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Matériels et méthodes
Sites d’échantillonnage Notre étude porte sur l’étude de la qualité de la lagune Oualidia en analysant des échantillons d’eau et des bivalves vivants (moules et huîtres). Les stations ont été choisies en fonction des risques de contamination qui peuvent exister (agriculture, rejets des eaux usées, etc.). Cependant, les prélèvements des eaux ont été réalisés au niveau de sept stations différentes (figure 3). Alors que, les bivalves ont été collectés à partir de deux stations. Les moules ont été cueillis prés de la passe principale. Bien que, les huitres proviennent d’une ferme ostréicole dont l’élevage s’effectue au niveau de la lagune. Les paramètres tels que la température, le pH, la conductivité et la salinité ont été mesurés in situ avec un appareil de mesure multi-paramètres de terrain. Et ceci, a été réalisé au niveau des différentes stations.
Figure 3 : Carte représentant les sites d’échantillonnage de la lagune Oualidia
[image par : Google Earth pro]. Coordonnées géographiques Tableau 1 : Les repères des sites d’échantillonnage
Stations Latitudes (Y) Longitudes (X)
S1 32°44’27.18 N 9°2’26.79 O S2 32°46’26.13 N 8°59’12.22 O S3 32°44’17.53 N 9°2’0.74 O S4 32°44’42.46 N 9°1’42.41 O S5 32°45’36.76 N 9°0’41.97 O S6 32°45’49.09 N 9°0’11.28 O S7 32°44’10.59 N 9°2’32.84 O
Echantillonnage o Eaux
Pour chaque station, les prélèvements d’eau de mer ont été réalisés à l’aide de flacons stériles de 1L en plastique (polyéthylène). Les prélèvements ont été effectués sous la surface d’eau. Les échantillons d’eau ont été conservés à une température de 5 ±3ºC dans une glacière jusqu'à l’arrivée au laboratoire. Pour des raisons pratiques, les échantillons sont traités plus tard dans les 24 heures qui suivent le prélèvement.
Quatre paramètres microbiologiques sont pris en considération pour l’analyse des eaux : E. coli, Entérocoques intestinaux [UFC/100mL], Salmonelle [absence/1L], Vibrion [absence/1L].
o Bivalves vivants
Les échantillons sont brossés et lavées à l’eau courante, puis ouvertes stérilement. La chair et le liquide inter-valvaire sont recueillis et broyés. Pour la recherche des paramètres bactériologiques le poids qui a été analysé est de 100g.
L’analyse des mollusques bivalves vivants a fait l’objet de recherche de deux paramètres microbiologiques : E. coli qui a été recherché par la méthode NPP (Nombre le plus probable) [UFC/100g] et Salmonelle [Absence/25g]. Analyses microbiologiques
Les modes opératoires des différents paramètres sont régies par des normes marocaines. Ces dernières permettent de rechercher (dénombrer) ou détecter (absence ou présence) les paramètres en question avec la méthode idéale.
o Analyse des eaux
1. Dénombrement d’E. Coli
Le dénombrement d’E. Coli s’est fait en suivant la méthode indiquée par la NM ISO 9308-1- 2019. La méthode consiste en une filtration sur membrane (0.45µm), suivie d’une mise en culture dans une gélose chromogène et d’un calcul des bactéries cibles présentes dans l’échantillon (figure 4).
Figure 4: Mode opératoire d’E. Coli
2. Dénombrement des Entérocoques intestinaux
La NM ISO 7899-2-2007 est décrite pour le dénombrement des entérocoques intestinaux.
Leur dénombrement est réalisé par filtration de l’échantillon à travers une membrane filtrante de porosité 0.45µm.. Puis, le filtre est placé sur un milieu sélectif (figure 5).
Figure 5: Mode opératoire des Entérocoques intestinaux (NM ISO 7899-2-2007)
3. Détection de vibrion
La détection de vibrion se fait en étapes. Il s’agit du pré-enrichissement, l’enrichissement et
puis l’isolement sur un milieu gélose. On finit par la confirmation biochimique dans le cas où
vibrion s’est développée sur la gélose après isolement (figure 6).
Figure 6: Mode opératoire de vibrion
4. Détection de Salmonelle La NM ISO 19250-2012 implique la filtration de 1L de l’échantillon pour la recherche de Salmonelle. Après pré-enrichissement nécessaire pour détecter des salmonelles restreintes ou stressées, on réalise l’enrichissement pour assurer le développement de la bactérie. Si elle est présente sur la gélose après isolement sélectif. On procède à la confirmation biochimique (figure 7).
Figure 7: Mode opératoire de Salmonelle (NM ISO 19250-2012)
o Analyse des bivalves vivants
1. Détection de Salmonelle
La NM ISO6579-1-2021 décrit la méthode de recherche de salmonelle au niveau des
aliments. Elle se réalise en quatre phases successives. On commence par le pré- enrichissement en milieu non sélectif liquide puis l’enrichissement en milieux sélectifs. Après, on réalise l’isolement sur des milieux solides sélectifs. Finalement, on procède à la confirmation biochimique (figure 8). Figure 8: Mode opératoire de Salmonelle (NM ISO6579-1-2021) 2. Dénombrement E. coli : (Méthode NPP) La NM ISO7251-2012 précise la méthode de dénombrement d’E.C présumés. Et ceci au moyen de la technique de culture en milieu liquide avec calcul du nombre la plus probable (NPP) après incubation.
La caractérisation de la qualité physico-chimique de la lagune Oualidia a fait l’objet de
l’étude de plusieurs paramètres. Certains ont été mesurés in situ (T°, salinité, oxygène dissous, conductivité) à l’aide d’une sonde multiparamétrique. Bien que d’autres ont été mesurés au laboratoire par des méthodes colorimétriques (sulfates, nitrates, chlorures, orthophosphates). Ce sont des méthodes décrites par Rodier(2009). Le dosage de la demande chimique en oxygène (DCO) a été réalisé à l’aide. Alors que le dosage des métaux lourds (Fe, Cu, Cd, Pb, Cr) a été effectué par .
o Mode opératoire des sulfates
Le dosage des sulfates a été fait selon la méthode néphélométrique. Dans un tube, on introduit successivement 50mL de l’échantillon à analyser, 1mL d’acide chlorhydrique au 1/10 et 5mL de solution de chlorure de baryum+tween20. Agiter énergiquement et laisser reposer 15 minutes. Agiter de nouveau et faire les lectures au spectromètre à la longueur d’onde de 650 nm. Se reporter à la courbe d’étalonnage pour déduire les concentrations en sulfates que contiennent les échantillons.
o Mode opératoire des chlorures
Le dosage des chlorures a été effectué selon la méthode de Mohr. On introduit 100 mL d’eau à analyser (préalablement filtrée si nécessaire). Après, on ajoute 2 à 3 gouttes d’acide nitrique pur puis une pincée de carbonate de chaux et 3 gouttes de solution de chromate de potassium à 10 %. Finalement, on fait verser au moyen d’une burette la solution de nitrate d’argent jusqu’à apparition d’une teinte rougeâtre, qui doit persister 1 à 3 minutes.
La concentration en chlorures exprime en cl-/l est déduite selon la relation suivante :
v×10×3.55. sachant que v est le nombre de nitrate d’argent 0.1N utilisé.
o Mode opératoire des orthophosphates
Le dosage des orthophosphates a été réalisé par la méthode de spectrométrie d’absorption
moléculaire. On introduit alors 20 mL d’eau dans une fiole jaugée de 25 mL, ajouter 1 mL de solution d’acide ascorbique, agiter, puis ajouter 4 mL de réactif, mélanger soigneusement. Attendre 30 minutes la stabilisation de la coloration et effectuer les mesures au spectromètre à la longueur d’onde de 700 ou 800 nm. Et pour obtenir les teneurs en orthophosphates, on se reporte à la courbe d’étalonnage.
o Mode opératoire des nitrates
o La DCO
o Les métaux lourds
Résultats
Dans la présente étude, le choix des paramètres microbiologiques a été fait en se basant sur les normes marocaines. Cependant, pour l’analyse des eaux la norme de référence était NM033.7.200. Alors que pour l’analyse des bivalves, les paramètres ont été choisis en dépend de l’arrêté marocain ARR.293-19. En effet, la norme ou l’arrêté exige des limites qui sont utilisées pour déterminer de la conformité des échantillons analysés.
Résultats des analyses microbiologiques des eaux
Pour déterminer la conformité des eaux marines, la norme indique la recherche des microorganismes suivants : Salmonelle, E. coli, Entérocoques intestinaux. Selon cette norme, ces trois paramètres sont suffisants pour déterminer la qualité de l’eau marine. Sauf qu’un autre paramètre a été recherché. Il s’agit de vibrion. Ce dernier a été choisi en raison que c’est un genre bactérien résistant à la salinité de l’eau marine. Aussi qu’il existe des espèces pathogènes pouvant se développer en milieux aquatiques tels que vibrion cholerea.
o E. coli et Entérocoques intestinaux
Les analyses des eaux ont permis de déceler E. coli au niveau de trois stations parmi sept échantillonnées. On parle des stations 5 et 6. Ces deux stations présentaient 20 UFC chacune. Egalement, les Entérocoques intestinaux n’avaient été détectés qu’au niveau des stations 5 et 6. Ces deux stations présentaient la même charge bactérienne vis-à-vis de ce paramètre [50 UFC/100mL].
L’absence de ces indicateurs de contamination fécale dans les autres stations est susceptible d’être liée à l’emplacement de la station et notamment à la présence des activités polluantes. Cependant, la station une, caractérisée par sa proximité de la passe principale de la lagune. Celle-ci, a été marquée par l’absence des germes témoins de contamination fécale. Et ceci peut être expliqué par le renouvellement de l’eau de façon continue et notamment la durée de renouvellement qui est plus grande par rapport à l’amont de la lagune. Ce qui nous mène à lier la présence de ces indicateurs dans la zone 5 et 6 qui sont situées en amont de la lagune au faible renouvellement. Mais aussi, à la présence d’activités agricoles qui peuvent apporter des agents de contamination microbiologique après ruissellement.
Aspect d’E. Coli sur
CCA : Colonies de couleur bleu foncée
Figure 10: Aspect d'E. Coli sur CCA
Colonies de couleur brune à noir
Figure 11: Aspect des Entérocoques intestinaux sur BEA
o Vibrion
La station une a été marquée par la présence du vibrion et précisément vibrion alginolyticus. Cette dernière appartient à la flore autochtone marine. De ce fait on peut expliquer sa présence dans la première station par sa proximité de la passe principale de lagune. A cet endroit d’échange permanent avec l’eau marine, la bactérie se trouve en conditions plus favorables par rapport aux autres stations. Surtout que la salinité présente le besoin majeur pour le développement de vibrion. Et la station une présente la forte teneur en salinité comme la mesure des paramètres physico-chimique l’a indiqué.
Colonies de couleur verte
Figure 12: Aspect de vibrion sur TCBS
Figure 13: Test biochimique pour la confirmation de vibrion par API 20E
L’absence des germes témoins de contamination fécale au niveau des zones proches de la passe peut être expliquée par le stress causé par les propriétés physico-chimique de l’eau de mer qui sont plus sévères près de la passe. Certes que le renouvellement par l’eau de mer apporte des nutriments qui peuvent être utiles pour la survie des bactéries. Mais en contrepartie, les conditions de l’eau de mer telles que la salinité, le ph peuvent exercer une action bactéricide sur ces organismes caractérisés par leur sensibilité à ces conditions environnementales.
En effet, la présence de ces microorganismes peut être corrélée à la saison d’échantillonnage.
Chaque saison est caractérisée par un phénomène. La saison pluviale est accompagnée par le lessivage des zones agricoles. Ceci, entraîne des quantités importantes des µ.o au niveau des eaux. Bien que la saison estivale est marquée par l’accueil d’un effectif assez important de touristes. Ces derniers pouvant représenter des réservoirs de µ.o pathogènes tels que Salmonelle. Ceci nous permet de lier la saison pluviale à la présence des indicateurs de contamination fécale au niveau des stations adjacentes des terrains agricoles (le cas des stations 5 et 6). Et lier leur absence au niveau de la station7 à la faible intensité des activités de loisirs puisque notre échantillonnage coïncide avec la saison pluviale.
o Salmonelle
L’ensemble des échantillons a montré un résultat négatif vis-à-vis de la Salmonelle (tableau
2). Ce qui indique que l’eau est de bonne qualité pour la baignade et la pratique d’autres activités telles que la pêche. Ceci peut être expliqué par la saison d’échantillonnage (hiver). Au cours de cette saison, la lagune comprend une faible densité de touristes par rapport à l’été. Donc moins de risque pour rencontrer la Salmonelle dans l’eau au cours du premier échantillonnage. Notamment, son absence peut être expliquée par les conditions physico- chimiques de l’eau pendant cette période surtout la salinité dont Salmonelle résiste mal à ce facteur environnemental.
Tableau 2 : Résultats des analyses microbiologiques des eaux (1érecompagne)
De façon générale, les résultats de la deuxième compagne ont montré une augmentation de charge bactérienne par rapport à la première. En effet, durant cet échantillonnage la lagune a été caractérisée par l’apparition des indicateurs de contamination fécale dans certaines stations. Celles-ci qui ont connues une absence de ces germes durant le premier échantillonnage. On parle de la station 7 par exemple qui présente 19 UFC/100mL vis à vis de E. coli et 8 UFC/100mL vis-à-vis des entérocoques intestinaux. L’augmentation de la charge bactérienne a été expliquée par la présence de touristes durant la période d’échantillonnage.
Ce qui est particulier durant l’échantillonnage en saison printanière était l’absence de vibrion alginolyticus au niveau de la première station. Cette dernière qui était présente durant la première compagne d’échantillonnage. Ce résultat peut être expliqué par une compétition entre les microorganismes ou encore par l’apparition des prédateurs tels que les protozoaires. Comme cité précédemment, l’échantillonnage coïncide avec la présence de touristes avec un effectif assez important susceptible d’apporter une charge bactérienne importante. Ces bactéries sont capables de gérer une compétition avec la flore autochtone marine. Et vivre ainsi au détriment de ces bactéries propres à l’eau marine. Ce résultat pourra être confirmé à travers la troisième compagne qui sera faite en période d’été. Durant cette saison la lagune accueille un nombre important de touristes.
Tableau : Résultats des analyses microbiologiques des eaux (2èmecompagne)
Résultats des analyses microbiologiques des bivalves vivants
Concernant les mollusques bivalves, E. coli a été détectée dans un seul échantillon avec une quantité ne dépassant pas le seuil exigé par l’arrêté marocain n°293-19 (tableau 3). En fait la valeur décelée dans notre échantillon (1NPP/100g) est très loin de présenter un risque sanitaire. Tandis que Salmonelle a été absente dans les deux échantillons analysés comme indiqué dans le tableau 2.
Tableau 3 : Résultats microbiologiques des bivalves vivants (1érecompagne)
Tableau 4 : Critères de sécurité relatifs des produits de pêche [ARR n°293-19]
Matrice MICRO-ORGANISMES Limites Mollusques bivalves vivants m=230 NPP/100 g de chair et et liquide intravalvaire M=700 E. coli échinodermes, tuniciers et NPP/100 g de chair et liquide gastéropodes vivants intravalvaire Salmonelle Absence/25g m=Tous les résultats égaux ou inférieurs sont considérés satisfaisants
M=Seuil limite d'acceptabilité, au-delà duquel les résultats ne sont plus considérés comme satisfaisants, sans que pour autant le produit soit considéré comme toxique. Couleur bleu indiquant la présence d’E. Coli
Figure 13: Aspect d’E. Coli sur TBX
Aucun aspect de Salmonelle sur
XLD
Aucun aspect de Salmonelle sur
le BS
Figure 14: Boîtes de pétri indiquant l'absence de Salmonelle sur deux milieux sélectifs
En effet l’absence de Salmonelle au niveau des moules collectés de la station une peut être lié à la forte salinité de l’eau marine. Cette salinité qui empêche le développement de cette bactérie halophobe. Ainsi, son absence dans l’eau implique son inexistence au niveau des moules qui sont considérés comme des organismes filtreurs. Bien que l’absence de Salmonelle au niveau des huitres peut être due à l’absence de rejets humains ou animaux à ce niveau de prélèvement.
Ceci se convient avec les critères microbiologiques autorisés par l’arrêté marocain qui exigent l’absence de salmonelle dans 25g de chair de bivalves. Cependant, les bivalves de la lagune sont de bonne qualité pouvant être destinés à la consommation humaine.
Tableau : Résultats microbiologiques des bivalves vivants (2éme compagne)
En ce qui concerne les deux échantillons des bivalves vivants, les moules ont montré une bonne qualité microbiologique comme c’était le cas durant la première compagne. Ils étaient caractérisés par l’absence de salmonelle et d’E. Coli. Tandis que pour les huitres, Salmonelle n’a pas été détectée. Mais elles présentaient une charge plus élevée par rapport à la première compagne vis-à-vis d’E. Coli [540NPP/100g]. Cette valeur ne dépasse pas le seuil exigé par l’arrêté marocain [700NPP/100g]. Cependant la charge décelée en E. coli est considérée comme étant acceptable. En effet, les huitres s’alimentent en filtrant l’eau. De ce fait la présence de germes dans l’eau implique leur présence chez les huitres. C’était le cas chez les huitres situés au niveau de la station 5.
Les huitres ont été prélevées au niveau de la station 5. L’eau au niveau de cette station a montré une augmentation de charge en E. coli par rapport au premier échantillonnage. Et donc la charge élevée en E. coli qui a été détectée chez les huitres revient à son importante présence au niveau de l’eau. Cette eau qui est filtrée par les huitres.
Résultats des analyses physico-chimiques des eaux
Les taux de salinité enregistrés en aval de la lagune sont toujours supérieurs à ceux mesurés en amont. Le niveau élevé enregistré de ces stations est expliqué par la communication permanente avec la mer. Cette variation amont-aval reste légère due au faible apport d’eau douce au niveau de lagune qui peut entraîner une dilution de la salinité.
La température a connu une légère variation spatio-temporelle. Les températures les plus élevées ont été enregistrées au niveau des stations 5 et 6. Celles-ci situées en amont de la lagune caractérisées per le faible renouvellement d’eau et une faible profondeur. Ce qui explique l’augmentation de la température à ce niveau (21-22°C).
La conductivité électrique était importante dans tous les échantillons. Elle variait de 40000µs/cm à 50000µs/cm. les stations localisées en amont présentaient les plus faibles valeurs. Les valeurs les plus importantes ont été mesurées au niveau des stations situées en aval de la lagune.
Les sulfates, les orthophosphates et les chlorures montrent une légère variation spatiale. Tandis que les nitrates montrent une importante variation spatiale. Les teneurs élevées en nitrates se manifestaient au niveau des stations 2 et 7. Les autres stations présentaient des teneurs plus faibles variant de 10 à 2 mg/l.
Oxygène dissous
En ce qui concerne les valeurs plus élevées d'oxygène dissous mesurées en amont, elles résultent de la présence de phytoplancton au printemps.
en amont, elles résultent de la floraison printanière du phytoplancton 16. Les valeurs
d'O2 dissous ont progressivement diminué et de l'augmentation de la température de l'eau en été qui limite la dissolution de l'O2. (48)
-l'influence des eaux océaniques, principale source de phosphate pour les eaux côtières. et par le lessivage des zones agricoles riches en engrais phosphatés et par la présence de mines de phosphate et par la présence d'une mine de phosphate entre El Jadida et Safi (48)
