CROMATOGRAFIA LIQUIDA

CROMATOGRAFIA LIQUIDA

También conocida como cromatografía de líquidos. Es una de las técnicas analíticas ampliamente utilizadas, la
cual permite separar físicamente los distintos componentes de una solución por la adsorción selectiva de los
constituyentes de una mezcla.
En toda cromatografía existe un contacto entre dos fases, un fija que suele llamarse fase estacionaria, una fase
móvil (fase móvil) que fluye constantemente durante el análisis, y que en este caso es un líquido o una mezcla de
varios de ellos.
 La fase estacionaria por su parte puede ser alúmina, sílice o resinas de intercambio iónico
que que se encuentran disponibles en el mercado. Los intercambiadores iónicos son
matrices sólidas que contienen sitos activos (llamados también grupos iogenicos) de
carga electrostática (positiva o negativa) de esta forma, la muestra se fija al soporte sólido
por afinidad electrostática.
 Dependiendo de la relación carga tamaño algunos constituyentes de la mezcla se
retendrán con mayor fuerza sobre el soporte sólido que otros, es decir serán absorbidos,
lo que provocará se separación. Las sustancias que permanecerán más tiempo libres en la
fase móvil avanzan más rápidamente con el fluir de la misma, y las que quedan más
unidas a la fase estacionaria o retenidas avanzan menos y por lo tanto tardaran más en
salir o fluir. Este es el principio fundamental d ela cromatografía.
 Un ejemplo notable es la cromatografía de intercambio iónico. La columnas mas
utilizadas son las de sílice.
 Cromatografía en columna

 El método clásico de la cromatografía líquida utiliza un tubo de vidrio con un diámetro alrededor de 10 a
50 mm que sostiene una columna de partículas sólidas de 50 a 500 cm.
 Las cuales constituyen la fase estacionaria. Para garantizar un flujo razonable, se utilizan partículas sólidas
de diámetros mayores a 150 a 200 um de diámetro. Por lo general la porción de líquido por encima del
empaque es suficiente para forzar la fase móvil, hacia abajo a lo largo de la columna.
 Desde que inició la historia de la cromatografía líquida se supo que pueden obtenerse
grandes aumentos en la eficiencia de una columna por medio de una disminución en el
tamaño de la partícula de los empaques. Sin embargo, no fue si no hasta el final de los
decenios de los sesenta que se desarrollo una tecnología que permitía producir partículas
de diámetros tan pequeños como de 10 um. Esta tecnología requiere instrumentos
complejos que contrastan notablemente con los simples dispositivos empleados en la
cromatografía líquida clásica.
 FUNDAMENTO
La cromatografía líquida tiene dos fases:
 Fase estacionaria o fase fija (sólido). En la cual puede utilizarse :
Alúmina, sílice o resina de intercambio irónico.
 Fase móvil (líquido). – En la que fluye permanentemente durante el análisis, generalmente se utiliza un
solvente o mezclas de solventes.

 Con el objetivo de aumentar la eficiencia en las separaciones, es decir obtener una separación óptima, se
disminuyó el tamaño de las partículas de los rellenos a menos de 50 micrones, también se redujo el
tamaño de la columna de 1 a 7 mm, la cual genero la necesidad de utilizar altas presiones (600atm) para
lograr que fluya la fase móvil.
COMPONENTES DE LA
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
 Desde que inició la historia de la cromatografía líquida se supo que pueden obtenerse
grandes aumentos en la eficiencia de una columna por medio de una disminución en el
tamaño de la partícula de los empaques. Sin embargo, no fue si no hasta el final de los
decenios de los sesenta que se desarrollo una tecnología que permitía producir partículas
de diámetros tan pequeños como de 10 um. Esta tecnología requiere instrumentos
complejos que contrastan notablemente con los simples dispositivos empleados en la
cromatografía líquida clásica.
 BOMBAS:
 Tiene salidas por lo menos 70 kg/cm2y preferiblemente 280 a 420 kg/cm2la velocidad de
flujo 3ml/min debe mantenerse constante +-20%de dos tipos de bombas:
 BOMBAS MECANICAS: una jeringa accionada por un tornillo produce una impulsión no
impulsante se controla fácilmente, tiene inconveniente su baja capacidad inadecuada
para el cambio de disolvente.
 BOMBAS DE MOVIMIENTO ALTERNADO: son más utilizadas produce un Flujo punzante que
debe ser amortiguado ventaja es que con ella se pude utilizar un límite de disolvente.
SITEMASDE INYECCION DE LA MUESTRA:

 tiene válvulas giratorias, válvulas correderas se fabrican de kel-f mueve en

un plano entre dos piezas se coloca la muestra en una jeringa se mueve el
cursor de izquierda y derecha de modo que la muestra quede colocada a
la corriente del disolvente.
 La inyección de la muestra puede llevarse a cabo por medio de una
jeringa y un tabique obturador de silicona neopreno o teflón. Otra
posibilidad es de detener momentáneamente el fluido atraves de la
columna retirar una tapa e inyectar directamente la muestra sobre la
parte superior de la columna con una jeringa.
 COLUMNAS
 Se fabrican con tipos de vidrio de pared grueso o acero inoxidable de calibre muy
preciso columna típica tiene una longuitud de 15-150 cm diámetro de 2-3 mm.
 El tipo más común de empaquete es el gel de sílice en otras alúminas y celito tierra de
diatomeas, tamaño de partícula 5 a 10 um. PRECOLUMNAS: La finalidad de la
precolumna es retirar las impurezas del disolvente y de esta forma evitar la
contaminación de la columna analítica
 DETECTORES
 : no existe un sistema detección universal y alta sensibilidad.
 El detector más común para la cromatografía liquida se alto rendimiento son los que se
basan en la absorción de la radiación del ultravioleta y visible.
 los detectores espectofometricos son considerablemente más versátiles que los
fotómetros debido a que la radiación puede ser seleccionada de forma anticipada de
acuerdo a los picos de absorción con los componentes de la muestra.
RECIPIENTES PARA LA FASE MÓVIL

 Un aparato de cromatografía líquida se equipa

con uno uno o más recipientes de vidrio cada
uno de los cuales contiene 500 mL de un
disolvente.
● Diagrama de bloques que muestra los
componentes de un aparato característico
Sistemas para el tratamiento del disolvente

Los disolventes deben estar filtrados y desgasificados.

 Sistema de bombeo por vacío.
 Sistema de destilación.
 Dispositivo para calentar y agitar los solventes.
 Sistemas de purga.
Separación de mezclas
Elución: Es la migración de los solutos a lo largo
de la columna hacia la salida de esta.
● Elución isocrática: Es una corrida
cromatografía en la cual permanece
constante la composición de la fase móvil.
● Elución en gradiente: Es una técnica en CL en
la cual varia en forma continua la
composición de la fase móvil durante la
elución.
Ventaja de una elución con gradiente en la
separación de una mezcla de clorobencenos.
 Debe tomarse encuenta que las presiones elevadas que
generan las bombas de cromatografía de líquidos no
constituyen un riesgo de explosión, porque los líquidos no son
muy compresibles. Por tanto, la rotura de un componente del
sistema sólo supone una pérdida de solvente.

 Lo que sí es evidente es que ésta puede representar un riesgo

de incendio o de contaminación del ambiente.
TIPOS DE BOMBAS
 Bombas reciprocantes:
 consiste en una pequeña cámara en la que el solvente es impulsado por el
movimiento de vaivén de un pistón accionado mediante un motor.
 Presenta dos válvulas de globo unidireccionales, que se abren y cierran de
manera alternada, controlan el flujo del solvente hacia dentro y hacia
afuera de un cilindro.
 Desventajas:
 producen un flujo pulsado que se tiene que amortiguar porque los pulsos se
manifiestan como ruido en la línea base del cromatograma.
 Los instrumentos modernos de LC están equipados con cabezas dobles para las
bombas o levas elípticas para reducir al mínimo dichos pulsos.
 Ventajas:
 Entre las ventajas de las bombas reciprocantes se pueden citar su pequeño
volumen interno (35 a 400 μL), sus altas presiones de salida (hasta 10 000 psi), su
fácil adaptación a la elución con gradiente, su gran capacidad de solvente y
sus flujos constantes, que son prácticamente independientes de la
contrapresión de la columna y de la viscosidad del solvente
 Bombas de desplazamiento:
 Por lo general, consisten en unas grandes cámaras similares a las de una
jeringa, equipadas con un émbolo que se activa por medio de un
mecanismo de tornillo accionado mediante un motor de etapas.
 Ventajas:
• el flujo que resulta está libre de pulsos.
 Entre las desventajas están una capacidad de solvente limitada (250 mL) y
muchas dificultades cuando éste se tiene que cambiar.
 Control de flujo y sistemas de programación:

 Como una parte de sus sistemas de bombeo, muchos

instrumentos comerciales están equipados con dispositivos
controlados por computadora que permiten medir la tasa de flujo
mediante la determinación de la caída de presión a través de un
constrictor colocado en la salida de la bomba.
 Cualquier diferencia entre la señal y un valor preestablecido se
utiliza para aumentar o disminuir la velocidad del motor de la
bomba.
 SISTEMAS DE INYECCION DE MUESTRA

 La inyeccion de un volumen preciso de muestra debe hacerse a

la entrada de la columna en un corto periodo de tiempo para
pertubar lo menos posible el regimen de circulacion de fase movil
establecido en la columna y el detector.
😑~El medio que mas se usa para la introduccion de las mustras en la
cromatografia de liquidos se basa en los rizos de muestreo .

~Fundamentalmente existen 2 tipos de inyectores manuales:

De jeringa
De válvula
Rizo de muestreo para cromatografia
de liquidos
 Valvula giratoria para la
muestra : en la posicion a) de
la valvula se llena el circuito
ACB con la muestra.
 La posicion b) es para la
introduccion de la muestra en
la columna
 Estos dispositivos con frecuencia forman parte del equipo cromatografico .

 Hay rizos intercambiables que permiten la eleccion de tamanos de

muestra desde 1 hasta 100 ul o más.
 La mayor parte de los cromatografos actuales se vende con
autoinyectores , que tienen la capacidad de inyectar muestras
en el cromatografo de liquidos .

 A partir de frascos que estan en un carrusel o desde placas

microtituladoras.
 Un inyector ideal debe de tener las siguientes características:
 Introducir la muestra en la columna como una banda lo más
estrecha posible.
 Ser de fácil manejo
 Dar lugar a resultados reproducibles
 Ser capaz de trabajar a presiones elevadas
COLUMNAS
Columnas analíticas
 En la columna analítica ocurre la separación de los componentes de la muestra
debido a la afinidad que tenga con la fase móvil y la fase estacionaria. El
solvente o fase móvil “ corre “ a lo largo de la columna arrastrando con ella
muestra y los componentes se quedan atrapados en la microesferas de los
rellenos de una columna.
 Años 60’s :Empaques de tamaño de partículas pequeños: 3- 10 mm.
Instrumentos complejos para trabajar a altas presiones
 Ensanchamiento de banda Extracolumna en cromatografía de líquidos
En la cromatografía de líquidos a veces tiene lugar un ensanchamiento de banda
significativo fuera del relleno de la columna propiamente dicho. Este
ensanchamiento de banda extracolumna se presenta cuando el soluto se
transporta a través de tubos abiertos como los que se utilizan en los sistemas de
inyección, en la región de los detectores y en los tubos que conectan los distintos
componentes del sistema.
 La mayoría de las columnas para cromatografía de líquidos miden de 5 a 25 cm
de largo. Invariablemente se usan columnas rectas. A veces se pueden alargar
acoplando dos o más de ellas.
 El diámetro interior de las columnas analíticas es a menudo de 3 a 5 mm; los
tamaños de las partículas de los rellenos más comunes son 3 o 5 μm. Las
columnas que más se utilizan miden de 10 a 15 cm de longitud y 4.6 mm de
diámetro interior y están rellenas con partículas de 5 μm. Este tipo de columnas
generan de 40 000 a 70 000 platos/metro (por lo regular, alrededor de 10 000
platos/columna)
 Precolumnas
 Por lo regular, para aumentar la vida de la columna analítica, se coloca una
precolumna que elimina no solo la materia en suspensión y los contaminantes de
los solventes, sino también los componentes de la muestra que se unen de
manera irreversible a la fase estacionaria.
 Cuando la precolumna ya se contamino, sé vacía y se rellena de nuevo o se
reemplaza por una nueva del mismo tipo. Por tanto, se le sacrifica para proteger
a la columna analítica que es más cara.
 Control de la temperatura de la columna
 En muchas aplicaciones no se necesita un control riguroso de la temperatura,
por esa razón las columnas trabajan a temperatura ambiente
Tipos de columna

Tipos de columna dimensiones típicas velocidad de flujo cantidad demuestra

i.d. longuitud

Columna convencional 4,6 mm 10-25 cm 1 ml/min 10-100ug

Columna de pequeño 0,2-1 mm 1-10 cm 1-20 uL/min 1-10 ug
Diametro
Columna capilar 40-80um 1-100cm 0,5-2uL/min 100ng-1ug
Columna de capilar 15-50um 1-100cm <1Ul/min <100ng
Abierto

 Las columnas más estrechas no podrán retener mucho analito, reduciendo la

capacidad de la columna. Esto no presenta problema cuando los solutos están
diluidos, y no hay posibilidad de saturación.
 Tipos de rellenos de la columna
 En cromatografía de líquidos se utilizan dos tipos básicos de rellenos, pelicular y
de partícula porosa.
 Las partículas peliculares
 Originales eran cuentas esféricas de vidrio o de polímero no porosas cuyos
diámetros característicos eran de 30 a 40 μm. En la superficie de estas se
depositaba una fina capa porosa de silice, de alúmina o de una resina sintética
de poliestireno-divinilbenceno, o bien, una resina de intercambio iónico.
 Los rellenos de partículas porosas
 Característicos para cromatografía de líquidos están formados por
microparticulas porosas cuyos diámetros varían entre 3 y 10 μm; para un tamaño
de partícula dado es deseable tener una distribución muy estrecha de
dimensiones de partícula.
 Las partículas son de sílice, alúmina, de una resina sintética de poliestireno-
divinilbenceno o resinas de intercambio iónico.
 DETECTORES
 PARA LA CROMATOGRAFÍA LIQUIDA CONVENCIONAL LA MAYORÍA DE LOS DE LOS
DETECTORES TIENEN VOLÚMENES EN EL INTERVALO DE 5-20UL
 SI EL VOLUMEN ES MUCHO MAYOR PUEDE PERDER RESOLUCIÓN, LA RESOLUCIÓN DE LA
CROMATOGRAFÍA SE REDUCE EN EL PROCESO DE MEZCLA
 LOS DETECTORES DE CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS HAN SIDO INSTRUMENTOS
ANALÍTICOS TRADICIONALES ADAPTADOS CON CELDAS DE FLUJO PARA MEDIR
CONCENTRACIONES BAJAS DE SOLUTOS EN FLUJOS DE LÍQUIDOS
 LOS DETECTORES PARA CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS SON DE DOS TIPOS BÁSICOS.
 LOS DETECTORES BASADOS EN UNA PROPIEDAD DE LA SOLUCIÓN SON SENSIBLES A UNA
PROPIEDAD DE LA FASE MÓVIL, COMO EL ÍNDICE DE REFRACCIÓN, LA CONSTANTE
DIELÉCTRICA O LA DENSIDAD, LA CUAL ES MODULADA POR LA PRESENCIA DE SOLUTOS.
EN CAMBIO, LOS DETECTORES BASADOS EN UNA PROPIEDAD DEL SOLUTO RESPONDEN
A ALGUNA DE LAS PROPIEDADES DE ESTE ÚLTIMO, COMO LA ABSORBANCIA EN EL UV,
flUORESCENCIA O CORRIENTE DE DIFUSIÓN, QUE NO SON INHERENTES A LA FASE MÓVIL.
TIPOS DE DETECTORES
DETECTORES DE ABSORCION VIS-UV

 MUCHOS DETECTORES DE ABSORCIÓN SON DISPOSITIVOS DE DOBLE HAZ, EN

LOS QUE UNO DE ELLOS ATRAVIESA LA CELDA DEL ELUYENTE Y EL OTRO ES
DE REFERENCIA. PARA COMPARAR LAS INTENSIDADES DE LOS DOS HACES SE
UTILIZAN DETECTORES FOTOELÉCTRICOS CONTRASTADOS
DETECTORES DE INDICE DE
REFRACCION DIFERENCIAL
 LA DETECCION POR LOS CAMBION DE INDECE DE REFRACCION DEPENDEN
DE LAS PROPIEDADES REFRACTANTES DEL LIQUIDO
 LA VENTAJA DE LOS DETECTORES DE ÍNDICE DE REFRACCIÓN ES QUE
RESPONDEN A CASI TODOS LOS SOLUTOS. PERO EN ESTE TIPO DE
DETECTORES NO SE PUEDE USAR GRADIENTE
DETECTORES
ELECTROQUIMICOS:AMPEROMETRO Y
CONDUCTOMETRO
 Estos dispositivos se basan en la amperometría, la voltametría, la
coulombimetría y la conductimetría.
 Aunque los procedimientos electro analíticos no se han explotado todavía
tanto como los detectores ópticos, en muchos casos parecen ofrecer las
ventajas de una elevada sensibilidad, sencillez, conveniencia y una
extensa aplicabilidad o reducción de 16 grupos funcionales orgánicos.
 La principal limitación de los detectores electroquímicos es que no son
compatibles con la elución con gradiente.
DETECTORES DE FLUORESCENCIA
 La fluorescencia se detecta por medio de un transductor fotoeléctrico
colocado a 90Њ respecto al haz de excitación.
 Los detectores más sencillos utilizan una fuente de excitación de mercurio
y uno o más filtros para aislar una banda de la radiación emitida.
 DETECTORES DE DISPERSION DE LA LUZ

 Una de las principales ventajas de este tipos de detector es que su

respuesta es casi igual para todos los solutos no volátiles.
 Además, es notablemente más sensible que el detector de índice de
refracción, ya que se han establecido límites de detección de 0.2 ng/μL.
 La desventaja es que las composiciones de la fase móvil están limitadas
sólo a componentes volátiles.
DETECTORES DE DISPERSION DE LA LUZ
APLICACÍON DE LA
CROMATOGRAFÍA LIQUIDA
 Es la técnica analítica de separación más ampliamente utilizada.
 Las razones de su popularidad : Su sensibilidad , su fácil adaptación a las
determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para automatizarla,
su capacidad para separar especies no volátiles o termolábiles , pero
sobre todo , su amplia aplicabilidad a sustancias que son importantes en la
industria , muchos campos de la ciencia y para sociedad en general.
 Algunos ejemplos de estos materiales son : aminoácidos , proteínas , ácidos
nucleicos , hidrocarburos , carbohidratos , fármacos , terpenoides ,
plaguicidas , antibióticos , esteroides , especies órgano metalicas y una
variedad de sustancias inorgánicas .
 Respecto al
ejemplo:
 Selección de tipos de cromatografía de
líquidos . Los métodos se escogen con base
en la solubilidad y la masa molecular . En la
mayoría de los casos de moléculas pequeñas
no iónicas ( m 2000) son apropiados los
métodos de fase inversa . Las técnicas que
están en la parte inferior del diagrama son
mejores para las especies de alta masa
molecular (m 2000)
GRACIAS POR SU ATENCION