Aula HPLC

HIGH PERFORMANCE LIQUID CROMATOGRAPHY
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA PERFORMANCE
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTO DESEMPENHO
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE)
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CONCEITOS E FUNDAMENTOS
• “HPLC usa pressões elevadas para forçar a

passagem do solvente através de colunas
fechadas que contém partículas muito finas
capazes de proporcionar separações muito
efecientes (com alta resolução)”. Daniel C.
Harris.
2
O PROCESSO CROMATOGRÁFICO
COLUNA
RECHEADA
DETECTOR
SINAL
TEMPO
3
INSTRUMENTAÇÃO
• Os aparelhos empregados em HPLC são chamados

de cromatógrafos líquido. Estes se caracterizam por
apresentarem a seguinte configuração instrumental:
1- Reservatório de fase móvel

2- Sistema de bombeamento da fase móvel
3- Sistema de injeção
4- Sistema analítico: coluna cromatográfica
5- Sistema de detecção
6- Sistema de controle, aquisição e registro de dados.
4
EQUIPAMENTO PARA HPLC
Detector
Sistema de controle,
aquisição,
armazenamento
e tratamento de dados Descarte
Reservatórios
de fase móvel
Coletor de
frações
Sistema de Sistema de Coluna

bombeamento injeção forno
5
Adaptado de: http://www.forumsci.co.il/HPLC/system.gif
RESERVATÓRIO DE FASE MÓVEL (RFM)
• Recipiente contendo fase móvel que será bombeada dentro do

sistema analítico.
• As características desejadas em um RFM são:
- O frasco deve ser de vidro (borossilicato) e, às vezes, dependendo da fase

móvel empregada, poderá ser de teflon ou outro polímero conveniente.
- Sua tampa deve conter furos para a passagem de tubulações, as quais

servirão de canal de passagem de fase móvel (linha de solvente). A
superfície livre dos furos deve ser a menor possível a fim de evitar a
difusão de solvente para a atmosfera.
- Dependendo da técnica de degaseificação empregada o frasco poderá

estar acoplado a aquecimento agitação ou sistema de vácuo.
- A linha de solvente possui obrigatoriamente um filtro para reter partículas

sólidas porventura existente.
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CARACTERÍSTICAS IDEAIS PARA
A FASE MÓVEL
• Ser de alto grau de pureza ou de fácil purificação
• Dissolver a amostra sem decompor os seus componentes
• Não decompor ou dissolver a fase estacionária
• Ter baixa viscosidade
• Ser compatível com o detector utilizado
• Ter polaridade adequada para permitir uma separação

conveniente dos componentes da amostra
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SISTEMA DE BOMBEAMENTO
• Os aspectos mais importantes para o sistema de bombeamento são:
- pressão máxima de operação na faixa de 600 bar;
- vazão contínua sem pulsos ou se pulsando, com amortecedor de pulsos;
- intervalo de vazões entre 0,01 e 10 mL/min para; aplicações;
- analíticas e até 100 mL/min para aplicações preparativas;
- reprodutibilidade e constância na vazão de 1%;
- Não deve ser corroído pelas fases móveis empregadas. Logo, são
construídas com material nobre: sede de safira, esfera de rubi.
8
Adaptado de: CEFET-QUÍMICA, Unidade Rio de Janeiro, ANÁLISE 9
INSTRUMENTAL, CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUÇÃO
TIPOS DE ELUIÇÃO
• Isocrática: A composição da fase móvel

(% B) permanece constante durante toda
a análise cromatográfica. É realizada com
um único solvente ou mistura constante
de solventes.
• Gradiente: Ocorre alterações da
composição da fase móvel (% B) durante
a execução da análise.
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EM RELAÇÃO A ELUIÇÃO POR
GRADIENTE
• Gradiente linear
• Gradiente segmentado
• Gradiente formado a baixas pressões
- Demanda uma única bomba e uma válvula de diversas
vias controlada por um microcomputador
• Gradiente formado a altas pressões
- Cada solvente é bombeado por uma bomba específica
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SISTEMA DE INJEÇÃO
• Válvula de injeção para HPLC com alça de amostragem

substituível em vários tamanhos de volume fixo
Adaptado de: CEFET-QUÍMICA, Unidade Rio de Janeiro, ANÁLISE 12

INSTRUMENTAL, CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUÇÃO
COLUNA CROMATOGRÁFICA
• O equipamento usa colunas de aço de material polimérico,com um

comprimento de5 a 30 cm e um diâmetro interno de 1 a 5 mm.
• Essas colunas têm custo elevado e se degradam com facilidade

pela ação de poeira ou de partículas sólidas presentes na amostra e
no solvente e pela adsorção irreversível de impurezas, também
provenientes da amostra ou do solvente.
• A entrada da coluna principal é protegida por uma pequena pré-

coluna contendo a mesma fase estacionária presente na coluna
principal.
• Dispositivo de alocação da coluna termostatisado.
13
FASE ESTACIONÁRIA (FE)
• Os suportes mais comuns são as partículas porosas,

microporosas de sílica ou peliculares, altamente puras e
esféricas, que são permeáveis ao solvente e possuem
uma área superficial de várias centenas de metros
quadrados por grama.
• Pode ser usada a sílica descoberta como fase

estacionária para a cromatografia por adsorção.
• Normalmente a cromatografia líquida por partição é

realizada com uma fase estacionária quimicamente
ligada, unida covalentemente a superfície da sílica
mediante reações específicas.
14
ESTRUTURA ESQUEMÁTICA DA FE
15
TIPOS DE PARTÍCULAS PARA FE
• Porosas ou microporosas:
Consiste de micro partículas porosas com diâmetro variando de 3

a10m. As partículas podem ser compostas de sílica, alumina,
resina sintética de poliestireno-divinil-benzeno ou resina de troca
iônica
• Pelicular:
Consiste de leitos de polímeros ou vidro não poroso.Um camada

fina e porosa de sílica, alumina resina sintética de poliestireno-
divinil-benzeno ou resina de troca iônica é depositado sobre a
superfície desses leitos.
16
.
ESQUEMA DAS PARTÍCULAS DE FE
a) partículas porosas; b) partículas peliculares; c) micropartículas peliculares17

CLASSIFICAÇÃO CROMATOGRÁFICA
LEVANDO EM CONSIDERAÇÃO A FASE
ESTACIONÁRIA
• Cromatografia em fase normal:
- Fase estacionária polar,solvente menos polar;

- O solvente mais polar tem força eluente maior
• Cromatografia em fase reversa:
- Fase esatacionária apolar ou fracamente polar, solvente

é mais polar.
- O solvente menos polar tem força eluente menor.
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19
20
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22
SISTEMAS DE DETECÇÃO
- ULTRAVILOLETA
- ÍNDICE DE REFRAÇÃO
- EVAPORATIVO COM ESPALHAMENTO DE LUZ
- ELETROQUÍMICO
- FLUORESCÊNCIA
- NITROGÊNIO
- CONDUTIVIDADE
- ESPECTROMETRIA DE MASSA
- INFRAVERMELHO COM TRANSFORMADA DE FOURIER

23
ABSORVÂNCIA UV COM CÉLULA EM Z
24
COMPRIMENTO DE ONDA FIXO
25
UV – VIS COM COMPRIMENTO DE ONDA VARIÁVEL
26
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PROCESSO DE ELUIÇÃO
• As moléculas do solvente competem com as moléculas do soluto
para se ligarem aos sítios ativos presentes na fase estacionária.
Quanto maior a força eluente do solvente, mais facilmente ele
deslocará o soluto.
28
APLICAÇÕES
• Análises qualitativas
- Espectrometria de massa, RMN, infravermelho.
• Análises quantitativas
- Curva de calibração externa

- Curva por adição de padrão
- Curva por padrão interno
- Curva de calibração externa por interpolação dematriz
29

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CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA PERFORMANCE

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTO DESEMPENHO

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE)

• “HPLC usa pressões elevadas para forçar a

• Os aparelhos empregados em HPLC são chamados

1- Reservatório de fase móvel

Sistema de Sistema de Coluna

• Recipiente contendo fase móvel que será bombeada dentro do

• As características desejadas em um RFM são:

- O frasco deve ser de vidro (borossilicato) e, às vezes, dependendo da fase

- Sua tampa deve conter furos para a passagem de tubulações, as quais

- Dependendo da técnica de degaseificação empregada o frasco poderá

- A linha de solvente possui obrigatoriamente um filtro para reter partículas

• Ser de alto grau de pureza ou de fácil purificação

• Dissolver a amostra sem decompor os seus componentes

• Não decompor ou dissolver a fase estacionária

• Ter baixa viscosidade

• Ser compatível com o detector utilizado

• Ter polaridade adequada para permitir uma separação

• Os aspectos mais importantes para o sistema de bombeamento são:

- pressão máxima de operação na faixa de 600 bar;

- vazão contínua sem pulsos ou se pulsando, com amortecedor de pulsos;

- intervalo de vazões entre 0,01 e 10 mL/min para; aplicações;

- analíticas e até 100 mL/min para aplicações preparativas;

- reprodutibilidade e constância na vazão de 1%;

• Isocrática: A composição da fase móvel

• Válvula de injeção para HPLC com alça de amostragem

Adaptado de: CEFET-QUÍMICA, Unidade Rio de Janeiro, ANÁLISE 12

• O equipamento usa colunas de aço de material polimérico,com um

• Essas colunas têm custo elevado e se degradam com facilidade

• A entrada da coluna principal é protegida por uma pequena pré-

• Dispositivo de alocação da coluna termostatisado.

• Os suportes mais comuns são as partículas porosas,

• Pode ser usada a sílica descoberta como fase

• Normalmente a cromatografia líquida por partição é

Consiste de micro partículas porosas com diâmetro variando de 3

Consiste de leitos de polímeros ou vidro não poroso.Um camada

a) partículas porosas; b) partículas peliculares; c) micropartículas peliculares17

• Cromatografia em fase normal:

- Fase estacionária polar,solvente menos polar;

• Cromatografia em fase reversa:

- Fase esatacionária apolar ou fracamente polar, solvente

- EVAPORATIVO COM ESPALHAMENTO DE LUZ

- INFRAVERMELHO COM TRANSFORMADA DE FOURIER

- Espectrometria de massa, RMN, infravermelho.

- Curva de calibração externa

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