Methodes Etude Glucides

BTS BIAC 2ème année
LES GLUCIDES
Sous chapitre 4
PRINCIPALES METHODES D’ANALYSE
DES GLUCIDES
I . EXTRACTIONS SELECTIVES
1° ) Oses et oligosides
Ce sont des molécules hydrosolubles, on peut les extraire en les faisant passer en solution aqueuses :
- à chaud en milieu neutre (car un milieu acide risque de provoquer des hydrolyses et un milieu basique des
isomérisations)
- en présence d’éthanol (ce qui permet de neutraliser toutes enzymes en les dénaturant).
2° ) Les polyosides
Ce sont des molécules hydrophiles mais pas toujours hydrosolubles, et facilement hydrolysables ce qui rend leur
extraction délicate. Exemples :
- amidon : extraction par le DMSO (diméthylsulfoxyde)
- cellulose : extraction par la liqueur de Schweitzer (solution ammoniacale d’hydroxyde de cuivre); la
cellulose est ainsi solubilisée et on peut ensuite la faire précipiter par acidification.
II . FRACTIONNEMENT ET IDENTIFICATION
1° ) Fractionnement
Des oses et osides

Chromatographie d’adsorption sur couche mince
Chromatographie d’échanges d'ions après complexation à 1’acide borique
Des polyosides
Chromatographie d’exclusion moléculaire
2° ) Identification
Méthodes fondées sur les propriétés réductrices des sucres

Réduction de la liqueur de Fehling disparition de la couleur bleue et formation d’un précipité rouge
Réduction du nitrate d’argent ammoniacal apparition d’un miroir d’argent
Réduction de 1’acide picrique (jaune) formation d’acide picramique rouge
Méthodes fondées sur les réactions furfuraliques des sucres

Réaction de caractérisation des sucres :
• réaction de Molisch (α naphtol) coloration brun-violet avec tous les oses
Réactions de différenciations :
• réaction de Bial (orcinol) coloration verte avec les pentoses
• réaction de Sélivanoff (résorcinol) coloration rouge qui apparaît rapidement (en
moins de 5 minutes) avec les cétoses
Réaction à l’iode
• coloration bleue intense caractéristique de 1’amidon
• coloration brun-acajou caractéristique du glycogène
Formation d’osazones
Méthode comparative
Les différents types de chromatographies utilisées pour séparer les sucres peuvent être menées en parallèle pour
la solution à analyser et des solutions témoins.
La comparaison des résultats obtenus permet d’identifier le ou les sucres de la solution inconnue.
III . DOSAGE DES OSES ET OSIDES
1° ) Méthodes physiques
Polarimétrie : Fondée sur le pouvoir rotatoire des sucres α = α° x I x C)

(Loi de Biot :α
Réfractométrie : L’indice de réfraction d’une solution aqueuse de sucres augmente avec la concentration
(n = n° x k x C)
Viscosimétrie : La viscosité d’une solution aqueuse de sucres varie avec la concentration de la solution.
Toutes ces méthodes sont rapides mais ne donnent des résultats satisfaisants que si les solutions sont
concentrées. Elles sont donc surtout utilisées en industrie.
De plus, elles ne sont pas spécifiques.
2° ) Méthodes chimiques
a ) Méthodes réductimétriques
Elles sont fondées sur le pouvoir réducteur des oses et osides, pouvoir lié à la présence d’une fonction
hémiacétalique libre. Ce pouvoir réducteur s’exprime en milieu basique et à chaud.
L’oxydation des sucres réducteurs dans ces conditions est une réaction complexe et non stoechiométrique :
sucres réducteurs Produits d’oxydation + n e-
Cela implique donc la préparation d’un étalon ou d’une gamme d’étalonnage, ou bien 1’utilisation d’une
table, toutes les expériences devant être réalisées dans les mêmes conditions opératoires strictement respectées.
On distingue:
- des méthodes par comparaison (Fehling)
- des méthodes à relation empirique (Bertrand)
- des méthodes colorimétriques
On peut également classer ces méthodes selon la nature de 1’oxydant :

- méthodes cuprimétriques (Fehling, Bertrand, Luff…)
- méthodes mercurimétriques (Baudoin-Lewin)
- méthodes ferriques (Hagedorn-Jensen)
- méthodes par réduction de composés organiques (ex: DNS)
b ) Méthodes furfuraliques
Les oses ayant un nombre de carbone au moins égale à 5 sont déshydratés en milieu acide acétique concentré et à
chaud en dérivés furfuraliques, ces dérivés pouvant ensuite se condenser avec des phénols ou des amines
cycliques pour former des composés colorés qui absorbent spécifiquement à une longueur d’onde donnée.
Exemple : méthode colorimétrique à 1’orthotoluidine (apparition d’une coloration verte dont l’intensité est
proportionnelle à la concentration en aldohexoses dans la solution testée).
Toutes ces nombreuses méthodes sont peu spécifiques et souvent fastidieuses.

Beaucoup sont désuètes et ne sont plus utilisées de façon courante dans les laboratoires d’analyses.
3° ) Méthodes enzymatiques
Dosage du glucose par la méthode à la glucose oxydase
glucose oxydase H 2O
Glucose Gluconolactone acide gluconique
instable
O2 H 2O 2
L’évolution de cette réaction est suivie grâce à une réaction indicatrice, catalysée par une péroxydase.
péroxydase
H2O2 + AH2 2H2O + A
chromogène réduit chromogène oxydé coloré
incolore on suit 1’évolution de 1’absorbance à λmax de ce composé
Dosage du glucose par la méthode à 1’hexokinase
Glucose 6 phosphate
Hexokinase déshydrogénase
Glucose Glucose 6 phosphate Gluconolactone 6 phosphate
ATP ADP NAD+ NADH+H+ H 2O
ac. 6 phospho gluconique
On suit 1'évolution de 1’absorbanœ à la longueur d’onde d'absorption maximum du NADH.
Ces enzymes peuvent être utilisées :

- sous forme soluble : kit enzymatique, souvent en point final,
- fixées à des membranes pour fabriquer par exemple des électrodes à enzyme (ex : électrode à glucose).
L’avantage de ces méthodes est leur spécificité et leur simplicité à mettre on œuvre.
IV . DETERMINATION DE LA STRUCTURE DES OSIDES

L’étude d’un oside consiste à déterminer le nombre et la nature des oses constitutifs, ainsi que les modes de
liaison entre ces oses. Pour cela, on procède par étape :
Détermination de la masse molaire

Cela permet d’évaluer la longueur des chaînes dans le cas des polyosides.
Hydrolyse totale : hydrolyse chimique, en milieu acide et à chaud

Cette hydrolyse libère les oses dont on détermine la nature par chromatographie.
Recherche d’un pouvoir réducteur

Cela apporte un renseignement important sur le mode de liaison entre les oses pour les oligosides (présence
d’une fonction hémiacétalique libre).
Hydrolyse chimique partielle

Peuvent contribuer à déterminer la nature et l’enchaînement des oses constitutifs.
Hydrolyses enzymatiques
Très spécifiques, elles permettent de préciser la nature, la structure et le mode de liaison entre les oses
constitutifs.
Méthylation suivie d’hydrolyse acide ménagée

Permet de déterminer les groupements engagés dans les liaisons osidiques (non méthylés).
Oxydation périodique
Permet aussi de déterminer les groupements engagés dans les liaisons osidiques, ainsi que la forme furanique
ou pyranique des oses.

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Des oses et osides

Méthodes fondées sur les propriétés réductrices des sucres

Méthodes fondées sur les réactions furfuraliques des sucres

Polarimétrie : Fondée sur le pouvoir rotatoire des sucres α = α° x I x C)

sucres réducteurs Produits d’oxydation + n e-

On peut également classer ces méthodes selon la nature de 1’oxydant :

Toutes ces nombreuses méthodes sont peu spécifiques et souvent fastidieuses.

Dosage du glucose par la méthode à la glucose oxydase

ATP ADP NAD+ NADH+H+ H 2O

ac. 6 phospho gluconique

On suit 1'évolution de 1’absorbanœ à la longueur d’onde d'absorption maximum du NADH.

Ces enzymes peuvent être utilisées :

IV . DETERMINATION DE LA STRUCTURE DES OSIDES

Détermination de la masse molaire

Hydrolyse totale : hydrolyse chimique, en milieu acide et à chaud

Recherche d’un pouvoir réducteur

Hydrolyse chimique partielle

Méthylation suivie d’hydrolyse acide ménagée

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