1.

Références
 NM ISO 7218 v 2014 : Microbiologie des aliments - Exigences générales et
recommandations ;
 NM ISO 6887-3 v 2017 : Préparation des échantillons de la suspension mère et des
dilutions décimales en vue de l'examen microbiologique. Partie 1 & 3 ;
 Règlement (UE) 2017/644 de la commission du 5 avril 2017 portant fixation des
méthodes de prélèvement et d'analyse d'échantillons à utiliser pour le contrôle des
teneurs en dioxines, en PCB de type dioxine et en PCB autres que ceux de type
dioxine de certaines denrées alimentaires
 NM EN 15204 v 2016. Norme guide pour le dénombrement du phytoplancton par
microscopie inversée (méthode Utermöhl).
 NF EN 15972 v 2011. Guide pour l'étude quantitative et qualitative du phytoplancton
marin.
 NM EN 13804 : Produits alimentaires - Détermination des éléments et de leurs
espèces chimiques – Considérations générales et exigences spécifiques – Dosage des
éléments et de leurs espèces chimiques.
 Arrêté du ministre de l'agriculture, de la pêche maritime, du développement rural et
des eaux et forêts n° 1950-17 du 14 kaâda 1438 (07 août 2017) relatif au classement
sanitaire des zones maritimes de production conchylicole.
 NM ISO 17025 v 2018 : Exigences générales concernant la compétence des
laboratoires d'étalonnages et d'essais.
2. Matériel requis pour le prélèvement
 Bottes, cirés et gilets de sécurité en cas de prélèvement par zodiac ou barque ;
 Glacières isothermes de capacité suffisante pour contenir les échantillons avec
accumulateurs de froid ;
 GPS, thermomètre, papier aluminium, marqueur et stylo ;
 Flacons et bouteille de prélèvement d’eau de mer pour le phytoplancton ;
 Lugol et seringues de 2 ml ;
 Le préleveur doit nettoyer avec soin tout le matériel entrant en contact direct avec les
échantillons. Avant chaque utilisation, le matériel de prélèvement doit être rincé avec
de l’eau de mer du point de prélèvement.
 Au retour au laboratoire, la bouteille est nettoyée à l’eau douce puis rapidement séchée
pour éviter tout développement d’algues sur les parois de l’appareil intégrateur.
3. Planning des prélèvements

La fréquence de prélèvement des échantillons en surveillance régulière est Hebdomadaire

pour les analyses du phytoplancton nuisible.

4. Méthode de prélèvement d’eau de mer

Des prélèvements des échantillons destinés à la surveillance des microalgues potentiellement
toxiques doivent être représentatifs de la colonne d’eau. En effet, les échantillons prélevés en
tant qu'échantillon intégrale de la colonne d’eau où l'échantillonnage englobe toute la colonne
d'eau 0m-15m. L’échantillon est ensuite fractionné en deux. Un volume est fixé sur place pour
comptage, l’autre servira à l’observation des cellules vivantes.
Pour faciliter l’homogénéisation des échantillons, le remplissage des flacons sera à une
hauteur d’environ 80%. Le flaconnage utilisé pour le prélèvement sur le terrain est
1
 usuellement en matière plastique pour éviter la casse. Les échantillons doivent être entreposé
dans une glacière à température maintenue entre +0 et +10 °C par des accumulateurs de froid
jusqu’à l’arrivée au laboratoire.
L’échantillon du comptage est immédiatement fixé avec du Lugol. L’utilisation de 5 ml de
solution de Lugol par litre d’échantillon est la norme. Cependant, cela dépend de la densité
des algues : dans le cas des eaux mésotrophes et particulièrement oligotrophes, plus de 2 ml
peuvent déjà provoquer une sursaturation ce qui rend les algues difficiles à identifier, auquel
cas il convient de diminuer la quantité de liquide de Lugol. Généralement, il convient
d’ajouter suffisamment de liquide de Lugol pour faire virer la couleur de l’échantillon au
jaune paille ou couleur Cognac (NM EN 15204 2016).

5. Transport des échantillons

Les échantillons sont maintenus à l'abri du soleil et sont transportés dans un conteneur
isotherme, disposant d’accumulateurs de froid ou réfrigéré. Ils ne doivent pas être en contact
direct avec les accumulateurs. Le transport des échantillons au laboratoire doit s’effectuer
dans les meilleurs délais. S’ils sont mis en attente avant transport vers le laboratoire, ils
doivent être stockés au réfrigérateur. Il est fortement recommandé d’aviser à l'avance le
laboratoire récepteur des échantillons.

6. Analyse des échantillons

6.1. Définitions et abréviations

Chambre de sédimentation (appelée aussi cuve de sédimentation) : enceinte tubulaire dont

la face inférieure est une lamelle d’observation au microscope (épaisseur de quelques 10 èmes
de mm), et la face supérieure une lame de verre.
Comptage, dénombrement : réalisation de l’identification des espèces phytoplanctoniques
présentes dans la cuve et leur dénombrement dans un volume élémentaire (totalité ou
partie de la cuve).
Conservation : Processus qui protège les substances organiques contre la décomposition.
Echantillon d’eau : c’est une partie représentative du prélèvement d’eau.
Fixation : Protection contre la désintégration de la structure morphologique des organismes.
Objet algal : unité/groupe d’une ou plusieurs cellules d’algues, rencontré(e) lors de l’analyse
du phytoplancton, qui est indépendant(e) (peut sédimenter de manière indépendante) des
autres particules de l’échantillon.
Phytoplancton : Communauté d’organismes libres en suspension principalement
photosynthétiques dans les systèmes aquatiques comprenant les cyanobactéries et les
algues.

6.2. Matériel et consommable

 Microscope inversé (200.000 Dh)
 Conservateur : Solution du Lugol
 Flacons d’échantillonnage : volume 100 à 200 ml
 Chambres de sédimentation (5 ml, 10 ml, 25 ml) (5000 Dh)

2
6.3. Processus opératoire
6.3.1. Préparation des échantillons
6.3.1.1. Fixation (Liquide de lugol acide)

La fixation s’effectue au niveau du site d’échantillonnage juste après le prélèvement

d’eau de mer, à raison de 5 ml/L. (voir norme : NM EN 15204 ; § 5.4.2)

6.3.1.2. Stockage
 Echantillons vivants
Les échantillons vivants sont conservés à l’obscurité à température comprise entre 4°C et
10°C, et analysés dans les 36 h qui suivent le prélèvement.

 Echantillons conservés (fixés)

Les échantillons de préférence sont stockés et conservés avec la solution lugol au

réfrigérateur à l’obscurité à une température comprise entre 1°C à 5°C, à moins qu’ils ne
soient analysés sous trois semaines, auquel cas il est possible de les stocker à l’obscurité à
température ambiante.
Le stockage à basse température ralentit la vitesse des processus physiques et chimiques, ce
qui préserve la qualité de l’échantillon. Le stockage à l’obscurité est toujours nécessaire pour
éviter la photo-oxydation. Le temps de stockage maximal pour les échantillons conservés au
lugol, à l’obscurité et de 1°C à 5°C est de 12 mois.

6.3.1.3. Homogénéisation de l’échantillon :

Cette étape est suivie de la préparation du sous-échantillon.
La première étape critique dans la préparation d’un échantillon pour l’analyse microscopique
est l’homogénéisation de l’échantillon. Pendant le stockage de l’échantillon, les particules en
suspension sédimentent et les petites algues deviennent indiscernables car elles sont
incorporées dans les agrégats de détritus ou adhérent à d’autres cellules d’algues plus
grosses. Il est possible d’obtenir une ré-suspension et une séparation des particules en
agitant l’échantillon le plus doucement possible.
La méthode d’agitation manuelle est la méthode retenue pour homogénéisation de
l’échantillon par une combinaison de roulement horizontal alternant avec un retournement
vertical de l’échantillon.

6.3.2. Méthode de comptage

6.3.2.1. Analyse qualitative et quantitative :
Le mode opératoire pour l’analyse qualitative et quantitative implique l’enregistrement des
taxons observés et du nombre d’objets algaux pour chaque taxon, et on procède à un

3
comptage de la chambre entière qui est réalisé en parcourant la chambre d’un bord à l’autre
du haut vers le bas ou inversement.

6.3.2.2. Technique de lecture des cuves

er
1 Cas : aucune espèce n’est véritablement dominante.
En suivi comme en alerte la technique sera la même :

2. Déplacement horizontal à droite

1. Positionnement du champ au plus
Pour début du comptage
haut de la cuve

3. Déplacement champ par champ 4. Descente d’un champ et déplacement

avec comptage vers la droite avec comptage … etc.

Toute la cuve est ainsi observée

2er Cas : Une espèce est très dominante.

Un sous-échantillonnage pour l’espèce dominante est envisageable, le comptage se fait dans
une cuve de sédimentation de 5ml ou on fait des dilutions.

Note :
Etant donné qu’un grand nombre d’algues microscopiques vivantes ne sédimentent pas ou
sédimentent très lentement, il convient que les échantillons frais soient étudiés dans une
chambre de sédimentation très peu profonde ou simplement dans une goutte sous lamelle.

6.3.3. Identification

Il convient de faire référence à des clés, guides des flores. La liste des espèces à surveiller est
en (annexe 1), les espèces phytoplanctoniques observées sont notées au fur et à mesure sur

4
«les fiches identification et dénombrement du phytoplancton », ainsi que tout commentaire
ou dessin relatif à chacun des taxons : tel est le cas par exemple d’une espèce non décrite
dans les manuels d’identification ou d’un doute sur un taxon.

6.3.4. Calcul des concentrations

Les résultats du comptage sur les échantillons prélevés par bouteille sont calculés comme
suit :
 1 cellule observée sur une cuve de 5 ml 200 cellules/l.
 1 cellule observée sur une cuve de 10 ml 100 cellules/l.
 1 cellule observée sur une cuve de 25 ml 40 cellules/l.

En cas de dilution de l’échantillon, la concentration finale est obtenue après multiplication

par le facteur de dilution.
Pour une biomasse de phytoplancton élevée, une étape de dilution peut s’avérer nécessaire
pour s’assurer que la concentration des particules est assez basse pour éviter l’agrégation
des particules par adhésion et pour optimiser le processus de comptage. Il convient d’utiliser
de l’eau du robinet filtrée ou de l’eau de mer filtrée à l’aide des filtres de diamètre 0,45µm
pour la dilution. Il est possible d’obtenir une solution-mère pouvant être utilisée pour la
dilution par l’ajout de solution de lugol dans une concentration similaire à celle ajoutée à
l’échantillon.
En cas de dilution de l’échantillon, la concentration finale est obtenue après multiplication
par le facteur de dilution, calculé comme suit,

Fd =Vd/Vi
Fd : Facteur de dilution
Vi : Volume initial
Vd : volume obtenu après dilution.