ENZIMOINMUNOENSAYO

UAP- EAP-TECNOLOGÍA MÉDICA

Lic.T.M. Volga V. Astocaza Rosales

 ELISA
• La técnica ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay: ‘ensayo por
inmunoadsorción ligado a enzimas’) es una técnica de inmunoensayo en la
cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a
una enzima capaz de generar un producto detectable, como cambio de color
o algún otro tipo; existe un anticuerpo primario que reconoce al antígeno y
que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado
la enzima anteriormente mencionada. La adición del sustrato permite medir
indirectamente mediante espectrofotometría el antígeno en la muestra.
Microplaca
Metodología
• Se han ensayado numerosas fases sólidas, desde los tubos de cristal de los orígenes
hasta las actuales microplacas de 96 pocillos de plástico tratado, para aumentar su
capacidad de adsorción (en su superficie) de moléculas, y con fondos de pocillo
ópticamente claros que permitan realizar las medidas de densidad óptica en
instrumentos específicos, espectrofotómetros de lectura de placas que han recibido
el nombre de lectores ELISA. Actualmente se están desarrollando dispositivos de
mayor capacidad —por ejemplo, con 384 y 1536 pocillos—, adecuados para los
sistemas de screening masivo de los sistemas robotizados (HTS, High-throughput
system).
Lectores
• Los lectores ELISA son espectrofotómetros capaces de realizar lecturas
seriadas de cada uno de los pocillos de la placa ELISA. A diferencia de un
espectrofotómetro convencional, con capacidad de leer todas las
longitudes de onda del ultravioleta y el visible de manera continua, los
lectores de ELISA disponen de sistemas de filtros que solo permiten la
lectura de una o pocas longitudes de onda; son la que se corresponden con
las necesarias para determinar la densidad óptica de los cromógenos más
comúnmente utilizados.
 Fases
•
*ELISA: ensayo inmunoenzimático principios de base.
*Pocillo
*Anticuerpo primario específico para el antígeno que hay que individualizar. Está ligado al fondo
del pocillo.
*Agregado de la solución o muestra en la cual se busca la presencia del antígeno.
*Unión del antígeno con el anticuerpo primario.
*Lavado
*Agregado del anticuerpo secundario específico conjugado con una enzima.
*El anticuerpo secundario conjugado con la enzima se liga al antígeno.
*Lavado
*Agregado del sustrato de la enzima.
*La enzima convierte el sustrato en un compuesto coloreado (amarillo, en este ejemplo).
*Prueba positiva.
1. Conjugado
• Conjugación del anticuerpo o del antígeno con una enzima (peroxidasa,
fosfatasa alcalina...). El anticuerpo conjugado a la enzima se emplea en los
ensayos directos e indirectos, sándwich, etc.
• El antígeno marcado se emplea en ensayos de competición de antígeno.
Dicha unión anticuerpo-enzima o antígeno-enzima ha de producirse durante
un determinado período de tiempo para producir una solución coloreada y
que pueda ser valorada visualmente o cuantificada por medio de un
espectrofotómetro (normalmente a una longitud de onda de 414 nm).
• Si no transcurre el tiempo adecuado para que se dé la reacción, no se
evidenciará ningún color, interpretándose este resultado como un falso
negativo y disminuyendo la sensibilidad de la técnica.
2. Unión Ag-Ac
• Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unión de
anticuerpos o antígenos se realiza con facilidad a la superficie de plásticos
tratados que tienen gran afinidad por proteínas. Así, el procedimiento de
recubrimiento de los pocillos debe realizarse cuidadosamente. Si se usa
mucho antígeno, se pueden obtener falsos positivos. Por el contrario, si se
usa poco antígeno, esto dará lugar a una reacción falsa negativa.
 3.- Formación de Inmunocomplejos
Formación de una o más capas de inmunocomplejos. En el caso del antígeno unido a la placa, se puede detectar
mediante un anticuerpo anti-antígeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antígeno
y un secundario anti-primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo método permite la amplificación de la
señal al poderse unir uno o más anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo
unido a la placa, se incuba con una mezcla de antígeno y antígeno marcado. Se ensayan diferentes relaciones de
antígeno frio frente a una cantidad fija de antígeno marcado. Es el ensayo de competición del antígeno. En esta
etapa es muy importante controlar los factores tiempo y temperatura de incubación para evitar la aparición de
falsos negativos. En el caso del tiempo, si es inferior a 15 minutos, no ocurrirá la interacción antígeno-anticuerpo
y el color no será evidente al final del ensayo, dando un falso negativo. Por su parte, si la temperatura de
incubación es muy baja, la formación del complejo antígeno-anticuerpo tampoco se completará en el tiempo
establecido, mientras que si es muy alta, las proteínas (antígeno y anticuerpo) se desnaturalizan y, por tanto,
disminuyen su capacidad para interaccionar, dando igualmente falsos negativos.
4. Revelado
• Revelado de la reacción enzimática. Después de un lavado para eliminar
todas las moléculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos, se
añade el sustrato enzimático, se incuba durante un tiempo estandarizado
por cada casa comercial, en el cual se producirá una reacción enzimática,
luego se frena esta reacción mediante el uso de una solución stop y se lee
la densidad óptica mediante espectrofotometría.
Clases
 1.- ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas ELISA se
preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se
encuentra el antígeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la
presencia de antígeno en la solución analizada.
 Es necesario incluir controles negativos que serán muestras del mismo tipo
que las analizadas (sangre, orina...), pero en las que se tenga la certeza de la
ausencia del antígeno buscado. Asimismo se incluyen controles positivos
(soluciones donde se encuentra el antígeno buscado).
 2.- ELISA indirecto. Las placas ELISA se preparan de la misma forma a la anterior. Los
controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de detección emplea dos
anticuerpos: uno primario contra el antígeno y uno secundario marcado contra el
primario. La detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señal
debida a la unión de dos o más anticuerpos secundarios por cada primario. Es el ensayo
más popular, como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario
marcado y un mismo sistema enzimático permiten cuantificar una gran variedad de
antígenos; por eso es un método más polivalente y barato, aunque se pierda algo de
precisión por tener un eslabón más con respecto al método directo. La dilución de la
solución que contiene el anticuerpo primario —por ejemplo, suero sanguíneo— es un
factor muy importante a tener en cuenta para evitar la aparición de falsos negativos, ya
que si la muestra está muy diluida, no saldrá positiva si la titulación de anticuerpos es
muy baja. (Es decir, aunque los anticuerpos están presentes, la prueba no da positivo
porque la concentración de anticuerpos específicos contra el antígeno que está pegado
en el fondo del pocillo no es suficiente como para dar una señal detectable.).
• 3.- ELISA «sándwich» (Ensayo de captura de antígeno y detección
mediante inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el
que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antígeno. Después
de lavar el exceso de anticuerpo, se aplica la muestra problema en la que
se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido
por el primer anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el
material no retenido, se aplica una solución con un segundo anticuerpo
anti-antígeno marcado. Así, pues, cada molécula de antígeno estará unida
a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al
menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y
sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el segundo
anticuerpo.
• 4.- ELISpot. es un método altamente sensible en la inmunología para
enumerar las células que producen una citoquina dada. Las células se
estimularon en una placa de microtitulación per-recubierta con un anticuerpo
específico anti-analito. En respuesta a la estimulación, las células liberan
citocinas que se unen al anticuerpo anti-analito. Después de una etapa de
lavado, que elimina las células de los pozos, la ubicación de citoquinas
secretadas se visualiza mediante un anticuerpo de detección marcado con
enzima y su sustrato cromogénico correspondiente. El resultado final es un
conjunto de manchas de color, cada uno de los cuales representa un área
donde se había localizado una célula que secreta la citoquina. Existe un
método de ELISpot estándar y una variación denominada de células
dendríticas DC-ELISpot para la detección de las células tras la estimulación
con oligopéptidos y antígenos de proteína, respectivamente.
Microplaca
Pocillo
• Anticuerpo primario específico o Ag para el antígeno que hay que individualizar.
• Está ligado al fondo del pocillo
• Agregado de la solución o muestra en la cual se busca la presencia del antígeno o anticuerpo.
• Unión del antígeno con el anticuerpo primario.
• Lavado
• Agregado del anticuerpo secundario específico conjugado con una enzima.
• El anticuerpo secundario conjugado con la enzima se liga al antígeno.
• Lavado
• Agregado del sustrato de la enzima.
• La enzima convierte el sustrato en un compuesto coloreado (rosado, en este ejemplo).
• Prueba positiva.
 A S
C I
R A
G