los tres aislados.
Otro parámetro que se modificó ligeramente fue el tiempo de incubación de la
mezcla de reacción de la enzima, ya que se midió la actividad de Pri cada mm
durante 5 y a partir de ese tiempo, se decidió que el más adecuado fue 1 mm, ya que
se obtuvo la mayor actividad. El tiempo de incubación obtenido para P.
fumosoroseus es semejante al observado para M. anisopllae (Gillespie etal., 1998).
Las actividades enzimáticas de Pri que se obtuvieron con los dos reguladores
y con los diversos tiempos de incubación, se sometieron a un análisis de varianza
(ANOVA), y a una comparación de medias, pero sin embargo, estadísticamente no
hubo una diferencia significativa, por lo que se compararon los resultados de los
estudios cinéticos para cada caso. De acuerdo con esto, se decidió utilizar regulador
Tris y establecer en 1 min el tiempo de incubación de la reacción, para entonces
trabajar con los otros dos aislados EH-50313 y EH-52013.
La actividad de Pri observada en el presente estudio, tuvo actividad contra
caseína. Dicha actividad se presentó después de las 96 h, probablemente por la
riqueza del medio. En M. anisopliae, se ha detectado la actividad de Pri, y se le ha
descrito como una buena proteasa general con actividad contra un espectro amplio
de proteínas, tales como caseína, elastina, albúmina sérica bovina, colágeno y las
proteínas presentes en la cutícula de los insectos (Braga et al., 1994). Peptidasas
análogas han sido encontradas en filtrados de cultivo de B. bassiana, V. lecaníi, N.
rileyi y A. aleyrodis (Charnley y St Leger, 1991, Bidochka et al., 1999).
Las actividades obtenidas en el estudio cinético de Pri, sugieren que es una
enzima inducible. La aparición tardía sugiere una represión por todos los productos
nitrogenados (peptona y extracto de levadura) presentes en el medio de cultivo
(Paterson etal. 1993, 1994a y 1994b). En M. anisopliae, se ha descrito a Pri como
una enzima inducible, con un mecanismo de represión-inducción por carbono y
nitrógeno (Screen etal., 1997).
101
Las altas y bajas de actividad enzimática observadas en este estudio, podrían
deberse a que se detectó actividad simultánea de isoenzimas. Pri de M. anisopliae
ocurre como múltiples isoenzimas (Joshi etal., 1997, St. Leger et al., 1994); se han
identificado a la fecha once genes que codifican para isoformas de Pri (Pr1A- PrIJ,
Pr1G-K) (Freimoser et al., 2003), los cuales han sido detectados en una base de
datos de "Expressed Sequence Tag" (EST), indicando que todos son expresados y
presumiblemente funcionales. La presencia de un número excepcionalmente grande
de isoenzimas de subtilisina está presumiblemente relacionado a la patogenicidad de
M. anisopliae. según Shimizu etal. (1993), el mecanismo de regulación de proteasas
de B. bassiana es desencadenado por los mismos componentes cuticulares del
insecto, ya que la producción de proteasas disminuye cuando la proteína cuticular ha
sido degradada y la quitina ha quedado al descubierto. Es entonces cuando ésta
última actúa como un inductor para las quitinasas, las cuales comienzan a producirse
en mayor cantidad.
Probablemente las diferentes actividades enzimáticas reflejan la actividad
conjunta de diferentes isoformas, algunas de las cuales pueden estar apareciendo y
desapareciendo conforme el hongo va degradando el sustrato (St. Leger et al., 1987;
Chul-Kang et al., 1998). Las subtilisinas de amplio espectro son las principales
proteínas producidas por M. anisopllae y otros entomopatógenos durante la infección
y la degradación de la cutícula de los insectos (St. Leger, 1995).
En el presente estudio se observó una producción característica de Prl para
cada uno de los aislados, reflejando variación intraespecífica, la cual podría estar
asociada con diferencias adaptativas, como ha sido señalado para otros
102
entomopatógenos (St. Leger et al., 1987; Bidochka y Khachatourians, 1994;
Freimoser et al., 2003). En un estudio previo de caracterización genotípica, con
aislados de México y cepas de referencia de P. fumosoroseus, se observó que los
primeros se relacionaron formando un solo grupo, no obstante, entre ellos mostraron
una gran variabilidad genotípica (Cavallazi-Vargas, 2002), lo que apoya la variación
intraespecífica observada en nuestro estudio.
Los tres aislados estudiados también mostraron actividad de Pr2, sin embargo,
la actividad, cuando se campará con la de Pri, fue mucho más baja y relativamente
constante durante el ensayo. Los resultados sugieren que Pr2 es una enzima
constitutiva, ya que a pesar de la gran cantidad de compuestos nitrogenados en el
medio, no presentó una aparente represión de actividad, ni un aumento de la misma.
Una actividad baja y constante de Pr2 ha sido reportada para M. flavoviride
cultivado en medio mineral con cutícula de langosta (Rhammatocerus schicercoides)
o caseína, por Silva-Pinto et al. (2002). Se ha señalado que Pr2 es una enzima
constitutiva pero reprimible en M. anisopliae dependiendo de los niveles de carbono y
nitrógeno del medio de cultivo (Paterson et al., 1993) y probablemente también lo
sea en P. fumosoroseus. La actividad de Pr2 en el presente estudio, se detectó en un
medio con caseína. La tripsina Pr2 de M. anisopliae tiene gran actividad contra
proteínas cuticulares solubilizadas y caseína (St. Leger et al., 1987). Estas enzimas
podrían estar involucradas en los mecanismos de control celular como la
diferenciación, catalizando procesos proteolíticos específicas de activación e
inactivación, y está aparentemente regulada por el nitrógeno presente en el medio de
cultivo (Paterson et al, 1993). Esa regulación por nitrógeno podría explicar los bajos
103
niveles de enzima observados en P. fumosoroseus. Sin embargo, probablemente
esté menos sujeta que Pri a la represión por catabolitos ya que Charnley (2003),
señala que Pr2 quizás no tenga un papel preponderante en la penetración fúngica,
aunque podría complementar la acción de Pri, proveyendo péptidos para la nutrición
(Paterson etal., 1993).
Las quitinasas de nuestro estudio se produjeron en medio sintético con quitina
coloidal teñida con azul brillante de remazol, por lo que pudo medirse la actividad
directamente a partir de los sobrenadantes colectados. La actividad de quitinasas
observada, difiere de la actividad obtenida en estudios previos para estos mismos
aislados (Castellanos-Moguel et al., 2001 a y 2001 b). Dicha variación puede atribuirse
a que los aislados fueron cultivados previamente en medio sintético con agar
adicionado con chapulín molido (Orthoptera: Acrididae) al 1 o 2% antes de la siembra
en medio de glucosa Sabouraud para la obtención de los conidios que se utilizaron
para los estudio cinéticos, tanto de proteasas como de quitinasas. La máxima
actividad de quitinasas de los tres aislados fue observada después de las 168 h, lo
cual coincide con ChuI-Kang et al. (1998), que señalan que las quitinasas se
producen en la última fase del crecimiento en cultivo sumergido. Se detectó un
mínimo de actividad de quitinasas en el momento en que los matraces se sembraron
con los conidios de EH-50613, lo que podría señalar una actividad de dichas enzimas
en los conidios. Este hecho ya ha sido reportada en conidios y conidios con tubos
germinales de B. bassiana, M, anisopliae y N. rileyi (Smith y Grula, 1983; Coudron et
al., 1984).
104
El estudio cinético de las quitinasas de P. fumosoroseus sugiere que son
enzimas inducibles por los componentes del medio, específicamente la quitina,
mencionado también en M. anisopliae (Barreto et al., 2004). Krieger de Moraes et al.
(2003) realizaron experimentos de inducción de quitinasas con diversos sustratos y
señalaron que la N-acetilglucosamina es el inductor específico para las quitinasas de
M. anisopliae. García-Juárez etal. (1999), señalan que V. lecanii produce una mayor
cantidad de N-acetil-J3-glucosaminidasas que otras enzimas, cuantificadas con
APIZYM, las cuales también podrían estar presentes en otros entomopatógenos
como P. fumosoroseus. Cohen-Kupiec y Chet (1998) obtuvieron quitinasas de
Trichoderma cuando lo cultivaron en medio con quitina como inductor.
Además del estudio de actividades enzimáticas específicas de P.
fumosoroseus, también se investigó al mismo tiempo la transición conidio-
blastospora en dos medios de cultivo: medio H adicionado con caseína al 1% y
medio sintético con quitina coloidal. En ambos medios de cultivo, se observó la
aparición de blastosporas típicas, así como de cuerpos hifales antes de 96 h de
incubación. Las blastosporas ya habían sido obtenidas por otros autores para P.
fumosoroseus. En diversos artículos, se señala la aparición de blastosporas durante
las primeras 96 h de cultivo (Vida¡ etal., 1998; Vega etal., 1999; Altre yVandenberg,
2001; Jackson et al., 2003, Vega et al., 2003). Sin embargo, en este trabajo, se
describió con detalle el tiempo de aparición de los diversos propágulos, así como las
diferencias observadas entre aislados de distinta virulencia de la misma especie.
105
P. fumosoroseus ha sido descrito como un hongo que puede crecer y
esporular en una gran cantidad de fuentes de carbono y de nitrógeno (Cliquet y
Jackson, 1999). En el presente estudio, las blastosporas fueron obtenidas en un
medio rico (H), con sacarosa y glucosa, y varias fuentes de nitrógeno, tales como
caseína, peptona y extracto de levadura. Sandoval-Coronado et al. (2001),
encontraron una cantidad similar de blastosporas (5 x 10 7 a las 72 h) a las
encontradas por nosotros con la cepa 612 de P. fumosoroseus en un medio
suplementado con glucosa, peptona y extracto de levadura. Prerenová (1995) señala
que el medio óptimo para la germinación de P. farinosus, contiene peptona. Jackson
et al. (2003) obtuvieron grandes cantidades (6.0 x 10) de blastosporas de P.
fumosoroseus resistentes a la desecación en un fermentador con un medio que
contenía caseína. lssaly et al. (2005) observaron grandes cantidades de blastosporas
de M. flavoviride (1-5.4 x 108 blastosporas/mI) usando una elevada concentración de
nitrógeno y baja de carbono en el medio de cultivo.
En nuestro estudio también se obtuvo una producción de propágulos en un
medio rico, que asemeja las condiciones nutrimentales que encuentra el hongo
cuando entra en contacto con la cutícula del insecto, esto es, el medio sintético con
quitina coloidal. En este medio se observaron además de las blastosporas, cuerpos
hifales. A la fecha, no se conoce un reporte de estructuras levaduriformes en medios
de cultivo con cutícula de insecto o quitina coloidal. Con los tres aislados (E1-1-50613,
EH-50313 y EH-52013) en medio sintético con quitina coloidal, se observó un cambio
de forma en menos tiempo que en medio H, lo cual probablemente se deba a la
quitina coloidal ya que la cantidad de carbono y nitrógeno es semejante a la que
106
contiene la cutícula de los insectos. Es probable que este rápido cambio dimórfico
sea inducido por la presencia de ciertos compuestos derivados de la quitina coloidal
a partir de la esterilización, como por ejemplo, oligómeros de quitina producidos por
el tratamiento térmico, ya que se ha demostrado que M. anisopliae requiere
nutrimentos solubles en agua provenientes de la cutícula del hospedante para
germinar y desarrollarse (Wang y St. Leger, 1995). Braga et al. (1999) señalan que la
N-acetilglucosamina acelera la germinación del hongo. El rápido cambio de forma en
medio con quitina, podría ser explicado también porque la formación de blastosporas
no siempre es dependiente del agotamiento de los nutrimentos, sino de la cantidad
de nitrógeno en el medio (Jackson et al., 1997). Esto pudo ser observado en el
presente estudio, ya que en medio H con caseína hubo crecimiento de tubos
germinales y luego de la aparición de los mismos, comenzaron a observarse las
blastosporas. En cambio, en el medio sintético con quitina, se observó una transición
más rápida. Daigte et al. (1998) obtuvieron blastosporas típicas en 3 días, al incubar
P. fumosoroseus en un medio basa¡ de sales con glucosa y casaminoácidos. En
nuestro estudio, se usó también un medio de sales, pero lo que aparentemente
indujo la transición rápida fue la presencia de la quitina coloidal. Utilizando este
medio se observó que el aislado más virulento EH-50613 fue el que mostró la mayor
rapidez en la transición a blastosporas, seguido por los aislados de mediana y baja
virulencia. Esa relación entre rapidez de transición y virulencia ha sido observada en
el hongo dimórfico patógeno de humanos Histoplasma capsulatum, Las cepas de
este hongo de alta y mediana virulencia expresan el gen yps3 que les permite
adaptarse a aumentos de temperatura cambiando rápidamente de forma (Keath et
107
al., 1989). En M. anisopliae, se han señalado varios factores nutrimentales que
influyen para una rápida germinación, y dichos factores dependen del insecto del
cual fue obtenida la cepa (St. Leger etal., 1994).
P. fumosoroseus tiene una gran plasticidad fenotípica (Vandenberg y Cantone,
2004) reflejada en las diversas formas obtenidas en cultivo in vitro. Se ha
demostrado que M. anisopliae, cuando se cultiva en un medio de sales con gelatina,
tiene un aumento en la producción de proteasas extracelulares conforme se produce
micelio aéreo y la producción de las enzimas proteolíticas disminuye conforme
aumenta la concentración de blastosporas (Bidochka y Melzer, 2000). Esto podría
explicar nuestras observaciones, ya que la producción de blastosporas se realizó de
manera simultánea en medios donde se estudiaron las enzimas extracelulares, y
durante las primeras 96 h de cultivo en medio H con caseína, se observó una gran
cantidad de blastosporas, pero la actividad enzimática permaneció baja. Al comenzar
a aumentar las pelotillas de micelio, se observó también un aumento en la actividad,
tanto de proteasas totales, como de Pri y Pr2. En el medio de quitina coloidal, se
observó un fenómeno parecido, ya que la mayor cantidad de blastosporas se
obtuvieron dentro de las primeras 72 h de cultivo, y las enzimas alcanzaron su
máxima actividad hasta las 312 h.
De acuerdo con los resultados obtenidos en la transición dimórfica de aislados
de P. fumosoroseus de México, se sugiere que la germinación de los conidios es
seguida de la formación de tubos germinales o producción directa de blastosporas. A
partir de los tubos germinales, se producen blastosporas y cuerpos hifales, los cuales
a su vez, dan origen a nuevos cuerpos hifales o a conidios sumergidos (Figura 18).
108
Dichos conidios sumergidos y blastosporas originan hifas que se agrupan en
pelotillas de micelio, o bien, pueden formarse también blastosporas directamente de
los conidios. Este modelo corresponde al propuesto por Fargues et al. (1994), donde
proponen que la germinación de los conidios tiene tres pasos: pregerminación,
hinchamiento y emergencia de uno o varios tubos germinales, y éstos, varían
fuertemente dependiendo de las condiciones ambientales, ya que la diferenciación
vegetativa de un tubo germinal podría consistir en el crecimiento micelial en forma de
hifas, o la multiplicación celular por gemación, o llevar a la formación de conidios por
conidiación microcíclica.
En cuanto al tamaño y forma de las blastosporas obtenidas, la relación largo-
ancho de los propágulos de EH-50613 y EH-50313 entre las 36 y 96 h en los dos
medios de cultivo probados, y para EH-52013 entre las 48 y 96 h, también en ambos
medios, fueron similares a los diámetros modales obtenidos por Vida¡ etal. (1998),
usando medio Goral (4.28 mm) a las 96 h, y medio Jackson, Catroux y Paris (6.07
mm) a las 48 h.
Otro parámetro de singular relevancia en los hongos entomopatógenos es la
virulencia de los aislados hacia el insecto plaga (Vida¡ et al., 1999), ya que incide
directamente en su control.
Los tres aislados probados mostraron ser virulentos contra la mosquita blanca
en este estudio, el ICDF permitió la observación de la inducción del crecimiento
fúngico por las ninfas, como lo observaron Landa et al. (1994) para P. fumosoroseus
cuando infectó a Bemisia argentifolii. Los conidios de EH-50613, EH-50313 y EH-
52013 fueron capaces de adherirse a la cutícula del insecto, germinar y producir una
infección. Los valores más altos del ICDF alcanzados en diferentes tiempos,
mostraron variaciones en la virulencia entre los aislados estudiados. Con base en los
resultados pudo determinarse que el aislado mas virulento fue EH-50613 ya que
alcanzó el ICDF más alto en menor tiempo. Los valores del ICDF, así como valores
previos de CL50 (Castellanos-Moguel et al., 2001b) lo confirmaron. El aislado que
siguió en virulencia fue EH-50313 y por último EH-52013. Entre las 6 y 96 h, los tres
aislados se adhirieron, germinaron, penetraron las ninfas y posteriormente
esporularon en su superficie. Este desarrollo es mas rápido que aquel señalado por
Landa et al. (1994) para P. fumosoroseus colonizando B. argeritifolii, y el de Askary y
Brodeur (1999) para y. lecanü creciendo en el áfido Marcrosiphum euphorbiae. Para
P. fumosoroseus se han observado tiempos letales medios de hasta 240 h cuando
infecta Boophllus annulatus (Gindin et al., 2001). Se observaron diferencias entre el
ICDF obtenido por nosotros y el ICDF obtenido por otros autores. V. lecanii
infectando mosquita blanca, alcanzó un índice de 2 (García-Juárez et al., 1999) a las
48 h de incubación, en el presente estudio E1-1-50613, el aislado más virulento,
presentó ese mismo valor (2) a las 18 h. Las variaciones en virulencia pueden
deberse a muchos factores, tanto del entomopatógeno, como por la fisiología del
insecto (Jaramillo y Borgemeister, 2005) y su estado nutrimental (Tefera y Pringle,
2003).
La infección de las ninfas con el aislado EH-50613 presentó poca producción
micelial, lo que de acuerdo con Vey et al. (2001) sugiere la intervención de toxinas,
como la beauvericina o beauverolido. Después de la muerte del hospedante, el
110
hongo crece abundantemente en la superficie del insecto, lo que sugiere entonces un
crecimiento de tipo saprobio (Charnley, 2003).
Las ninfas infectadas con EH-50313 mostraron un crecimiento micelial más
abundante en comparación con EH-50613. A las 36 h de la infección, la cutícula ninfa¡
estaba severamente deformada, y a las 96 h, estaba completamente destruida con el
aislado EH-50313. Este aislado posee una alta producción de quitinasas
(Castellanos-Moguel et al, 2001a), lo que sugiere una hidrólisis enzimática
(Charnley, 2003). Además de las proteasas, las quitinasas también han sido
implicadas como determinantes de patogenicidad en hongos que atacan insectos.
Por ejemplo, cepas hiperproductoras de quitinasa de B. bassiana y P. fumosoroseus
han aumentado su virulencia hasta en 50% (Gupta et al, 1994; Res¡-Bogo et al.,
1998; Hernández-Torres etal., 2004; Fang etal., 2005). Las ninfas infectadas con los
otros dos aislados no mostraron deformaciones cuticulares tan notorias. El aislado
EH-52013 de menor virulencia, se desarrolló muy despacio en comparación con los
otros dos aislados, sin embargo, su esporulación en la cutícula ninfa¡ fue muy
abundante. Wang et al. (2003) han propuesto dos estrategias de virulencia para M.
anísopliae. La primera, en la cual existe un crecimiento limitado del hongo, pero gran
producción de toxinas que desencadenan la muerte del hospedante. La segunda,
con crecimiento fúngico muy copioso, provocando un rompimiento de la homeostasis
por deficiencia de nutrimentos que desencadena la muerte del hospedante. En
nuestro estudio se observó un patrón similar, el aislado virulento EH-50613 no
presentó un crecimiento abundante en la ninfa, lo que sugiere que presenta la primer
estrategia de virulencia (producción de toxinas). En cambio, los aislados EH-50313 y

EH-52013, de menor virulencia, tienen un crecimiento micelial más abundante, lo que
sugiere la segunda estrategia de virulencia (crecimiento invasivo) de Wang et al.
(2003).
La virulencia de los tres aislados por ICDF señala una marcada variabilidad
¡ ntraespecífica. Se observaron diferencias significativas (P<0.05) entre aislados,
contrastando con los resultados de Poprawski y Jones (2000), donde no encontraron
diferencia intraespecifica estadísticamente significativa entre aislados de P.
fumosoroseus al infectar B. argentifolii.
El ensayo de ICDF permitió seleccionar los tiempos óptimos para el estudio de
la interacción hongolhospedante por microscopía electrónica de barrido (MEB) de los
dos aislados probados: EH-50613, muy virulento y con una rápida muerte de la ninfa
y EH-52013, baja virulencia y lenta colonización de la ninfa.
En otros entomopatógenos como Entomophaga maimaga, Paecilomyces,
Tolypocladium, Metarhizíum y Verticillium (Jeffs et al., 1999), se ha observado que la
interacción conidio-hospedante podría involucrar un complejo de mecanismos de
reconocimiento específicos, i.e. glicoproteínas, interacciones ligando-receptor (por
ejemplo lectinas) y no específicos, i.e. electrostáticos o hidrofóbicos, fuerzas de Van
de Waals (Cotter y Kavanagh, 2000; Doyle, 2000). En hongos patógenos para el
hombre, la adherencia de los conidios a tejidos del hospedante está estudiado como
un mecanismo importante en la patogenicidad. Las moléculas que intervienen en
este proceso han sido el objeto de estudio en varios hongos, como por ejemplo en
Aspergillus fumigatus y Candida albicans. En el primer hongo se han descrito dos
sistemas de adherencia, el primero corresponde a la unión de la laminina y el
112
fibrinógeno, mediado por una lectina fúngica específica para ácido sialico (27 kDa), el
segundo implica la interacción entre dos polipéptidos de 23 y 30 kDa y la fibronectina
por su secuencia de tripéptidos Arg-GIy-Asp (Bouchara y Tronchin, 1999). Este
mecanismo también ha sido descrito para Candida albicans (Hostetter, 2000). Es
probable que mecanismos y moléculas análogas se encuentren presentes en la
adherencia de los conidios de los hongos entomopatógenos en el hospedante. En
nuestro estudio, a las O h de infección, los conidios de ambos aislados (EH-50613 y
EH-50313), mostraron una delgada matriz extracelular, la cual podría contener
moléculas proteicas que mediarían en la adhesión, dichas moléculas que confieren
cierta hidrofobicidad han sido descritas por Jeffs et al. (1999) para conidios de P.
farinosus.
Las imágenes de MEB del aislado mas virulento EH-50613, mostrando un
mayor número de conidios sobre la superficie ninfa¡ sugieren que éstos tuvieron una
mayor capacidad de adherencia, probablemente mediada por moléculas
relacionadas con la adherencia. Boucias et al. (1988) demostraron que los
componentes responsables de la interacción hidrofóbica para la adherencia del
conidio están localizados a lo largo de la pared celular de los conidios que tienen
microfibrillas. Se ha demostrado con Beauveria, Metarhizium, Paeci/omyces,
Tolypocladium y Verticillium que la capa de microfibrillas esta formada principalmente
por hidrofobinas (Kamp y Bidochka, 2002). La adhesión de la espora influencia los
eventos de desarrollo subsecuentes manteniendo la espora en la proximidad de la
superficie del hospedante y la unión parece a menudo ser requerida para la
113
transmisión de señales morfogenéticas para la extensión del tubo germinal y el
desarrollo de las estructuras de infección (Tucker y Talbot, 2001; Kennedy, 1990).
La interacción de los aislados de mayor (EH-506/3) y menor virulencia (EH-
52013) con las ninfas también se observó en MEB. Las imágenes de MEB mostraron
amplias zonas de degradación de la cutícula a las 6 h de incubación con EH-50613,
dichas zonas, probablemente fueron provocadas por la producción de enzimas
extracelutares. Estas observaciones son congruentes con lo obtenido en nuestro
estudio, ya que in vitro, EH-50613 produce la mayor cantidad de Pri, enzima
determinante de patogenicidad (St. Leger, 1995). EH-50613, también es el aislado
más virulento, como se observó con el ICDF, ya que a las 18 h ya había matado al
insecto. El fenómeno de daño cuticular ha sido observado para huevecillos de
mosquita blanca tratados con P. fumosoroseus (Lacey et al., 1999), pero se presentó
hasta las 48 h de incubación. Gran daño estructural sido observado para huevecillos
del nemátodo Meloidogyrie javanica, tratados con proteasas y quitinasas de P.
lilacinus (Khan et al, 2004). En nuestro estudio, EH-50613 provocó un intenso daño
cuticular y una amplia zona de histolisis en comparación con EH-52013. Este daño
podría haber sido causado por esas enzimas, facilitando la penetración fúngica
(Charnley, 2003), como lo señalan St. Leger et al. (1987) para M. anisopliae cuando
penetra a Manduca sexta y Calliphora vomitoria.
De acuerdo con todos los resultados obtenidos anteriormente, la microscopía
electrónica de transmisión (MET) con inmuno-oro se realizó con EH-50613, por ser el
aislado mas virulento. Las observaciones señalaron que no hubo una gran cantidad
de marcas de oro coloidal en la vecindad de las hifas, por lo que puede inferirse que
114
no existe gran cantidad de quitinasas producidas ¡n vivo en el momento de la
infección por este aislado. St. Leger et al. (1996b) demostraron que las quitinasas
son producidas en bajas cantidades por las estructuras de infección de M. anisopliae
en el proceso inicial de penetración en M. sexta. La mencionada producción de
quitinasas podría ser tomada como un indicador indirecto de la presencia de
proteasas, ya que es necesaria la acción de éstas para que la quitina cuticular sea
desenmascarada. Además, St. Leger et al. (1987) señalan que Pri y Pr2 son
producidas en los sitios de infección de M. sexta y C. vomitoria. En nuestro estudio,
también se observó durante la determinación del ICDF, que el aislado EH-50313, que
produce gran cantidad de quitinasas, provocó daños cuticulares muy extensos, e
incluso huecos en la superficie de la ninfa, visibles con microscopía de luz.
También con MEB se observó la formación de estructuras semejantes a
apresorios en los pliegues del raquis y el orificio vasiforme de la ninfa, tanto para las
infectadas con EH-50613, como con EH-52013. La penetración del hongo al insecto
es alcanzada, entre otros factores, con fuerza mecánica, ejercida con estructuras
especializadas tales como los apresorios, como ha sido propuesto para el
fitopatógeno Magnaporte grisea (Howard et al., 1991). En nuestro estudio, los dos
aislados (EH-50613 y EH-520/3) mostraron un hinchamiento en la punta de las hifas,
que se asemeja a los apresorios por la forma. Este tipo de estructuras no han sido
observadas por otros autores en ensayos con P. fumosoroseus, cuando infecta otros
insectos, como Plutel/a xy/oste/la (Altre y Vandenberg, 2001a). Ellos reportaron que
el hongo aparentemente penetró la cutícula directamente, con tubos germinales no
diferenciados dentro de las primeras 22 horas de incubación. En contraste con otros
115
eventos, la diferenciación de los apresorios no siempre aparecen en el ciclo
mecanismo de infección, pero es una reacción específica al ambiente (Altre y
Vandenberg, 2001). Wang y St. Leger (2005) demostraron al menos cuatro diferentes
señales que afectan la formación de apresorios en un patógeno de insectos
específico: una fracción polar de la cutícula, niveles de nutrimentos, superficies
hidrofóbicas y una señal desconocida.
Nuestras observaciones mostraron que P. fumosoroseus aparentemente
penetra directamente por la cutícula o bien por el orificio vasiforme y la zona del
raquis y que las estructuras tipo apresorio observadas probablemente medien esa
penetración. En otras secciones de la cutícula, se observó penetración directa por las
hifas, que podría ser explicado por las condiciones particulares de humedad de las
zonas antes mencionadas creando un microclima que promovería el desarrollo de los
apresorios (Bidochka y Khachatourians, 1988; Charnley, 2003). Otro factor
ampliamente demostrado para hongos fitopatógenos en la penetración del tejido
vegetal (Howard et al., 1991) es la dureza de la superficie. Las observaciones de
MEB, mostraron que los conidios forman un tubo germinal unipolar que se extiende
cierta distancia antes de penetrar, esto ha sido descrito por Hajek y Eastburn (2003)
para Entomophora maimaga, creciendo en Limantria dispar y por Askary et al. (1999)
para y. lecanii, cuando invade el áfido de la papa Macrosiphonella sanbornii. Dichos
autores refieren que con MEB no es posible obtener evidencia clara de la entrada del
hongo. En nuestro estudio, las imágenes de MET mostraron diferentes estructuras
fúngicas en el sitio de los cortes, como hifas penetrantes, así como estructuras
esféricas en la cercanía de las mismas.

La zona dañada de las ninfas tratadas con EH-50613 estaba cubierta con
mucílago, aún lejos de la zona del micelio. Este mucílago también se observó en las
ninfas tratadas con EH-52013, pero solamente se encontraba cerca de las estructuras
fúngicas. Este fenómeno ha sido observado asociado a la degradación de los
huevecillos de Phoenicococcus marlatil por Lecanicillium dimorphum (Asensio et al.,
2002), así como en M. anisopliae cuando infecta al trip Frank/miel/a occidentalis
(Vestegaard et al., 1999). Esa matriz mucilaginosa podría tener propiedades de
adhesión y facilitar la penetración fúngica (Askary et al., 1999), o bien contener
proteínas de reconocimiento (Latgé, 2001).
Probablemente la capa mucosa pueda tener un papel en la preparación de la
superficie del hospedante para la penetración, ya que se ha demostrado que en
especies de fitopatógenos como U. viviae-fabae, dicha capa forma un tapete de
adhesión junto con la superficie de la planta. En dicho tapete se encuentran
presentes enzimas hidrolíticas, que además podrían afectar la adhesión a las células
del hospedante y así podría ayudar al hongo a persistir en la superficie del
hospedante y penetrar en tejidos más profundos. La presencia de tales proteínas en
el material de adhesión proporciona un medio para asegurar que el material
proveniente de la ruptura de la cutícula esté inmediatamente disponible como
nutrimento para la parte más activa del hongo (Tucker y Talbot, 2001; Cole et al.,
1998).
Las características más marcadas del aislado virulento (EH-50613) fueron una
elevada producción de Pri y la rapidez de transición de conidio a blastospora, lo que
117
concuerda con lo que se observó en los bioensayos, con la mayor digestión de la
superficie cuticular, penetración y muerte del insecto.
Los estudios sobre la biología básica de los entomopatógenos son esenciales
para contribuir al conocimiento integral del hongo lo que permitiría su aplicación en
los factores prácticos que influyen para mejorar su eficiencia terminal en el campo
agrícola y favorecer así el aumento en la utilización de este tipo de microorganismos
en un manejo integrado de plagas, que contribuya a un mantenimiento racional de
los agroecosistemas.
118
Conclusiones
1. Los tres aislados de Paecilomyces fumosoroseus utilizados presentaron
diversos factores de patogenicidad, tales como enzimas hidrolíticas
específicas para los componentes cuticulares, formación de estructuras
especializadas como los apresarlos.
2. Los tres aislados presentaron in vitro, la transición de conidio a diferentes
propágulos del hongo, tales como blastosporas, cuerpos hifales y
levaduriformes.
3. Se observó una marcada variabilidad intraespecífica de virulencia entre los
tres aislados, expresada mediante el índice de crecimiento y desarrollo
fúngico.
4. Las variaciones de virulencia se observaron con microscopia electrónica de
barrido (MEB), al contrastar la rapidez de la formación de estructuras
fúngicas sobre las ninfas.
5. La MEB permitió observar también el daño cuticular producido por los
aislados del hongo.
6. Otra característica asociada a la patogenicidad observada con MEB fue la
formación de apresorios, estructuras que permiten al hongo ejercer fuerza
mecánica.
7. En este estudio, EH-50613 mostró la mayor cantidad de Pri, una enzima
identificada como fundamental en la virulencia de los hongos, así como una
transición mas rápida de conidio a blastospora, esta transición dimórfica ha
sido documentada en la mayoría de los hongos entomopatógenos.
119
Además, este aislado es muy virulento, ya que a las 18 h, ya había matado
a las ninfas de mosquita blanca.
8. Con los estudios in vitro, se constató que el aislado que tuvo una mayor
cantidad, enzimas, además de una rápida transición de conidio a
blastospora, fue también el aislado mas virulento.
9. En este estudio pudo comprobarse que los propágulos de P. fumosoroseus
pueden seguir el esquema propuesto para el dimorfismo de 8. bassiana, o
bien, pasar por la fase de conidio hinchado, emitir un tubo germinal e
inmediatamente iniciar la formación de una blastospora.
10. Este estudio mostró características asociadas a la virulencia no descritas
previamente para P. fumosoroseus de México, como son la producción de
Pri y Pr2, y la formación de apresorios en la cutícula del insecto.
120
Bi bliog rafia
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45
TITILE: Virutence tests and extracelluiar subtilisin-Iike (Pri) and trypsin-like (Pr2)
activities during propagule production of Paecilomyces fumosoroseus isolates from
whiteflies (Homoptera. Aleyrodidae)
AUTHORS:
Judith Castellanos-Moguel', Margarita González-Barajas 1 , Teresa Mier 1 , María del
Rocío Reyes-Montes2 , Eduardo Aranda 3, and Conchita Toriello2'
'Departamento el Hombre y su Ambiente, Universidad Autónoma Metropolitana-
Xochimilco, Mexico D. E. 04960, Mexico; 2 Departamento de Microbiología y
Parasitología, Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México,
Mexico D. E 04510, Mexico and 3Centro de Investigación en Biotecnología,
Universidad Autónoma del Estado de Morelos, Cuernavaca, 62250, Mexico
ADDRESS FOR CORRESPONDENCE
Dra. Conchita Toriello. Depto. de Microbiología y Parasitología, Facultad de
Medicina, Universidad Nacional Autónoma de Mexico, Mexico D.F. 04510, Mexico.
Phone/Fax: (52 55) 5623-2461. Email
torielIoservidor. unam. mx
RUNNING TITILE:
Virulence, Prl and Pr2 activities during propagule production of Paecilomyces
fumosoroseus
SUMMARY:
In order to characterize isolates for biocontrol purposes, virulence towards whitefly,
Trialeurodes vaporariorum. (Homoptera: Aleyrodidae) and subtilisin-iike (Pri) and

trypsin-like (Pr2) protease activities during blastospore production were
investigated in monospore cultures (MCs) of °aeciiomyces fumosoroseus.
Virulence towards second instar whteflies was assessed in three MCs, and
expressed as lethal median concentration (LC). Number and width—Iength ratio of
propagules (blastospores, hyphal bodies, short hyphae, submerged conidida and
others) and simultaneously the extracellular proteolitic activity were determined in
liquid medium. Total protease activity was assayed with azocasein, Pri and Pr2
activities were determined with N-Succiny-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide and N-
Benzoyl-Phe-Val-Arg-p-nitroanilide as substrates, respectively. A natural variability
in virulence, propagule production and cuticle-degrading proteases was observed

o
among isolates. Bioassays showed an LC50 of 1.1 x iO3 , 2.5 x 10 and 7.6 x 104
.
conidia/mi for MCs EH-50613, EH-50313 and EH-520/3, respectively, showing EH-
506/3 as the most virulent isolate. Under the experimental conditions assayed,
isolate EH-50313 produced the highest yield of propagules (7.7 x 10 7 e-
propagules/mi), followed by EH-50613 with 1.0 x 10 7 and EH-52013 with 6.4 x 107
propaguies/mi. Subtiiisin-like (Pri) and trypsin-like (Pr2) activities were present in
the three MCs. Subtilisin-like (Pri) activity was highest (745.7 UPr1/mi at 120 h) in
EH-506/3, the most virulent isolate, pointing out Pri as a phenotypic marker of
virulence for P. fumosoroseus. EH-50613 appears as a good candidate for whitefly
biocontrol due to its high virulence, Pri concentration and rapid transition to
blastospores in submerged ¡¡quid medium.
KEY WORDS:
Paecilomyces ftirnosoroseus, wh 1 tefly, Tnaleurodes vaporanorum subti lis in-1 ike
(Pri), trypsin-like (Pr2), biocontrol, virulence, blastospores
TITULO:
Pruebas de virulencia y determinación de actividad extracelular de proteasas tipo
subtilisina (Pri) y tipo tripsina (Pr2) durante la producción de propágulos de
aislados de Paeci/omyces furnosoroseus de mosquita blanca (Homoptera:
Aleyrodidae)
RESUMEN:
Con el objetivo de caracterizar aislados para el control biológico de mosquita
blanca (Horrioptera: Aleyrodidae), se estudiaron tres cultivos monospóricos (CM)
de Paecilomyces fumosoroseus, hongo entomopatógeno de la mosquita blanca
(Homoptera: Aleyrodidae). Se determinó la virulencia en ninfas de segundo
estadio de la mosquita blanca expresada como concentración letal media (CL).
Se determinó la producción de propágulos fúngicos (blastosporas, cuerpos hifales,
hifas cortas, conidios sumergidos y otros) en medio líquido, se midió la relación de
largo y ancho de los propágulos, y la actividad proteofítica (total; tipo subtilisina,
Pri y tipo tripsina, Pr2) simultáneamente con la producción de propágulos. La
proteasa total se determinó con azocaseina, y las actividades de Pri y Pr2 con N-
Succinil-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilida y N-Benzoil-Phe-Val-Arg-p-nitroanilida
como sustratos específicos, respectivamente. Se observó variabilidad entre los
tres CM en cuanto a la virulencia, producción de propágalos y proteasas. Los

bioensayos mostraron una CL 50 de 1.1 x iO3, 2.5 x 10 4y 7.6 x iO conidios/ml para
los CMs EH-50613, EH-50313 y EH-52013, respectivamente. El CM donde se
observó el mayor número de propágalos en las condiciones ensayadas fue EH-
50313 (7.7 x 10), luego EH-50613 con 1.0 x 10 7 y EH-520/3 con 6.4 x
propágulos/ml. Las actividades enzimáticas de Pri y Pr2 se demostraron en los
tres CMs. La actividad tipo subtilisina (Pri) fue mayor en el aislado más virulento
(EH-50613) con 745.7 UPr1/mI a las 120 H, y señala a Pri como un marcador
fenotípico de virulencia para P. fumosoroseus. EH-50613 es un buen candidato
para el control biológico de la mosquita blanca en México, por su alta virulencia,
elevada concentración de Pri y su rápida transición a blastosporas en el medio
líquido ensayado.
PALABRAS CLAVE:
Paeci/omyces fumosoroseus. mosquita blanca. Tnaleurodes vaporariorum,
proteasa tipo subtilisina (Pri), proteasa tipo tripsina (Pr2), control biológico,
virulencia, blastosporas
4
Introduction
Paecilomyces fumosoroseus has been used successfully as a biocontrol
agent of whiteflies (Homoptera. Aleyrodidae) and other insect pests [8, 361.
Whiteflies are polyphagous ¡nsects that can attack vegetable, staple and
ornamental crops, as well as other cultivated plant species, both in greenhouses
and in the open field worldwide. In Mexico, the whitefly is considered as an
¡mportant pest of vegetable crops, as well as ornamental plants [30].
For the successful use of a mycoinsecticide in biocontrol, a relevant
characteristic for biocontrol agents' success in the fíetd is their virulence toward
target insects. Proteases are primary enzymes in insect cuticle degradation that
play a key role in different aspects of fungal biology and have been related to
virulence [12, 131. St. Leger et al. [39] isolated a general protease from
Metarhszíum anisopliae capabe of degrading a wide variety of protefns. The serme
proteases, Pri and Pr2, have been identified in M. anisop/iae. M. flavoviride,
Beauveria bassiana, Verticillium /ecanhi, and Nomuraea rileyi [3, 24, 38, 40]. Pinto
et al. [28] described Pri and Pr2 activities in M. flavoviride growing in a minera¡
medium supplemented with either cuticle from the locust Rhammatocerus
schistocercoides or casein. Recently, eleven protease isoforms and a
metalloprotease related to the rnechanism of fungal penetration have been
identified and cloned from M. anisopliae var. anisopliae and var. acridum [16].
These enzymatic actívities have been reported in other entomopathogenic fungi,
particularly Metarhizium isolates [39, 41], in the mycelial phase, but to our
knowledge not in P. fumosoroseus during propagule producton in submerged

cultures. In these cultures, entomopathogenic fungí usually form asexual spores as
single cells by schizolytic separation at septa, or by mechanical fragmentation of
hyphae, or can also be produced from hyphae by yeast-like budding [31]. These
structures are described by severa¡ authors as blastospores or hyphal bodies [21,
31, 32, 451. These blastospores have been shown to be at least as infective as
conidia in assays using topically applied propagules against severa¡ insects [1].
These structures are similar to the ones found when the fungus grows in the insect
haemolymph [19]. Furthermore, submerged culture processes have advantages
a y er conidial production in solid-state fermentation, such as reducing time of
propagule production, and faster germination rate of blastospores on the insect
cuticle [1, 43, 451.
In order to characterize a strain for biocontrol purposes, it is necessary to
assay the virulence toward the target insect of different isolates to asses their
potential as biocontrol agents, in addition to other fungal characteristics. In this
study, virulence of three monospore cultures (MCs) of P. fumosoroseus ¡solated in
Mexico was tested in whiteflies, as well as total proteases, and Pri and Pr2
activities during propagule production to select a suitable candidate to be used as
a microbial agent for whitefly control.
Materials and methods
Fungal ¡so/ates and growth condif,ons. Al¡P. fumosoroseus PFCAM, MBP,
and PSM131 strains were isolates from whitefhies and were obtaíned from the
e)
National Center for Biological Control, Mexico (Centro Nacional de Referencia de
Control 8 iológico-C NRCB). Single spore cultures denominated EH-50613, EH-50313
and EH-520/3 from PFCAM, MBP. and PSMB1, respectively, were prepared by the
method of Goettel and Inglis [17] as modified by Cavallazzi et al. [11]. Monospore
cultures (MCs) were preserved in sterile water, mineral oil, and in liquid nitrogen
cryopreservation at —196 °C and deposited in the fungal collection of the Laboratorio
de Micología Básica, Departamento de Microbiología y Parasitología, Facultad de
Medicina, UNAM. Isolates were maintained on culture medium slants containing (in
grams per ¡¡ter)-. sucrose, 10; glucose, 5; peptone, 0.5 yeast extract, 5; agar, 23,
(SGPYE medium), until used.
The MC were selected based on total protease activity, showing high, low,
and intermediate activity [9, 101.
Virulence test; lnsects. The whitefly nymphs (Tna/eurodes vaporariorum)
used for bioassays originated from colonies maintained at the greenhouse and
experimental field of the Centro de Investigación en Biotecnología, Universidad
Autónoma del Estado de Morelos (CEIB-UAEM), Mexico. Whiteflies were reared
on flor de mayo" beans (Phaseolus vulgaris).
Bioassay procedure. The rnethod used was according to Vida¡ et al. [46],
with minor modifications. Fungal conidia were produced in SGPYE medium
cultures, and five doses ranging from 4.7 x 102 to 4.7 x 106 conidia /ml were used.
Phaseolus vulgaris leaf disks were outlined with a plastic cap (3.5 cm of diameter)
7
and cut with a sterile scalpel. In al¡ bioassays, second instar nymphs were
identified by marking leaves wtth a permanent ink pen near the selected insects.
Nymphs were disinfected in a laminar flow hood by soaking them in the followirig
solutions: 70% alcohol for 5 s, sterile distilled water for 40 s, 5% sodium
hypochiorite for 20 s, followed by rinsing in 3 changes of sterile distilled water for a
total of 120 s. Leaves were air-dried on sterile filter paper. Nymphs were infected
by floating the disks downwards on the fungal suspension so that the side infested
with the whitefly nymphs touched the suspension, on each of the five selected
conidia concentrations (4.7 x 102 to 4.7 x 106 conidia ¡mi). Disks were transferred
to 3.5 cm Petri dishes containing sterile KNOP medium (in grams per liter:
phosphate nitrate, 0.125; calcium nitrate, 0.500; manganese sulfate, 0.125:
potassium phosphate, 0.125; agar. 23). The top side of the leaf disks was placed
against the agar so that the side of the nymphs faced upward. Control disks were
used with 0.005% Tween 80. The lids of the Petri dishes were sealed with strips of
parafiim to maintain saturated humidity and placed in an incubator at 24°C and a
photoperiod of 16:8 h light:dark, (LID). After incubation for 24 h under high
humidity, the uds were repiaced with another one that had a paper-filter covered 1-
cm hole for aeration, and to prevent condensation as described in Vida¡ et al. [46].
Petri dishes were maintained in the incubator at 26°C (± 1° C), 60% RH, and a
photoperiod of 16:8 (L. D) h, during a total of 10 d. Individual selected nymphs were
monitored for mortality at 10 d. Emerged whitefiies (empty pupa¡ cases) were
considered non infected. A total of 75 nymphs were used. 25 for each replicate
bioassay, and another 25 nymphs as control, for each conidial concentration
8
tested. The number of nymphs of second instar that did not change lo the next
developmental stage was recorded (dead nymphs). All nymphs were then removed
from the heaf surface, placed on sterile water agar dishes, and incubated at 24°C
for 5-7 d to determine the percentage of mortality caused by mycosis, based ori
fungal sporulation on the insects. Nymphs that remained in second instar, were
considered dead, and lethal median concentration (CL 50) was calculated using
second instar data.
Propa guie production, and assays of enzyme activity. For a shake flask
biastospore production studies, cultures of P. fumosoroseus were grown in 250-ml
Erienmeyer fiasks containing 70 ml of SGPYE liquid medium supplemented with
1% casein (w/v) to ensure a high yieid of biastospores and simultaneously,
produce enzymes. Inocula consisted of conidia from 10-day oid slant SGPYE
medium cultures with a final ceIl density of 1 x 106 conidia/mI. Al¡ experiments were
repeated at least three times. Conidia and blastospore concentrations were
determined microscopicaiiy with a haemocytometer. The length and width of 30
submerged propagules (biastospores, hyphal bodies, short hyphae, and
submerged conidia), randomly chosen, of each isolate were measured using an
Olympus BX-40 microscope through a calibrated objective at 40 x. Micrographs
were made with an Olympus PM-C35 camera and an Olympus PM20 exposure
control unit. Fungal transformation was registered according to the ciassification
scheme of Bidochka et al. [4], with siight modifications. This scheme comprises six
developmental stages (DS): (1) Unswohlen conidia. (ti) Swollen conidia. (III)
9
Emergence of the germ tube. (IV) Elongaton of the germ tube and formaton of the
first septum. (V) Polar and bipolar elongation (growth) of the resulting mycelium
and inítiation of a bIastospore and (VI) Seccession of that blastospore. Flasks
were incubated with orbital shaking (150 rpm) at 28°C, for 312 h. Control flasks of
¡¡quid medium without inocula were maintained under the same experimental
conditions. At 6, 12, 18, 24, 48, 72, 96, 120, 168, 216, 240, and 312 h. 3-ml
aliquots of cultures and controis were coUected. After blastospore and propagule
measurements, the rernainder samples were centrifuged (5000 X g, 10 mm), and
ceil-free supernatants were maintained at -20 °C until enzymatic activities were
determined.
A nonspecific proteolytic assay with azocasein was performed for both, ceil
free supernatants and controis, according to Sarath ef al- [35]. Briefly. 2%
azocasein ¡rl 0.2 M sodium phosphate buffer, pH 7.0, was equilibrated at 25°C.
Reactions were performed in Eppendorf tubes containing 250 ul of azocasein and
150 il of crude enzymatic extract. After 1 h of incubation at 25°C, reactions were
stopped by the addition of 1.2 ml of 10% trichloroacetic acid (Baker, Mexico). After
10 min at 4°C, samples were centrifuged (5000 x g, 10 mm), 1.2 ml of supernatant
was placed in test tubes, mixed with 1.4 ml of 1 .0 M NaOH for color development
and absorbance was read at 440 nm in a Beckman DU650 spectrophotometer
(Beckman Instruments, CA, USA). One unit of protease activity (UP) was defined
as the amount of enzyme that produced a change of 0.010 in the optical density at
440 nm.
lo
Pri and Pr2 activities were deterrriined using N-Succinyl-AIa-Ala-Pro-Phe-p-
nitroanilide and N-Benzoyl-Phe-Val-Arg-p-nitroanilide as substrates, respectively,
essentially as described by St. Leger etal. [39], except thai 0.1 M tris/HCL buffer,
pH 8.0 was used. Briefly, 1 mM substrate diluted in this last buffer and the enzyme
fraction were pre-warmed at 23°C prior to mixing. Control absorbance values were
read at 410 nm, before adding the substrate. Then, triplicate reaction mixtures,
containing 50 ul of crude enzyme extract, 50 LII of substrate (for Pri and Pr2), and
900 LI of Tris buffer, pH 8,0, were incubated at 23°C. After 1 mm, absorbance was
read at 410 nm in the spectrophotometer. One enzyme unit was defined as the
amount of Pri (UPr1) or Pr2 (UPr2) that produced a change of 0.001 in the optical
density at 410 nm under the experimental conditions described abo ye. Control
samples were also incubated with specific substrates for Pri and Pr2.
Experiments were replicated thrice with different aerial conidia inocula and
sampPes were taken from 3 shake-flasks for each MC tested.
Protein determina fion. Protein content was measured using Coomasie
Brilliant Blue G-250 [7]
Chernicais. Unless otherwise stated. al ¡ chemicais used were obtained from
Sigma-Aldrich Quimica (Toluca, Mexico).

Statístical ana/ysis. Mortality of second stage nymphs was subjected to
Probit analysis [15], generating a concentration-mortality relationship for the
estimates of LC 50 and its 95% confidence intervais for each of the MCs tested,
using POLO-PC program (1996). Analysis of variance (ANOVA a = 0.05) was
calculated for the length to width ratio of propagules at the different assay times,
total protease, and Pri and Pr2 activities among the three MCs selected, followed
by a Tukey multiple mean comparison test [14]. Statistical analyses were
performed using the SPSS Program. version 10. 2001
Results and discussion
Bioassays. Fungal MCs varied in their ability (o infect T. vaporariorum
nymphs. The criterion for mortality status of whitefly nymphs was instar change,
because nymphs are immobile, and at day 10, nymphs that had not shown change
from 2 to 3rd instar, were considered dead. At day 10, all marked nymphs,
independently from the instar stage were transferred to water-agar and aH of them
showed mycelial growth, suggesting an ¡nsect mycosis, and were considered killed
by the fungus. In al¡ cases, mycoses were abo ye 95% of the treated nymphs (data
t
not shown). Control nymphs reached the 4 stage or adult stage in the same time
penad of the bioassay. The MCs impact on nymph mortahities largely depended on
the conidial concentrations tested Change of nymphs to (he next developmental
stage tended to decrease with increasing concentrations of conidia, showing a
concentration-mortahty response in aH MCs tested.
IN
Alt EH-50613 concentrations were highly toxic for 2 nd instar whitefhes, in
contrast with a lower mortality observed for EH-52013 at the same concentration,
for the same Instar stage (data not shown). This last MC (EH-52013) showed a
marked concentration-response, mycelial growth from nyrnphs placed on water-
agar showed that insects were infected but infection signais were observed late (7
days) in the experimental time-course. Conidiat concentrations of the other MC
tested, E1-11-50313, were also virulent, however, this isolate infected nymphs in the
2 nd instar, but killed them late in the time-course experiment. The same conidial
concentration-response has been observed for whiteflies treated with Verticillium
lecanil [25], and mites treated with severa¡ isolates of P. fumosoroseus [37]. In
contrast, James et al., [23] observed no differences among the dose ranges of P.
fumosoroseus tested in whitefly nymphs.
MC EH-50613 was considered the rnost virulent isolate because 1.1 x iO
conidia/mI were enough to kill half of the tested ¡nsects in the experimental penad.
In contrast, EH-50313 showed a LC 50 of 2.5 x iO 4 , and EH-52013 of 7.6 x 104
conidia/mi, suggesting the last as the isolate with the lower virulence. Al¡LC
observed in this study (from 1.1 x 10 3 to 7.6 x 104 conidia/mI) were tower than
those mentioned by Vida¡ et al. [46] (from 1 79 x to 99 x 108 conidia/mI) for P.
fumosoroseus treated wh 1 tefl es.
Propagule production. The three MCs selected exhibited transition from
conidia (DS: 1) (Figure la) to different propagules in different times. First, conidium
swetls (DS: II) and begins producing one or more germ tubes (Figure lb) (DS: III).
la
Ear(y at the experimental time, differential development of MCs was observed; at 6
h, EH-506/3 already produced germ tubes (DS III), while EH-50313 started to
germinate between 6 and 12 h, and E1-1-52013. unfll 12 h (Tabte 1). At 36 h, the
three isolates produced primary blastospores (DS: y), originated from hyphal septa
(Figure lc) and tips (Figure id); budding blastospores (DS: V) (Figure le), and
hyphal bodies (DS: VI) (Figure it). Similar yeast-like structures have been
described in severa¡ liquid media [1. 22. 43, 44, 451. After 48-96 h, oblong narrow
structures (Figure lg) similar to short hyphae were formed, but these produced
both blastospores (DS: V) (Figure lh), or submerged conidia (Figure u). From 96
h, pellets were more evident, and at 196 h larger and more hyphal bodies were
observed (Figure ij). At 240 h, blastospores showed well defined vacuoles, and
produced germ tubes. After 240 h, single propagules were less evident, and mainly
hyphal pellets were observed (Figure 1 k).
Assays showed different propagules (blastospores, hyphal bodies, short
hyphae, and submerged conidia) for the three MCs tested during the first 96 h of
the experiment, as reported by other authors [1, 22, 43.451.
Signficant differences of propagule concentrations were observed among
EH-506/3, the most virulent MC, and the other two isolates. Maximal propagule
(blastospores, hyphal bodies) concentrations were observed at different times for
each isolate. At 96 h, 1.0 x 107 propagules/ml for EH-50613; at 60 h, 7.7 x i07
conidia/ ml for EH-50313; and 6.4 x i0 7 conidia/mi for E1-1-52013. In different
experiments, other authors [34] found similar amount of blastospores (5 x 10 7 at 72
14
h) with P. fumosoroseus strain 612 in a rnneraI medium supplemented wth
glucose, peptone, and yeast-extract.
Blastospores were obtained in a rich medium, with sucrose and glucose,
and severa¡ nitrogen sources, such as casein, peptone, and yeast extract, a
medium with peptone has been pointed out by Prenerová [29] as the optimal
germination medium for P. farinosus. Jackson et al. [22] obtained high yields (6.0
X 108 ) of des¡ ccation-tolerant
P. fumosoroseus blastospores in a fermentor with a
medium containing casein. lssaly et al. [18] reported high yields of Metarhizium
fiavoviride blastospores (1-.5.4 x 108 biastospores/ml) when a medium with a high
rate of nitrogen and low rate of carbon was used in ftask cultures.
The size of the aerial conidia used for initial inoculation, and measured after
incubation for 10 d at 28°C on SGPYE salid medium, was 5 ± O m length and
2.5 ± O ltm width. The propagule size was determined by the ratio of length to width
for each sample time (Table 1). At 12 h, MC EH-50313 showed a ratio of 16 that
corresponds to short hyphae (conidia producing one or more germ tubes), but
longer than the two other MCs. From 24 h on, aH submerged propagules (DS: VI)
showed higher ratios (han those from aerial inoculated conidia (DS: 1). This has
been mentioned for P. fumosoroseus and other entomopathogens [211. Significant
differences (P<0,05) of propagule size among the three MCs were observed (Table
1) at almost aH times tested. with the exception of 18 and 96 h. Ratio values of
propagules from MC EH-50613 and EH-50313 between 36 and 96 h, and between
48 and 96 h for EH-52013, were similar to the modal diameters obtained by Vida¡ et
al. [45}, using Goral medium (4.28 im) at 96 h, and Jackson, Catroux and Paris
(6.07 p.m) medium, at 48 h. In our study, MC EH-506/3 that exhibited the highest
virulence showed the fastest transition from conidia (DS: 1) to blastospore (DS: VI)
as showed in Table 1. This dimorphic transition frorn conidia to yeast-Iike
propagules (blastospores) has been documented in most entomopathogenic fungi
[33]. In ¡¡quid culture, this MC (EH-50613) produced 1 x10 7 propagules/mI, but
otherwise has always shown a very low conidia production on slant or rice cultures,
however, its fast transiton from conidia to blastospore, suggests another
characteristic of virulent strains.
Enzymatic activity. Dimorphism was evident in SGPYE medium, with several
nitrogen and carbon sources, and proteases determined during blastospore
production. During the first hours of the experiment, proteolitic activity remained
low, but after 96 h of culture incubation, a rise in total proteolytic activity was
detected for the three MCs. Total proteases started to rise at 120 and 168 h (data
not shown). Peaks of P. fumosoroseus total protease activity corresponding to 91
UPImI at 216 of incubation, by the highly virulent EH-50613 strain. The medium-
virulence isclate (EH-50313) showed a much lower activity (58.7 UP/ml) at 216 h.
The low virulence isolate (EH-520/3), on the other hand, exhibited a lower activity
(49 UP/mI) at 216 h (Table 2). Total extracellular proteases were measured by the
azocasein method [35] instead of by absorbance at 280 nm because P.

fumosoroseus produces beauvericin [26], which contains phenylalanine [27] that
interferes wth absorbance at this wavelength.
The three MCs tested expressed Pri and Pr2 activities under the
experimental conditions used in this study. Sorne points showed significant
dfferences, and these values are summarized on Table 2.
At day O of the time course experiment, the three isolates showed Pri and
Pr2 activities from 49.3 UPr2/ml to 150.6 UPr1/mi, suggesting that conidia contain
proteolytic activity, as reported by Boucias and Pendland [6]. Significant
differences were observed (E 2,24 127.8, P<0.05 for Pri and F 2,24 184.9, P'z0.05
for Pr2) at this time among the three MCs. For Pri, at 120 h of incubation, this
difference persisted between the highest-virulence MC (EH-50613) and the other
two MCs, but not among the low and medium virulence isolates (F 224 = 1631;
P<0.05), as well as at 216 h (F 224 = 120.4; P<0.05) (Table 2). For Pr2, a significant
difference was observed among the three MCs, at 120 (E 2,24 214.1, P<=0.05)
and 216 h (E224 208, P<0.05).
For the three isolates, Pri activity varied between 66 and 192 UPr1/mi up
to 96 h of incubation (Data not shown). Pri activity of EH-50613 started to increase
reached a major peak (745 7 UPr1/mt) at 120 h and a second, lower one (620.4
UPr1/rn). at 216 h. Pri activty of EH-503/3. on the other hand, started to increase
after 168 h and reached a value of 496 UPr1/mi at the end of the experimental
period (312 h, data not shown). The lowest Pri activity was shown by the 10w
virulence EH-52013 strain with a maximum of 347.4 UPr1/mi at 216 h.

Among the three isolates tested, Pr2 showed a much lower activity than Pri
and this remained low and retatively constant. Broad-spectrum subtUisins are the
main píoteins produced by M. anisopliae and other entomopathogens during
infection and degradahon of insect cutice [38]. Different teveis of production are
signais of intraspecific variation among isolates, and coutd be associated with
adaptative differences [2, 16, 39]. The differences observed here among isolates of
the same species of P. fumosoroseus confirm previous studies with other fungi in
which protease activity has been reated to virulence [5, 20, 39, 421.
Pri and Pr2 activtes on the specific substrates used here have been
reported in M. anisopíie isolates [38, 39, 411 but not in P. fumosaroseus
propagutes. In this study, Pr2 was induced at lower leveis and with less variability
among isolates than Pri. This phenomenon was also observed in M. fía voviride by
Pinto et al. [28].
Subtilisins comprise the major protease components in entomopathogenic
fungi, such as Metarhizium and Beauvería [2, 391. The number of Pri proteases
produced by M. anisopliae and the shght differences in their catatytic activities is
not only of great interest to the functionat pathology but also to population structure
of species of this fungus [3}. This may also be valid for other entomopathogenic
fungi as wefl. Results showed that the virulent MC (EH-50613), had a high Pri
activity (745.7 UPr1/mi), and the low virulence isolate (EH-52013) had a tow Pri
activity (347.4 UPr1/m1) when compared with EH-50613. As Pri appears to be a
pathogenicity determinant by virtue of its considerable ability to degrade cuticle
[41], our findings suggest that Pri production of the propagules of P.
18
fumosoroseus, could be assumed as a virulence marker, and supernatant
concentration measurements considered as a screening test for preliminary
selection among several isolates. The selected isolates wth high Pri activity could
be used for pathogenicity bioassays. Studies of induction-repression mechanism of
these enzymes must be done to determine optimal production in conditions of low
nutrimental availability, similar to the ones found when infecting the insect cuticle.
The intra-specific variability of virulence towards whitefly nymphs, propagule
production. and Pri and Pr2 activties found among P fumosoroseus isolates are
relevant findings for the characterization and selection of isolates suitable for their
use as biocontrol agents. Our results would suggest MC EH-50613 as the best
candidate for whitefly control among the three studied MCs, due to its high
virulence, Pri production (745.7 Upri/mI at 120 h) of the propagules, and rapid
transition to blastospores in submerged cu'ture.
Acknowledgments
The authors thank Dr. Víctor Hernández Velázquez and Angélica Berlanga
from the Centro Nacional de Referencia en Control Biológico, for the original P.
fumosoroseus isolates, and Biol. Laura Lina for the maintenance of whitefly
colonies. This research was supported by Grant No. G-31451-B from CONACyT,
Mexico, and JCM acknowledges the granted Ph.D. scholarship. This researcfi is
part of JCM's Ph.D. thesis, student of the Doctorado en Ciencias Biológicas from
the Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco.
1y
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765-700.
2 ()
FIGURE LEGENOS
Figure 1. Paeci/omyces fumosoroseus propagules produced in submerged culture.
a) aerial conidia of E1-1-50313. Developmental stage 1: unswollen conidia. b) EH-
50313 swollen condia with two germ tubes at 6 h. Devetopmental stage III:
emergence of the germ tube. c) EH-52013 blastospore originated from hyphal
septum at 36 h. Developmental stage V polar and bipolar elongation of the
resulting mycelium and initiation of a blastospore. d) EH-52013 blastospore
originated from hyphal tip at 24 h. e) EH-50313 budding yeast at 24 h.
Developmental stage V. f) EH-506/3 hyphal body at 24 h Developmental stage VI:
seccession of the blastospore. g) EH-503/3 short hyphae at 24 h. h) EH-50313
blastospores at the hyphal body tips at 36 h. i) EH-503/3 submerged conidia at
60h, j) EH-50313 large hyphal bodies at 72 h of incubation, k) EH-52013 hyphal
pelJets after 240 h of incubation. Scale bar: 5irn
27
Table 1
Morphologicai type and Iength to width ratio of fungar propagules from
Paecilomyces fumoscroseus.
T i me sc3te Length to Morphological type (Dev&oprnental stage)
width ratio
EH-50613 .oa -
2.&_ conidia (1) -
Oh EH-50313 2. oa conidia (1)
EH-52013 2. ca conidia (1)
EH-50613 2.1 (05)a.b gerrninatingconidia (III)
Oh EH-50313 germinating conidia (11 1)
EH-52013 1.9(± Q4)a swollen conidia (U)
E 1-506/3 8.5 (± 257)b hyphal bodies, blastospores V. VI)
12 h EH-503/3 15 3.11) cerminating corca OH'
EH-520/3 5 (±5.16) germinating. :.JHd
É H-506/3 5.1 (±2.16)a hyphal bodies, blastospores (V, VI)
18h EH-50313 4.5 2.1 1)a hyphal bodies, blastospores V, VI)
E H-520/3 6.9 (±6.5)a hyphal bodies, blastospores (y , VI)
EH-506./3 AA
.- '-4 bodes bastcspores V. VI)
24h EH-50313 nyphal bodes. bastosperes (V. VI)
EH-52013 10.4 (± 74)b hyphal bodies, blastospores (V, VI)

EH-50613 4.4 (1 1.5) 2 hyphat bodes, blastospores(V, VF
E-i-5Q33 4.6 (± 1) hyphai bodes, biastospores (VP V)
EH-52013 10.4 (j 74)b hyphal bodies, blastospores (V, VI)
50613 5.4 (± 2.3)b hyphal bodies, btastospores V, Vi)
2. 222 ph bcds bsospores (y , V)
EH-50613 5.5 (±2.4) hyphal bodies, blastospores ( y, VI)
4. t yphai bodies, Lpc
ubmerged conida
- 2 h;yphal bodies, bJastospores, (y , VI)
.bmed ottid
EF-I 506/3 4.8 (± 1 .2) 2 b hyphal bodies, blastospores (y, VI)
2. Y pi ai bodies,
- ubmerged conidL
yphal bodies, rcsÍ: V.
buteed iukL
EH-50613 4.5 (± 0 . 9)a hyphal bodies, blastospores (V, VI)
2E jphai bodies,
ubmerged conid
1 phai bodies,
Values are representative of three independent experiments run in triplicate.
Values in the same column corresponding to the same time, marked with the same
letter did not differ significantly according to Tukey's test at a significance level of
5%
30
Table 2
Total proteases, Subtilisin-like (Pri) and Trypsin-Iike (Pr2) activities of P. fumosoroseus isola
virulence against whitefiies,
lsolates Lethal median Total protease Subtilisin-Iike Pri activity Trypsin-Iike Pr2 activity
concentration activity (UPrI /ml) (U Pr2Iml)
(U P/ml)
(conidia/mi) Oh 120h 216h Oh 120h 216h Oh 120h 216h

74 57b 6200 493 8 23 , 48 251.3c
EH-50613 1.1 x 10 3.60 62 . 4c 91 C 66.08
EH-50313 2.5 x
104 3,38 2 . 78 58.7' 1500 90 . 1 8 391 . 1 1 138 . 4c 109 . Oc 1557b
87b 498 940b 34748 954b

EH-52013 7.6 x 10 4 88 111.28 103. Ob 92.38
Average of three independent experiments.
Values in the same column marked with the same letter did not differ significantly according to the
significance leve¡ of 5%.
31
a h c
CII
g h i

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..

Estudio de la producción de enzimas, virulencia y diferenciación

Que para obtener el grado de

M. en C. Maña Judith Castellanos Moguel

pertenece al Padrón de Posgrados de Excelencia de CONACYT y además cuenta

con apoyo del mismo Consejo, con el convenio PFP-20-93

Unidades Iztapalapa y Xochimilco aprobó la tesis que presentó

M. en G. Maria Judith Uastetlanos Moguel

MIEMBROS DEL JURADO

CODIRECTORAS: DRA. TERESA FRANCISCA MIER

DRA. CONCEPCIÓN TORIELLO NÁJERA

ASESORA DRA. MARÍA DEL ROCiO REYES MONTES

SINODALES DRA. LUCIA TAYLOR DA CUNHA E MELL

DR. ARMANDO PÉREZ TORRES -- ..

A las siguientes instituciones;

A los siguientes laboratorios y su personal:

encuentran la actividad de enzimas, como proteasas y quitinasas, producidas cor,

propágulos fúngicos conocidos como blastosporas

En el presente trabajo se comprobó experimentalmente la actividad de prcteasas

quitinasas en tres aislados (EH-50613, EH-50313 y EH-52013) de Paecilomyces

fumosoroseus de México. También se observó la transición conidio-blastospora in

y en un medio sintético con quitina coloidal como única fuente de carbono y de

nitrógeno. Otro parámetro observado fue la virulencia en mosquita blanca

(Trialeurodes vaporariorum) de los tres aislados, expresada a través del índice de

crecimiento y desarrollo fúngico (ICDF).

virulencia y rápida colonización en la ninfa) y EH-52013 (baja virulencia y lenta

colonización de la ninfa) para infectar ninfas de mosquita blanca y dar seguimiento al

desarrollo del hongo con microscopia electrónica de barrido (MEB). Finalmente, se

realizó un estudio inmunocitoquímico por microscopía electrónica de transmisión

(MET), durante las 6 primeras horas de la infección de la mosquita blanca con el

aislado mas virulento (EH-50613).

De acuerdo con los resultados obtenidos, el aislado EH-50613 produjo más

(realizado con EH-50613 y E1-1-52013), ya que a las 18 h, EH-50613 ya había

penetrado al hospedante, emergido nuevamente y producido conidios, mientras que

observaciones obtenidas al aplicar el ICDF. Las observaciones de MET con el

aislado mas virulento (EH-50613) permitieron constatar que a las 6 h el hongo ya

había penetrado, y que se estaban produciendo quitinasas, aunque en muy baja

Los resultados experimentales mostraron evidencias de una aparente relación entre

permitió hacer una primera descripción de la aparición de Pri y Pr2 en P.

fumosoroseus y la existencia de estructuras de infección como los apresorios en el

binomio P. fumosoroseuslmosqu ita blanca estudiado.

Among virulence factors of entomopathogenic fungi, protease and chitinase activities

during blastospore production have been mentioned. This work describes

isolates (EH-50613, EH-50313 and EH-52013) from Mexico.

Conidia-blastospore transition is also described, in a rich culture media with severa

measured in whitefly (Trialeurodes vaporariorum).

follow the GDFI by scanning electron microscopy (SEM). Finaily, an

immunocytochemical study by transmission electron microscopy (TEM) with the most

EH-50613 TEM observations showed fungal penetration at 6 h of incubation. Low

chitinase production was also observed.

Experimental results showed an apparent relation among Pri production, dimorphic

change speed and virulence.

infection structures that resembled appresioria in shape in the studied rejation

24. Ninfas de Tnaleurodes vaporariorum a las 36 h de incubación con 83

Entre las diferentes causas de la contaminación de los ecosistemas se

encuentra el uso inadecuado de plaguicidas químicos, que originan severos daños

encuentran en una situación en la que prácticamente no tienen enemigos naturales, y

si existen las condiciones ambientales adecuadas, su población se incrementa

rápidamente. Uno de tos principales problemas que presenta el control de insectos

por medios químicos, es la adquisición de resistencia, por lo que su uso frecuente