TD Microscope Fluorescence

Technique microscopique de mesure et de contrôle
Exercice 1: Microscope confocal ; profondeur de champ ; fluorescence
Schéma du microscope confocal
La performance du microscope confocal en profondeur, c'est à dire sa capacité à séparer des

détails suivant la direction verticale, est caractérisée par l'étude de la réponse obtenue pour un
échantillon horizontal infiniment fin en z=0.
On enregistre l'intensité I reçue par le détecteur en fonction de la position z du point de

focalisation P sous l'objectif. La figure suivante représente le tracé partiel de I(Z), fonction
paire de la variable réduite Z définie par :
Z = 8n/0 z sin2(½u).
1/ Définir la profondeur de champ d'un instrument d'optique utilisé avec un détecteur

ponctuel.
TD Microscopie confocale et à fluorescence Page 1

2/ Calculer pour 0 = 632,8 nm la profondeur de champ obtenue, d'une part, avec l'objectif x10
dans l'air et, d'autre part, avec l'objectif x100 dans l'huile. Comparer avec le microscope
optique classique.
Données : nair = 1 ; sin u = 0 = 0,25 ;
nhuile= 1,52 ; 0 =1,30 ; sin u =1,30/1,52 =0,855
3/ Citer un exemple d'objet de la vie de tous les jours qui est phosphorescent
4/ On considère un microscope confocal utilisé pour observer un échantillon marqué par des
fluorophores FITC et équipé d'une lampe à vapeur de mercure pour l'éclairage, dont le spectre
est donné ci-dessous :
Les fluorophores sont des molécules qui absorbent la lumière dans un certain domaine
spectral et la réémettent dans un domaine différent (luminescence). Les profils spectraux en
absorption et en émission du fluorophore FITC (isothiocyanate de fluorescéine) (Le FITC
possède un pic d'excitation et d'émission à 495 nm et 521 nm respectivement. Comme la
plupart des fluorochromes, il est sujet au photobleaching) . Sont donnés ci-dessous :
L'objectif du microscope ne transmet que les longueurs d'onde supérieures à 400 nm.
Tracer qualitativement l'allure d'un profil spectral de transmission plausible pour le séparateur
dichroïque de faisceau.

5/ Un filtre appelé filtre d'excitation, est placé devant la lampe à vapeur de mercure. Compte
tenu du profil spectral du FITC, proposer, avec justification, l'allure d'un profil spectral de
transmission cohérent pour ce filtre.
6/ On place un filtre, appelé filtre d'arrêt, devant le détecteur. On propose deux filtres dont les
profils spectraux de transmission sont représentés ci-dessous.
Lequel de ces deux filtres vous semble le plus adapté ?
Exercice 2 : Étude du microscope confocal

De nos jours on préfère souvent l'acquisition d'images numériques à la visualisation directe de
l'image. Pour cela on peut utiliser un capteur d'image appelé "capteur CCD". Pour réaliser un
"microscope confocal", on introduit un diaphragme de petite taille (par exemple 50 µm), lui
aussi centré sur l'axe optique, dans le plan du capteur : de cette façon l'ensemble (capteur
CCD + diaphragme) permet de réaliser un détecteur quasi ponctuel.
1/ On s'intéresse d'abord au point B de la cellule biologique n'appartenant pas à l'axe optique.
Sur la figure 1 EN ANNEXE, construire l'image B1 du point B ainsi que le faisceau lumineux
issu de B passant par les bords de la lentille. Hachurer ce faisceau.
2/ On s'intéresse ensuite au point D de la cellule biologique. Sur la figure 2 EN ANNEXE,
construire l'image D1 du point D et le faisceau lumineux issu du point D limité par les bords
de la lentille. Hachurer ce faisceau.
3/En utilisant les figures 1 et 2 complétées précédemment DE L'ANNEXE, montrer que la
plus grande partie de la lumière détectée par le capteur est émise par le point A et non par les
point B et D.
4/ Le système (capteur CCD + diaphragme) étant fixe et centré sur l'axe optique, il est
nécessaire de déplacer l'objet pour former successivement toutes les images des points situés
entre A et B. Pour cela on utilise une platine porte-échantillon motorisée. Cette platine permet
un déplacement dans les trois directions x'x, y'y et z'z (voir figure ci-dessous). On construit
alors point par point l'image d'un plan de l'échantillon. Pour cette raison, on appelle cette
technique "microscopie à balayage". Par opposition à la microscopie classique, elle nécessite
donc un temps d'acquisition correspondant au déplacement point par point de l'échantillon.

Selon quel axe et dans quel sens faut-il déplacer l'échantillon et où faut-il placer l'objet AB de
façon à pouvoir détecter l'image du point B ? Positionner alors l'objet AB sur la figure 3 EN
ANNEXE; tracer le faisceau issu de B et limité par les bords de la lentille.
En utilisant le même système d'axes, indiquer comment il faut déplacer l'échantillon pour
acquérir l'image du point D de la cellule biologique ?
La microscopie confocale permet ainsi d'acquérir une série d'images des plans en profondeur
dans un échantillon transparent et par suite, d'obtenir, grâce à un traitement informatique, des
informations sur la structure spatiale de l'échantillon.

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nhuile= 1,52 ; 0 =1,30 ; sin u =1,30/1,52 =0,855

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