Physique 2
Physique 2
Physique 2
2021
PC
4 heures Calculatrice autorisée
Détection de molécules individuelles
à température ambiante
Une molécule fluorescente peut être utilisée comme une sonde locale, à l’échelle nanométrique, de son environ-
nement. Des techniques comme la microscopie confocale, la microscopie biphotonique permettent la détection,
avec un bon rapport signal sur bruit, de la fluorescence émise par une molécule individuelle appelée fluorophore.
Il est ainsi possible d’accéder à une information non moyennée spatialement. L’évolution temporelle du signal
permet alors de suivre la dynamique de la molécule étudiée, aussi bien la dynamique interne que les interactions
de la molécule avec son environnement.
L’objet de ce sujet est de comprendre comment détecter de façon satisfaisante le signal de fluorescence émis par
une seule molécule (partie I), comment exalter le signal (« Raman ») diffusé par une molécule en interaction
avec une nanoparticule métallique (partie III). La partie II aborde l’analyse du signal de fluorescence émis par
une molécule.
Les fluorophores sont des molécules qui absorbent la lumière dans un certain domaine spectral et réémettent de la
lumière par désexcitation radiative dans un autre domaine. Les fluorophores étudiés sont insérés dans un substrat,
qui peut être par exemple un polymère ou une matrice dite sol-gel, ou sont simplement des solutés dans un
solvant. Le fluorophore est choisi pour être un bon chromophore, c’est-à dire pour absorber fortement la lumière,
et sera caractérisé par un fort coefficient d’extinction molaire à la longueur d’onde du maximum d’absorption
𝜀max ≈ 1 × 105 mol–1 ⋅L⋅cm–1 (par comparaison 𝜀max ≈ 2 × 103 mol–1 ⋅L⋅cm–1 pour les ions permanganate en
solution aqueuse).
Le signal de fluorescence 𝑆𝑓 émis par une seule molécule dépend de son taux de fluorescence 𝑅𝑓 , de l’ordre
de 1 × 108 photons⋅s–1 dans des conditions favorables. Le microscope est, lui, caractérisé par son efficacité de
détection globale des photons (système optique plus détecteur) 𝜂𝐷 dont un ordre de grandeur satisfaisant est
de 2 %. Pour obtenir un bon rapport signal sur bruit, il faut exciter convenablement les chromophores, collecter
avec une bonne efficacité de détection le signal émis 𝑆𝑓 et éliminer de façon importante le signal parasite 𝑆𝑑
issu du très grand nombre de molécules du substrat qui seront illuminées en même temps que le chromophore.
Des données et relations utiles sont disponibles en fin d’énoncé.
𝑧 𝑧
Par souci de simplicité, pour les calculs, on se placera dans les conditions de Gauss, même si elles sont mal
vérifiées en pratique. Un schéma optique du microscope est représenté sur la figure A du document réponse.
Q 1. Où doit se former l’image intermédiaire donnée par l’objectif, pour une observation sans accommoda-
tion à travers l’oculaire, de l’image finale ?
Q 2. Sur le schéma de la figure A du document réponse, réaliser la construction géométrique de l’image de
l’objet 𝐴𝐵 par l’ensemble du microscope.
Q 3. Déterminer puis calculer la distance focale équivalente 𝑓′1 de la lentille modélisant l’objectif.
Q 4. Déterminer puis calculer la distance frontale 𝑤 (distance de travail), c’est-à-dire la distance 𝑃 𝐴 sépa-
rant la lame porte-échantillon et le plan de front de l’objectif ×40. Expliquer pourquoi certains objectifs de fort
grandissement sont équipés d’un système à ressort qui évite la détérioration de la lentille frontale.
On considère que l’œil est capable d’accommoder pour avoir une vision nette d’un objet situé à une distance
minimale 𝑑𝑚 = 25 cm. L’œil est positionné dans le plan focal image de l’oculaire.
Q 5. Calculez la latitude de mise au point du microscope pour cet objectif, c’est-à-dire la distance dont on
peut déplacer l’objectif par rapport à l’objet en conservant une vision nette. De quel système doit être équipé
le tube du microscope ?
Photodétecteur
Lentille
Plan de achromatique
l’échantillon Laser
Figure 2 Schéma de principe du microscope confocal
c (2 µm × 2 µm)
Figure 3 Images de fluorescence de molécules individuelles (256 × 256 pixels), zooms
successifs sur une même zone de l’échantillon (images a, b et c) et profil du nombre
de coups détectés sur une ligne de l’image c passant par le centre de la tache image
niveau excité
Excitation
Énergie
𝜆 = 532 nm
Désexcitation radiative
niveau fondamental
Figure 4 Schéma simplifié des niveaux d’énergie dans une molécule fluorescente
Q 10. D’après le schéma de la figure 4 comparer la longueur d’onde du signal de fluorescence résultant de la
désexcitation radiative à celle du laser excitateur (𝜆 = 532 nm).
𝑘𝑖𝑠𝑐
niveau 3
𝑘𝑒 𝑘𝑟 𝑘𝑛𝑟
𝑘𝑇
niveau 1
Figure 5 Description des niveaux d’énergie du fluorophore par un système à 3 niveaux
On note 𝑃1 , 𝑃2 et 𝑃3 , les probabilités d’occupation de chaque niveau. Les probabilités 𝑃1 et 𝑃3 obéissent aux
équations différentielles
d𝑃1
= −𝑘𝑒 𝑃1 + (𝑘𝑟 + 𝑘𝑛𝑟 )𝑃2 + 𝑘𝑇 𝑃3 ,
d𝑡
d𝑃3
= 𝑘𝑖𝑠𝑐 𝑃2 − 𝑘𝑇 𝑃3 .
d𝑡
d𝑃2
Q 12. Déterminer l’équation vérifiée par en fonction des taux définis précédemment et des probabilités
d𝑡
d’occupation des niveaux d’énergie. Les équations du système sont-elles linéairement indépendantes ?
On suppose que le système est fermé, c’est-à-dire que les seuls niveaux accessibles sont les niveaux 1, 2, et 3.
Cela permet d’écrire une relation supplémentaire entre les probabilités 𝑃1 , 𝑃2 et 𝑃3 .
Q 13. Écrire cette relation entre les probabilités 𝑃1 , 𝑃2 et 𝑃3 .
En réalité la molécule n’est pas toujours photostable. La fluorescence peut s’arrêter brutalement et définitivement
après que la molécule ait été excitée un trop grand nombre de fois. Le système réel n’est donc pas fermé.
Q 14. Comment peut-on observer ce phénomène sur l’image b de la figure 3 ?
Q 15. Déterminer la solution stationnaire 𝑃2𝑠 pour la probabilité d’occupation du niveau 2 en fonction de
𝑘
𝑘𝑒 , 𝑘𝑟 , 𝑘𝑛𝑟 , 𝑘𝑖𝑠𝑐 et 𝐾 = 1 + 𝑖𝑠𝑐 dans le cas d’un système fermé.
𝑘𝑇
Le taux de fluorescence en régime stationnaire s’écrit 𝑅𝑓 = 𝑘𝑟 𝑃2𝑠 .
Q 16. En déduire qu’il existe un taux limite de fluorescence, noté 𝑅𝑓∞ quand le taux d’excitation 𝑘𝑒 devient
très grand devant les taux de désexcitation 𝑘𝑟 , 𝑘𝑛𝑟 et 𝑘𝑖𝑠𝑐 . Justifier qualitativement l’existence d’un taux limite.
Q 17. Expliquer pourquoi alors il n’est pas souhaitable d’exciter trop fortement l’échantillon.
Q 18. Calculer la valeur numérique de 𝑅𝑓∞ dans le cas d’un « bon » chromophore où 𝐾 = 10 avec une durée
de vie radiative 𝜏𝑟 = 1/𝑘𝑟 = 5 ns.
On définit le taux d’excitation à saturation 𝑘𝑒𝑠 par 𝑅𝑓 (𝑘𝑒𝑠 ) = 12 𝑅𝑓∞ et 𝐼𝑠 l’intensité à saturation du faisceau laser,
correspondant à ce taux d’excitation.
1 𝑘𝑟
Q 19. Montrer que le taux d’excitation à saturation 𝑘𝑒𝑠 s’écrit 𝑘𝑒𝑠 = . Expliciter 𝜙𝑓 appelé rendement
𝜙𝑓 𝐾
quantique de fluorescence en fonction 𝑘𝑟 , 𝑘𝑛𝑟 et 𝑘𝑖𝑠𝑐 . Réexprimer alors 𝑅𝑓∞ en fonction 𝜙𝑓 et 𝑘𝑒𝑠 .
𝐼𝑠 𝜀max
L’intensité laser à saturation 𝐼𝑠 et le taux d’excitation à saturation 𝑘𝑒𝑠 sont reliées par 𝑘𝑒𝑠 = où 𝜈
ℎ𝜈 𝑁𝐴
est la fréquence de l’onde laser, ℎ la constante de Planck, 𝑁𝐴 la constante d’Avogadro et 𝜀max le coefficient
d’extinction molaire.
𝑧2 𝑟2
𝐼(𝑟, 𝑧) = 𝐼0 exp (−2 ) exp (−2 )
𝜔𝑧2 𝜔𝑟2
𝜆 𝜆
où 𝜔𝑟 = 0,5 et 𝜔𝑧 = 0,8 sont des grandeurs dépendant de la longueur d’onde et de l’ouverture
sin 𝜃 1 − cos 𝜃
numérique ON = sin 𝜃.
Q 22. En considérant la molécule fluorescente comme un émetteur ponctuel, évaluer l’ouverture numérique
de l’objectif utilisé pour réaliser les images de la figure 3 avec la longueur d’onde laser 𝜆 = 532 nm. Pourquoi
est-il important d’utiliser un objectif d’ouverture numérique élevée ?
Q 23. Déterminer un ordre de grandeur de la puissance du faisceau laser incident pour obtenir un taux
d’excitation à saturation.
Q 24. Déterminer un ordre de grandeur du volume excité en fonction de 𝜔𝑟 et 𝜔𝑧 . Calculer numériquement
cet ordre de grandeur.
Pour réaliser un échantillon permettant la détection individuelle de molécules fluorescentes, on réalise un dépôt
d’une solution de molécules fluorescentes solvatées, sur une lame porte-échantillon. Le dépôt est réalisé sur un
plateau tournant à haute vitesse pour produire des films de 100 nm d’épaisseur.
Q 25. Quel doit être l’ordre de grandeur de la concentration de la solution de molécules fluorescentes pour
pouvoir produire des images telles que celles représentées en figure 3 ?
Q 32. Relier par un développement limité au second ordre 𝑝(𝑥𝑛−1 , 𝑡𝑛−1 ) et 𝑝(𝑥𝑛+1 , 𝑡𝑛−1 ) à 𝑝(𝑥𝑛 , 𝑡𝑛−1 ).
Q 33. Montrer alors que 𝑝(𝑥, 𝑡) vérifie une équation de diffusion.
Q 34. Déterminer le coefficient de diffusion 𝐷.
Q 35. ⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⟩, la moyenne statistique sur un grand nombre de configurations de la quantité vecto-
Exprimer ⟨𝑂𝐴 𝑁
⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗
rielle 𝑂𝐴 après 𝑁 sauts. Commenter.
𝑁
Q 36. Montrer que le déplacement quadratique moyen Δ2 (noté MSD sur la figure 6), Δ2 = ⟨‖⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗⃗
𝑂𝐴𝑁 ‖2 ⟩, est
proportionnel à la durée Δ𝑡 correspondant à 𝑁 sauts.
À deux dimensions on admet que le coefficient de proportionnalité est multiplié par deux. Sur le schéma de la
figure 6, est tracé la modélisation de Δ2 en fonction de la durée Δ𝑡.
Q 37. Sur la molécule suivie en figure 6, une modélisation linéaire de Δ2 en fonction de Δ𝑡 donne pour le
coefficient directeur 𝛽 = 4 × 10–13 SI. En déduire la valeur du coefficient de diffusion avec son unité.
Figure 7 Substrat métallique présentant une rugosité sur lequel sont adsorbées des molécules
Données et formulaire
Relations de conjugaison de Descartes et de Newton pour une lentille mince de distance focale 𝑓′, de centre
optique 𝑂, de foyer objet 𝐹, de foyer image 𝐹 ′ et expression du grandissement algébrique 𝛾, 𝐴 et 𝐴′ étant deux
points conjugués appartenant à l’axe optique.
⎧ 1 − 1 = 1 ⎧ 𝐹 ′ 𝐴′ 𝐹 𝐴 = −𝑓′ 2
{
{ 𝑂𝐴′ 𝑓′ {
𝑂𝐴
⎨ 𝐴′ 𝐵′ 𝑂𝐴′ ⎨ 𝐴′ 𝐵′ 𝐹 ′ 𝐴′ 𝐹𝑂
{
{𝛾 = {𝛾 = = =
= ⎩ 𝐴𝐵 𝐹 ′𝑂 𝐹𝐴
⎩ 𝐴𝐵 𝑂𝐴
Constantes physiques
• • • FIN • • •