TEMA 4.

TÉCNIAS ANALÍTICAS BASADAS EN LA ESPECTROSCOPÍA UV-VIS MOLECULAR E IR

1. Espectroscopía de absorción molecular UV-VIS

La espectroscopía de absorción molecular UV-VIS es un mecanismo de interacción materia-

radiación que se describe a partir del siguiente esquema:
Moléculas en
estado gaseoso o en
disolución
X + hν → X*→ X + Q
Complejos
(neutros, cationes
iónicos o
aniónicos)

Se puede definir como un mecanismo de interacción materia-radiación en el que a partir de una

molécula ya sea en estado gaseoso o en disolución o un complejo ya sea neutro, aniónico o
catiónico que reacciona con la radiación electromagnética, se obtiene una molécula /complejo en
estado excitado. Es un proceso en el cual se desprende calor.

Los espectros que se obtienen a partir de esta técnica son de bandas anchas, las cuales están
compuestas tanto por niveles electrónicos, vibracionales y rotacionales. En ensanchamiento de
estas bandas será mayor o menos en función del disolvente.

Las sustancias puras en estado gaseoso tienen espectros más puros que aquellas sustancias que se
encuentran en disolución ya que en este caso no existiría disolvente que diera lugar a un
ensanchamiento de las bandas.

Los métodos de análisis basados en la absorción molecular son los más frecuentes. Sirven para
llevar a cabo análisis cuantitativos a una o dos longitudes de onda; a nivel cualitativo, se miden a
todas las longitudes de onda y permite llevar a cabo la determinación de estructuras siempre y
cuando esté combinada esta técnica con otras.

Los detectores que se emplean en estas técnicas derivan del efecto fotoeléctrico. Sin embargo,
también se emplean diodos en serie, en batería o en cadena que son conocidos como ‘’Diode Array
Detector (DAD)’, los cuales se pueden acoplar a cromatógrafos.

Las principales características que presentan estos métodos basados en la absorción molecular son
las siguientes:

-Presentan una elevada sensibilidad

-Presentan una baja selectividad puesto que prácticamente todas las sustancias absorben en el
UV
-Dan resultados con una buena precisión y muy buena exactitud.
-Son métodos muy versátiles ya que sirven para analizar muchísimos tipos de muestras.
-Presentan una gran sencillez de operación
-Tienen un precio aceptable.
La zona espectral en la cual se realizan los análisis de las muestras y en la cual se realiza por tanto el
espectro de absorción está comprendida entre los 100-800 nm.

Se llama absorción molecular a la capacidad que tienen algunas moléculas de absorber energía a
ciertas longitudes de onda. Experimentalmente se observa que a ciertas longitudes de ondas,
moléculas o complejos presentan una fuerte absorción.

La representación gráfica de la absorción de las moléculas en función de la longitud de onda se

denomina espectro de absorción molecular.

Medidas de absorbancia y transmitancia

Las medidas de absorbancia y transmitancia es una forma de exponer los datos que proporcionan
los aparatos para medir en el rango del UV-VIS.

El esquema a partir del cual se puede explicar cómo se obtienen estos datos es el siguiente:

Al pasar por el medio la radiación, tiene lugar una atenuación de la radiación electromagnética
como consecuencia de la solución absorbente que recorre un camino óptimo. La potencia
disminuye con la atenuación ya que parte de ella la capta la especie absorbente.

La transmitancia se define como la relación existente entre la potencia transmitida y la potencia

incidente. También se define como la medida que refleja cómo se atenúa la radiación
electromagnética cuando atraviesa una sustancia.

P( potencia transmitida) I
%T= ∗100= ∗100
P0 ( potencia incidente) I0

La absorbancia se define como la medida que refleja cómo se atenúa la radiación electromagnética
cuando atraviesa un elemento.

P
A=−log =−log T
P0
 −A
P=P 0∗10 =2−log ⁡(%T )

Los datos se presentan en los aparatos como %T, A o log A frente a λ.

Instrumentación empleada para medir absorbancia y transmitancia

La instrumentación que normalmente se utiliza para media la transmitancia o la absorbancia de una

muestra en función de la longitud de onda es el espectrofotómetro. Antes de pasar a describir sus
componentes básicos es conveniente indicar algunos términos relacionados con la nomenclatura
utilizada a propósito en la instrumentación en los métodos ópticos de análisis. Las definiciones que
se indican no pueden considerarse universales, pero sí están en razonable acuerdo con el uso
popular y son las que se utilizan en las principales obras dedicadas al tema.

-Fotómetro: cualquier dispositivo para medir la intensidad de radiación. Normalmente se utiliza

para designar un instrumento sencillo provisto de filtros para seleccionar una banda de
longitudes de onda y una fotocélula para medir la intensidad de radiación.
-Espectrofotómetro: instrumento más sofisticado que posee un monocromador en lugar de
filtros. Además, el sistema de detección normalmente es fotomultiplicador, más sensible
que una fotocélula.

-Colorímetro: instrumento muy simple que compara, usando el ojo humano como detector, el
color de la sustancia problema con el de una disolución patrón (F). El nombre de
colorímetro suele aplicarse en la práctica a cualquier instrumento apropiado para medir en
la región visible. En realidad, así se conocen muchos fotómetros de filtro comerciales.

-Espectrógrafo: aparato diseñado para detectar líneas espectrales a simple vista. Su aplicación
está restringida al análisis cualitativo para elementos con líneas de emisión en la zona del
visible del espectro.

-Espectrómetro: denominación general que se aplica a instrumentos que poseen sistemas de

detección eléctricos.

Según las definiciones anteriores, un espectrofotómetro es un espectrómetro que mide

fotones. Su utilización suele limitarse, en la práctica, a la región UV, VIS, IR.

Los componentes básicos de un espectrofotómetro son: una fuente de radiación, un

monocromador que selecciona una banda estrecha de longitudes de onda, una cubeta o
recipiente que contenga la muestra, un detector de radiación y un sistema de tratamiento y
lectura de la señal detectada.

La Ley básica de análisis cuantitativo conocida como Ley de Bouguer-Lambert-Beer es un método

matemático que se emplea para expresar de qué modo la materia absorbe la luz.

Un ejemplo de esta ley es la siguiente:

Supongamos una disolución de MnO4- en una serie de matraces de 25 mL que cubren el rango 1-10
ppb de Mn

 Experimento 1

Se mide la absorbancia (A) a una longitud de onda de λ = 525 nm en cubetas de 1 cm

Puesto que la absorbancia es proporcional a la concentración:

A=k [ Mn]
 Experimento 2

Se mide la absorbancia (A) a λ = 525 nm de una solución de 2 ppm de Mn y varía el camino óptico
desde 0.5-4 cm

En este caso, es el camino óptico el que es proporcional a la absorbancia. Este método de análisis es
más fiable puesto que si la muestra tiene un error, solo cambiaría la pendiente.

A=K K b [ Mn ]=k b [ Mn ] =ℇ b c ( mol/ L)

'
Algunos de los símbolos más importantes empleados en las medidas de absorción son los
siguientes:

Nombre Símbolo Nombres y símbolos

alternativos
Potencia radiante: P, P⁰ Energía de la radiación sobre Intensidad de radiación, I, I0
un área determinada en un
detector por segundo
Absorbancia, A Log P⁰/P Densidad óptica (D),
extinción (E)
Transmitancia, T P/P⁰ Transmisión, T
Camino óptico a través de la b e, d

Absortividad molar, ℇ (M-1,

muestra en cm
A/bc (mol/L) Coeficiente de extinción
cm-1) molar
Absortividad específica A/bc (g/l; μg/mL) Coeficiente de extinción k

Algunos de los aspectos importantes en la ley mencionada anteriormente son los siguientes:

-Sensibilidad y selectividad espectral

El criterio que se sigue para determinar la sensibilidad de un método es el siguiente:

ℇ >10 M c m → muy sensible

4 −1 −1

ℇ <10 M c m → poco sensible

4 −1 −1

Para eliminar las posibles interferencias, se combinan las longitudes de onda: λ1→λ2. Sin
embargo, se debe tener en cuenta que cambiar la longitud de onda a la cual se mide hace que
disminuya la sensibilidad, pero por otro lado, aumente la selectividad.

-Aditividad

Se llama aditividad a la suma algebraica de todas las absorciones de las especies consideradas
independientes. Esta suma únicamente se puede emplear como método matemático para
calcular la absorbancia total cuando las especies que absorben lo hacen a la misma longitud de
onda.

A =∑ ℇ i∗b∗c=b ∑ ℇ i ∗c i
λ λ

A=k c
El cumplimiento de la ley de Bouguer-Lambert-Beer se remite a considerar los siguientes
requisitos:

-La radiación electromagnética (REM) debe ser monocromática y paralela a la base de la

cubeta. Si no es paralela cambia el camino óptico, la absorbancia es mayor de lo que
debería ya que esta es proporcional al camino óptico, el cual aumentaría.
-Debe existir independencia en la absorción
-La absorción debe ser uniforme y para ello es necesario que las disoluciones o medios sean
homogéneos.
-Debe existir una degradación rápida de la energía y no debe existir fluorescencia
¿ ¿
A → hν y A → X+ Q(rápida)

-El índice de refracción (n) debe ser independiente a la concentración de analito [A]. Si el índice
de refracción varía, la longitud de onda también.

n2 λ 1
=
n1 λ 2
Si estos requisitos no se cumplen, se dan desviaciones de la ley de Beer. Estas desviaciones se
aprecian en las rectas de calibrado:

Existen dos tipos de desviaciones:

-Reales o intrínsecas: son aquellas que ocurren cuando la concentración de analito es menos
de 10-2 M, ya que lo que ocurre es que las partículas de la disolución interaccionan entre
ellas y dan lugar a cambios en el índice de refracción y absortividad molar/energía

-Instrumentales: estas pueden ser como consecuencia de varios motivos:

 REM no sea monocromática

 Sección trasversal no sea uniforme
 Poca limpieza en el material óptico (personales): las cubetas estén sucias (huellas),
caídas de las disoluciones.
 Variación de la P0 (I0).
 Respuesta no lineal del detector

-Químicas: son aquellas derivadas de equilibrios o reacciones químicas secundarias. Por

ejemplo, la disociación/asociación (dimerización), la polimerización (rédox), complejos
(hidrólisis).

Se llama radiación parásita a toda REM que puede llegar al detector y que no procede de la
muestra problema. Puede producirse por polvo atmosférico, reflexiones y/o defectos del
sistema óptico (ralladuras o roturas). El efecto que tienen este tipo de radiaciones se refleja en
un aumento del valor de la transmitancia y por tanto, en una desviación de la ley.
−2 −2 +¿¿
Ejemplo 1: Cr 2 O 7 + H 2 O↔ 2 Cr2 O 4 +2 H
Para obtener una linealidad del calibrado, el equilibrio debe desplazar hacia un lado u otro
totalmente. La solución para obtener la linealidad del calibrado es emplear disoluciones
reguladoras que fijen el pH.

El punto isobéstico (PI) es el punto en el que la absorbancia es la misma en ambos espectros de

dos especies distintas. Este punto es la longitud de onda donde se cortan los espectros de dos
especies que se interconvierten mediante una reacción ácido-base o por un intercambio
protónico. En este punto, la absortividad molar de las dos especies es la misma.

Ejemplo 2: 2 NO2 ↔(NO¿¿ 2)2 ¿

Este es un ejemplo en el cual ocurre el proceso de dimerización, el cual también da lugar a una
desviación de la ley.

Este fenómeno ocurre por efecto de:

-La transmitancia (T)

-La potencia (P)
-Un aumento de la concentración en un momento dado
-Impurezas de reactivos absorbentes
-Interacciones soluto-REM que no sea la absorción como la florescencia, la dispersión o las
reacciones fotoquímicas.

Otro caso en el cual se producen desviaciones es por efecto del disolvente, que como
consecuencia de este efecto desaparece el máximo de absorción.

Un resumen de estas desviaciones se refleja en las siguientes gráficas:

Policromía de REM Policromía de REM

 Policromía de REM Dispersión (%) de REM

Disolución de pH no regulado

Especies absorbentes y tipos de transiciones electrónicas

Las moléculas orgánicas/iones inorgánicos (algunos como MnO 4-, Cr2O7-2) presentan electrones
en orbitales moleculares enlazantes (σ, π ) y también en orbitales moleculares antienlazantes
(n). Cuando estas especies absorben REM se producen transiciones electrónicas generándose
espectros de bandas.

Ej:

Las transiciones electrónicas entre orbitales moleculares y bandas de absorción originadas se

reflejan en los siguientes esquemas:
 ¿
En estos esquemas faltan transiciones como por ejemplo la transición de π →σ ya que es una
transición muy poco probable. Todas las transiciones que sean muy poco probables entre todas
las moléculas se eliminan.

Las dos transiciones más típicas son las siguientes:

¿
- σ → σ : Ocurre en la zona del UV VACÍO- LEJANO a una longitud de onda menor de 200 nm.
Estas transiciones son propias del N 2 y O2 y del CH4. Sin embargo son transiciones sin interés
analítico.
¿
- n → σ : Son transiciones que se dan en compuestos con heteroátomos como N-O que aparece
en la zona del UV LEJANO. Estas transiciones son poco intensas.

Sin embargo, las transiciones más importantes son las modificables por disolventes y/o
sustituyentes.
¿
- n → π : Ocurre en la zona comprendida entre 250-600 nm y es propia de C=O, C 4H9, N=O y
presenta bajos valores de absortividad molar
¿
- π → π : Ocurre en la zona del UV PRÓXIMO-LEJANO y es propia de C=C y benceno; presenta
altos valores de absortividad molar.

Para que ocurran estas transiciones, las especies absorbentes deben presentar:

-Grupos cromóforos (relacionados con el color): grupos funciones como el carbonilo, enlaces
típicos o grupos atómicos típicos que son los responsables de la absorción. A estos grupos
pertenecen aquellas especies que absorben en el UV-VIS, IR como C=O ó –C=C.
-Grupos auxócromos: no absorben y son los auxiliares de la absorción y pueden producir
desplazamientos en intensidad y posición. Estos grupos son por ejemplo el –OH, NH2.

Hay que tomar siempre una referencia para poder determinar de qué efecto se trata:

El efecto hipocrómico presenta valores de absortividad molar menores respecto al cromóforo.

Si se produce un desplazamiento de la longitud de onda se pueden dar dos efectos: efecto

batocrómico, hacia longitudes de onda mayores, o efecto hipsocrómico hacia longitudes de
onda menores.
Características de absorción de algunos cromóforos orgánicos comunes y aplicaciones

Cromóforo Ejemplo Disolvente λmáx, nm ℇmáx

Alqueno C6H13CH=CH2 n-heptano 177 13000
Alqueno CH2=CHCH=CH2 n-heptano 217 21000
conjugado
Alquino C5H11C≡C-CH3 n-heptano 178 10000
196 2000
225 160
Carbonilo CH3COCH3 n-hexano 186 1000
CH3COH 280 16
n-hexano 180 Grande
293 12
Carboxilo CH3COOH Etanol 204 41
Amido CH3CONH2 Agua 214 60
Azo CH3N=NCH3 Etanol 339 5
Nitro CH3NO2 Isooctano 280 22
Nitroso C4H9NO Etil éter 300 100
665 20
Nitrato C2H5ONO2 Dioxano 270 12
Aromático Benceno n-hexano 204 7900
256 200

Las transiciones típicas que se aprecian en esta tabla son las siguientes:
¿
- π → π : alqueno, carbonilo 1, nitroso.
¿
- n → π : carbonilo 2, azo y amido.

En esta tabla también se refleja el efecto de los grupos auxócromos sobre la absortividad molar
máxima, en los compuestos alquino y carbonilo. Tal y como se ha mencionado anteriormente,
se debe tomar siempre una referencia.

Los valores de la absortividad molar máxima se han obtenido en 1 disolvente dado, son
indicadores de la sensibilidad del método y en algunos casos sirven para identificar grupos
funcionales.

Para poder comparar valores, se debe emplear el mismo disolvente.

Las flechas que se muestran en la tabla, indican los efectos causados por un desplazamiento de
la longitud de onda. En el caso de pasar de 186 a 180 nm, se trata de un efecto batocrómico
puesto que se desplaza hacia longitudes de onda menores; por el contrario, al pasar de 225 a
280 nm, se trata de un efecto hipsocrómico puesto que se desplazan hacia longitudes de onda
mayores.

Cuanto mayor sea el valor de absortividad molar, mayor será la sensibilidad

Moléculas orgánicas con dos o más cromóforos

A. Aislados

Este tipo de moléculas no están conjugadas y el máximo de absorción no se desplaza mucho.

Molécula λ, nm ℇ, M-1, cm-1

CH2-CH2-CH2-CH=CH2 184 10000
CH2-CH2-CH2-CH2-CH-CH2 185 20000

Se trata en este caso de un efecto hipercrómico, pues aumenta el doble la intensidad al

aumentar el número de dobles enlaces.

B. Conjugados

Al aumentar la conjugación, se aprecia un efecto batocrómico, hacia mayores longitudes de

onda.

Molécula λ, nm
CH2=CH2 193
CH2=CH-CH=CH2 217
CH2=CH-CH=CH-CH=CH2 258
CH2-CH-(CH=CH)2-CH-CH2 300

Al desplazarnos hacia mayores longitudes de onda, tendremos efectos coloreados. El primer

color que se aprecia es el amarillo y absorbe en el violeta.

C. Alqueno/ino

Molécula λ, nm ℇ, M-1, cm-1

CH2=CH-CH=CH2 219 21000
CH2=CH-CH≡CH 219 6500

En este caso, se da un efecto hipocrómico, pues disminuye la intensidad al aumentar el grado

de insaturación.

Las bandas de transferencia de carga (TC) se producen de una parte a otra de un sistema. Estas
bandas las presentan muchos compuestos orgánicos e inorgánicos, especialmente los
complejos.
+ ¿¿
−¿L ¿

Complejo Fe ( III ) + SC N −¿→ M −L+hν=M ¿

Por efecto de la radiación, el metal se lleva la carga negativa. En este complejo interviene el
efecto dador-aceptor, y en este caso el aceptor sería el complejo de Fe (III) y el dado el
isotiocianato.
−¿¿
−2 +¿ L ¿
Fe ( II ) + Fenantrolina ( FEN ) → ( FEN )3 ( ferroina )=M

Este es un ejemplo en el cual se da una transferencia de carga inversa, ya que en este caso el
aceptor es el ligando (FEN) a diferencia del ejemplo anterior.
Los complejos presentan bandas en el UV-VIS con valores de absortividad molar mayores de
104, lo que implica que los límites de detección en estos casos son bajos.

Los espectros de estos dos complejos son muy similares, no obstante, el espectro en el que se
produce la transición de carga inversa, presenta más irregularidades y más fluctuaciones en el
mismo. (Mirar fotos).

También existen las bandas de campo de ligando las cuales son muy útiles para predecir el
efecto que tienen los distintos ligandos sobre el ion.

Efecto del disolvente

Algunos de los aspectos importantes a la hora de realizar medidas en disolución son los
siguientes:

-Las medidas que se hagan deben compararse entre patrones y muestras, pero siempre
empleando el mismo disolvente para ambos dos.
-El disolvente por sí mismo tiene transparencia

A continuación, se muestran una serie de disolventes y el mínimo aproximado de transferencia:

Disolvente Mínimo aproximado de transferencia (T),

nm
Agua 190
Etanol 210
n-hexano 195
Ciclohexano 210
Benceno 280
Dietil éter 210
Acetona 330
1,4-Dioxano 220

El mínimo de transferencia de cada disolvente hace referencia a la longitud de onda a partir de

la cual un disolvente es transparente y por tanto no absorbe, o bien, la longitud de onda por
debajo de la cual un disolvente no es transparente y absorbe.

Por ejemplo, la acetona, a longitudes de onda superiores a 330 no absorbe y por tanto es
transparente. Sin embargo, por debajo de esta longitud de onda absorbe. Esto quiere decir que
un analito no se puede medir en este disolvente por debajo de 330 nm ya que se mide el
analito y las interferencias causadas por la absorción del disolvente.

El disolvente influye en estas medidas puesto que entre el soluto (analito) y el disolvente
ocurren interferencias que se traducen en que existen desplazamientos del cromóforo
(ensanchamiento de bandas).

Ejemplo: al medir el yodo empleando como disolvente el agua, se aprecia una banda naranja
que pertenece a una zona muy cercana al UV; sin embargo, si se mide con el CH 3Cl
(clorometano) que es apolar y en estado gaseoso, se aprecia una banda violeta pertenceciente
a la zona del VIS-IR.
En el caso de los gases, las interacciones son pocas porque las moléculas se encuentran
prácticamente aisladas. Los espectros muestran las estructuras finas, es decir se pueden
diferenciar los niveles rotacionales y vibracionales con respecto a los electrónicos. Hay mayor
libertad.

Sin embargo, en disolución hay una restricción de libertad de giro, por lo que no se ven
claramente los niveles rotacionales y vibracionales, se ven bandas que corresponden a los
niveles electrónicos únicamente.

Cuando la polaridad aumenta, el estado excitado es más polar que el fundamental.

Teniendo en cuenta los posibles efectos que existen por desplazamiento del máximo de
absorción, se pueden asignar estos a las distintas transiciones:
¿
- n → π : en este caso se da un efecto hipsocrómico como consecuencia de una solvatación de
electrones n. Se produce una polaridad en la molécula.

¿
- π → π : en este caso se da un efecto batocrómico y entran en juego las fuerzas electrostáticas.

Ejemplo efecto del disolvente: Tetrazina (mirar foto)

La Tetrazina es una molécula polar o tiene cierta polaridad y es N-electronegativa.

En estado gaseoso, no se aprecian interacciones con el disolvente, y es posible apreciar los

niveles vibracionales y rotacionales.

En disolución, en presencia de hexano como disolvente, el cual es apolar, tampoco se aprecian

interacciones ya que no se ve un desplazamiento del máximo de absorción. En este caso no
existe libertar de giro, por lo que no se aprecia la estructura fina y solo se ve la envolvente. Sin
embargo, si se emplea el agua como disolvente si existe interacción entre este y la Tetrazina y
se aprecia un desplazamiento del máximo de absorción hacia longitudes de onda mayores
(efecto batocrómico).

El color

El color se define como una emisión de radiación comprendida entre 400-700 nm. La
percepción del mismo por el ojo, varía en función de factores químicos, físicos o fisiológicos.

Al interaccionar una sustancia dada con la radiación electromagnética, pueden ocurrir tres
cosas:

-La absorción que se produce es total (cuerpo negro)

-La absorción que se produce es nula (color blanco)
-La absorción que se produce es parcial, de tal manera que se absorben ciertas longitudes de
onda no detectables y se transmiten otras detectables. Los colores que se van a ver son el
producto de la transmitancia de la radiación, es decir, se va a ver el color complementario
(detectables) al absorbido.
 λ absorbida (nm) Color absorbido Color observado
(complementario)
380-420 Violeta Amarillo verdoso
420-440 Azul violeta Amarillo
440-470 Azul Anaranjado
470-500 Verde azulado Rojo
500-520 Verde Púrpura
520-550 Amarillo-verdoso Violeta
550-580 Amarillo Azul violeta
580-620 Anaranjado Azul
620-680 Rojo Verde azulado
680-780 Púrpura Verde

Espectroscopía de absorción UV-VIS

Un espectrofotómetro es un instrumento de absorción molecular que trabaja en el rango

ultravioleta-visible de longitudes de onda. Está constituido por:

1. Lámparas
2. Sistema óptico
3. Compartimento de cubetas
4. Detector
5. Sistema de lectura
6. Impresora de resultados

Lámparas

Las lámparas son la fuente de radiación continua que precisa un espectrofotómetro de UV-VIS.
Las radiaciones emitidas por las lámparas, serán las que mediante un sistema óptico adecuado,
se harán incidir sobre las muestras a analizar.

Casi todos los espectrofotómetros utilizan una lámpara de deuterio y otra de tungsteno para
cubrir el rango de longitudes de onda comprendido entre 190 y 850 nm.

Se puede medir harta 350 nm, a partir de esta longitud de onda, trabaja la lámpara de
wolframio.

Compartimento de cubetas/células

Las principales características que presentan estos compartimentos son las siguientes:

-Tienen una dimensión, un paso óptico de 0.2-10 cm para que se pueda medir.
-Se debe mantener una cautelosa limpieza con ellas (grasa, huellas…)
-No se deben calentar porque su efecto puede ser pernicioso (perjudicial) para la medida
puesto que las cubetas se dilatan y aumenta el camino óptico.
-No debe presentar ralladuras ya que si las tiene aparecen bandas y se produce el fenómeno de
difracción.

A parte de cubetas, existen tubos de vidrio que se empelan en aparatos de aja calidad como el
SPECTRONIC 20. En cualquiera de los casos, se debe usar siempre el mismo vidrio para medir.

Existen varios tipos de cubetas: ´´OPEN-TOP’’ –cubeta cuadrada con tapón o no-, ‘’TALL
MICRO’’-se caracteriza por tener un camino óptico pequeño puesto que se emplea para medir
cantidades de muestra pequeños-, ‘’SAMPLING’’, ‘’SEMI-MICRO FLOW’’.

Diseño de instrumentos (fotómetros y espectrofotómetros) (colorímetro=fotómetro)

A. Haz simple

Los principales componentes que presentan los fotómetros/espectrofotómetros de haz simple

son los siguientes:

-Todos ellos presentan una fuente que puede ser o bien de wolframio, que sirve para medir en
la zona del visible mediante el fotómetro y por consiguiente únicamente es útil para
sustancias coloreadas; o una fuente de wolframio y deuterio.

Wolframio Filtro Tubos Celdas FT m-Amperímetro

Wolframio + Red + rendija Cubetas Fotomultiplicador Digital
Deuterio (E/S)
Ordenador (200-1000 nm)

-Filtro o monocromador que son seleccionadores de longitudes de onda.

-Red de difracción y rendijas.
-Las muestras se colocan en tubos (siempre el mismo para que no varíe el camino óptico).
-Detectores, como el fotomultiplicador el cual es más complejos que las celdas FT.

Una vez que la radiación pasa por el monocromador y se selecciona una longitud de onda, pasa
por el obturador (célula de referencia) que sirve para el control de lectura de 0, es decir, para
hacer el 0 de medida. En este punto se controla el 0% de transmitancia.

En la célula de referencia también se puede obturar.

Cuando el obturador está abierto, pasa la radiación. Al ser de 1 haz solo, se puede operar con
una célula de referencia.

Al medir la muestra, se quita la celda de referencia, se desplaza o bien se remplaza el tubo del
blanco por el de la muestra.

Finalmente se multiplica la señal.

B. Haz doble

La única diferencia que presenta este instrumento con respecto al de haz simple, es que en este
caso existen dos haces. Sin embargo, los elementos que presenta son los mismos.

En este caso, se pueden distinguir dos tipos de fotómetros/espectrofotómetros de haz doble:

-Con separación espacial

El funcionamiento de este equipo a groso modo es el siguiente:

Las lentes focalizan la radiación → la radiación se bifurca en dos partes exactamente iguales al
pasar por el sistema de divisor de haz → la radiación llega a dos espejos que la dirigen por un
lado hacia la celda de referencia (P 0) y por otro lado, a la celda de muestra (P, porque parte de
la radiación se ha absorbido) → la radiación llega a dos detectores, uno de ellos a continuación
de la celda de referencia y el otro a continuación de la celda de muestra → una vez que la
radiación pasa por los detectores, llega a un amplificador diferencial que amplifica la señal (P 0 –
P)→ finalmente se lee una relación entre P’ y P0.

-Con separación temporal

La peculiaridad que tiene este es que presenta un espejo con sectores, es decir, es un espejo
que presenta partes en las que el medio es transparente, y otras en las que el medio es negro y
por tanto, por estas últimas no pasa la radiación. Esto es lo equivalente a un obturador.

El punto de recombinación es el punto a partir del cual se calcula la relación entre P y P 0.

El funcionamiento de este equipo a groso modo es el siguiente:

En este caso, existen dos tipos de fuente: o bien una lámpara de deuterio o una de halógeno y
tungsteno → la radiación llega a una lente → llega a una ranura de entrada → una segunda
lente → pasa por el monocromador (red de difracción) el cual gira al seleccionar longitudes de
onda → una tercera lente → pasa por una ranura e salida (únicamente pasa la longitud de onda
que se ha seleccionado) → una cuarta lente → pasa por un divisor periódico (opaco-muestra,
transparente-referencia) → finalmente llega a un sistema de lectura.

El divisor periódico de haz es un disco impulsado por un motor que deja pasar
alternativamente el haz de muestra y el de referencia.

Algunas de las prestaciones más importantes de este equipo son las siguientes:
-Funciona de forma automática
-Si cambia la potencia de la fuente, afecta tanto a P como P0 y ambas dos se compensan.
-La potencia que llega al detector depende de la longitud de onda.
-Permite un barrido con el intervalo deseado
-Corrige cualquier variación de potencia de la fuente, de la potencia que llega al detector que es
función de la longitud de onda, de la eficiencia de la red y de la reflectividad de los espejos.

La relación de potencia de los dos haces permanece siempre constante.

Óptica

Los monocromadores son filtros, prismas o redes.

-Espejos: el número de componentes es muy alto. Al pasar la radiación por los espejos, se
produce una pérdida de la potencia, lo que implica que la sensibilidad que llega al detector
es baja, y se traduce en un rendimiento óptico pobre.

-Lentes: en este caso, se debe corregir la distancia foca. En este caso, se consigue mayor
sensibilidad como consecuencia de la mayor transparencia de estas, por lo que se obtiene
un rendimiento óptimo.

Rendimiento Haz simple Haz doble

Espejos 43% 4.4 %
Lentes 72.9 % 14.7 %

Generalmente, se prefiere un detector de haz simple ya que en los de haz doble se precisa un
fotomultiplicador.

Un instrumento que cabe destacar es el espectrofotómetro con detector de cadena de diodos

el cual presenta varios diodos: multicanales, mono-haz y el DAD.

En este caso, la fuente es una bombilla. La radiación emitida por la fuente pasa por la cubeta y
posteriormente por una rendija. Llega a una red de difracción en la cual se produce una
dispersión de la radiación, y finalmente llega a un detector por cadena de diodos que en
definitiva es un chip de silicio. Este último es un sistema de mono-haz, multicanal en el que la
REM difractada se divide en muchos canales con sus respectivas longitudes de onda.

Las ventajas que presenta este equipo es que ningún elemento óptico se mueve y que el
espectro se obtiene en intervalos de tiempo muy cortos, menos de 1 segundo.

Las aplicaciones que presenta son:

-Aplicaciones cualitativas y cuantitativas.

-Aplicaciones cinéticas
-Producción de intermedios lábiles
-Sirve para acoplarlo en un HPLC que es tipo de cromatografía en columna.

Aplicaciones de la espectroscopía UV-VIS

1. Análisis cuantitativo

Para hacer el análisis cuantitativo, en algunos espectrofotómetros, resulta más conveniente

hacer un espectro en un rango de longitud de onda próximo al pico de interés, que realizar una
medida a una única longitud de onda.

-Identificación de un compuesto, lo cual requiere comparar detalles espectrales como son los
máximos, los mínimos, el punto isobéstico, la longitud de onda máxima, la derivada
espectral, etc, entre patrones y muestras problema.

-Como control de pureza, controlando el valor mínimo (Ejemplos: benceno con EtOH absoluto,
ciclohexano)

-Asignación de estructuras, teniendo en cuenta que la isomería es capaz de desplazar el

máximo de absorción y consecuentemente la absortividad molar cambia.

2. Análisis cualitativo

Las aplicaciones cualitativas son muy numerosas y se extienden tanto para compuestos
orgánicos como inorgánicos.

Estos métodos son rápidos, precisos, exactos, sensibles, selectivos, sencillos y cómodos.

2.1. Análisis de un componente

El análisis de un componente requiere:

-La absorción en el UV-VIS como por ejemplo el benceno, MnO4-, Cr2O7-2.

-Si no existe absorción, o bien esta es débil, se debe derivatizar, que consiste en obtener un
derivado del analito que se quiere determinar generalmente, un reactivo orgánico.

Por ejemplo, el Fe+3 presenta una absorción en el UV-VIS muy débil

−¿ ( Rojo ) ¿

F e +3 + SC N−¿ → Fe ( SCN ) ¿

C=O+ F . H → F−H
Este modo de operar, presenta una elevada selectividad y sensibilidad.

2.2. Factores a tener en cuenta en la elaboración ‘’PUESTA A PUNTO’’ de un método

espectrofotométrico

Para llevar a cabo la puesta a punto de un método espectrofotométrico es necesario establecer

en primer lugar las condiciones de trabajo y en segundo lugar, obtener la recta de calibrado.

A. Disolvente o medio de reacción

El disolvente o el medio de reacción puede ser acuoso, semiacuoso o no acuoso. En el caso en

el que se emplee un medio de reacción no acuoso, el método que se empleará será de tipo
‘’Extracto-espectrofotométrico’’ el cual implica la extracción del complejo líquido-líquido. Este
método es más selectivo porque se quedan posibles interferencias en la fase acuosa.

Por ejemplo, si se tienen 20 mL de fase acuosa y 5 ml de fase orgánica, aumenta la

concentración 4 veces, lo que hace que aumente la sensibilidad del método.

El disolvente que se emplee va a condicionar la sensibilidad y la selectividad del método.

B. Selección de la longitud de onda ¿λmax?

En primer lugar se debe obtener el espectro del complejo y posteriormente obtener el del
ligando con la misma referencia con la que se mide el complejo.

Se aprecia que el ligando se encuentra más a la derecha, hacia longitudes de onda mayores que
el complejo y por tanto estamos ante un efecto batocrómico.

En el caso del espectro del complejo (1), existe un efecto hipercrómico del ligando respecto al
complejo.

En el caso del espectro del ligando (2), existe un efecto hipocrómico del complejo respecto al
ligando.
En este caso, se debe medir a la longitud de onda 1, la del complejo, puesto que la diferencia es
mayor.

Una vez que se obtienen estos espectros, se hace el espectro de diferencia.

Se debe medir a dos longitudes de onda distintas con el objetivo de eliminar interferencias.

C. Condiciones químicas
-Se debe controlar el pH, pues existen múltiples equilibrios implicados:
+¿ ¿
M + LH ↔ ML+ H
H ↔
−¿ ¿
+¿O H ¿ ↔ ↔
+ ¿¿ +¿¿
M (OH ) L−¿ ó LH 2 ¿
ML H

Se elige el tipo ácido-base, se realiza el registro gráfico y se representa A = f(pH).

No es lo mismo usar (SO4-2, que NO3-, que Cl-) + H+ ya que el anión puede producir o dar distintos
efectos

En ese punto, cuando el pH es muy crítico se debe emplear una disolución reguladora.

-Otro factor a tener en cuenta es el tiempo de desarrollo de color.

Este tiempo puede ser instantáneo, de unos 10 minutos o bien, muy prolongado. En este último
caso se produce la degradación fotoquímica que implica que lo que se forma, automáticamente
se degrada como consecuencia de la radiación electromagnética
-El exceso de reactivo.

Emplear un exceso de reactivo permite que a partir de las curvas de calibrado (del hueco
coloreado), se pueda obtener la estequiometría del complejo y las constantes de formación.

-Orden de adición de los reactivos

-Estabilidad térmica

-Fuerza iónica (μ)

-Selectividad

Ejemplo: determinar Co+2 en presencia de Fe+3/SCN-

+3 −¿ → Fe ( SCN ) : Rojo ¿
F e + SC N
−2

C o+2 +SC N −¿→ Co(SCN ) 4 : Azul ¿

Para eliminar la interferencia, se añade a la disolución F –y acetona puesto que esta resalta el
color azul y aumenta la absorbancia y se obtiene un compuesto que es el Co(SCN) 4-2 de color
azul + F6Fe-3 (incoloro).

D. Curva de calibrado: A = F(c)

A partir de la recta de calibrado se puede calcular el valor de la absortividad molar, el límite de

detección, el coeficiente de variación, etc.

2.3. Análisis multicomponente

El análisis multicomponente se lleva a cabo obteniendo los espectros de cada uno de los
componentes en primer lugar.

El fundamento de este análisis es una suma de absorbancias que es lo que se conoce como Ley
de Lambert aditiva.
Ejemplo: [A] = 0.001 M y [B] = 0.002 M

C=[ A ] + [ B ] =0.0001+0.0002=0.0003 M
λ A : A 1 [ ℇ a c A +ℇ B c B ] b

λ B : A 2 [ ℇ a c A +ℇ B c B ] b

El problema que hay es el cálculo de la concentración de A y B de la muestra problema puesto

que A1 y A2 son valores que se obtienen experimentalmente. El valor de la absortividad molar
también se debe conocer, y estos valores se obtienen a partir de compuestos puros, ‘’Patrones’’,
si se conocen.

A
ℇ A ( λ A )=
0.001∗b
A
ℇ B ( λ B )=
0.002∗b
Una vez conocido el valor de la absortividad molar, se resuelve un sistema de dos ecuaciones.

Si se quiere conocer información de otros componentes C, D, E… se necesita establecer un

sistema de n ecuaciones para resolver las n incógnitas (n componentes).

Campos de aplicación de la absorción molecular UV-VIS

A. Determinación de Fe en aguas duras y potables por espectrofotometría empleando 2,4,6-

tripiridil-1,3,5-triazina.
+2
F e +TPT → Fe−TPT
Este complejo tiene una longitud de onda máxima de 595 nm, por lo que presentará un color
azul.

Las principales características del método son:

-Las sustancias que se determinan son todas las formas del hierro
-Los tipos de muestras que se analizan son las aguas duras y potables.
-Las bases del método son dos: la reducción del Fe (III) a Fe (II) y la formación del complejo del
hierro con el TPT.
-El rango de aplicación se extiende hasta 1 mg/L (μg/mL); 1ppm
-La curva de calibrado es lineal hasta 2 mg/L a 595 nm.

función de ℇ = 5.6*104 M-1 cm1.

-Sensibilidad: 1 mg/L genera una A = 1.25 (b=40 mm), pero mucho mejor es expresarlo en

-LD = 0.06 mg/L (n=8)

-Sesgo (error sistemático, ‘’bias’’), no se detectan fuentes importantes.
-Se aprecian interferencias de poli-fosfatos comerciales.
-El tiempo requerido del método para 1-10 muestras es de 45-60 minutos incluyendo
tratamientos previos.

B. Determinación de Sucrosa y Glucosa en alimentos mediante un método enzimático e

indirecto
Los pasos a seguir para llevar a cabo esta determinación son los siguientes:

1. Fundamento: se deben emlear dos muestras de alimento que contengan Sucrosa y

Glucosa.

Muestra 1 :G+ HK ( hexoquinasa )(GDP−OH

pH=7.6 ) → GDP+ ADP : Fosforilación
' +¿ ¿

GGP+λ=334
NAD P, 340 , 365 nm
+ ¿+ (GGP ) + H ¿
+¿ → NADP H ¿

[ G ] =20 mM

3−fructosidasa (pH =4.6)

Muestra 2 :S + H 2 O→ fructosa + glucosa→ aplicar método M 1

Glucosa ( 42mM )=[ G ( M 1 ) =20 mM ] +[G ( M 2 )=fructosa ]

[ Fructosa ] =22 mM
2. Preparación y estabilidad de disoluciones
3. Cálculos
4. Procedimientos de preparación de muestra para determinar Sucrosa y Glucosa en
alimentos líquidos (zumo de frutas, vino, cerveza, leche condensada), alimentos
sólidos (Sucrosa en chocolate) y alimentos pastosos/gelatinosos (mermelada y miel).

C. Valoraciones fotométricas

Las valoraciones fotométricas es un procedimiento por el cual se determina el punto final de

una valoración utilizando las medidas de absorbancia a una longitud de onda fija. El objetivo es
determinar o localizar el punto final mediante las representaciones de la absorbancia en
función del volumen de reactivo valorante.

Estas valoraciones se basan en reacciones químicas, en reacciones volumétricas y como

condición indispensable está que alguna de las especies implicadas en estas reacciones
presente color.

aM +bR → M a R b

Los principales requisitos que se deben cumplir para llevar a cabo una valoración fotométrica
es que alguna de las sustancias implicadas en la reacción tenga color, y poseer una cubeta
macro.
Se manda radiación a una longitud de onda seleccionada y se pasa por la muestra sin que
llegue al agitador.

Existen varios tipos de valoraciones fotométricas:

A. Indirectas, en las cuales se necesita un indicador

−¿ ( base )→ H 2 O ¿

H +¿ (ácido )+O H ¿

FNA ( azul ) a pH básicos

B. Directas
+3 +2

F e +2 + MnO−¿
4
→Fe +M n ¿

Más ejemplos: