 LACTA™ test

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Détection rapide de la résistance aux céphalosporines de troisième génération chez les
entérobactéries

881150 – 2014/02

Sommaire

1. INTERET CLINIQUE

2. RÉSUMÉ ET EXPLICATION DU TEST

3. PRINCIPE DU TEST

4. RÉACTIFS

5. PRÉCAUTIONS D’UTILISATION

6. ÉCHANTILLONS

7. PROCÉDURE

8. LIMITES DU TEST

9. PERFORMANCES

10. BIBLIOGRAPHIE

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1. INTERÊT CLINIQUE
 LACTATM est un test colorimétrique qualitatif utilisé pour la détection de souches à sensibilité diminuée aux céphalosporines de
troisième génération. Cette sensibilité diminuée est due à la présence d'enzymes spécifiques au sein de la bactérie. Il peut être
réalisé soit directement à partir des colonies isolées d’entérobactéries, soit à partir de culots bactériens provenant de flacons
d'hémoculture positive ou d'urines.

2. RÉSUMÉ ET EXPLICATION DU TEST

Le mécanisme de résistance le plus courant chez les entérobactéries est la résistance aux -lactamines par la production de
-lactamases (1, 2). Ces enzymes ont progressivement diversifié leur information génétique au fil des années.
Les -lactamases responsables de la résistance aux céphalosporines de troisième génération (C3G) sont les plus préoccupantes
(1, 2). Elles sont classées en trois catégories :
 Les -lactamases à spectre élargi (ou BLSE), dont la prévalence augmente en continu depuis les années 90 ;
 Les céphalosporinases acquises (AmpC) incluant les AmpC déréprimées et plasmidiques ;
 Les carbapénémases, notamment les métallo--lactamases (MBL) et les carbapénémases chez Klebsiella pneumoniae
(KPC).

Le  LACTATM test fournit un élément de réponse aux cliniciens afin d’adapter le traitement empirique antibiotique dans les plus
brefs délais (3).

3. PRINCIPE DU TEST
Le principe du test  LACTATM se base sur le clivage d'une céphalosporine chromogénique, HMRZ-86*. Initialement jaune, ce
substrat devient rouge en présence de souches d'entérobactéries productrices de -lactamases responsables de la résistance
aux céphalosporines de troisième génération.
La céphalosporine chromogénique HMRZ-86 n'est pas hydrolysée par les pénicillinases acquises (par ex.: SHV-1, TEM-1) mais
par les BLSE, les carbapénémases (KPC, MBL) et les AmpC acquises.
Le kit  LACTATM comprend deux flacons compte-gouttes contenant les réactifs à mélanger (R1 et R2).
Le test est réalisé directement dans des micro-tubes soit avec des colonies d'entérobactéries fraîchement isolées soit à partir d’un
culot bactérien issu de flacons d’hémoculture positive ou d’urines positives à entérobactéries et la lecture doit être effectuée dans
les 15 minutes qui suivent.
* La formulation du HMRZ-86 a été mise au point grâce à la contribution du Dr.Hideaki Hanaki de l'université de Kitasato.

4. RÉACTIFS
4.1 Description
Un kit contenant les réactifs R1, R2 et 50 micro-tubes

Identification Description Présentation

Solution d'extraction (incolore)
R1 Un flacon prêt à l'emploi, 2,0 ml
Conservateur : 0.1% ProClinTM 200
Solution chromogène (orange)
R2 Un flacon prêt à l'emploi, 2,6 ml
Conservateur : 0.1% ProClinTM 200

4.2 Stockage et conditions de manipulations

Ce kit doit être conservé à +2-8 °C, à l'abri de la lumière.
Les réactifs sont utilisables jusqu'à la date de péremption indiquée sur l'emballage.

Identification Conservation (après la première ouverture)

R1 à l'abri de la lumière, pendant 3 mois à +2-8 °C
R2 à l'abri de la lumière, pendant 3 mois à +2-8 °C

S'assurer que les bouchons des deux flacons sont bien fermés pour éviter toute contamination ou l'assèchement du réactif et
conserver les flacons en position verticale.

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5. PRÉCAUTIONS D’UTILISATION
Pour le diagnostic in vitro uniquement.
À usage professionnel uniquement.

Consignes d’hygiène et de sécurité :

 La manipulation de ce test est uniquement réservée à un personnel qualifié, formé aux procédures de laboratoire et
connaissant les risques potentiels. Porter des vêtements de protection adaptés, des gants et une protection oculaire/faciale
et procéder de manière appropriée en appliquant les bonnes pratiques de laboratoire.
 Éliminer tous les échantillons et le matériel utilisé pour réaliser le test comme des déchets infectieux. Les déchets de
laboratoire, chimiques ou biologiques dangereux doivent être manipulés et éliminés conformément à toutes les
réglementations locales, régionales et nationales.
 Pour connaître les recommandations liées aux risques et les précautions relatives à certains produits chimiques contenus
dans ce kit, consulter le(s) pictogramme(s) figurant sur les étiquettes et les informations fournies à la fin des instructions
d'utilisation. La fiche technique de sécurité est disponible sur www.bio-rad.com.

Précautions liées à la procédure

5.1. Préparation
 Ne pas mélanger ou associer des réactifs issus de lots différents pour une même analyse.
 Ne pas congeler les réactifs R1 et R2.
 Ne pas préparer à l'avance le mélange de R1 et R2.
 Avant utilisation, laisser les réactifs se stabiliser entre 18 et 30°C pendant 10 minutes.
 Essuyer la pointe du compte-gouttes du flacon afin d'obtenir une goutte correctement calibrée.
 Tenir toujours le flacon de réactif en position verticale pour obtenir une goutte calibrée.
 Ne pas utiliser de réactifs périmés.
 Ne pas utiliser de colonies d'entérobactéries isolées sur un milieu ayant été incubé plus de 24 heures.
 Utiliser uniquement des colonies bien isolées individuellement.
 Pour l’application liée aux urines et aux hémocultures :
- Il n’est pas recommandé d'utiliser un culot bactérien contenant des hématies,
- En cas d’absence de culot bactérien visible, ne pas réaliser le test.

5.2. Manipulation
 Effectuer le test à température ambiante (entre 18 et 30°C).
 Respecter la quantité d'inoculum en utilisant une öse de 1µl pleine.
 La lecture du changement de couleur doit être effectuée dans les 15 minutes.

6. ÉCHANTILLONS
Le test peut être effectué soit à partir de colonies d’entérobactéries fraîchement isolées après 16-24 heures d’incubation, soit à
partir de culots bactériens obtenus de bouillons d’hémoculture positive ou bien d’urines suspectées positives.
La notion de positivité pour le bouillon d’hémoculture ou pour le prélèvement d’urine est sous la responsabilité du laboratoire et
est réalisée selon les critères de routine du laboratoire.
Les culots bactériens doivent être réalisés à partir d’urines fraîchement recueillies ou après la positivité des flacons
d’hémoculture.

Préparation du culot bactérien à partir de bouillons d’hémoculture positive :

A partir d’un bouillon d’hémoculture positive, deux protocoles d’obtention d’un culot ont été validés:

 Protocole A : Un tube sec avec gel séparateur est rempli de 2 ml de bouillon d’hémoculture. Suivre les recommandations
du fabricant pour la séparation des hématies. Le surnageant est alors éliminé et les bactéries présentes à la surface du gel
sont mises en suspension délicatement avec 1 ml d’eau distillée stérile. Centrifuger pendant 3 min. à 300 g. Prélever 800 µl
du surnageant dans un micro-tube et centrifuger pendant 1 min. à 15 000 g.
Eliminer délicatement le surnageant et garder le culot bactérien obtenu pour réaliser le test.

 Protocole B : 1 ml de bouillon d’hémoculture est prélevé et mis dans un tube de 1,5 ml pour être centrifugé pendant 1 min.
à 1000 g. Eliminer le surnageant délicatement et remettre en suspension le culot avec 1 ml d’une solution de TritonTM X-100
à 0,1% préparée extemporanément. Vortexer 10 sec.
Centrifuger pendant 1 min. à 13 000 g. Eliminer délicatement le surnageant.
Reprendre le culot avec 1 ml d’eau distillée stérile par aspiration et refoulement. Centrifuger pendant 1 min. à 13 000 g.
Eliminer délicatement le surnageant et garder le culot bactérien obtenu pour réaliser le test.

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Préparation du culot bactérien à partir d’urine positive aux entérobactéries à l’examen direct
A partir d’une urine suspectée positive, prélever 1,5 ml dans un tube de 1,5 ml et centrifuger pendant 5 min. à 3 000 g. Eliminer le
surnageant et garder le culot bactérien obtenu pour réaliser le test.

Pour tout protocole d’obtention du culot bactérien, il est nécessaire de valider la méthode employée avec des souches
de contrôle positif contenant des -lactamases conférant une résistance aux céphalosporines de troisième génération et
des souches de contrôle négatif.

7. PROCEDURE

7.1 Équipement requis

7.1.1 Équipement fourni
 Micro-tubes
 Réactifs R1 et R2

7.1.2. Équipement requis non fourni

 Öses plastiques de 1µl
 Minuteur

7.2 Mode opératoire

7.2.1 Pour le test réalisé à partir de colonies

 Étiqueter le micro-tube.
 Ajouter une goutte de réactif R1 et une goutte de réactif R2 dans le micro-tube.
 Sélectionner des colonies d'entérobactéries isolées et les prélever avec une öse de 1 µl. L’öse doit être remplie.
Choisir des colonies d'une couleur homogène si l’isolement a été réalisé sur milieu chromogénique.
 Décharger l’öse dans le micro-tube. Noter la couleur du mélange à T0.
 Laisser le micro-tube entre 18-30°C et lire le résultat dans les 15 minutes qui suivent.
 Noter tout changement de couleur et interpréter le résultat (négatif/positif/non interprétable).

7.2.2 Pour le test réalisé à partir d’un culot

 Ajouter une goutte de réactif R1 et une goutte de réactif R2 dans le micro-tube contenant le culot.
 Mettre en suspension le culot dans le mélange. Noter la couleur du mélange à T0.
 Laisser le micro-tube entre 18-30°C et lire le résultat dans les 15 minutes qui suivent.
 Noter tout changement de couleur et interpréter le résultat (négatif/positif/non interprétable).

7.3 Contrôle de qualité

 Contrôle négatif, par ex. : Escherichia coli ATCC 35218 (souche productrice de pénicillinase de type TEM-1)
 Contrôle positif, par ex. : Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Escherichia coli ATCC 51446. Ces souches contiennent des
-lactamases conférant une résistance aux céphalosporines de troisième génération. En routine, il est possible d'utiliser une
souche clinique caractérisée comme ayant un phénotype BLSE.

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7.4 Interprétation des résultats
Résultat Interprétation
Pas de changement de couleur par rapport à T0 Négatif Sensible aux C3G
La couleur à T0 vire au rouge, rouge-violet Positif Sensibilité diminuée aux C3G
La couleur à T0 vire à l'orange Non interprétable Non interprétable

8. LIMITES DU TEST
 Il n’est pas recommandé d’utiliser le test à plus de 30°C.
 Attention ! Il n’est pas recommandé d’utiliser des colonies d'entérobactéries isolées à partir d’une gélose Mac Conkey
avec ou sans Crystal Violet. La couleur des colonies interfère avec le mélange réactionnel et le résultat final ne sera pas
interprétable.
 L'interprétation des résultats du test doit être réalisée en tenant compte de l'état clinique du patient.
 En cas d’absence de culot bactérien, ne pas réaliser le test.

9. PERFORMANCES

9.1. Étude de précision

Sur une période de 4 semaines, 5 souches ont été testées en triplicat 10 fois par 2 manipulateurs différents. La répétabilité et la
reproductibilité intermédiaire ont été calculées avec deux lots différents de  LACTATM. Tous les tests étaient conformes aux
résultats attendus.

9.2. Performances cliniques et analytiques

9.2.1 A partir de colonies

Une étude clinique prospective a été réalisée pendant 3 mois. Toutes les colonies d'entérobactéries isolées à partir de différents
échantillons (urine, hémoculture, autres…) ont été testées avec le kit  LACTATM, la lecture et l'interprétation des résultats ont été
réalisées conformément aux instructions du fabricant.

Les résultats du  LACTATM test ont été comparés aux résultats obtenus avec les disques de ceftazidime (CAZ), céfotaxime
(CTX), et céfépime (FEP) réalisés en méthode de diffusion.

482 colonies d'entérobactéries ont été testées avec  LACTATM. Parmi ces colonies, 81 présentaient une sensibilité diminuée aux
C3G (résultat positif), 392 étaient sensibles aux C3G (résultat négatif) et 9 étaient non interprétables avec le test
 LACTATM (moins de 2 %).

Performances générales
Méthode de référence
Nbre de
Nbre de souches sensibles au Nbre de souches résistantes ou souches
CAZ, CTX et FEP* intermédiaires au CAZ, CTX et FEP**
Négatif 374 18 392
™ Positif 8 73 81
β LACTA
Non interprétable 3 6 9
Total 385 97 482
* Toutes les céphalosporines citées ont un résultat sensible selon les critères d’interprétation du CA-SFM 2012.
** Au moins un antibiotique testé (CAZ, CTX, FEP) a un résultat intermédiaire ou résistant selon les critères d’interprétation du CA-SFM 2012.

9.2.1.1 Spécificité

Nbre de souches sensibles au CAZ, CTX et FEP* (%)

Négatif 374
Positif 8
β LACTA™
Total 382
Spécificité 374 / 382 (97,9%)

Les résultats « non interprétables » sont exclus des calculs, il s’agit de moins de 2 % de la population étudiée.
* Toutes les céphalosporines citées ont un résultat sensible selon les critères d’interprétation du CA-SFM 2012.

 6 des 8 souches  LACTATM positif ont été identifiées comme des souches de Klebsiella oxytoca avec une hyperproduction
de leur -lactamase chromosomique.

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 9.2.2.2 Sensibilité

Nbre de souches résistantes ou intermédiaires au CAZ, CTX et FEP** (%)

Négatif 18
Positif 73
β LACTA™
Total 91
Sensibilité 73 / 91 (80,2%)

Les résultats « non interprétables » sont exclus des calculs, il s’agit de moins de 2 % de la population étudiée
** Au moins un antibiotique testé (CAZ, CTX, FEP) a un résultat intermédiaire ou résistant selon les critères d’interprétation du CA-SFM 2012.

 17 des 18 souches résistantes ou intermédiaires à au moins une céphalosporine et négatives avec le  LACTATM sont
productrices de céphalosporinase. 11 souches ont été identifiées comme des Enterobacter sp., Morganella morganii,
Citrobacter freundii, Hafnia halvei ; les 6 autres sont des Escherichia coli.
 Une souche d'Escherichia coli de phénotype BLSE est sensible au CTX et au FEP et intermédiaire à CAZ mais présente
un résultat négatif avec  LACTATM.

Les valeurs prédicatives positives et négatives de cette étude sont respectivement de 90,12 % et 95,41 %.

9.2.2 A partir d’un culot bactérien

Performances du β LACTATM avec des culots bactériens obtenus à partir d’hémocultures :

Des études analytiques ont été réalisées sur des flacons d’hémoculture ensemencés avec des inoculums calibrés de souches
d’entérobactéries.

Les performances ont été évaluées sur un panel comprenant au total 37 souches d’entérobactéries isolées de prélèvements
cliniques et parfaitement caractérisées génotypiquement et phénotypiquement. Ce panel incluait :
 10 souches sensibles aux C3G,
 27 souches résistantes aux C3G.

Les culots bactériens ont été réalisés selon le protocole décrit dans le paragraphe Echantillons pour des flacons d’hémoculture
ensemencés.

Nombre de souches sensibles aux C3G (n = 10)

Obtention du culot Protocole A Protocole B
Total 10 9
TM Positif - -
β LACTA
Négatif 10 9
Spécificité 10/10 (100%) 9/9 (100%)
Un résultat « non interprétable » a été exclu du calcul pour le protocole B.

Nombre de souches résistantes aux C3G (n = 27)

Obtention du culot Protocole A Protocole B
Total 25 26
TM Positif 21 23
β LACTA
Négatif 4 3
Sensibilité 21/25 (84%) 23/26 (88,5%)
Les résultats « non interprétables » au nombre de 2 pour le protocole A et au nombre de 1 pour le protocole B ont été exclus des calculs.

Performances du β LACTATM avec des culots bactériens obtenus à partir d’urines :

Une étude prospective a été réalisée sur 102 urines collectées dans la routine d’un laboratoire hospitalier.
L’observation à l’examen direct de toutes ces urines a montré la présence de bacilles à Gram négatif. Un culot bactérien a été
réalisé selon le protocole décrit ci-dessus afin d’effectuer le test du β LACTATM.
Les résultats obtenus avec le test ont été comparés avec ceux obtenus lors de la procédure habituelle de routine pour l’analyse
microbiologique des urines.

L’analyse des 102 urines positives à l’examen direct a donné les résultats suivants :
 4 urines ne contenaient pas d’entérobactéries.
 73 urines avaient une ou plusieurs souches d’entérobactéries qui d’après l’antibiogramme étaient sensibles aux C3G
(ceftazidime et céfotaxime).
 25 urines avaient une ou plusieurs souches d’entérobactéries présentant une résistance aux C3G (ceftazidime et/ou
céfotaxime).

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Les performances du test β LACTATM sur ce panel sont détaillées dans le tableau suivant.

Nombre d’urines avec un examen direct positif à bacilles Gram négatif (102)
Nombre d’urines avec un isolement Nombre d’urines avec un isolement
d’entérobactéries sensibles aux C3G d’entérobactéries résistantes aux C3G
Total 73 25
Négatif 73 5
Positif - 20
β LACTATM
Spécificité 73/73 (100%)
Sensibilité 20/25 (80%)

Les études analytiques ont été complétées avec des souches appartenant à des espèces autres que des entérobactéries afin
d’étudier d’éventuelles réactions non spécifiques ou croisées.

Aucune réaction croisée n’a été détectée avec des culots bactériens obtenus à partir de souches telles que Candida albicans,
Streptococcus agalactiae, Enterococcus faecalis et Staphylococcus aureus.

10. BIBLIOGRAPHIE
1. Bush K. Alarming -lactamase-mediated resistance in multidrug-resistant Enterobacteriaceae. Curr Opin Microbiol. 2010;
13: 558-564
2. Pitout JDD, Laupland KB. Extended-spectrum β-lactamase-producing Enterobacteriaceae: an emerging public-health
concern. Lancet Infect Dis 2008; 8: 159-66.
3. Renvoisé A., Decré D., Amarsy-Guerle R., Huang TD., Jost C., Podglajen I., Raskine L., Genel N., Bogaerts P., Jarlier V.,
Arlet G. Evaluation of the β Lacta test, a rapid test detecting resistance to third-generation cephalosporins in clinical strains
of Enterobacteriaceae. J. Clin. Microbiol. 2013, 12: 4012-4017.

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