Preceptoras: Stefanne Rezende e Vanessa Moura Data: 16/01/2024

Aluno (a): Andressa Vitória Cabral de Souza

Tema: Microbiologia

1) Atividades Realizadas:
a. Biossegurança, Esterilização, desinfecção e descarte;
A esterilização é um processo que visa destruir todas as formas de vida microbianas
que possam contaminar materiais e objetos, sendo eliminados durante a esterilização
organismos como vírus, bactérias e fungos. A esterilização de materiais pode desenvolver-se
através de diferentes processos químicos e físicos. Esse processo é tão eficaz que a
probabilidade de um microrganismo submetido ao processo de esterilização sobreviver é
menor que uma em um milhão. Portanto, as autoclaves são equipamentos que utilizam vapor
saturado (ideal para o processo de esterilização dos equipamentos) sob pressão, com 100% de
umidade relativa, estando a água entre as formas líquida e gasosa.
Durante o dia foi reforçado a importância da biossegurança, a necessidade de
utilização de EPIs (máscara, jaleco, calça, sapatos fechados, sem adornos, etc). Ademais, foi
realizada a esterilização dos materiais limpos (vidrarias, placas de petri) utilizando como fonte
de calor a autoclave a 121° C por 30 minutos. O método de se utilizar e desinfectar a câmara
de fluxo laminar e a importância da sua utilização para manipular microorganismos. Já o
processo de descarte dos materiais ocorreu pela retirada de todo meio em um saco plástico de
contaminação e limpeza das vidrarias e placas de petri com água e detergente, para assim,
encaminhar para a esterilização.

b. Preparo de meios de cultura

O preparo de meios de cultura ocorre pelo cálculo inicial de conversão da quantidade
do meio desidratado por mL de acordo com o fabricante descrito no rótulo da embalagem.
Desse modo, após é pesado o meio utilizando a balança com auxílio de uma colher,
posteriormente, repassa a amostra para o béquer. Após, mede-se a água destilada contida na
proveta para o béquer. Enquanto isso, as placas de cultura foram lavadas e secadas no papel
de toalha. Assim, coloca-se a água destilada no meio de cultura e leva-o para o microondas
durante 30 a 30 segundos até diluir todo o líquido com auxílio de uma luva.
Logo após, a placa de cultura foi empacotada no papelão e os frascos com meio de
cultura foram afrouxados um pouco na tampa e, ambos esterilizados com uso da autoclave.
Para o processo de esterilização com uso da autoclave, adicionou-se a água destilada na
autoclave para iniciar o processo, verificando se o nível da água cobriu a resistência, assim,
foram colocados os materiais destinados à esterilização do meio de cultura durante 15 minutos
a 121° C.

c. Tipos de semeadura
● Técnica de semeadura em estrias: Utilizado para estocar a bactéria; Estudar seu
metabolismo em uma prova “bioquímica”; Avaliar sua capacidade de crescimento ou
não no meio de cultura.

● Técnica de semeadura em picada: Verificar a motilidade do microorganismo.

 ● Técnica de semeadura em esgotamento: Obter colônias isoladas, o que permite
distinguir os diferentes micro-organismos em um material ou cultura polimicrobiana
através da sua morfologia colonial.

● Técnica de semeadura simples e contínua: Utilizado para quantificar as bactérias (UFC).

d. Coloração de Gram (Análise microscópica e morfológica).

As bactérias Gram positivas apresentam, além da membrana plasmática, uma grossa
camada de peptidoglicanos, e inseridos nela ácidos teicóicos e lipoteicóicos. Já as bactérias
Gram negativas têm membrana plasmática e uma fina parede de peptideoglicanos, além de
apresentar uma membrana externa com lipopolissacarídeos (LPS). Ao inserir o corante cristal
violeta os dois tipos de bactérias ficam com coloração roxa, uma vez que este reagente
impregna na camada de peptidoglicano de ambas. O segundo passo foi inserir o lugol, nesta
situação ele tem papel de unir os cristais violeta, ou seja, ele é
uma solução mordente.
O álcool, ao serem inseridos, promovem a quebra e dissolução da membrana externa e
dos LPS de bactérias Gram negativas. Desse modo, o corante azul violeta unidos conseguem
libertar-se, ficando, agora, descoradas. Já nas bactérias Gram positivas, o álcool não é
suficiente para quebrar a grossa camada de peptidoglicano. Desse modo, os cristais de azul
violeta não conseguem sair, ficando presos nessa estrutura da bactéria, e portanto, continuam
corados de roxo. Para que bactérias gram negativas, antes sem cor, sejam coradas é necessário
inserir o corante safranina/fucsina, o qual irá tingir a bactéria de rosa. Por isso, bactérias gram
positivas apresentaram coloração arroxeada e gram negativas coloração rosa.

Nesse sentido, foi realizado o repique da bactéria E. coli com auxílio de uma alça
bacteriológica, sendo feito o esfregaço que está na ponta da alça, em uma lâmina contendo
uma gota de salina. Posteriormente, fixa-se no fogo, fazendo movimentos de ida e volta até o
conteúdo da lâmina apresentar-se seco. Após fixação, leva-se a lâmina para um local
adequado, onde inseri, primeiramente, o cristal violeta, deixando agir por 1 minuto. Após este
tempo, é feito o enxágue com água destilada, e acrescenta-se o lugol, deixando repousar por
um minuto. Enxaguado, foi adicionado o álcool por 30 segundos. Enxaguado, e por último,
acrescentou-se Fucsina por 30 segundos, foi feito, então, o enxágue e secagem da parte
posterior da lâmina e levada ao microscópio.

e. Testes bioquímicos – Gram negativos

● Teste da Oxidase: Detectar se a bactéria possui a enzima oxidase presente no
citocromo C oxidase, que é capaz de fermentar a tira reagente ou disco que possui os
reagentes N, N, N, N-tetrametil-p-fenilenodiamina ou N, N-dimetil-p-fenilenodiamina.

● Teste Sulfeto Indol Motilidade (SIM): Detecta a produção de sulfeto de hidrogênio,

Indol (são capazes de degradar o aminoácido triptofano até indol através da ação
enzimática da triptofanase) e a motilidade da bactéria.
● Tríplice açúcar ferro (TSI): Analisa se a bactéria é capaz de fermentar açúcares: Glicose,
lactose e sacarose. E verifica se produzem gases: sulfeto de hidrogênio (H2S) e dióxido de
carbono.

● Voges-Proskauer (VP): Verifica se a bactéria realiza fermentação por via butanodióica pela
detecção de acetilmetilcarbinol (acetoína) que é o produto final desse processo. O qual
adiciona KOH que na oxida acetoína em diacetil, forma um halo avermelhado na
superfície.
● Fenilalanina: Detecta a presença da enzima Fenilalanina desaminase, que é causa remoção
do aminoácido amina da fenilalanina, formando ácido fenilpirúvico, adicionando cloreto
férrico 10% ocorre reação dando uma coloração esverdeada.

● Urease: Detecção da atividade enzimática da urease, enzima capaz de degradar ureia em

amônia e bicarbonato.
● Citrato: Utilizado para identificar bactérias que utilizam o citrato como principal fonte de
CO2 e fosfato de amônia como fonte de nitrogênio.

● Lisina: O caldo lisina descarboxilase possui peptonas e extrato de leveduras que favorecem
o crescimento bacteriano. A fermentação de glicose abaixa o pH e o meio fica amarelo. Se
ocorrer atividade da enzima lisina descarboxilase, o pH aumentará devido a transformação
da lisina em uma amina primária: a cadaverina, e o meio voltará a apresentar uma
coloração roxa.

f. Testes bioquímicos – Gram positivos.

● Catalase: Decomposição do peróxido de hidrogênio em água e gás oxigênio. Neste teste,
adiciona-se uma quantidade de água oxigenada em uma alíquota oriunda da cultura para
que se observe a formação de bolhas, resultante da ação positiva da catalase.
● Coagulase: Capacidade de bactérias reagirem com o plasma e formar um coágulo, uma
vez que a coagulase, produzida pelo microrganismo é uma proteína com atividade
semelhante à proteína protrombina, que é capaz de converter o fibrinogênio em
fibrina, o que resulta na formação de um coágulo observável a olho nu.

● DNAse: Verifica se a bactéria tem a capacidade de degradar DNA através da enzima

desoxirribonuclease. A colônia é semeada em ágar DNA e após o período de
incubação, utiliza-se HCl a 37% para a revelar a presença ou não do halo.
g. Diagnóstico – Cocos Gram positivos (Catalase negativos).
h. Diagnóstico – Cocos Gram positivos (Catalase positivos).
i. Diagnóstico – Gram negativos (Rugai).
 j. Diagnóstico – Micobactérias
Na baciloscopia de escarro foi realizada a técnica de Ziehl-Neelsen, o qual, foi
realizado a coleta de amostra de escarro para confecção do esfregão com auxílio de palito de
sorvete e fixação usando fonte de calor. Posteriormente, foi realizado o processo de coloração
que se inicia adicionando Fucsina Fenicada de Ziehl cobrindo toda a lâmina, aquecendo
durante 5 minutos para que ocorra a quebra dos lipídios dos bacilos ácido álcool resistente.
Em seguida, foi efetuado a lavagem com água destilada e adição de solução Descorante de
Ziehl, por fim, é feito a adição do contra corante Azul de Metileno “Loeffler” deixando agir
por 1 minuto.

k. Meios de cultivo – Micologia

● Ágar Sabouraud:
Utilizado para o cultivo e crescimento qualitativo de fungos, como filamentoses,
leveduras, espécies de cândidas e fungos associados a infecções artificiais. O Ágar Sabouraud
é um método extremamente seletivo, pois seu pH, levemente ácido, favorece o crescimento de
dermatófitos e inibe algumas espécies bacterianas de interesse clínico, isso acontece devido a
presença de cloranfenicol, um antibiótico de amplo espectro que age contra as bactérias gram
negativas, gram positivas e riquétsias.
Um dos diferenciais do meio Ágar Sabouraud é a elevada concentração de dextrose,
que proporciona uma vantagem para o desenvolvimento dos fungos estáveis por osmose, a
medida que a maioria das bactérias não suporta a elevada concentração de açúcar. O período
de incubação do Ágar Sabouraud é de no mínimo 3 dias em temperatura de 25°C. O Ágar
Sabouraud apresenta outras vantagens. Uma delas é que o caldo presente no método serve
para controlar a esterilidade e realizar procedimentos baseados na utilização de membranas
filtrantes. Além disso, é mais fácil de utilizar, pois é fornecido em placas prontas para o uso,
eliminando o complicado trabalho de preparar o meio no laboratório.
 ● Ágar batata dextrose:
Utilizado na contagem de fungos e leveduras. Ele é rico em açúcares simples
provenientes da batata e, por isso, pode ser utilizado como local de crescimento e cultura para
diferentes tipos de microrganismos. A infusão de batata e dextrose como fonte de
carboidratos suportam o crescimento dos fungos e bactérias, estimulando a esporulação dos
fungos e a produção de pigmentos em certos dermatófitos.

l. Colorações – Micologia
O método de coloração com Lactofenol Azul Algodão é usado para preparar exame
microscópico de colônias de fungos. É uma técnica que tem a finalidade de visualizar o
micélio vegetativo e reprodutor de um fungo filamentoso, como também as características da
célula vegetativa e reprodução por brotamento de leveduras. O uso da tinta Nankin é bem
específico para “visualizar” leveduras que apresentam cápsula.
Após o crescimento do fungo deve-se colocar uma gota de lactofenol azul-algodão
(LFAA) sobre a lâmina. Retirar pequeno fragmento da cultura de bolor ou uma alíquota da
cultura de levedura, utilizando alça ou fio de platina. Colocar o fragmento da cultura ou a
alíquota de levedura sobre a gota de lactofenol e homogeneizar. Cobrir com lamínula e
examinar o microscópio.
 m. Microcultivo.
Apesar de existirem algumas técnicas para identificar fungos utilizando a morfologia,
a técnica de microcultivo (ou cultivo em lâmina) é empregada por alguns taxonomistas de
fungos. Esta técnica consiste na preparação de culturas de fungos em lâminas de microscopia
para observação direta em microscópio de campo claro. O microcultivo permite na íntegra o
estudo das estruturas de reprodução (tanto sexuadas quanto assexuadas) da maioria dos
fungos; facilitando a observação das principais características utilizadas para identificar tais
micro-organismos. O microcultivo se fundamenta na cultura do fungo em pequenos pedaço de
meio de cultura, entre lâmina e lamínula, onde o crescimento do fungo se expande e fixa na
porção inferior da lamínula, que quando retirada com cuidado mantém as estruturas que
formam esporos (corpo de frutificação), intacta, o que facilita melhor identificar as
características dos fungos.
Inicia com a identificação da placa de Petri e adição de um papel filtro no fundo da
placa, adiciona duas lâminas de vidro em baixo para suporte da lâmina de vidro que será
utilizada para o cultivo do fungo. Em seguida, com auxílio de uma espátula flambada, cortar
um quadrado de aproximadamente 1 cm2 do meio ágar batata e depositar o bloco de ágar
sobre a lâmina. Realizar todo o procedimento próximo a chama do bico de Bunsen. Com
auxílio de uma agulha de inoculação (no caso de fungos filamentosos), flambar a agulha e
tocar na superfície da colônia do fungo. Em seguida, tocar a agulha nos quatro cantos do
bloco de ágar; flambar a agulha.
No caso das leveduras, com auxílio da alça de transferência, tocar a colônia e riscar
suavemente duas vezes o bloco de ágar. Tanto para as leveduras quanto para os fungos
filamentosos, após inocular o material no bloco, flambar a pinça e retirar uma lamínula estéril
de dentro do recipiente apropriado e dispor suavemente a lamínula sobre o bloco de ágar.
Flambar novamente a pinça e umedecer o papel filtro com água destilada, assim, deve-se
aguardar de 7 a 10 dias para a leitura do mesmo.
n. Diagnóstico – IST’s
● Cancro Mole (Cancroide): Haemophilus ducreyi - Feridas múltiplas e dolorosas de
tamanho pequeno com presença de pus, que aparecem com frequência nos órgãos
genitais (ex.: pênis, ânus e vulva), podem aparecer nódulos (caroços ou ínguas) na
virilha. Na microscopia aparecem pequenos bacilos gram negativos em grupos frouxos
ou levemente curvos.

● Donovanose/Granuloma inguinal: Krebisiella granulomatis - Acomete

preferencialmente a pele e mucosas das regiões da genitália, da virilha e do ânus.
Causa úlceras e destrói a pele infectada. Na microscopia aparecem corpos de
Donovan, com numerosos bacilos no citoplasma de macrófagos.
● Gonorreia: Neisseria gonorrhoeae - Os sintomas mais frequentes causados por essas
infecções são, na mulher, corrimento vaginal com dor no baixo ventre na mulher, e nos
homens, corrimento no pênis e dor ao urinar. No entanto, é muito comum que as
infecções causadas por essas bactérias sejam assintomáticas na maioria dos casos. Na
microscopia observa diplococos gram negativos, reniformes intra e extracelulares.

● Linfogranuloma venério: Chlamydia tracomatis - Ferida inicial, surge um inchaço

doloroso (caroço ou íngua) na virilha, que, se não for tratado, rompe-se, com a saída
de pus. Pode haver sintomas por todo o corpo, como dores nas articulações, febre e
mal-estar. Microscopicamente observa pequenas bactérias intracelulares.
● Sífilis: Treponema pallidum - Pode apresentar várias manifestações clínicas e
diferentes estágios (sífilis primária, secundária, latente e terciária). A primeira etapa
envolve uma ferida indolor na genitália, no reto ou na boca. Após a cura da ferida
inicial, a segunda fase é caracterizada por uma irritação na pele. Depois, não há
sintomas até a fase final, que pode ocorrer anos mais tarde. Essa fase final pode
resultar em danos para cérebro, nervos, olhos ou coração. No microscópio observa-se
espiroquetas.

● Vaginose bacteriana: Gardnerella vaginalis / Candida sp. - A vaginose bacteriana

tende a afetar mulheres em idade fértil. Atividades como relação sexual sem proteção
ou ducha vaginal frequente podem aumentar os riscos. Em alguns casos, não há
sintomas. Em outros, pode haver corrimento vaginal anormal, coceira ou odor. No
microscópio é analisado cocobacilos gram variáveis supracitoplasmáticos (clue cells).
o. Laudo

Exame Microbiológico
● Coloração de Gram: Presença de bacilos gram negativos isolados e aglomerados.
● Ágar Sangue: Colônias redondas e secas (Não hemolítico).

Provas Bioquímicas
● Fermentação de Sacarose: Negativo
● Fermentação de Lactose: Positivo
● Fermentação de Glicose: Positivo
● Produção de H2S: Negativo
● Voges-Proskauer: Negativo
● Produção de Gás: Positivo
● Fenilalanina: Negativo
● Motilidade: Positivo
● Citrato: Negativo
● Urease: Negativo
● Lisina: Positivo
● Indol: Positivo

Microrganismo: Escherichia coli

Antimicrobianos
● Amoxicilina-ácido clavulânico (AMC 301): Sensível.
● Ampicilina (AMP 10): Sensível.
● Cefepime (CPM 30): Sensível.
● Cefotaxima (CTX 301): Sensível.
● Ceftazidima (CAZ 301): Sensível.
● Ceftriaxona (CRO 30): Sensível.
● Imipenem (IPM 10): Sensível.
● Meropenem (MPM 10): Sensível.
● Aztreonam (ATM 301): Sensível.
● Ciprofloxacina (CIP 05): Sensível.
● Amicacina (AMI 30): Sensível.
● Gentamicina (GEN 10): Sensível.