Diagnostic Bacteriologique

DIAGNOSTIC
BACTERIOLOGIQUE
DR RADJI
Cours 2e année CHIR DENT 2018-2019
• Devant une infection, le clinicien réalise un
prélèvement qu’il envoi au laboratoire. En
attendant les résultats, il instaure un traitement
probabiliste (en fonction des signes cliniques,
de l’âge du patient du germe présumé et de
l’épidemiologie des résistances).
• Le rôle du laboratoire est d’isoler, d’identifier
puis de tester la sensibilité aux antibiotique du
germe en cause
INTRODUCTION
• Diagnostic direct: mise en évidence de la
bactérie responsable du tableau clinique,
identification et étude de la sensibilité aux anti-
bactériens
• Diagnostic indirect: mise en évidence des

marqueurs biologiques (Anticorps humoraux)
témoins de la multiplication bactérienne dans
l’organisme
LES PRELEVEMENTS
De la qualité du prélèvement et
des conditions de son transport
au laboratoire dépend la qualité
du résultat
LES PRELEVEMENTS
Règles générales:
- Avant toute antibiothérapie si possible, sinon
après une fenêtre thérapeutique
- Asepsie rigoureuse
- Acheminement rapide ( à +4° polymicrobien, à
37° monomicrobien)
- Germes fragiles: possibilité d’ensemencement
au lit du malade (méningocoque, gonocoque)
- Milieux de transport
Fiche de renseignements cliniques
• Informations utiles sur le malade: âge,
sexe, profession, origine géographique,
etc.
• sur le tableau clinique: début, symptômes
majeurs, type d’évolution, traitement
reçus avant.
• Autres types d’informations spécifiques
pouvant orienter le bactériologistes vers
une recherche de germes particuliers.
Enregistrement au laboratoire
• Sur registre du laboratoire

– Numéro
– date de réception au laboratoire
– Nom, prénom, âge et sexe
– Adresse ou service hospitalier, nom du
médecin
– Nature du prélèvement
DIAGNOSTIC DIRECT
1. Examen macroscopique :
=» aspect du prélèvement
la présence d’un trouble, l’odeur
(particulièrement pour les anaérobies),
la consistance, la granulations… peuvent
apporter des premières informations sur
l’existence d’une infection ou non.
Il existe différents types de prélèvements:
Coproculture
Expectorations
LCR
Clair trouble
purulentes clair
2. Examens microscopiques:
 état frais fourni des informations sur la forme
et la mobilité des bactéries.
 examen à l’encre de chine : recherche de
capsule.
 frottis colorés par le bleu, le Gram, ou
coloration spécifique (Ziehl-Neelsen), IFD
immunofluorescence directe……
 Coloration de Gram :Gram (montre l’affinité
tinctoriale du micro-organisme)
Permettent d’avoir des informations sur la
pureté de la population bactérienne, la présence
de cellules polynucléaires ou lymphocytaires
Orientent les recherches ultérieures pour le
choix des milieux à ensemencer, les tests à
lancer rapidement et
Permet parfois de donner un diagnostic de forte
présomption au clinicien qui peut commencer le
bon traitement immédiat
2- Examens microscopiques
 État frais
compte des
cellules en
Malassez
Encre de Chine
(microscope Utilisée pour
visualiser la capsule
optique X40)
coques diplocoques chainettes
Polynucléaires
Bacilles fusiforme vibrions

La coloration de Gram
• Renseigne sur la présence (ou absence) de
bactéries:
• leur forme (cocci ou bacille, cocobacille,
fusiforme)
• leur groupement (amas, chaînettes,
diplocoques)
• leur gram (+ ou -) ⇒ très utile car oriente
l’antibiothérapie.
Principe de la coloration de Gram
Cocci à Gram(+) en amas cocci à Gram(+) en chainettes
Bacille Gram (+) en amas Bacille Gram (-)

Informations sur la pureté de la population bactérienne
Flore fécale normale
 après colorations ( au bleu de méthylène,
le gram)
• AUTRES COLORATIONS:
Certaines bactéries ne se colorent
pas avec la coloration de Gram:
Ziehl-Neelsen pour les
mycobactéries : coloration des
bacilles acido-alcoolo-résistants
(BAAR).
 Colorations spéciales ( exp: Ziehl Neelsen)
BAAR
Bacilles acido- alcoolo-résistants = BAAR≈ mycobactéries.

Coloration à l’auramine
lecture au microscope à fluorescence
 IFD (Legionella et Chlamydia trachomatis)
Examen au microscope à fond noir pour
Treponema pallidum et IFD
3. recherches des Ag bactériens solubles dans
les méningites bactériennes décapitées par
agglutination, contre-
immunoéléctrophorèse
4. mise en culture et isolement l’isolement sur milieux
selon l’orientation clinique, le site anatomique du prélèvement :
flore, type d’infection, espèces pathogènes courantes
La mise en culture doit être appropriée à la bactérie suspectée
 Isolement sur milieux de culture
- Milieux nutritifs simples
- Milieux nutritifs enrichis
- Milieux sélectifs
 Conditions d’incubation
- Température ( 37, 30 ou 42° )
- Tension d’oxygène
- Tension de CO2
- Durée d’incubation ( 18h, 24h, 48h, jours ou semaines)
 obtenir une culture:
une bactérie une colonie
Milieux de culture
Gélose au sang
MH
Flacons d’hémocultures Lowenstein jensen

• Isolement des bactéries : ⇒ milieux solides
étalement et isolement en stries pour étaler les
bactéries et les isoler les unes des autres. les
bactéries se multiplient et donne une colonie visible
à l’oeil nu au bout de 18 à 24h ou plus.
Incubation
Etuve Jarres
Leur principal avantage
est de détecter
automatiquement et
très rapidement toute
croissance bactérienne
en mesurant
régulièrement la
production de CO2 due
Automate BactAlert® (Biomerieux) à la multiplication
pour les hémocultures
bactérienne
5. Identification des bactéries: à partir de culture
pure
 caractères morphologiques
 caractères culturaux :
●Aspect des colonies,
●Pigmentation
●Vitesse de croissance
 caractères biochimiques
 caractères antigéniques (sérotypie) intérêt
épidémiologique exp: salmonella
BCP HK
SS HK
GSF
Milieu de culture contenant des
substances chromogènes qui vont
permettre de mettre en évidence
une activité enzymatique spécifique
de l’espèce recherchée, entraînant
l’apparition de colonies bactériennes
colorées.
Milieu
chromogènes
spécifique pour
Salmonella
2 types de colonies Culture pur
Corynrbacterium diphteriae
Hémolyse atour
de la colonie
Chainettes Streptococcus du groupe A

Listeria monocytogenes
Staphylococcus aureus
Identification de la bactérie (suite)
Réalisée sur une population bactérienne « pure »
• L’étude microscopique ( état frais et colorations)
• Caractères culturaux ( morphologie, durée,
conditions physiologiques)
• Tests biochimiques explorant le métabolisme
glucidique, protidique et lipidique
• Tests explorant les conséquences du métabolisme
– Détection de produits de dégradation
métaboliques ou
– d’enzymes impliquées dans la réaction
Gram à partir d’une culture
Identification de la bactérie ( suite)
• Etude antigénique: Etude des antigènes de
groupe ou de type portés par la bactérie à
l’aide de sérums spécifiques connus, par des
réaction immunologiques d’agglutination ou de
précipitation de l’antigène bactérien par
l’antisérum spécifique connu.
• caractères antigéniques (sérotypie) intérêt
épidémiologique exp: salmonella
Tests biochimiques
La galerie biochimique
d’identification:
Contient des tests plus
lents (résultat en 4h à
24h) basés sur l’étude de
la fermentation de sucres + + _ _
+
et des caractères
enzymatiques.
Automate
d'identification
Vitek2®
Compact
(BioMérieux)
6. Les tests de sensibilité aux antibiotiques
L’ Antibiogramme
résistance naturelle aux
polymyxines (image en
cocarde).
DIAGNOSTIC INDIRECT
Mettre en évidence la réaction immunitaire
de l’organisme infecté:
 Humorale: production d’anticorps
 Indications : le diagnostic d’infection due à
une bactérie de croissance difficile ou
impossible (Syphilis, rickettsiose,
leptospirose, maladie de lyme…)
 Tester 2 sérums à 15 jours d’intervalle.
Recherche des anticorps spécifiques =
sérodiagnostic
- principe: complexe immun Ag – Ac

- Techniques: immuno-précipitation, immuno-
agglutination, IF et immuno-enzymatique
ELISA +++
• Analyse quantitative : titre
• Analyse qualitative : classe des Ig, G ou M.
Sérodiagnostic de Widal-Felix
Sérodiagnostic De Wright
dilutions du sérum (du
1/10 au 1/640e)
sur lame (Epreuve à l'antigène tamponné ou rose
bengale test dans la brucellose) sur sérum non dilué
Quelques exemples de sérodiagnostic:
- Brucellose : agglutination (Wright), Antigène
tamponné ou Rose bengale
- Chlamydioses : ELISA
- Legionellose : IFI, ELISA
- Lyme (maladie) : ELISA
- Mycoplasmes : ELISA
- Rickettsioses - Coxiella : IFI
- Salmonelloses : anti-typhoparathyphoïdiques
(Widal-Félix) par agglutination
- Infections à Streptocoques du groupe A : anti-
streptolysines, anti-strepdornases, anti-
streptokinases
- Syphilis : TPHA, FTA, TPI, ELISA
 La sérologie n’est pas fiable:
- Infection ancienne
- Vaccination
- Antigénnicité croisé
pour plus de fiabilité:
 02 titrages à 15 jours d’intervalle
 recherche des IgM primo-infection
BIOLOGIE MOLECULAIRE
 Recherche du génome bactérien: spécificité +
+
 Intérêt application pour les bactéries non
cultivables ou celles à croissance lente ou
difficile
 02 techniques:
- hybridation par les sondes
- PCR
Amplification enzymatique in vitro ou
polymerase chain réaction (PCR)
 Consiste à synthétiser in vitro des milliers de
copies d’une séquence spécifique de l’ADN
bactérien (automates)
 La révélation du produit amplifié se fait soit
par hybridation soit par électrophorèse sur
gel d’agarose et visualisation de la bande
d’ADN
Principe de la technique PCR
1- ADN double brin

2- Dénaturation thermique (ouverture
des 2 brins )
3- Hybridation des amorces ( sens et
anti-sens)
4- Elongation ou synthèse ( ADN
polymérase+ désoxynucléotides)
hybridation d’un néo brin d’ADN
complémentaire de l’ADN d’origine
5- Continuation de la réaction par
réactions successives de
dénaturation/ hybridation sous
l’action de la température
(chauffage, refroidissement)
aboutissant à la fabrication d’un
grand nombre de fragments d’ADN
copies du fragment original
Diagnostic bactériologique. 2007
Principe de la PCR
les cycles de la PCR
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Bacilles fusiforme vibrions

Bacille Gram (+) en amas Bacille Gram (-)

Bacilles acido- alcoolo-résistants = BAAR≈ mycobactéries.

Flacons d’hémocultures Lowenstein jensen

Chainettes Streptococcus du groupe A

- principe: complexe immun Ag – Ac

1- ADN double brin

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