Pesquisa Mestrado Tea

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SAÚDE DA CRIANÇA E DO

ADOLESCENTE
TRANSTORNO DO ESPECTRO AUTISTA E

NEUROINFLAMAÇÃO: BUSCA POR
BIOMARCADORES E ALVOS TERAPÊUTICOS
TESE DE DOUTORADO
JOSEMAR MARCHEZAN
Porto Alegre, Brasil
2018

ADOLESCENTE
TRANSTORNO DO ESPECTRO AUTISTA E

NEUROINFLAMAÇÃO: BUSCA POR
BIOMARCADORES E ALVOS TERAPÊUTICOS
JOSEMAR MARCHEZAN
A apresentação desta Tese é exigência

do Programa de Pós-Graduação em
Saúde da Criança e do Adolescente, da
Universidade Federal do Rio Grande do
Sul, para obtenção do título de Doutor.
Orientador: Prof. Dr. Rudimar dos Santos Riesgo
Coorientadora: Profa. Dra. Carmem Gottfried
Porto Alegre, Brasil
2018

ADOLESCENTE
ESTA TESE FOI DEFENDIDA PUBLICAMENTE EM:
17/07/2018
E, FOI AVALIADA PELA BANCA EXAMINADORA COMPOSTA POR:
Prof. Dr. Lauro José Gregianini

Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Dra. Josiane Ranzan

Hospital de Clínicas de Porto Alegre
Profa. Dra. Clarissa Aires Roza

Universidade de Santa Cruz / Universidade do Vale do Taquari
Para minha mãe, Salete Cocco Marchezan,
com gratidão e saudade.

AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador, Prof. Rudimar dos Santos Riesgo, que com seu entusiasmo pelos
estudos acadêmicos me incentivou a iniciar essa caminhada, por seus ensinamentos,
orientações e cordialidade. Agradeço a oportunidade e a confiança.
A minha coorientadora Profa. Carmem Gottfried, exemplo de vida dedicada à
ciência, sem a qual esse projeto não teria existido, agradeço a amizade, as orientações e o
apoio constante.
Às minhas preceptoras Dra. Lygia Ohlweiler, Dra. Maria Isabel Bragatti Winckler,
Dra. Josiane Ranzan e Dra. Michele Michelin Becker, por me guiarem durante minha
formação de Neuropediatra e me apoiarem em todos os momentos de necessidade, ensinando
com ética e cordialidade.
Aos colegas de pós-graduação Iohanna Deckmann, Mauro Mozael Hirsch, Mellanie
Fontes-Dutra, Guilherme Cordenonsi da Fonseca e Victorio Bambini-Junior pela
receptividade, amizade e toda ajuda prestada.
Aos meus pais Ademar e Salete (in memoriam), cujo esforço me permitiu chegar até
aqui, e que me mostraram a importância do estudo, do trabalho e da dedicação.
A minha esposa Luiza, pelo amor, carinho e apoio incondicional.

A minha filha Cecília, por tornar os dias de muito trabalho mais alegres.
Aos alunos de iniciação científica Giovanna Carello Collar e Eduardo Geyer Arrussul
Winkler dos Santos pela colaboração no projeto.
Ao Programa de Pós-Graduação em Saúde da Criança e do Adolescente, professores
e funcionários, pelos ensinamentos e oportunidades. Especialmente a Rosane Blanguer,
sempre eficiente e prestativa.
Às equipes da Zona 4 do ambulatório do HCPA e do CPC-HCPA pela importante ajuda
na realização desse projeto.
Ao Fundo de Investimento em Pesquisas e Eventos (FIPE-HCPA) pelo suporte
financeiro a este estudo.
RESUMO
Introdução: O diagnóstico do transtorno do espectro autista (TEA) permanece clínico. A

disfunção imunológica tem sido uma característica reconhecida no TEA e diversos
pesquisadores sugerem que possa ser utilizada como ferramenta diagnóstica na forma de
biomarcador além de uma via efetiva para intervenção farmacológica. MicroRNA referem-se a
um grupo de pequenos RNA não-codificantes e seu uso como biomarcadores tem recebido
atenção progressiva. O resveratrol (RSV) apresenta capacidade de modulação da resposta
inflamatória e estudos em animais têm indicado seu efeito benéfico nos sintomas do TEA.
Objetivo: Avaliar os efeitos da administração de RSV a sujeitos pediátricos com TEA no
comportamento, expressão de microRNA, além de sua segurança. Adicionalmente, avaliar a
expressão de microRNA na saliva de crianças com TEA e controles. Metodologia: Foi
administrado RSV 200mg ao dia para 5 crianças pelo período de 90 dias. Avaliou-se as escalas
Clinical Global Impressions-Improvement (CGI-I) e Aberrant Behavior Checklist (ABC),
expressão de microRNA e exames laboratoriais previamente e após o tratamento. Também foi
avaliada a expressão de microRNA na saliva de 26 crianças com TEA e respectivos controles.
Resultados: Houve redução significativa nos escores da escala ABC total (p=0,042) e da
subescala Irritabilidade (p=0,041). As subescalas Comportamento estereotipado (p=0,066),
Hiperatividade (p=0,068) e Letargia e esquiva social (p=0,078) tiveram redução limítrofe para
significância. Pela escala CGI-I, três (60%) dos cinco participantes estavam melhor, 1
ligeiramente melhor e 1 não apresentou alterações. Não houve efeitos adversos, nem variações
laboratoriais associados ao uso do RSV. Dos 8 microRNA avaliados, houve diferença de
expressão pré e pós resveratrol dos miRNA: miR-124-3p, miR-125a-5p e miR-195-5p. Na
avaliação a expressão de microRNA foi possível verificar o aumento de expressão do miR-191
nos pacientes com TEA em relação aos controles. Conclusões: Os resultados deste estudo
sugerem a segurança do uso de RSV em crianças e seu possível efeito benéfico nos sintomas do
espectro. O RSV também aumentou a expressão dos miR-124, miR-125a-5p e miR-195-5p. Nas
amostras de saliva, encontramos aumento de expressão do miR-191 nos pacientes com TEA.
Novos ensaios clínicos controlados por placebo são necessários para confirmar o potencial
terapêutico e a segurança do RSV em crianças com TEA. A continuidade de pesquisas para
avaliar os miRNA como biomarcadores e alvos terapêuticos no TEA também é encorajada.
Palavras-chave: Transtorno do espectro autista. TEA. Disfunção imune. Resveratrol.

MicroRNA.
ABSTRACT
Introduction: Diagnosis of autism spectrum disorder (ASD) is purely clinical. Immune

dysfunction is a well-known phenomenon in ASD, and several research groups have suggested
that it may be employed as a diagnostic tool acting as a biomarker, as well as a therapeutic
target suitable for pharmacologic intervention. MicroRNAs are small non-coding RNAs, and
their use as biomarkers have received widespread attention. O Resveratrol (RSV) demonstrates
the ability of modulating inflammatory responses, and animal studies suggest that its use may
be beneficial in treating ASD symptoms. Objectives: To evaluate the safety of administering
RSV in pediatric patients diagnosed with ASD, as well as to evaluate the effects of RSV in their
behavior and microRNA expression. Additionally, to analyze microRNA expression in the
saliva of patients diagnosed with ASD and compare it to healthy controls. Methods: Five
children diagnosed with ASD received 200mg RSV daily, for 90 days. The patients were
evaluated via the Clinical Global Impressions-Improvement (CGI-I) and Aberrant Behavior
Checklist (ABC) scale, microRNA expression, and clinical laboratory exams before and after
treatment. The expression of microRNA in the saliva of 26 children diagnosed with ASD, as
well as in age-matched controls, was also analyzed. Results: The total score of the ABC scale
and Irritability subscale score were significantly reduced (P = 0.042 and P = 0.041,
respectively). The Stereotypy (P = 0.066), Hyperactivity (P = 0.068), and Lethargy/Social
Withdrawal (P = 0.078) subscales were also reduced, albeit not significantly. According to
the CGI-I scale, three (60%) of the five patients demonstrated improvement, one patient
demonstrated slight improvement and one patient did not demonstrate changes in behavior.
There were no adverse effects and laboratory test results remained unchanged after RSV use.
Of the eight microRNAs evaluated, differences in expression before and after RSV treatment
was observed in miR-124-3p, miR-125a-5p and miR-195-5p. miR-191 was overexpressed in
the saliva of patients diagnosed with ASD, in comparison to their age-matched controls.
Conclusion: These results demonstrate that RSV is safe for use in the pediatric population, and
that it may be beneficial in relieving ASD symptoms. RSV also increased the expression of
miR-124, miR-125a-5p and miR-195-5p. In saliva samples, we found that miR-191 expression
was increased in patients diagnosed with ASD. New placebo-controlled clinical trials are
necessary to confirm RSV’s therapeutic potential and safety in children diagnosed with ASD.
The ongoing research to evaluate miRNAs as biomarkers and therapeutic targets is also
encouraged.
Keywords: Autism spectrum disorder. ASD. Immune dysfunction. Resveratrol. MicroRNA.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Índice de Preferência Social. ................................................................................... 47
Figura 2 - Tempo de interação social. ..................................................................................... 48
Figura 3 - Biogênese dos miRNA. ........................................................................................... 50
Figura 4 - Rede/relações entre miRNA .................................................................................... 51
Figura 5 - Mecanismo de transporte de moléculas do plasma para os ductos salivares. .......... 56

LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Achados pós-natais no sistema imune periférico de crianças com TEA. ................ 32
Tabela 2 - Citocinas e associação com severidade dos sintomas relacionados ao TEA. ......... 33
Tabela 3 - Genes alterados em TEA e correlacionados com função imune. ............................ 35
Tabela 4 - Citocinas alteradas no TEA. .................................................................................... 37
Tabela 5 - Doses e efeitos colaterais em ensaios clínicos com resveratrol. ............................. 45
Tabela 6 - MicroRNA com expressão alterada em sujeitos com TEA. .................................... 54

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABA Applied Behavior Analysis

ABC Aberrant Behavior Checklist
ADI-R Autism Diagnostic Interview-Revised
BHE Barreira hematoencefálica
BDNF Fator neurotrófico derivado do cérebro
CARS Childhood Autism Rating Scale
CDC Centers for Disease Control and Prevention
CGI-I Clinical Global Impression – Improvement Scale
CGI-S Clinical Global Impression – Severity Scale
CNV Variação no número de cópias
COX-2 Ciclo-oxigenase-2
CPC Centro de Pesquisas Clínicas
DSM-5 Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Fifth Edition
DSM-III Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Third Edition
DSM-III-R Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Third Edition-Revised
DSM-IV Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Fourth Edition
EUA Estados Unidos da América
FDA Food and Drug Administration
Floortime Developmental Individual Difference Relations-Ship-Based Approach
GAF Assessement Functioning Scale
G-CSF Fator estimulante de colônias de granulócitos
HCPA Hospital de Clínicas de Porto Alegre
HLA Antígeno leucocitário humano
IFN-γ Interferon gama
IL Interleucina
iNOS Óxido nítrico sintase
LCR Líquido cefalorraquidiano
MCP Proteína de quimioatração de monócitos
MCP-1 Proteína quimioatratante para monócitos 1
miRNA MicroRNA
MSEL Mullen Scales of Early Learning
NF-κB Fator nuclear kappa B
PBMCs Células mononucleares do sangue periférico
PECS Picture Exchange Communication System
PET Tomografia com emissão de pósitrons
PTEN Phosphatase and tensin homolog gene
QI Quociente de Inteligência
ReBEC Registro Brasileiro de Ensaios Clínicos
RMN Ressonância Magnética Nuclear
RNAm RNA mensageiro
RSV Resveratrol
SSRI Inibidores seletivos da recaptação da serotonina
SNC Sistema nervoso central
SPSS Statistical Package for the Social Sciences
TCLE Termo de consentimento livre e esclarecido
TEA Transtorno do Espectro Autista
TEACCH Treatment and Educational of Autistic and Related Communication-
Handicapped Children Children
TGF-β Fator de transformação do crescimento beta
TLR Receptores do tipo Toll
TNF-α Fator de necrose tumoral alfa
TOC Transtorno Obsessivo-Compulsivo
Treg Célula T reguladora
UFRGS Universidade Federal do Rio Grande do Sul
VABS Vineland Adaptive Behavior Scales
VPA Ácido valproico
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 17
2 REVISÃO DA LITERATURA .......................................................................................... 20
2.1 TRANSTORNO DO ESPECTRO AUTISTA ............................................................... 20
2.1.1 Aspectos Históricos ........................................................................................... 20
2.1.2 Aspectos epidemiológicos ................................................................................. 21
2.1.3 Manifestações clínicas e diagnóstico ............................................................... 22
2.1.4 Etiologia e Neurobiologia ................................................................................. 24
2.1.5 Tratamento ........................................................................................................ 27
2.1.6 Prognóstico ........................................................................................................ 29
2.2 TEA E O SISTEMA IMUNOLÓGICO ......................................................................... 29
2.3 RESVERATROL ........................................................................................................... 40
2.3.1 Biodisponibilidade e farmacocinética em humanos ........................................... 41
2.3.2 Estudos de toxicidade do RSV em animais ......................................................... 43
2.3.3 Resveratrol e estudos em humanos ...................................................................... 43
2.3.4 Resveratrol: efeito neuroprotetor e anti-inflamatório ....................................... 43
2.3.5 Resveratrol e Transtorno do Espectro Autista ................................................... 44
2.4 MICRORNA................................................................................................................... 49
2.4.1 MicroRNA e TEA .................................................................................................. 51
2.4.2 MicroRNA e Biomarcadores ................................................................................ 52
2.4.3 Expressão de MicroRNA na saliva ...................................................................... 55
3 JUSTIFICATIVA ................................................................................................................ 57
4 OBJETIVOS RELACIONADOS AO ARTIGO 2: USO DE RESVERATROL EM

SUJEITOS DE PESQUISA PEDIÁTRICOS COM DIAGNÓSTICO DE TRANSTORNO
DO ESPECTRO AUTISTA ................................................................................................... 58
4.1 OBEJTIVO GERAL ....................................................................................................... 58

4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................................... 58
5 METODOLOGIA RELACIONADA AO ARTIGO 2: USO DE RESVERATROL EM

SUJEITOS DE PESQUISA PEDIÁTRICOS COM DIAGNÓSTICO DE TRANSTORNO
DO ESPECTRO AUTISTA ................................................................................................... 58
5.1 DELINEAMENTO DO ESTUDO ................................................................................. 58
5.2 AMOSTRA..................................................................................................................... 59
5.2.1 Critérios de Inclusão ............................................................................................. 59
5.2.2 Critérios de Exclusão ............................................................................................ 59
5.3 INTERVENÇÃO ............................................................................................................ 60
5.4 VARIÁVEIS EM ESTUDO ........................................................................................... 60
5.5 DESFECHO ESPERADO .............................................................................................. 61
5.6 FERRAMENTAS DE PESQUISA ................................................................................ 61
5.7 EXTRAÇÃO DE MICRORNA ..................................................................................... 62
5.8 LOCAL DE REALIZAÇÃO .......................................................................................... 66
5.9 LOGÍSTICA ................................................................................................................... 66
5.10 ASPECTOS ESTATÍSTICOS ...................................................................................... 67
5.10.1 Cálculo do tamanho da amostra ........................................................................ 67
5.10.2 Análise dos resultados ......................................................................................... 67
5.11 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS ...................................................................................... 68
6 OBJETIVOS RELACIONADOS AO ARTIGO 3: AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE

microRNA EM SUJEITOS PEDIÁTRICOS COM TRANSTORNO DO ESPECTRO
AUTISTA ................................................................................................................................ 69
6.1 OBEJTIVO GERAL ....................................................................................................... 69
6.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................................... 69
7 METODOLOGIA RELACIONADA AO ARTIGO 3: AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO

DE microRNA EM SUJEITOS PEDIÁTRICOS COM TRANSTORNO DO ESPECTRO
AUTISTA ................................................................................................................................ 69
7.1 DELINEAMENTO DO ESTUDO ................................................................................. 69

7.2 AMOSTRA..................................................................................................................... 70
7.2.1 Critérios de Inclusão ............................................................................................. 70
7.2.2 Critérios de Exclusão ............................................................................................ 70
7.3 VARIÁVEIS EM ESTUDO ........................................................................................... 71
7.4 DESFECHO ESPERADO .............................................................................................. 71
7.5 LOCAL DE REALIZAÇÃO .......................................................................................... 71
7.6 LOGÍSTICA ................................................................................................................... 71
7.6.1 Coleta de saliva e análise de microRNA .............................................................. 72
7.7 ASPECTOS ESTATÍSTICOS........................................................................................ 73
7.7.1 Cálculo do tamanho da amostra .......................................................................... 74
7.7.2 Análise dos resultados ........................................................................................... 74
7.8 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS ........................................................................................ 74
8 REFERÊNCIAS .................................................................................................................. 75
9 ARTIGO 1 PORTUGUÊS .................................................................................................. 93
10 ARTIGO 1 INGLÊS ........................................................................................................ 140
11 ARTIGO 2 PORTUGUÊS .............................................................................................. 184
12 ARTIGO 2 INGLÊS ........................................................................................................ 204
13 ARTIGO 3 PORTUGUÊS ............................................................................................. 224
14 ARTIGO 3 INGLÊS ........................................................................................................ 234
15 CONSIDERAÇÕES FINAIS .........................................................................................244
APÊNDICES ......................................................................................................................... 246
APÊNDICE A – TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO –

VOLUNTÁRIOS PARA USO DE RESVERATROL. ...................................................... 246
APÊNDICE B – TERMO DE CONSENTIMENRO LIVRE E ESCLARECIDO –

AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE MICRORNA – CASOS. ....................................... 248
APÊNDICE C – TERMO DE CONSENTIMENRO LIVRE E ESCLARECIDO –

AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE MICRORNA - CONTROLES .............................. 250
ANEXOS ............................................................................................................................... 252

ANEXO A – Critérios diagnósticos para Transtorno do Espectro Autista segundo o DSM-5.
............................................................................................................................................ 252
ANEXO B – Escala Clinical Global Impression (CGI) ..................................................... 253
ANEXO C - Aberrant Behavior Checklist (ABC) ............................................................. 254

17
1 INTRODUÇÃO
O transtorno do espectro autista (TEA) é um distúrbio do desenvolvimento neurológico

de base biológica caracterizado por alterações em dois domínios comportamentais principais:
1) déficits na comunicação e interação sociais e 2) padrões restritos e repetitivos de
comportamento, interesses e atividades (ASSOCIATION, 2013).
O diagnóstico de TEA aumentou dramaticamente nas últimas décadas. O Centro de

Controle e Prevenção de Doenças dos Estados Unidos (Center for Disease Control and
Prevention - CDC) estimou em 2018 a prevalência de TEA em 16,8 por 1000 crianças (1 em
59) com idade de 8 anos, afetando 26,6/1000 meninos e 6,6/1000 meninas (BAIO et al., 2018).
Essa prevalência representa um aumento de aproximadamente 150% entre os anos 2000 e 2014
(BAIO et al., 2018). A expansão dos critérios diagnósticos pode explicar em parte esses valores,
mas não justifica todo o aumento registrado. Esses números evidenciam o TEA como uma das
desordens do neurodesenvolvimento mais frequentes, representando uma grande preocupação
em saúde pública (BAXTER et al., 2015; BRENTANI et al., 2013).
Um dos aspectos mais desconcertantes do TEA continua sendo sua etiologia. As

causas suspeitas do TEA são tão diversas quanto o próprio espectro, e presumivelmente
refletem o ambiente intrauterino, o início da vida da criança e herança genética
(TCHACONAS; ADESMAN, 2013). Evidências acumuladas até o momento sugerem que
fatores genéticos, ambientais, inflamatórios, imunológicos e metabólicos desempenham um
papel proeminente no distúrbio (BORIS et al., 2007; GHALEIHA et al., 2015).
A disfunção imunológica tem sido uma característica reconhecida TEA há várias

décadas e tem sido destacada em revisões recentes (CAREAGA; VAN DE WATER;
ASHWOOD, 2010; CHEZ; GUIDO-ESTRADA, 2010; GŁADYSZ; KRZYWDZIŃSKA;
HOZYASZ, 2018; GOTTFRIED et al., 2015; MASI et al., 2015, 2017; MCDOUGLE et al.,
2015; MEAD; ASHWOOD, 2015; NORIEGA; SAVELKOUL, 2014; VERKHRATSKY;
RODRÍGUEZ; PARPURA, 2014). Nos últimos anos, estudos em modelos animais e humanos
mostraram evidências de alterações no sistema imunológico central e periférico no TEA,
incluindo alterações na estimulação de células do sistema imunológico, geração de auto-
anticorpos, desequilíbrio de citocinas/quimiocinas e aumento da permeabilidade da barreira
hematoencefálica (CAREAGA; VAN DE WATER; ASHWOOD, 2010; CHEZ; GUIDO-
ESTRADA, 2010; GŁADYSZ; KRZYWDZIŃSKA; HOZYASZ, 2018; GOTTFRIED et al.,
18
2015; MASI et al., 2015, 2017; MCDOUGLE et al., 2015; MEAD; ASHWOOD, 2015;
NORIEGA; SAVELKOUL, 2014; VERKHRATSKY; RODRÍGUEZ; PARPURA, 2014).
Na ausência de um marcador biológico, o diagnóstico do autismo e a demarcação dos

seus limites permanecem uma decisão clínica (GADIA; TUCHMAN; ROTTA, 2004;
GOLDANI et al., 2014; SHARMA; GONDA; TARAZI, 2018). Numerosos biomarcadores têm
sido propostos para o TEA, incluindo marcadores bioquímicos, morfológicos, imunológicos,
hormonais, neurofisiológicos, neuroanatômicos e neuropsicológicos (AHMAD et al., 2017;
FULCERI et al., 2018; HEUNIS; ALDRICH; DE VRIES, 2016; INGA JÁCOME et al., 2016;
LI; KARNATH; XU, 2017; MASI et al., 2017; RUGGERI et al., 2014).
Os MicroRNA (miRNA) referem-se a um grupo de pequenos RNA não-codificantes

(CHEN; RAJEWSKY, 2007), com notável estabilidade e resistência à degradação
(KICHUKOVA et al., 2017), que podem atuar como reguladores de diversos processos. Os
miRNA estão envolvidos em múltiplos estágios do desenvolvimento do cérebro e manutenção
da função do sistema nervoso central (SNC) ao longo da idade adulta (BELZEAUX; LIN;
TURECKI, 2017; BLANDFORD; GALLOWAY; MOORE, 2018) além de resposta imunes
em condições patológicas e fisiológicas (SUN et al., 2018). O uso de perfis de miRNA como
biomarcadores para patologias do SNC tem recebido atenção significativa nos últimos anos
(BLANDFORD; GALLOWAY; MOORE, 2018; MELLIOS; SUR, 2012). Os biomarcadores
poderiam auxiliar no diagnóstico precoce, na mensuração de risco de desenvolvimento do
TEA, no prognóstico, na caracterização de subgrupos de pacientes e na definição de
subconjuntos de indivíduos que responderiam mais favoravelmente a tratamentos específicos
(ANDERSON, 2015; BELZEAUX; LIN; TURECKI, 2017; GOLDANI et al., 2014;
ZWAIGENBAUM; PENNER, 2018).
Atualmente, não existem medicamentos aprovados pela Food and Drug Administration
(FDA) para tratar os sintomas nucleares do autismo, sendo a farmacoterapia utilizada somente
para melhorar os sintomas associados ao transtorno, tais como hiperatividade, impulsividade,
desatenção, agressividade, irritabilidade e ansiedade (KAPLAN; MCCRACKEN, 2012;
LECLERC; EASLEY, 2015; MARCUS et al., 2009; MEAD; ASHWOOD, 2015; OWEN et
al., 2009; TCHACONAS; ADESMAN, 2013). Esses agentes, contudo, têm eficácia limitada e
desencadeiam importantes efeitos adversos (WINK et al., 2010). O tratamento com o
antipsicótico Risperidona por exemplo, aumenta o risco de sobrepeso e de obesidade
(HOEKSTRA et al., 2010).
19
Muitos pesquisadores sugerem a possibilidade de que a disfunção imune no TEA possa

ser caminho viável para a intervenção farmacológica, e um subgrupo de indivíduos com TEA
poderia se beneficiar de terapias de base imunológica. (CAREAGA; VAN DE WATER;
ASHWOOD, 2010; CHEZ; GUIDO-ESTRADA, 2010; ESTES; MCALLISTER, 2015;
GŁADYSZ; KRZYWDZIŃSKA; HOZYASZ, 2018; GOTTFRIED et al., 2015; LACIVITA et
al., 2017; MCDOUGLE et al., 2015; MEAD; ASHWOOD, 2015; MELTZER; VAN DE
WATER, 2017; NORIEGA; SAVELKOUL, 2014; VERKHRATSKY; RODRÍGUEZ;
PARPURA, 2014).
O Resveratrol (RSV) é uma molécula simples inicialmente isolada em extrato derivado

da planta Cassia quinquangulata (JANG et al., 1997) e apresenta capacidade de modulação da
resposta inflamatória. Estudos em animais têm indicado seu efeito neuroprotetor
(QUINCOZES-SANTOS; GOTTFRIED, 2011; VANG et al., 2011). No modelo animal de
autismo induzido por exposição pre-natal ao ácido valproico, o RSV preveniu sintomas
comportamentais típicos do TEA (BAMBINI-JUNIOR et al., 2014; FONTES-DUTRA et al.,
2018; HIRSCH et al., 2018). O seu papel antiinflamatório e antioxidante pode estar modulando
e prevenindo uma desregulação imune na prole desde o período gestacional (AHMAD et al.,
2018a, 2018b; BAKHEET et al., 2017; BHANDARI; KUHAD, 2017).
O prejuízo individual causado pelo TEA afeta várias faces do funcionamento diário e,
muitas vezes, impede a independência na vida adulta (MASI et al., 2017). O substancial efeito
econômico direto e indireto dos tratamentos e o sofrimento do indivíduo e de sua família
reforçam a necessidade da busca contínua por intervenções efetivas (BUESCHER et al., 2014;
KARST; VAN HECKE, 2012; MARCHEZAN et al., 2017; SMITH; GREENBERG;
MAILICK, 2014; WEISS et al., 2012).
Neste trabalho, foi realizada a administração resveratrol a sujeitos pediátricos com TEA
para avaliação de seus efeitos no comportamento, microRNA, além de sua tolerabilidade e
segurança. Adicionalmente, avaliou-se a expressão de microRNA na saliva de crianças com
TEA e controles.
20
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 TRANSTORNO DO ESPECTRO AUTISTA
2.1.1 Aspectos Históricos
A expressão “autismo” foi primeiramente utilizada em 1911 pelo psiquiatra suíço Eugen
Bleurer para designar a perda de contato com a realidade (“uma retirada definitiva do mundo
externo”), o que considerava um dos principais sintomas da esquizofrenia, termo também de
sua autoria (VERHOEFF, 2013). No entanto, foi o psiquiatra infantil Leo Kanner (KANNER,
1968), a partir de uma amostra de 11 crianças com condutas não esclarecidas por nenhum
sistema nosológico, quem descreveu pela primeira vez o autismo como uma síndrome
comportamental caracterizada por alterações na linguagem ou na comunicação, nos
relacionamentos sociais e na capacidade cognitiva (GREYDANUS; TOLEDO-PEREYRA,
2012). Kanner também observou respostas incomuns ao ambiente, que incluíam maneirismos
motores estereotipados, resistência a mudanças ou insistência na monotonia (KANNER, 1968).
Nas primeiras décadas após a descrição de Kanner, o interesse no autismo aumentou

gradualmente. Nesse período formaram-se linhas de trabalho focadas no potencial da
psicopatologia parental como causa do autismo. Algumas escolas propunham a hipótese de que
o autismo era uma reação psicológica a um distúrbio nas relações precoces, colocando a mãe
como núcleo etiológico da patologia e propondo tratamentos de cunho analítico (PARELLADA
et al., 2014). Houve também um forte movimento que indicava o transtorno como a primeira
manifestação na infância de psicose ou esquizofrenia. No entanto, diversas linhas de evidência
desafiaram esses pontos de vista. Em 1964 o trabalho pioneiro de Bernard Rimland, fundador
da Austim Society of America, centrou-se em novas abordagens para o diagnóstico e forneceu
um mecanismo neurobiológico hipotético para o autismo (GREYDANUS; TOLEDO-
PEREYRA, 2012). Já em 1972, estudos fenomenológicos realizados por Kolvin e Rutter
deixaram claro que o autismo era diferente da esquizofrenia em termos de início, características
clínicas e história familiar (KOLVIN, 1972; RUTTER, 1972). No final de 1970, os primeiros
estudos de gêmeos sugeriram uma forte base genética para a condição (VOLKMAR;
MCPARTLAND, 2014).
21
Em 1980 essas linhas convergentes de investigação levaram à inclusão do "Autismo

Infantil" como um diagnóstico oficialmente reconhecido no Diagnostic and Statistical Manual
of Mental Disorders, Third Edition (DSM-III) (VOLKMAR; MCPARTLAND, 2014). No ano
de 1987, o Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Third Edition-Revised
(DSM-III-R) instituiu critérios diagnósticos com uma perspectiva de desenvolvimento, e foram
estabelecidos dois diagnósticos, encampados sob o termo Transtornos Invasivos (ou Globais)
do Desenvolvimento: (1) Autismo; e (2) Transtorno Invasivo (ou Global) do Desenvolvimento
não especificado. Em 1994 o Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Fourth
Edition (DSM-IV), na tentativa de equilibrar a sensibilidade e especificidade da abordagem
diagnóstica, criou 5 subgrupos dentro dos Transtornos Invasivos do Desenvolvimento:
Autismo, Síndrome de Rett, Transtorno Desintegrativo da Infância, Transtorno Invasivo do
Desenvolvimento Não-Especificado e Síndrome de Asperger (GADIA; TUCHMAN; ROTTA,
2004; GOTTFRIED et al., 2015; TCHACONAS; ADESMAN, 2013). No início do ano de
2013, foi publicado nos Estados Unidos o Diagnostic and Statistical Manual of Mental
Disorders, Fifth Edition (DSM-5), que optou por juntar todos os subgrupos sob o termo comum
de TEA e classificá-los conforme a intensidade dos sintomas em leve, moderado e grave. O
DSM-5 excluiu do grupo o Transtorno de Rett e o Transtorno Desintegrativo da Infância por
serem distúrbios neurológicos com etiologia distinta (ASSOCIATION, 2013; VERHOEFF,
2013).
2.1.2 Aspectos epidemiológicos
Quando foi inicialmente descrito em 1942 (KANNER, 1968), o autismo era

mencionado como uma condição rara, afetando não mais que 4 crianças por 100.000. O
primeiro estudo epidemiológico sobre o autismo foi realizado apenas em 1966, por Victor
Lotter (BRENTANI et al., 2013). Nesse estudo, ele relatou uma prevalência de 4,5 em 10.000
em toda a população de crianças de 8 a 10 anos de Middlesex, um condado ao noroeste de
Londres.
A prevalência estimada na década de 1980-1990 era de 4-5/10.000 habitantes. Na

década 1990-2000, aumentou para 30-60/10.000. Atualmente, acredita-se que o TEA afete
cerca de 1% da população (SIMONOFF, 2012), e dados de estudos na Ásia, Europa e América
do Norte confirmam essa prevalência (NORIEGA; SAVELKOUL, 2014). Em 2018, o Center
22
for Disease Control and Prevention (CDC) estimou a prevalência de TEA em 16,8 por 1000
crianças (1 em 59) com idade de 8 anos, afetando 26,6/1000 meninos e 6,6/1000 meninas
(BAIO et al., 2018). Essa prevalência representa um aumento de aproximadamente 150% entre
os anos 2000 e 2014 (BAIO et al., 2018). A idade de 8 anos foi escolhida pelo CDC por ser o
pico de prevalência do transtorno.
Estudos epidemiológicos evidenciam uma maior incidência de autismo em meninos do

que em meninas, com proporções médias relatadas de 3,5 a 4,0 meninos para cada menina. Essa
preponderância ainda não é bem entendida, e fatores genéticos, epigenéticos, hormonais,
imunes e ambientais estariam implicados (BAIO et al., 2018; FERRI; ABEL; BRODKIN,
2018; SCHAAFSMA; PFAFF, 2014). A proporção do sexo masculino para feminino é ainda
mais acentuada em indivíduos com nível intelectual mais elevado, para cerca de 11:1
(GILLBERG et al., 2006).
Atualmente há mais diagnósticos de autismo em crianças a cada ano nos Estados Unidos
da América (EUA) do que AIDS, câncer e diabetes combinados (TCHACONAS; ADESMAN,
2013). A prevalência do TEA o torna uma das desordens do desenvolvimento neurológico mais
frequentes, representando uma grande preocupação de saúde pública (BRENTANI et al., 2013)
e levando a altos custos sociais e econômicos. O custo do suporte a um indivíduo com TEA e
deficiência mental durante a sua vida foi avaliada em 2,4 milhões de dólares nos EUA e 2,2
milhões de dólares no Reino Unido. Os maiores componentes dessas despesas na infância foram
os serviços de educação especial e perda de produtividade dos pais (BUESCHER et al., 2014).
Provavelmente o aumento da incidência do TEA seja devido à combinação de diferentes

fatores, principalmente ao aumento do reconhecimento da patologia e à detecção precoce por
pediatras e professores, além da ampliação do conceito de autismo com inclusão de fenótipos
mais diversos. Nesse último se inclui a ''aposição de diagnósticos”, em que pacientes com outros
diagnósticos prévios, como retardo mental, adicionalmente possuem critérios para também
receber o diagnóstico de autismo. Outros fatores como idade materna e paterna avançada e o
potencial efeito de toxinas ambientais estão sob investigação (PARELLADA et al., 2014).
2.1.3 Manifestações clínicas e diagnóstico

23
O TEA é um distúrbio que se manifesta por uma grande variedade de sintomas nas áreas
cognitiva, emocional e neurocomportamental. Apesar das características que o compõem serem
bem definidas, a grande heterogeneidade dos achados em cada indivíduo torna o seu
reconhecimento desafiador. O transtorno engloba fenótipos extremamente heterogêneos,
principalmente nos casos mais brandos do espectro, e a gravidade dos déficits centrais varia
grandemente entre os pacientes (JOHNSON; MYERS; AMERICAN ACADEMY OF
PEDIATRICS COUNCIL ON CHILDREN WITH DISABILITIES, 2007; SHARMA;
GONDA; TARAZI, 2018; STANKOVIC; LAKIC; ILIC, 2012).
Os principais sintomas do espectro são déficits de interação social, déficits de

comunicação e padrões restritos e repetitivos de comportamento, interesses e atividades; juntos,
constituem a conhecida tríade diagnóstica de Wing. Embora esses sintomas possam ocorrer em
uma variedade de transtornos psiquiátricos, é a junção deles em um mesmo indivíduo que torna
o TEA único. Os sintomas também variam com a idade. Durante a infância, as crianças com
autismo costumam apresentar mais déficits de linguagem e agitação. Já na adolescência, os
sintomas mais importantes podem ser os problemas de relacionamento e de modulação do
humor (NAZEER; GHAZIUDDIN, 2012; SHARMA; GONDA; TARAZI, 2018).
Os pacientes com TEA também apresentam déficits no funcionamento executivo e na

capacidade mental de resolver problemas, além de dificuldade de integrar informações para
produção de um significado. Alterações no processamento sensorial são frequentes. Essas
crianças e adolescentes podem apresentar tanto hipo quanto hipersensibilidade a estímulos
sensoriais de uma mesma modalidade ou em múltiplos domínios sensoriais (visual, auditivo,
olfativo, palatal e tátil) (ASSOCIATION, 2013; OLIVIÉ, 2012).
Hiperatividade, auto e heteroagressividade ocorrem em mais da metade dessas crianças.

Comportamentos auto-agressivos são mais comuns entre pacientes com deficiência cognitiva,
e os gatilhos para esses comportamentos podem ser previsíveis (frustração, ansiedade,
excitação) ou aparentemente aleatórias. A falta de compreensão ou a incapacidade de se
comunicar, ou a frustração total, podem levar a explosões de agressividade (KLIN, 2006).
Na ausência de um marcador biológico, o diagnóstico do autismo e a demarcação dos

seus limites permanecem uma decisão clínica (GADIA; TUCHMAN; ROTTA, 2004;
GOLDANI et al., 2014; SHARMA; GONDA; TARAZI, 2018). Instrumentos e escalas são
frequentemente utilizados para auxílio diagnóstico do transtorno, e esses instrumentos de
avaliação incluem entrevistas com pais/cuidadores, entrevistas com pacientes, observação
24
direta de pacientes e avaliações que englobam uma revisão completa da história familiar para
TEA ou outros distúrbios do neurodesenvolvimento (SHARMA; GONDA; TARAZI, 2018).
No DSM-5, "Transtorno do Espectro Autista" é o termo que substitui todas as

subclassificações anteriormente utilizados no DSM IV-TR. A eliminação de transtorno de
Asperger no DSM-5 tem sido compreensivelmente controverso, com dados na literatura que
prestam serviços a retirada e também à manutenção do subtipo categórico (KING et al., 2014).
O diagnóstico precoce alivia as preocupações prolongadas de muitas famílias e acelera
oportunidades de beneficiar a criança com intervenções especializadas (ANAGNOSTOU et al.,
2014). Os critérios diagnósticos conforme o DSM-5 encontram-se no Anexo A.
Numerosos biomarcadores têm sido propostos para o TEA, incluindo marcadores

bioquímicos, morfológicos, imunológicos, hormonais, neurofisiológicos, neuroanatômicos e
neuropsicológicos (AHMAD et al., 2017; FULCERI et al., 2018; HEUNIS; ALDRICH; DE
VRIES, 2016; INGA JÁCOME et al., 2016; LI; KARNATH; XU, 2017; MASI et al., 2017;
RUGGERI et al., 2014). O termo "biomarcador" tem sido definido como uma medida biológica
que difere entre os grupos ou está associado a algum aspecto de uma condição (ANDERSON,
2015; ZWAIGENBAUM; PENNER, 2018). Os biomarcadores poderiam auxiliar no
diagnóstico precoce, na mensuração de risco de desenvolvimento do TEA, no prognóstico, na
caracterização de subgrupos de pacientes e na definição de subconjuntos de indivíduos que
responderiam mais favoravelmente a tratamentos específicos (ANDERSON, 2015; GOLDANI
et al., 2014; ZWAIGENBAUM; PENNER, 2018).
2.1.4 Etiologia e Neurobiologia
Embora várias definições e avanços tenham sido feitos em relação ao TEA, os aspectos
etiológicos permanecem obscuros (EISSA et al., 2018). A verdade inegável, quando se olha
para todas as teorias atuais sobre a causa do TEA, é que "é tempo para desistir de uma única
explicação para o autismo” (HAPPÉ; RONALD; PLOMIN, 2006). O número crescente de
publicações, especialmente na última década, não deixa dúvidas quanto ao aspecto multifatorial
do espectro e indica uma interação complexa entre fatores genéticos/ambientais e fatores do
sistema imunológico (GOTTFRIED et al., 2015).
25
O papel da genética é fortemente sugerido pelo risco 15 a 20 vezes maior de recorrência

em irmãos de crianças afetadas em comparação com a população geral e por 60 a 90% de
concordância em gêmeos monozigóticos contra 10% em gêmeos dizigóticos (LEVY;
MANDELL; SCHULTZ, 2009). A diferença entre as taxas de concordância entre
monozigóticos e dizigóticos sugere interações entre os fatores de risco (gene-gene ou gene-
ambiente), que poderiam resultar de fatores tóxicos ambientais ou epigenéticos que alterariam
o funcionamento do gene (LEVY; MANDELL; SCHULTZ, 2009). Estudos têm implicado
várias regiões cromossômicas para a presença de loci de susceptibilidade. Como o autismo não
é uma entidade clínica única, pode ser visto como uma manifestação comportamental de
dezenas ou talvez centenas de distúrbios genéticos. Estima-se que existam mais de 500 loci
genéticos distintos que podem ser relacionados com TEA (GOLDANI et al., 2014;
TCHACONAS; ADESMAN, 2013). Uma grande variedade de mecanismos genéticos pode
estar envolvida, como desordens genéticas únicas, anormalidades cromossômicas e variação no
número de cópias (CNV). Esses diferentes mecanismos resultam em variados riscos de
herdabilidade (OLIVIÉ, 2012).
A associação entre TEA e síndromes genéticas está bem estabelecida. Cerca de 3% dos
pacientes com TEA tem Síndrome do X-Frágil (LEVY; MANDELL; SCHULTZ, 2009), e
aproximadamente um terço desses indivíduos tem autismo (SCHAEFER; MENDELSOHN;
PROFESSIONAL PRACTICE AND GUIDELINES COMMITTEE, 2013). Outras síndromes
e doenças genéticas estão associadas ao TEA são:, tais como: Síndrome do X Frágil, Síndrome
de Cohen, Síndrome de Joubert, Síndrome de Smith– Magenis, Síndrome de Smith-Lemli-
Opitz, Deficiência de Adenil-succinato liase, Neurofibromatose, Síndrome de San Filippo,
Esclerose Tuberosa, Deleção do 22q.11, Deficiência de Creatina, Síndrome de Angelman,
Fenilcetonúria, Síndrome de Down, Distrofia Muscular de Duchenne, Síndrome de CHARGE,
Síndrome de Lange, Síndrome de Prader-Willi, Síndrome de Sotos, Síndrome de Cowden,
Síndrome de Bannayan–Riley–Ruvalcaba (COHEN et al., 2005; SCHAEFER;
MENDELSOHN; PROFESSIONAL PRACTICE AND GUIDELINES COMMITTEE, 2013).
Juntas, elas correspondem a 10% de todos os casos (COHEN et al., 2005; MEFFORD;
BATSHAW; HOFFMAN, 2012; OLIVIÉ, 2012).
Até o momento, poucas causas não genéticas são reconhecidas no TEA, como encefalite
herpética, infecções congênitas (ex. embriopatia por rubéola e citomegalovírus), síndrome
alcoólico-fetal e exposição pré-natal ao ácido valpróico (VPA) (MUHLE; TRENTACOSTE;
RAPIN, 2004; OLIVIÉ, 2012). Alguns estudos sugerem que a exposição intra-útero à
26
talidomida e ao misoprostol também seriam fatores de risco para autismo (MILES, 2011;
MUHLE; TRENTACOSTE; RAPIN, 2004). Uma metanálise com 40 estudos de fatores de
risco perinatais e neonatais para o autismo encontrou pouca evidência para implicar um único
fator na etiologia do TEA; no entanto, sugere que a exposição a várias complicações neonatais
poderia aumentar o risco de desenvolver o transtorno. Dentre as mais fortemente associadas
estão a apresentação anormal, as complicações do cordão umbilical, o sofrimento fetal, a lesão
ou trauma do nascimento, o nascimento múltiplo, a hemorragia materna, o nascimento no
verão, o baixo peso ao nascimento, ser pequeno para a idade gestacional, malformação
congênita, o Apgar baixo no quinto minuto, dificuldade de alimentação, aspiração de mecônio,
a anemia neonatal, a incompatibilidade ABO ou Rh e a hiperbilirrubinemia (GARDENER;
SPIEGELMAN; BUKA, 2011). Outra metanálise do mesmo grupo com fatores de risco pré-
natais sugere que a idade avançada dos pais, o uso materno de medicação pré-natal, o
sangramento na gestação, o diabetes gestacional, a ordem de nascimento (ser o primeiro ou o
terceiro filho em diante) e ter uma mãe imigrante (GARDENER; SPIEGELMAN; BUKA,
2009) estariam associados ao aumento do risco para desenvolver o TEA. Num estudo de coorte
retrospectivo avaliando 95 mil crianças, a vacina tríplice viral (sarampo, caxumba e rubéola)
não foi associada com um risco aumentado de TEA, mesmo em crianças com irmãos mais
velhos com autismo (JAIN et al., 2015). Estudos têm evidenciado que o aumento da idade
materna é um fator de risco para o transtorno, tanto independentemente quanto em combinação
com o aumento da idade paterna (KONG et al., 2012; SANDIN et al., 2012).
Devido à grande heterogeneidade na forma como o TEA se expressa, não é surpresa

que tentativas de identificar uma teoria explicativa única para o autismo tenham sido
fracassadas (LEVY; MANDELL; SCHULTZ, 2009). Várias anormalidades neuroanatômicas
foram identificadas em estruturas cerebrais e circuitos neuronais, como o cerebelo, o sistema
límbico, o corpo caloso e o córtex cerebral (MEAD; ASHWOOD, 2015). Os estudos
descobriram, por exemplo, o aumento do tamanho do cérebro em períodos precoces
determinando um aumento da circunferência da cabeça (AMARAL; SCHUMANN;
NORDAHL, 2008; COURCHESNE et al., 2001), aumento anormal da amígdala (AMARAL;
SCHUMANN; NORDAHL, 2008; BREECE et al., 2013) e substância branca aberrante em
regiões do cérebro implicadas na cognição social (MINSHEW; WILLIAMS, 2007).
Embora um consenso sobre aspectos estruturais e funcionais anormais no TEA
permaneça difícil, uma série de estudos sobre esses tópicos reúnem dados importantes, e várias
anormalidades foram identificadas, incluindo defeitos sutis na arquitetura cortical,
27
possivelmente causados pela perturbação da remodelação ocorrida num período crítico da

formação da rede neural. Tais mudanças levam a defeitos de substância branca e problemas de
conectividade (GOTTFRIED et al., 2015).
A disfunção imunológica tem sido uma característica reconhecida nos distúrbios do

espectro do há várias décadas (CAREAGA; VAN DE WATER; ASHWOOD, 2010; CHEZ;
GUIDO-ESTRADA, 2010; GŁADYSZ; KRZYWDZIŃSKA; HOZYASZ, 2018;
GOTTFRIED et al., 2015; MASI et al., 2015, 2017; MCDOUGLE et al., 2015; MEAD;
ASHWOOD, 2015; NORIEGA; SAVELKOUL, 2014; VERKHRATSKY; RODRÍGUEZ;
PARPURA, 2014) e será abordada mais detalhadamente no tópico “TEA e o Sistema
Imunológico”.
2.1.5 Tratamento
Apesar do avanço no diagnóstico precoce e nas intervenções, nenhum tratamento

disponível até o momento é capaz de reverter completamente os principais sintomas do TEA
(BENVENUTO et al., 2013; GOEL et al., 2018; ROSSIGNOL, 2009). Terapia educacional
com foco no comportamento, comunicação e habilidades adaptativas continua sendo o pilar do
tratamento para o TEA. Apesar da inexistência de medicamentos para o tratamento específico
do autismo, os fármacos são muitas vezes úteis no alívio de diferentes sintomas associados ao
transtorno, incluindo hiperatividade e irritabilidade. Uma gama de terapias alternativas existe,
embora tenham pouco embasamento científico para apoiar sua utilização (TCHACONAS;
ADESMAN, 2013).
2.1.5.1 Tratamento não farmacológico
Existem muitas abordagens terapêuticas disponíveis para o autismo, incluindo

intervenções educativas, análise comportamental aplicada, ensino estruturado, intervenção
parental-mediada, terapias de fala e linguagem e terapias para habilidades sociais. Grande parte
das crianças com autismo são tratadas com combinações dessas terapias. Infelizmente, os
estudos sobre a eficácia da maioria dessas intervenções têm problemas metodológicos
importantes, o que resulta na falta de provas para apoiar recomendações em diretrizes clínicas
28
sobre autismo (AL-QABANDI; GORTER; ROSENBAUM, 2011). Existem evidências de que

maior intensidade do tratamento não farmacológico (horas por semana) e uma maior duração
(em meses) leva a melhores resultados. Crianças com TEA devem ter acesso a pelo menos
25 horas por semana de intervenção abrangente para desenvolver a comunicação e a
linguagem, melhorar habilidades sociais e reduzir comportamento desajustado
(MAGLIONE et al., 2012). Dentre os modelos de terapia intervencionista encontram-se o
Applied Behavior Analysis (ABA), Treatment and Educational of Autistic and Related
Communication- Handicapped Children (TEACCH) e Developmental Individual Difference
Relations-Ship-Based Approach (Floortime) (WARREN et al., 2011). Atualmente os
programas de intervenção baseados no ABA são vistos como primeira linha para o tratamento
de TEA na infância (BRENTANI et al., 2013). Nas terapias comportamentais não
intervencionistas destaca-se o método Picture Exchange Communication System (PECS), que
é um sistema de comunicação funcional, utilizando figuras (GANZ et al., 2012), assim como a
musicoterapia (GOTTFRIED et al., 2018; KIM; WIGRAM; GOLD, 2008).
2.1.5.2 Tratamento farmacológico
Atualmente não existem medicamentos disponíveis para tratar os déficits de

comunicação e interação social do autismo, embora esse seja um assunto de intensos esforços
de investigação. Apesar dos diferentes níveis de suporte empírico para os medicamentos
direcionados, o tratamento medicamentoso de crianças e adultos com TEA é prática clínica
comum. Em torno de 45-75% das crianças com TEA são medicadas com drogas psicotrópicas
(BRENTANI et al., 2013; EISSA et al., 2018). Intervenções farmacológicas incluem diferentes
classes de drogas, incluindo psicoestimulantes, antipsicóticos atípicos, antidepressivos,
agonista alfa-2 adrenérgicos, inibidores da colinesterase, antagonistas do receptor NMDA e
anticonvulsivantes estabilizadores do humor (EISSA et al., 2018; SHARMA; GONDA;
TARAZI, 2018). A maioria da utilização de psicofármacos em TEA é off-label, existindo
atualmente apenas dois medicamentos (risperidona e aripiprazol) aprovados pelo FDA (GOEL
et al., 2018; KAPLAN; MCCRACKEN, 2012). É importante ressaltar que risperidona e
aripiprazol estão associados a eventos metabólicos adversos, como ganho de peso, dislipidemia
e hiperglicemia (YOUNG; FINDLING, 2015).
29
2.1.6 Prognóstico
Dados recentes sugerem que os resultados das intervenções em crianças com TEA
podem ser altamente variáveis. Crianças com autismo podem diferir consideravelmente no
início e no acompanhamento da patologia, não apenas em termos de gravidade, mas também
no que diz respeito a deficiências de desenvolvimento associados, condições médicas e
comorbidade psiquiátrica (TCHACONAS; ADESMAN, 2013). Os mais importantes fatores
determinantes de prognóstico parecem ser os testes de funcionamento intelectual realizados na
infância e escores de QI.(HOWLIN et al., 2004; HOWLIN; MAWHOOD; RUTTER, 2000). O
desfecho também parece ser pior naqueles que falham em adquirir linguagem funcional até a
idade de 5-6 anos (BRENTANI et al., 2013; HOWLIN et al., 2004).
O nível socioeconômico está implicado como um fator significativo para o melhor

desenvolvimento, pois engloba variáveis do ambiente como a tipo de casa e bairro, além da
qualidade de tratamento, educação e o acesso a serviços e a intervenções precoces
(TCHACONAS; ADESMAN, 2013). Infelizmente, apenas uma pequena minoria de indivíduos
com TEA consegue trabalhar, viver de forma independente e desenvolver relacionamentos
sociais significativos. A maioria permanece muito dependente do suporte dos pais ou de outros
cuidadores. Poucos se casam e a maioria estuda em classes especiais (HOWLIN et al., 2004).
2.2 TEA E O SISTEMA IMUNOLÓGICO
A interação envolvendo os sistemas nervoso e imune engloba um caminho complexo e

intrincado de sinais com extensa comunicação entre eles, tanto na saúde quanto na doença
(GOTTFRIED et al., 2015). Durante muito tempo pensou-se que o cérebro fosse
“imunologicamente privilegiado”, sendo isolado da influência do sistema imunológico pela
barreira hematoencefálica (BHE), com apenas a micróglia fornecendo funções imunes dentro
do cérebro. A micróglia é um conjunto de células imunes inatas residentes do sistema nervoso
central (SNC), que desempenham papéis vitais na manutenção e desenvolvimento neuronal
(MEAD; ASHWOOD, 2015). Ela fagocita neurônios apoptóticos, modulando inflamação
(TIAN et al., 2012). Também regula a formação de sinapses e plasticidade por fagocitose de
30
sinapses opsonizadas com componentes do complemento (STREIT, 2001). A redução da

fagocitose resulta no acúmulo de detritos celulares e tem efeitos nocivos nos neurônios
circundantes, o que pode desempenhar um papel nas doenças neurodegenerativas e desordens
do desenvolvimento (SCHWARTZ et al., 2013).
De fato, grande parte da interação entre os neurônios e as células do sistema

imunológico ocorre na periferia e, quando ocorre no SNC, geralmente ocorre em consequência
de uma quebra na BHE. No entanto, novas evidências sugerem que o sistema imunológico
periférico pode desempenhar um papel no funcionamento neuronal (MEAD; ASHWOOD,
2015). Por exemplo, num estudo em que o sistema imune adaptativo foi depletado em
camundongos, foi observada uma redução na cognição desses animais, e esse fenômeno foi
revertido após células T autólogas serem injetadas, indicando uma importância das células T
além de seu papel imunológico (BRYNSKIKH et al., 2008). Um caminho de comunicação
alternativo entre o SNC e o sistema imune periférico foi recentemente proposto com base no
trabalho inovador de Louveau et al., que identificou vasos linfáticos funcionais no SNC que
transportam fluidos e células imunológicas do líquido cerebrospinal (LOUVEAU et al., 2015;
MASI et al., 2017).
As citocinas, moléculas que estão ligadas à comunicação entre as células imunes,

desempenham um papel importante no neurodesenvolvimento, especialmente as citocinas pró-
inflamatórias (MEAD; ASHWOOD, 2015). A interleucina 1 (IL-1) está envolvida na
manutenção da potenciação a longo prazo, um correlato experimental de formação de memória,
bem como na indução e inibição específicas da proliferação de células progenitoras neurais. A
desregulação na expressão de IL-1 gera comprometimento na memória e na aprendizagem. Já
IL-6 e seus receptores são expressos no cérebro, e essa expressão aumenta durante uma resposta
inflamatória (MEAD; ASHWOOD, 2015). De fato, as citocinas, como fator de necrose tumoral
alfa (TNF-α), IL-1β, IL-6 e fator de transformação do crescimento beta (TGF-β), são capazes
de modular a atividade neuronal (ONORE; CAREAGA; ASHWOOD, 2012), e a IL-6 promove
a sobrevivência dos oligodendrócitos (VITKOVIC et al., 2000). Citocinas pró-inflamatórias,
incluindo IL-1, IL-6, IL-12, interferon gama (IFN-γ) e TNF-α, estão envolvidas nos efeitos
pleiotrópicos do SNC durante o neurodesenvolvimento (THEOHARIDES et al., 2016).
A literatura identifica perfis anormais de citocinas em depressão, transtorno bipolar e

esquizofrenia (MASI et al., 2017), sugerindo coletivamente que as citocinas induzem tanto
alterações no comportamento como sintomas neuropsiquiátricos, e que inflamação é um fator-
chave fundamental na psicopatologia (CAPURON; CASTANON, 2016). Além disso, uma
31
revisão sistemática avaliando marcadores pró-inflamatórios em quase 4.000 crianças e

adolescentes com distúrbios do neurodesenvolvimento e neuropsiquiátricos, incluindo TEA,
identificou evidências preliminares do papel da inflamação nessas condições e uma associação
com um estado pró-inflamatório (MITCHELL; GOLDSTEIN, 2014).
A natureza multifacetada do autismo resultou em investigações com o objetivo de

caracterizar subtipos de TEA, e uma compreensão dos mecanismos biológicos que conduzem
sua fisiopatologia está em evolução. O acúmulo de evidências de alterações no funcionamento
do sistema imunológico central e periférico apoia a proposta de que há um subgrupo de
indivíduos com TEA que têm alguma forma de desregulação do sistema imunológico (MASI
et al., 2017). Na tabela 1, encontram-se algumas alterações no sistema imune periférico
observadas em pacientes com TEA em relação a controles saudáveis.
A primeira sugestão de uma ligação entre o sistema imunológico e TEA ocorreu em

1976, quando um estudo descobriu que 5 de 13 crianças autistas tinham títulos de anticorpos
indetectáveis após vacinação para rubéola, enquanto todos os indivíduos de controle tinham
títulos detectáveis (GŁADYSZ; KRZYWDZIŃSKA; HOZYASZ, 2018; STUBBS, 1976). Já
em 1977, o mesmo autor observou que a resposta de linfócitos à estimulação com o mitógeno
fitohemaglutinina mostrou ser diferente entre crianças com TEA e controles (STUBBS;
CRAWFORD, 1977). Nas últimas décadas, estudos em modelos animais e humanos mostraram
evidências crescentes de alterações no sistema imunológico central e periférico no TEA
(CAREAGA; VAN DE WATER; ASHWOOD, 2010; CHEZ; GUIDO-ESTRADA, 2010;
GŁADYSZ; KRZYWDZIŃSKA; HOZYASZ, 2018; GOTTFRIED et al., 2015; MASI et al.,
2015, 2017; MCDOUGLE et al., 2015; MEAD; ASHWOOD, 2015; NORIEGA;
SAVELKOUL, 2014; VERKHRATSKY; RODRÍGUEZ; PARPURA, 2014).
Muitos estudos também demonstraram uma correlação entre o intensidade de sintomas

autistas e os níveis de citocinas (AL-AYADHI, 2005; AL-AYADHI; MOSTAFA, 2012, 2013,
ASHWOOD et al., 2008, 2011a, 2011b; CAREAGA et al., 2017; EL-ANSARY et al., 2016;
EL GOHARY et al., 2015; ENSTROM et al., 2008; FERGUSON et al., 2016; HAN et al.,
2017; JYONOUCHI et al., 2005; JYONOUCHI; GENG; DAVIDOW, 2014; MAKINODAN
et al., 2017; NAPOLIONI et al., 2013; RICCI et al., 2013; ROSE; VAN DE WATER;
ASHWOOD, 2016; YANG et al., 2015), níveis de imunoglobulina (IgM e IgG) (ENSTROM
et al., 2009; HEUER et al., 2008), de auto-anticorpos reativos para tecido neural (GOINES et
al., 2011; MOSTAFA; AL-AYADHI, 2012; PIRAS et al., 2014), e auto-anticorpos maternos
(BRAUNSCHWEIG et al., 2012; PIRAS et al., 2014). Um resumo encontra-se na Tabela 2.
32
Tabela 1 - Achados pós-natais no sistema imune periférico de crianças com TEA.

Os resultados estão listados como diferenças significativas observadas em crianças com
TEA em comparação com os controles.
Achados no sistema imune de pacientes com TEA

Resposta linfocitária alterada a estímulo com fitohemaglutinina
Plasma contendo auto-anticorpos que se ligam a proteínas encontradas em cortes de tálamo e
hipotálamo de cérebros humanos adultos
Níveis plasmáticos aumentados de IgG4
Níveis séricos aumentados de IgG total, IgG2 e IgG4
Níveis plasmáticos reduzidos de IgG total
Níveis plasmáticos aumentados de IL-1β, IL-6, IL12p40 e IL-8
Níveis séricos aumentados de IL-1β, IL-6, IL-23, IL-12, TNF-α e BDNF
Aumento no número total de monócitos no sangue periférico (não confirmado em estudo
subsequente).
Monócitos produzem níveis maiores de neopterina após estímulo com IFN-
Monócitos do sangue periférico produzem níveis mais altos de IL-1β após estímulo com
lipopolisacarídeo
Frequência aumentada de monócitos expressando HLA-DR em culturas não estimuladas e após
estímulo com ácido lipoteicoico
Expressão aumentada de CD95 em linfócitos de sangue periférico
Aumento no número total de células NK CD56+, células B CD20+ e células B CD38+
Expressão aumentada de HLA-DR em células T
Aumento de CD26 em células T CD8+
Aumento de níveis plasmáticos de IFN- e IL-12
Níveis aumentados de IFN- e IL-1Ra em sobrenadante de cultura não estimulada de PBMCs
Número reduzido de células T CD3GITS+ em cultura não estimulada
Proporções reduzidas de células T CD4+ e CD8+ IFN-+ e IL-2+ e proporções aumentadas de
células T CD4+ e CD8+ IL-4+ em PBMCs estimuladas com acetato miristato de forbol e
ionomicina
Número aumentado de células T CD4+ produtoras de IFN- em PBMCs estimulados com SEB
e anti-CD28
Up-regulation de genes relacionados a células NK, como perforina e granzima B
Níveis aumentados de IFN- em células NK não estimuladas
Razão mais baixa de células T CD4+/CD8+ em sangue periférico
Número inalterado de células B
Níveis similares de IL-17
Níveis plasmáticos reduzidos de TGF-β
Número reduzido de células T IL-10+ CD-3+ em sangue periférico e mucosa
Níveis plasmáticos elevados de MCP-1, CCL5 e eotaxina
Níveis séricos elevados de MDC e TARC
Expressão diferenciada de genes associados a rotas de citotoxicidade por células NK
TEA: transtorno do espectro autista; IgG: imunoglobulina; IL: interleucina; TNF: fator de necrose tumoral; BDNF:
fator neurotrófico derivado do cérebro; IFN: interferon; NK: natural killer; PBMC: célula mononuclear de sangue
periférico; SEB: enterotoxina B estafilocócica; TGF: fator de transformação do crescimento; MCP: proteína de
quimioatração de monócitos; CCL5: quimiocina CC ligante 5; MDC: quimiocina derivada de macrófago; TARC:
quimiocina tímica regulada pela ativação. Adaptado de (MEAD; ASHWOOD, 2015).
Muitos estudos também demonstraram uma correlação entre o intensidade de sintomas

autistas e os níveis de citocinas (AL-AYADHI, 2005; AL-AYADHI; MOSTAFA, 2012, 2013,
ASHWOOD et al., 2008, 2011a, 2011b; CAREAGA et al., 2017; EL-ANSARY et al., 2016;
33
EL GOHARY et al., 2015; ENSTROM et al., 2008; FERGUSON et al., 2016; HAN et al.,
2017; JYONOUCHI et al., 2005; JYONOUCHI; GENG; DAVIDOW, 2014; MAKINODAN
et al., 2017; NAPOLIONI et al., 2013; RICCI et al., 2013; ROSE; VAN DE WATER;
ASHWOOD, 2016; YANG et al., 2015), níveis de imunoglobulina (IgM e IgG) (ENSTROM
et al., 2009; HEUER et al., 2008), de auto-anticorpos reativos para tecido neural (GOINES et
al., 2011; MOSTAFA; AL-AYADHI, 2012; PIRAS et al., 2014), e auto-anticorpos maternos
(BRAUNSCHWEIG et al., 2012; PIRAS et al., 2014). Um resumo encontra-se na Tabela 2.
Tabela 2 - Citocinas e associação com severidade dos sintomas relacionados ao TEA. Citocinas
dosadas no plasma e suas associações com severidade de sintomas relacionados ao autismo.
Citocina n (TEA) Medidas Achados Referência

Níveis reduzidos associados a menor
ABC, comportamento adaptativo e piores (ASHWOOD
TGF-β1 75
VABS sintomas comportamentais et al., 2008)
Níveis aumentados associados a maior

letargia, estereotipia e hiperatividade
(ABC)

prejuízo de recepção visual,
ABC,
motricidade fina e linguagem receptiva (ASHWOOD
Eotaxina 80 MSEL,
e expressiva (MSEL) et al., 2011a)
VABS
Níveis aumentados associados a
maiores prejuízos em comunicação,
habilidades da vida diária, socialização
e habilidades motoras (VABS)

prejuízo de recepção visual,
motricidade fina e linguagem
ABC, expressiva (MSEL)
(ASHWOOD
MCP-1 80 MSEL,
et al., 2011a)
VABS Níveis aumentados associados a
maiores prejuízos em habilidades da
vida diária (VABS)

(ABC)
ABC,
(ASHWOOD
CCL5 80 MSEL, Níveis aumentados associados a maior
et al., 2011a)
VABS prejuízo de recepção visual,
motricidade fina e linguagem
expressiva (MSEL)
34
Níveis aumentados associados a

maiores prejuízos em comunicação e
socialização (VABS)
ADI-R,
ABC, (ASHWOOD
IL-1β 97 estereotipia (ABC)
MSEL, et al., 2011b)
VABS
ADI-R, Níveis aumentados associados a maior
ABC, prejuízo em comunicação não-verbal (ASHWOOD
IL-4 97
MSEL, (ADI-R) et al., 2011b)
VABS
ADI-R,
ABC, (ASHWOOD
IL-6 97 estereotipia (ABC)
VABS
ADI-R, (ABC)
ABC, (ASHWOOD
IL-8 97
MSEL, Níveis reduzidos associados a melhor et al., 2011b)
VABS recepção visual e linguagem receptiva
e expressiva (MSEL)
Níveis reduzidos associados a

melhores habilidades da vida diária
(VABS)
ADI-R,
ABC, (ASHWOOD
IL-12p40 97 estereotipia e letargia (ABC)
VABS
Níveis reduzidos associados a maior (EL GOHARY
TGF-β1 30 CARS
severidade et al., 2015)
TEA: transtorno do espectro autista; TGF: fator de transformação do crescimento; MCP: proteína de quimioatração
de monócitos; CCL5: quimiocina CC ligante 5; IL: interleucina; ABC: Aberrant Behavior Checklist; VABS:
Vineland Adaptive Behavior Scales; MSEL: Mullen Scales of Early Learning; ADI-R: Autism Diagnostic
Interview-Revised. Adaptado de (MASI et al., 2017)
Algumas das muitas mutações genéticas associadas com o TEA ocorrem em genes que
estão envolvidos no sistema imunológico ou têm duplo papel nos sistemas nervoso e
imunológico, apoiando a ideia de que o sistema imune desempenha um papel no
desenvolvimento do TEA (MEAD; ASHWOOD, 2015). Alguns desses genes estão listados na
Tabela 3. Por exemplo, o risco de TEA foi associado a uma variante genética na região
promotora do receptor de tirosina quinase do MET, que contribui para o desenvolvimento do
córtex cerebral e do cerebelo, e também serve para regular a função e tolerância imunológica
(CAMPBELL et al., 2006). Uma associação entre alguns alelos do antígeno leucocitário
humano (HLA) e doenças autoimunes tem sido estabelecido. Vários estudos revelaram ligações
35
entre HLA e TEA, com crianças com autismo apresentando maior frequência do alelo HLA-
DRB1*11 e menor frequência do alelo HLA-DRB1*03, além de aumento do risco de TEA em
filhos de mãe HLA-DR4 (GŁADYSZ; KRZYWDZIŃSKA; HOZYASZ, 2018).
Tabela 3 - Genes alterados em TEA e correlacionados com função imune.
Gene Função
JARID2 Repressor transcricional que regula a hematopoese
TPO Enzima que produz hormônios tireoidianos
Promove diferenciação e proliferação de células hematopoiéticas e exerce
MET
amplos efeitos anti-inflamatórios
Medeia ativação de células B, migração de células T, função celular de
PRKCB
apresentação de antígenos e liberação de citocinas
Expresso em todas as células nucleadas para identificá-las como “próprias” às
HLA-A2 células do sistema imune; regula resposta imune celular a patógenos
intracelulares
HLA-DRB1 Inicia respostas imunes celulares a patógenos extracelulares
HLA-DRB4 Apresenta peptídeos derivados de proteínas extracelulares
Proteína da cascata do complemento envolvida na remoção de patógenos e
C4B
debris celulares
PTEN Afeta a diferenciação e função da célula T reguladora
TSC1 Promove aumento de interleucina-12 e conversão de macrófagos M2
TSC2 Regula a resposta imunológica inata

MIF Guia e controla a resposta imune
Adaptado de (GOTTFRIED et al., 2015; OHJA et al., 2018)
A presença de auto-anticorpos maternos dirigidos contra as proteínas do cérebro fetal

sustenta a importância das respostas imunes maternas no TEA. Em condições normais, os
anticorpos IgG maternos são capazes de atravessar a placenta e fornecer a transferência de
anticorpos protetores da mãe para o feto. No entanto, assim como anticorpos protetores,
anticorpos nocivos que se ligam a proteínas próprias também podem ser transferidos. Esses
anticorpos apresentam níveis detectáveis na circulação fetal com 18 semanas de gestação e
persistem em altas concentrações na criança nos primeiros 6 meses após o nascimento. A
presença de IgG materna após esse período de tempo poderia gerar alterações no
neurodesenvolvimento e levar ao TEA (BRAUNSCHWEIG et al., 2008; MEAD; ASHWOOD,
2015).
36
Diversos estudos em modelos animais confirmam que alterações imunes durante a

gravidez resultam em anormalidades no comportamento (GŁADYSZ; KRZYWDZIŃSKA;
HOZYASZ, 2018). Estudos mostraram que soro e plasma de mães de crianças diagnosticadas
com autismo continham anticorpos com autorreatividade para o cérebro fetal humano
(BRAUNSCHWEIG et al., 2008; CROEN et al., 2005; SINGER et al., 2008).
Interessantemente, quando as frações de IgG contendo os auto-anticorpos de mães de crianças
com TEA foram injetadas em macacas rhesus grávidas, seus descendentes mostraram
comportamento social anormal, e os machos mostraram um aumento do volume cerebral
(BAUMAN et al., 2013).
A infecção durante a gravidez também pode resultar em alterações nas trajetórias do

neurodesenvolvimento, seja por infecção direta do feto ou devido às respostas imunes da mãe
(MEAD; ASHWOOD, 2015). Vários estudos, incluindo recente metanálise (JIANG et al.,
2016), fazem uma correlação positiva entre infecção materna durante a gestação e posterior
diagnóstico de TEA na criança (ATLADÓTTIR et al., 2010; LEE et al., 2008; ZERBO et al.,
2013). Aumento da idade materna, obesidade, diabetes gestacional e presença de variante do
gene MET materno rs1858830 alelo "C" foram associados com o desencadeamento de TEA por
meio da ativação imune materna (ESTES; MCALLISTER, 2015; GOTTFRIED et al., 2015).
O plasma de crianças com TEA contém auto-anticorpos separados e diferentes daqueles

das mães (descritos anteriormente) que se ligam a proteínas em seções do tálamo e hipotálamo
de cérebro humano adulto (MEAD; ASHWOOD, 2015). Estudo utilizando o soro de 100
crianças com autismo entre 4 e 11 anos encontrou aumento significativo de anticorpos anti-
DNA e anticorpos antinucleares em comparação com 100 crianças saudáveis (MOSTAFA; EL-
SHERIF; AL-AYADHI, 2014).
Familiares de crianças com TEA, especialmente mães, apresentam maior incidência de

doenças autoimunes (GŁADYSZ; KRZYWDZIŃSKA; HOZYASZ, 2018; GOTTFRIED et al.,
2015; MEAD; ASHWOOD, 2015). Estudos sugerem que o risco de TEA seja
significativamente aumentado em crianças cujas mães tenham artrite reumatoide, doença
celíaca, hipotireoidismo, diabetes tipo 1 e psoríase (ATLADOTTIR et al., 2009; CROEN et al.,
2005; WU et al., 2015; XU et al., 2014). Vários estudos demonstraram associações de TEA
com autoimunidade e alergias (MEAD; ASHWOOD, 2015).
Alterações também foram observadas nos níveis e subtipos de IgG, IGM e IgE em
indivíduos com TEA (GŁADYSZ; KRZYWDZIŃSKA; HOZYASZ, 2018; MEAD;
37
ASHWOOD, 2015). Em comparação com crianças neurotípicas, as crianças com TEA

mostraram níveis significativamente aumentados de IgG4 (subclasse de IgG tem características
e função biológica diferente de outras subclasses IgG) (ENSTROM et al., 2009), e a análise
dos níveis plasmáticos de imunoglobulinas em mais de 100 indivíduos com TEA revelou níveis
reduzidos de IgG e IgM (HEUER et al., 2008).
Há evidências convincentes de que os níveis de citocinas, tanto na periferia quanto no

SNC, estão alterados em crianças com TEA. Vários estudos descobriram um aumento de
citocinas pró-inflamatórias secretadas por células imunes inatas, especialmente células da
linhagem mieloide, em crianças com TEA (GOTTFRIED et al., 2015; MEAD; ASHWOOD,
2015). O plasma de crianças pequenas com TEA mostrou aumento significativo nas citocinas
pró-inflamatórias IL-1, IL-6, IL-12p40 e IL-8 quando comparado ao plasma de crianças típicas
(ASHWOOD et al., 2011b). Além disso, aumento do nível de TNF-α foi encontrado no líquido
cefalorraquidiano de crianças com TEA (CHEZ et al., 2007). Uma metanálise com dados de
pacientes com TEA demonstra claramente alterações em diferentes citocinas, tanto no plasma
como no cérebro dessas crianças (GOTTFRIED et al., 2015). Esses dados são demonstrados na
Tabela 4.
Além disso, uma prevalência elevada de outras comorbidades relacionadas ao sistema

imunológico, incluindo doenças autoimunes, alergias e psoríase, tem sido encontradas em
crianças com autismo em comparação com controles saudáveis (ZERBO et al., 2015).
Tabela 4 - Citocinas alteradas no TEA.
Citocina Nível comparado a controles Fonte Sujeitos avaliados Referência

INTERLEUCINAS
(ASHWOOD et al.,
Plasma Crianças com TEA
2011b)
Plasma Crianças com TEA (SUZUKI et al., 2011)
Adultos com TEA (EMANUELE et al.,

Plasma
grave 2010)
IL-1
(JYONOUCHI; SUN;
Células do sangue Crianças com TEA
LE, 2001)
(estímulo com TLR2 ou (ENSTROM et al.,
TLR4) 2010)
(estímulo com TLR-9) (ENSTROM et al.,
2010)
(ASHWOOD et al.,
IL-6 Plasma Crianças com TEA
2011b)
38
Adultos com TEA (EMANUELE et al.,

Plasma
grave 2010)
(JYONOUCHI; SUN;
LE, 2001)
(estímulo com TLR2 ou (ENSTROM et al.,
TLR4) 2010)
(estímulo com TLR-9) (ENSTROM et al.,
2010)
Linfoblastos Crianças com TEA (MALIK et al., 2011)
Cerebelo (post
Crianças com TEA (WEI et al., 2011)
mortem)
Cérebro (post Crianças e adultos (VARGAS et al.,
mortem) com TEA 2005)
Cérebro (post Crianças e adultos (XU; LI; ZHONG,

(ASHWOOD et al.,
IL-12 P40 Plasma Crianças com TEA
2011b)
QUIMIOCINAS
Cérebro (post Crianças e adultos (VARGAS et al.,

CCL2
(ASHWOOD et al.,
2011b)
FATOR DE NECROSE TUMORAL
(ASHWOOD et al.,
LCR Crianças com TEA
2011b)
TNF-α
Cérebro (post
Crianças com TEA (LI et al., 2009)
mortem)
INTERFERON
Mulheres que
(GOINES;
Soro (na gestação) geraram filho com
ASHWOOD, 2013)
TEA
IFN- (CROONENBERGHS
Sangue total e soro Crianças com TEA
et al., 2002)
Cérebro (post Crianças e adultos
(LI et al., 2009)
mortem) com TEA
FATORES DE CRESCIMENTO
(ASHWOOD et al.,
TGF-β Plasma Crianças com TEA
2008)
Soro Adultos com TEA (OKADA et al., 2007)
DBNF Cérebro (post Crianças e adultos (VARGAS et al.,

(ASHWOOD et al.,
2011b)
TEA: transtorno do espectro autista; IL: interleucina; TLR: receptores do tipo Toll; TNF: fator de necrose tumoral; LCR:
líquido cefalorraquidiano; IFN: interferon; TGF: fator de transformação do crescimento; BDNF: fator neurotrófico derivado
do cérebro. Adaptado de (GOTTFRIED et al., 2015).
39
Os achados na periferia refletem algumas descobertas no SNC. Amostras congeladas do

córtex cerebral de crianças com TEA encontraram níveis aumentados das citocinas pró-
inflamatórias TNF-α, IL-6, fator estimulante de colônias de granulócitos (G-CSF), IFN-γ e IL-
8 (LI et al., 2009). Outro grupo de pesquisadores confirmou o aumento de IL-6 no cerebelo de
crianças com TEA (WEI et al., 2011). Outras avaliações de cérebro post mortem de pacientes
com TEA encontraram sinais de inflamação do SNC, ativação da micróglia e astrócitos ativados
(MORGAN et al., 2010; VARGAS et al., 2005). Tomografia computadorizada por emissão de
pósitron (PET) de adultos jovens com TEA mostrou evidências que também indicam aumento
da ativação microglial (SUZUKI et al., 2013).
Síndromes genéticas ligadas ao Phosphatase and tensin homolog gene (PTEN) são
frequentemente associadas ao autismo ou retardo mental. Os dados coletivos a partir de
estudos identificaram mutações patogênicas no PTEN em 15 de 318 indivíduos (5%) com
TEA. Uma análise retrospectiva desses dados mostrou que macrocefalia estava presente em
todos os casos positivos (KING et al., 2014; MCBRIDE et al., 2010; SCHAEFER;
MENDELSOHN; PROFESSIONAL PRACTICE AND GUIDELINES COMMITTEE, 2013).
Além do cérebro, a proteína PTEN exerce um papel crucial na coordenação das atividades da
fosfatase, afetando a diferenciação e função da célula T reguladora (Treg) e função mitocondrial
(CHEN et al., 2017). Em humanos, a mutação da PTEN poderia levar a sintomas auto-
inflamatórios e autoimunes por meio da ativação excessiva de células T, além de alterações nas
respostas imunes (TSUJITA et al., 2016). Curiosamente, a expressão do PTEN é regulada por
respostas de imunidade inata e, em parte, pela expressão de microRNA. Por exemplo, miR-181a
modula a ativação de células T por regulação positiva do PTEN (SUN; SIT; FEINBERG, 2014).
Interessante estudo de 2017 correlacionou a expressão de miRNA com a relação de

interleucinas IL1β/IL10 e sintomas autistas. Nesse estudo verificou-se que pacientes com TEA
e sem alterações na relação IL1β/IL10 não apresentavam perfis de expressão de miRNA
diferente dos controles, contudo, aquelas com alterações na relação IL1β/IL10 apresentavam
miRNA com expressão diferente dos controles. Os miRNA alterados foram aqueles que afetam
a vias chaves de sinalização que medeiam ou regulam processos inflamatórios: miR-342, miR-
181a-1/2, miR-93, miR-223 e miR-1248. Além disso, pontuações mais baixas da subescala ABC
Letargia foram observados em indivíduos com TEA e baixas razões IL-1β/IL-10, enquanto
escores na subescala ABC Fala inapropriada foram menores naqueles com razões altas
(JYONOUCHI et al., 2017).
40
Os dados acima corroboram a hipótese de que existe um subgrupo de indivíduos com

TEA que apresenta alguma forma de desregulação do sistema imunológico, e que, pelo menos
em parte, essa desregulação pode contribuir para o fenótipo autista. (CAREAGA; VAN DE
WATER; ASHWOOD, 2010; CHEZ; GUIDO-ESTRADA, 2010; GŁADYSZ;
KRZYWDZIŃSKA; HOZYASZ, 2018; GOTTFRIED et al., 2015; MASI et al., 2015, 2017;
MCDOUGLE et al., 2015; MEAD; ASHWOOD, 2015; NORIEGA; SAVELKOUL, 2014;
VERKHRATSKY; RODRÍGUEZ; PARPURA, 2014). Muitos pesquisadores sugerem a
possibilidade de que a disfunção imune no TEA possa ser caminho viável para a intervenção
farmacológica, e um subgrupo de indivíduos com TEA poderia se beneficiar de terapias de base
imunológica. (CAREAGA; VAN DE WATER; ASHWOOD, 2010; CHEZ; GUIDO-
ESTRADA, 2010; ESTES; MCALLISTER, 2015; GŁADYSZ; KRZYWDZIŃSKA;
HOZYASZ, 2018; GOTTFRIED et al., 2015; LACIVITA et al., 2017; MCDOUGLE et al.,
2015; MEAD; ASHWOOD, 2015; MELTZER; VAN DE WATER, 2017; NORIEGA;
Uma revisão das terapias com ação no sistema imune já utilizadas em ensaios clínicos
em pacientes com diagnóstico de TEA encontra-se no Artigo 1.
2.3 RESVERATROL
O Resveratrol (RSV) é uma molécula simples inicialmente isolada em extrato derivado

da planta Cassia quinquangulata, originária do Peru, durante a procura por novos agentes
quimiopreventivos contra o câncer (JANG et al., 1997). A função fisiológica do RSV em
plantas não está bem definida. Propõe-se que seja produzido durante episódios de estresse
ambiental ou ataque patogênico. O RSV foi encontrado em pelo menos 72 espécies de plantas
(distribuídas em 31 gêneros e 12 famílias), algumas das quais são componentes da dieta
humana, como amoras, amendoim e uva. Encontram-se quantidades relativamente elevadas
nesta última, possivelmente devido à resposta de Vitis vinifera à infecção fúngica. A casca da
uva fresca contém cerca de 50 a 100 μg de RSV por grama, e a concentração no vinho tinto está
na gama de 1,5 a 3 mg/litro. Quantidades apreciáveis também são encontradas nos vinhos
brancos e rosés (JANG et al., 1997; JEANDET; BESSIS; GAUTHERON, 1991).
É proposto que RSV possa ser ativo na prevenção de várias doenças, como câncer, as
doenças cardíacas, diabetes tipo 2 e doenças neurodegenerativas. É provável que diferentes
41
mecanismos estejam envolvidos, mas a da modulação da inflamação seria o mecanismo

unificador. Devido a diferentes mecanismos e alvos, deve-se supor que dose ótima dependerá
da doença em particular (VANG et al., 2011).
Até o momento, dados in vitro e in vivo, documentam os seguintes mecanismos de ação

do RSV: modulação da proliferação celular e apoptose, modulação da angiogênese, inibição da
metástase, modulação de reação redox, supressão da adipogênese e estimulação da lipólise,
estimulação da osteogênese, modulação da atividade mitocondrial, supressão da inflamação,
modulação de danos no DNA, modulação do metabolismo xenobiótico, modulação do
metabolismo do glutamato e atividade estrogênico-antiestrogênica (VANG et al., 2011).
O RSV modula a resposta inflamatória induzida por vários estímulos. Em quase todos
os modelos o RSV contra-balança o níveis de marcadores bioquímicos pró-inflamatórios como
TNFα, IL-1B, IL-6. Além disso, faz uma regulação negativa das enzimas proteína
quimioatratante para monócitos 1 (MCP-1), ciclo-oxigenase-2 (COX-2) e óxido nítrico sintase
(iNOS) durante o estímulo pró-inflamatório (VANG et al., 2011). O RSV reduziu a inflamação
em vários modelos animais como obesidade-induzida (RIVERA et al., 2009), ratos diabéticos
(ZHANG et al., 2010) ou diabetes induzida quimicamente (KUMAR et al., 2006). Outros
modelos utilizando hipertensão induzida (CSISZAR et al., 2009; INANAGA et al., 2009),
substâncias químicas que causam lesões teciduais no fígado (TUNALI-AKBAY et al., 2010),
pulmão (CSISZAR et al., 2009; SENER et al., 2007) e cólon (HONG et al., 2010; MARTÍN et
al., 2006; SENGOTTUVELAN; DEEPTHA; NALINI, 2009) também demostraram
diminuição dos níveis dos marcadores inflamatórios após o uso de RSV.
2.3.1 Biodisponibilidade e farmacocinética em humanos
Os estudos mostram que o RSV é rapidamente absorvido após

ingestão oral. Uma concentração plasmática máxima da substância é obtida
após 30 a 60 minutos (VANG et al., 2011). A meia-vida do trans-RSV foi 1-3 h após doses
únicas e 2-5 h após administrações repetidas, e com biodisponibilidade maior após a
administração matinal (ALMEIDA et al., 2009). A farmacocinética do RSV, em adultos, não
variou com a idade (NUNES et al., 2009). Num experimento com humanos saudáveis doses
únicas de 250 e 500mg de RSV aumentaram significativamente o fluxo sangüíneo cerebral após
42
45 minutos da ingestação, mas não alterou o desempenho cognitivo em testes padronizados

(KENNEDY et al., 2010).
O trans-RSV é rapidamente e extensamente biotransformado pelo metabolismo de

primeira passagem. Vias metabólicas indentificadas incluem sulfatação e glucorinidação
ácidas, contudo uma rápida sulfatação pelo intestino/fígado parece ser o passo limitante da
biodisponibilidade do RSV (WALLE et al., 2004).
A distribuição tecidual do RSV e seus metabólitos foi estimada em estudo no qual

pacientes com câncer de cólon que receberam 0,5g ou 1,0g de RSV diariamente durante oito
dias antes da ressecção cirúrgica. O nível de RSV que foi encontrado no tecido colonico
apresentava valores suficientes para efeitos anticarcinogênicos observados em testes in vitro
(PATEL et al., 2010).
O RSV penetra a barreira hemato-encefálica gerando efeito no sistema nervoso central.

Turner et al. (2015), utiliando RSV na dose de 1g a 2g em pacientes com diagnóstico de doença
de Alzheimer por 52 semanas, avaliou os níveis de RSV e seus metabólitos (3G-RES, 4G-RES
e S-RES) no sangue e no líquor desses pacientes. Na semana 52 do uso de RSV, os níveis
médios líquor do fármaco, 3G-RES, 4G-RES e S-RES foram de 3,3%, 0,4%, 0,4% e 0,3%,
respectivamente, dos níveis plasmáticos. Na dosagem mais alta, foram medidos níveis em µM
de RSV e os seus metabolitos no plasma, com os níveis de nM no líquor. Esses achados sugerem
que alvo molecular central do RSV pode ser atingido com a concentração de nM (TURNER et
al., 2015). Resultados de três ensaios pré-clínicos de eficácia quimiopreventiva sugerem que
repetidas doses baixas diárias de RSV (acima 2 mg/kg) são suficientes para produzir
concentrações plasmáticas máximas de RSV de até 2 μM, potencialmente exercendo efeitos
quimiopreventivos benéficos (GESCHER; STEWARD, 2003).
O RSV foi utilizado para reduzir o risco de desenvolvimento de câncer de cólon em

animais experimentais utilizando doses entre 0,2 a 8mg/kg em ratos e 2,4 a 60mg/kg em
camundongos. Aplicando os fatores de translalação de doses (REAGAN-SHAW; NIHAL;
AHMAD, 2008), as "doses humanas equivalentes" diárias seriam cerca de 2mg-78mg (com
base nos dados nos ratos) ou 12-290mg (com base nos camundongos) para uma pessoa de 60kg
(VANG et al., 2011). O aumento da sensibilidade à insulina foi observada em animais
experimentais quando exposta a 2,5-400mg/kg em camundogos e 1-100mg/kg em ratos. As
"doses humanas equivalentes" correspondentes seriam 12-1945mg (com base nos dados dos
ratos) ou 10-973mg/dia para uma pessoa com peso de 60kg (VANG et al., 2011).
43
2.3.2 Estudos de toxicidade do RSV em animais
Com base em estudos em animais, o RSV é geralmente bem tolerado (VANG et al.,
2011). Estudo com uso de RSV por pelo menos 24 meses em ratos e 18 meses em camundongos
não evidenciou efeitos tóxicos (BAUR et al., 2006). Em estudos com animais, exceto em doses
superiores a 1g/kg por dia, não causam efeitos tóxicos. Várias experiências sub-crônicas
indicam baixa toxicidade do RSV (VANG et al., 2011).
Em ratos, 20m/kg/dia administrado por 28 dias não indicou toxicidade sistêmica

(JUAN; VINARDELL; PLANAS, 2002). Doses orais de 300, 1000 ou 3000mg/kg/dia durante
28 dias apresentaram apenas efeitos tóxicos no grupo tratado com 3000mg, onde foi observada
toxicidade renal e hepática (CROWELL et al., 2004). A exposição de ratos Wistar a RSV (50,
150 ou 500mg/kg/dia) por quatro semanas ou três meses para 120, 300 ou 700mg/kg/dia não
apresentou efeitos toxicolócos significativos, sugerindo que o RSV é bem tolerado e não tóxico
(WILLIAMS et al., 2009).
2.3.3 Resveratrol e estudos em humanos
Vários estudos com o uso RSV em humanos saudáveis ou com patologias tem sido
realizados nos últimos anos. Essas pesquisas sugerem que o RSV é seguro e bem tolerado, e
somente quando utilizado em altas doses estaria associado a efeitos adversos leves a moderados
e auto-limitados, contudo, não encontramos descrição do uso em pacientes pediátricos. A
Tabela 5 resume as doses e efeitos colaterais em alguns ensaios clínicos com uso de RSV,
incluindo doenças neuropsiaquiátricas como esquizofrenia e doença de Alzheimer.
2.3.4 Resveratrol: efeito neuroprotetor e anti-inflamatório

44
Vários estudos animais têm indicado que RSV tem um efeito neuroprotetor (VANG et
al., 2011). Este efeito foi documentado em vários modelos, incluindo coelhos, camundongos e
ratos e utilizando vários métodos de avaliação como:
a) peroxidação e destruição células neuronais (ATES et al., 2007; KIM et al., 2010;
MOKNI et al., 2007; ROBB et al., 2008; SINHA; CHAUDHARY; GUPTA, 2002; YANG;
PIAO, 2003);
b) atenuação das áreas de lesão induzida (ATES et al., 2006, 2007;

KARUPPAGOUNDER et al., 2009; LU et al., 2008; SAKATA et al., 2010; TSAI et al., 2007;
YOUSUF et al., 2009);
c) aumento da tolerância a lesões cerebrais (DELLA-MORTE et al., 2009);
d) redução da freqüência de convulsões (WU et al., 2009);
e) dano na coordenação motora (BINIENDA et al., 2010; KHAN et al., 2010;

KIZILTEPE et al., 2004; KUMAR; SHARMA, 2010; KUMAR et al., 2006; LU et al., 2008;
SINGLETON et al., 2010; SINHA; CHAUDHARY; GUPTA, 2002; SÖNMEZ et al., 2007);
f) melhoria da aprendizagem (KIM et al., 2007; OOMEN et al., 2009; RANNEY;

PETRO, 2009).
2.3.5 Resveratrol e Transtorno do Espectro Autista
Considerando a associação entre a exposição ao VPA e os sintomas de TEA em

humanos, sugeriu-se um modelo animal de administração de VPA pré-natal. Nos últimos anos,
este modelo mostrou ser uma ferramenta de pesquisa confiável, pois apresenta muitas alterações
morfológicas e comportamentais relacionadas à fisiopatologia do TEA (BAMBINI-JUNIOR et
al., 2011). Um estudo inicial do nosso grupo investigou a influência do tratamento pré-natal
com RSV sobre comportamentos sociais num modelo de TEA induzido pela exposição pré-
natal ao VPA. A neste trabalho a administração pré-natal de RSV evitou os prejuízos sociais
induzidos pelo VPA. Foi realizada análise bioinformática para descartar possíveis interações
moleculares entre VPA e RSV durante a administração, sugerindo então, que esses resultados
derivam de alterações celulares e não de uma reação química isolada (BAMBINI-JUNIOR et
al., 2014) (Figura 1).
Tabela 5 - Doses e efeitos colaterais em ensaios clínicos com resveratrol.
N Idade* Patologia Dose diária Duração Efeitos Adversos Referências

Inespecíficos e sem severidade. Exames
24 32,3 ± 5,9 Sem patologia 600mg 3 dias (NUNES et al., 2009)
laboratoriais e ECG normais.
Cefaléia, mialgia e sonolência (leves). Exames (ALMEIDA et al.,
40 24,3 ±1,1 Sem patologia 150 a 900mg 5 dias
laboratoriais e ECG normais. 2009)
Sem patologia e (ELLIOTT et al.,
2,5g e 5g 28 dias Efeitos adversos de natureza leve e reversíveis
diabetes tipo 2 2009)
(LA PORTE et al.,
8 46 Sem patologia 4g 8 dias Diarreia, rash cutâneo, cefaleia
2010)
20 66,8±17,2 Câncer de cólon 500mg e 1g 8 dias Sem relato de efeitos adversos (PATEL et al., 2010)
19 55±2 Sem patologia 270mg 7 dias Sem relato de efeitos adversos (WONG et al., 2011)
8 61±1,3 Obesidade 75mg 6 semanas Sem relato de efeitos adversos (WONG et al., 2013)
Diarreia, náuseas, cólicas, prurido, rash cutâneo
13 42,7±9,4 Sem patologia 1g e 2g 4 semanas (VODUC et al., 2014)
e cefaleia.
Sem alterações nos sinais vitais, exames físicos (TURNER et al.,
120 69,8 ±7,7 Doença de Alzheimer 0,5g a 1g 52 semanas
ou exames laboratoriais. 2015)
(FAGHIHZADEH;
Esteato-hepatite não Sem relato de efeitos adversos. Exames ADIBI;
25 44±10,1 500mg 12 semanas
alcoólica laboratoriais sem alterações. HEKMATDOOST,
2015)
(MACEDO et al.,
60 21,5 ± 1,8 Sem patologia 100mg 90 dias Sem relato de efeitos adversos
2015)
(VAN DER MADE;
Sobrepeso e obesidade
45 60±7 150mg 4 semanas Sem relato de efeitos adversos PLAT; MENSINK,
leve
2015)
Sem relato de efeitos adversos ou alterações (ZORTEA et al.,
19 46,4±11,2 Esquizofrenia 200mg 4 semanas
laboratoriais 2016)
Obesidade e esteato- Relato de 1 efeito adverso grave: febre e (HEEBØLL et al.,
28 1,5g 6 meses
hepatite não alcoólica bicitopenia 2016)
Insuficiência renal / 150 ou (LIN; SUN; LIN,
72 12 semanas Sem relato de efeitos adversos
diálise peritoneal 450mg 2016)
(BEDADA;
12 27,2±1,8 Sem patologia 500mg 10 dias Sem relato de efeitos adversos
NEARATI, 2015)
45
N Idade* Patologia Dose diária Duração Efeitos Adversos Referências
16 20±0.8 Sem patologia 500mg 4 semanas Sem relato de efeitos adversos (POLLEY et al., 2016)
(THAZHATH et al.,
14 67,5±1,6 Diabetes tipo 2 1g 5 semanas Sem relato de efeitos adversos
2016)
Diabetes tipo 2 com (ZARE JAVID et al.,
21 49,1±7,4 480mg 4 semanas Não cita
periodontite crônica 2017)
(MOVAHED et al.,
15 68,1±1,1 Sem patologia 500mg 12 semanas Não cita
2016)
Síndrome do ovário (BANASZEWSKA et
17 26,8±1,1 1,5g 3 meses Sem relato de efeitos adversos
policístico al., 2016)
Insuficiência renal (SALDANHA et al.,
20 62±8 500mg 4 semanas Sem relato de efeitos adversos
não-dialítica 2016)
(SAMSAMIKOR et
28 37,4±16,5 Colite ulcerativa 500mg 6 semanas Sem relato de efeitos adversos
al., 2016)
112 32±16 Arterite de Takayasu 250mg 3 meses Não cita (SHI et al., 2017)
(TIMMERS et al.,
17 59,2-67,3 Diabetes tipo 2 150mg 30 dias Sem relato de efeitos adversos
2016)
40mg e
130 64,9±8 Diabetes tipo 2 6 meses Sem relato de efeitos adversos maiores (BO et al., 2016)
500mg
(IMAMURA et al.,
25 57,4±10,6 Diabetes tipo 2 100mg 12 semanas Sem relato de efeitos adversos
2017)
Homens com síndrome Efeitos adversos leves e temporários no grupo de
42 50,5±1,4 150mg e 1g 16 semanas (KJÆR et al., 2017)
metabólica dose maior
Mulheres pós- (WONG; EVANS;
37 61,3±1,1 150mg 14 semanas Sem relato de efeitos adversos
menopausa HOWE, 2017)
(SEYYEDEBRAHIMI
48 55±6,4 Diabetes tipo 2 800mg 2 meses Sem relato de efeitos adversos significativos
et al., 2018)
*Média±DP em anos
46
47
Figura 1 - Índice de Preferência Social. Grupos experimentais: Controle (control), RSV

(resveratrol), VPA (ácido valpróico) e VPA+RSV, adaptado de (BAMBINI-JUNIOR et al.,
2014)
Em recentes trabalhos do nosso grupo, observou-se que além da ação preventiva

comportamental do RSV no modelo VPA, ocorreu também alterações moleculares.
Verificou-se que miR134-5p foi significativamente aumentado no sangue total de animais
expostos ao VPA durante o período neonatal, e o RSV foi capaz de prevenir essa
alteração. Neste mesmo trabalho também foi verificado um aumento de expressão dos
miR134-5p e miR138-5p em crianças com TEA em relação ao controles (HIRSCH et al.,
2018). O RVS também reverteu alterações na sensibilidade no modelo animal de autismo
por VPA, inclusive, preservando o padrão laminar cortical e a distribuição de neurônios
na área somatossensorial primária e restabelecendo a proporção típica de neurônios
GABAérgicos parvalbumina+ na amígdala (FONTES-DUTRA et al., 2018).
O uso de RSV na dose de 20 mg ou 40 mg também foi investigado em outro
modelo animal para TEA, modelo BTBR. Os ratos BTBR mostram uma série de
anomalias imunitárias que também são observados em crianças com TEA (BAKHEET et
al., 2017; LI et al., 2009). Este modelo é caracterizado por níveis de Foxp3+ mais baixos
e níveis mais elevados de RORγt +, T-bet+ e produção de GATA-3+ em células T CD4+
quando comparadas a outros animais. Neste estudo o RSV gerou uma indução de Foxp3+
e redução da expressão de T-bet+, GATA-3+ e IL-17A+ em CD4+ quando comparado com
o grupo controle. Além disso, o tratamento com RSV resultou num aumento de expressão
de Foxp3 mRNA e diminuição da expressão de T-bet, GATA-3, RORγt e IL-17A em
tecidos esplenico e cerebral. Esses resultados sugerem o TEA está associado com a
desregulação da sinalização de fatores de transcrição e que o RSV poderia corrigir essa
48
desregulação (BAKHEET et al., 2017). Este trabalho também evidenciou que o RSV
produziu uma redução significativa no comportamento repetitivo nos ratos BTBR quando
comparados aos controles. Estes resultados indicam que o RSV pode reduzir o
comportamento repetitivo neste modelo animal de TEA (BAKHEET et al., 2017).
Posteriormente, o mesmo grupo, verificou que o RSV diminuiu significativamente IL-6+,
TNF-α+, IFN-γ+ e STAT3+ em células esplenicas CD4+ em comparação com
camundongos BTBR controles. Além disso, reduziu no tecido cerebral o nível de
expressão de mRNA (IL-6, TNF-α, IFN-γ, JAK1 e STAT) e expressão proteica de IL-6,
IFN-γ, TNF-α, pJAK1 e pSTAT3 (Tyr705) em comparação com controles (AHMAD et
al., 2018b). Outro trabalho recente com o mesmo modelo animal também verificou que
o RSV melhora a desregulação neuroimune através da inibição de mediadores pró-
inflamatórios através das vias dos TLR e fator nuclear kappa B (NF-kB), verificou-se
que o RSV reduz a expressão proteica e de mRNA de TLR2, TLR3, TLR4, NF-κB, iNOS
e COX-2 no tecido cerebral e células esplênicas CD4+. Sugerindo que o RSV possa ser
um novo candidato terapêutico para modular adisfunção neuroimune através da inibição
de TLR, iNOS e COX-2 (AHMAD et al., 2018a).
Em trabalho com outro modelo animal, este induzido por ácido propanóico, o RSV
restaurou o funcionamento típico dos animais, alterando os sintomas nucleares do
fenótipo autista, além de suprimir o estresse oxidativo-nitrosativo, disfunção
mitocondrial, espressão de TNF-α e MMP-9 nesses animais. Neste estudo, a resposta
comportamental foi dose dependente (5, 10 e 15 mg/kg), com doses maiores de RSV
reduzindo mais intensamente a sintomatologia autista (BHANDARI; KUHAD, 2017)
(Figura 2).
Figura 2 - Tempo de interação social. (RVT – resveratrol), adaptado de (BHANDARI;

KUHAD, 2017)
49
2.4 MICRORNA
MicroRNA refere-se a um grupo de pequenos RNA não-codificantes,

compreendendo cerca de 22 nucleotídeos. Por emparelhamento de bases com RNA
mensageiro (RNAm), os miRNA controlam a tradução de proteínas a partir dos
transcritos (CHEN; RAJEWSKY, 2007), figura 3. Os miRNA foram caracterizados pela
primeira vez no início da década de 1990 (LEE; FEINBAUM; AMBROS, 1993), mas
seu papel como uma categoria específica de reguladores biológicos com funções
conservadas não foi totalmente realizado até uma década depois (KAMAL; MUSHTAQ;
GREIG, 2015). Os miRNA estão possivelmente envolvidos em quase todos os processos
biológicos, por modular a expressão proteica via mRNA (KAMAL; MUSHTAQ;
GREIG, 2015), figura 4. Os miRNA estão envolvidos em múltiplos estágios do
desenvolvimento cerebral como proliferação de células-tronco neurais, diferenciação,
migração, formação de complexidade dendrítica e crescimento axonal, além de terem
ações na manutenção da função do SNC ao longo da idade adulta (BELZEAUX; LIN;
TURECKI, 2017; BLANDFORD; GALLOWAY; MOORE, 2018).
Níveis alterados de alguns miRNA têm sido implicados em várias desordens do

sistema nervoso central, como doença de Alzheimer, doença de Parkinson, esclerose
lateral amiotrófica (QIU; TAN; ZENG, 2015), doença de Huntington (HOSS et al.,
2014), esquizofrenia (YIN et al., 2014) e TEA (GEAGHAN; CAIRNS, 2015; MOR et
al., 2015).
Muitos miRNA podem atuar diretamente na modulação de processos

imunológicos, incluindo processos inflamatórios no SNC (SUN et al., 2018; XIAOYAN
et al., 2017). Estudos em modelos animais verificaram que durante o acidente vascular
cerebral, o aumento da expressão dos miR-424 e miR-let-7c-5p gera inibição da ativação
astrocitária reduzindo o volume do infarto e melhorando a função neurológica (NI et al.,
2015; ZHAO et al., 2013). Outros trabalhos em modelos de isquemia cerebral também
demonstraram que aumento da expressão dos miR-22 e miR-122 ou a redução do miR-
15a/16-1 diminui os níveis de TNF-α, IL-6, MCP-1, COX-2 e iNOS e expressão do gene
VCAM-1 (LIU et al., 2016; YANG et al., 2017; YU et al., 2015). Já em modelos para
trauma cranioencefálico e medular, o miR-124-3p inibe a inflamação tecidual (HUANG
et al., 2018) enquanto os miR-27a, miR-199b, miR-124, miR-497 e miR-133b reduzem
a ativação de astrócitos/macrófagos e inibem as vias NF-κB/IL-1β ou IκB kinase β-NF-
50
κB, reduzindo o processo inflamatório (LI et al., 2015; LOUW et al., 2016; THEIS et
al., 2017; ZHOU et al., 2016).
Figura 3 - Biogênese dos miRNA. Após transportado para o citoplasma o pré-miRNA é

clivado em miRNA e acoplado ao complexo silenciador RNA induzido (RISC), que por sua
vez liga-se ao mRNA, podendo interferir na sua tradução ou leva-lo à degradação. Fonte:
(MACK, 2007).
Evidências crescentes indicam que a neuroinflamação desempenha um papel

crucial na patogênese da epilepsia do lobo temporal, e estudos em tecido cerebral de
humanos e modelos animais evidenciam que existe um aumento de expressão do miR-
146a modulando esse processo (HE et al., 2016; LI et al., 2018; OMRAN et al., 2012).
Na doença de Alzheimer, os níveis de expressão do miR-146a aumentaram com gravidade
da doença, e foram particularmente elevados nas regiões do cérebro com achado
neuropatológicos de inflamação (LUKIW et al., 2011). Já o miR-132, alterado tanto no
autismo quanto na esquizofrenia, participa dos processos ligados à plasticidade cerebral,
à conectividade e regulação das respostas imunes (MELLIOS; SUR, 2012). O miR-146a
pode desempenhar um importante papel na inflamação mediada por astrócitos (IYER et
al., 2012). Além disso, o miR-155 tem sido relatado como modulador a resposta
inflamatória na micróglia (CARDOSO et al., 2012). Outros microRNA com importante
papel na inflamação, além do miR-1461 e do miR155 são: miR-132, miR-21, Let-7, miR-
223, miR-181b, miR-9, miR-147, miR-17, miR-18, miR-19, miR-301, miR-26, miR-23,
miR-24, miR-27, miR-203, miR-126, miR-302, miR-340, miR-1246, miR-34, miR-221,
miR-222, miR-320a, miR-674, miR-33, miR-10a e miR-145 (NEJAD; STUNDEN;
GANTIER, 2018).
51
Figura 4 - Exemplo de rede/relações entre miRNA, genes-alvo potenciais, funções

biológicas e doenças implicadas pelos genes alvo. Em vermelho genes e miRNA com
aumento de expressão. Em verde genes e miRNA com redução de expressão. Fonte:
(SARACHANA et al., 2010).
2.4.1 MicroRNA e TEA
Até o presente momento, a maioria dos estudos centraram-se mais em miRNA e

fatores genéticos, com poucos estudos investigando a relação do miRNA com fatores
epigenéticos envolvidos no TEA (KAMAL; MUSHTAQ; GREIG, 2015; KICHUKOVA
52
et al., 2017). Fatores epigenéticos regulam a função ou atividade do gene, sem alterar sua
sequência de DNA (KICHUKOVA et al., 2017).
Os miRNA que já foram descritos com alteração no TEA encontram-se na Tabela

6. Em um estudo de caso-controle, Abu-Elneel et al. (2008) rastrearam a expressão de
466 miRNA humanos no córtex cerebelar post-mortem de 13 indivíduos com TEA e igual
número de indivíduos neurotípicos. Um total de 28 miRNA apresentaram expresssão
diferente em pelo menos uma das amostras de indivíduos com TEA em comparação com
os indivíduos com desenvolvimento normal (ABU-ELNEEL et al., 2008). No entanto,
nenhum miRNA específico foi uniformemente desregulado em todo este conjunto de
amostras post-mortem. Um estudo de 2008 avaliou o perfil de 470 miRNA em linfócitos
de 6 indivíduos com TEA em comparação com indivíduos neurotípicos pareados. Os
autores descrevem expressão alterada de nove miRNA nas amostras de indivíduos com
TEA (TALEBIZADEH; BUTLER; THEODORO, 2008). Outro estudo também
utilizando linfócidos encontrou 43 miRNA diferentemente expressos nos pacientes com
TEA em relação aos indivíduos com desenvolvimento típico (SARACHANA et al.,
2010). Um recente trabalho usando amostras de soro de 55 indivíduos com TEA e 55
indivíduos controles pareados por idade e sexo identificou 13 miRNA que foram
diferencialmente expressos em indivíduos com TEA (MUNDALIL VASU et al., 2014).
Estudo chinês com 15 pacientes e 15 controles encontrou diferença significativa na
expressão de 5 microRNA com expressão aumentada em relação aos controles (HUANG
et al., 2015). Outro estudo com 30 crianças com TEA de ambos os sexos e 30 controles
saudáveis encontrou diferenças entre o perfil de expressão de microRNA no soro
(KICHUKOVA et al., 2017).
2.4.2 MicroRNA e Biomarcadores
Uma vez que um único miRNA pode regular uma miríade de transcritos e assim
atuar como um regulador de diversos processos, um subconjunto de miRNA poderia ser
utilizado como biomarcador de estados fisiológicos e patológicos. Um estudo demostrou
que a expressão de apenas dois miRNA poderia discriminar com precisão uma leucemia
linfoide aguda de uma leucemia mieloide aguda (MI et al., 2007), reforçando a
potencialidade dos miRNA como biomarcadores. Outras características que tornam os
53
miRNA excelentes candidatos para estudos de biomarcadores são: notável estabilidade e

resistência à degradação, especialmente em comparação com o RNAm (KICHUKOVA
et al., 2017); estabilidade em diferentes fluidos corporais; envolvimento na patogênese
das patologias; e detecção no início da doença (STOICEA et al., 2016).
Os miRNA na forma de biomarcadores, além da participação no diagnóstico,

poderiam ajudar a identificar indivíduos mais propensos a responder a terapêuticas
específicas e fornecer mais objetividade na tomada de decisão no tratamento
(BELZEAUX; LIN; TURECKI, 2017). Outra perspectiva é criação de novas estratégias
terapêuticas utilizando os miRNA como alvos, gerando mudanças na sinalização dos
processos nos quais esses microRNA estejam envolvidos (BLANDFORD;
GALLOWAY; MOORE, 2018; SUN et al., 2018).
O uso de perfis de miRNA como biomarcadores para patologias tem recebido

atenção significativa nos últimos anos (BLANDFORD; GALLOWAY; MOORE, 2018)
com trabalhos em patologias como asma na infância (KHO et al., 2018), câncer de
pâncreas (GUO et al., 2018), insuficiência cardíaca (SIASOS; TSIGKOU; TOUSOULIS,
2018), doença de Fabry (CAMMARATA et al., 2018), depressão (BELZEAUX; LIN;
TURECKI, 2017), esclerose múltipla (MANNA et al., 2018; REGEV et al., 2016),
tumores do SNC (A et al., 2018; KOPKOVA et al., 2018; WANG et al., 2014), acidente
vascular encefálico (JICKLING et al., 2016; TAN et al., 2009) e doença de Alzheimer
(DENK; JAHN, 2018; PUTTEERAJ; FAIRUZ; TEOH, 2018).
Como a amostragem do tecido cerebral em vida em seres humanos não é prático

para a maioria das doenças neurológicas, investigadores tem usado sangue, plasma,
líquido cefalorraquidiano e saliva como fontes acessíveis de RNA para realizar estudos
de perfis de miRNA com expressão em doenças do SNC (HICKS et al., 2016; SUN et
al., 2018).
54
Tabela 6 - MicroRNA com expressão alterada em sujeitos com TEA.
Amostra Amostra
MicroRNA Expressão Autor
Biológica N
miR-132, miR-146a, miR-146b, miR-23a, miR-23b, miR-663 Aumentada TALEBIZADE

H, Z. et al.
2008.
6
miR-92 (a1-a2), miR-320, miR-363 Reduzida
miR-185, miR-103, miR-107, miR-29b, miR-194, miR-524, miR-

Linfócitos 191, miR-376a-AS, miR-451, miR-23b, miR195, miR-342, miR-
Aumentada
23a, miR-186, miR-25, miR-519c, miR-346, miR-205, miR-30c,
miR-93, miR-186, miR-106b SARACHANA,
14
miR-182-AS, miR-136, miR-518a, miR-153-1, miR-520b, miR- T. et al. 2010.
455, miR-326, miR-199b, miR-211, miR-132, miR-495, miR-16-
Reduzida
2, miR-190, miR-219, miR-148b, miR-189, miR-133b, miR-
106b, miR-367, miR-139
miR-199b-5p, miR-548o, miR-577, miR-486-3p, miR-455-3p, GHAHRAMAN
miR-338-3p, miR-199a-5p, miR-650, miR-486-5p, miR-125b, Aumentada 20 I SENO, M. M.
miR-10a, miR-196a et al. 2011.
miR-101-3p, miR-106b-5p, miR-130a-3p, miR-195-5p, miR-19b- MUNDALIL

Aumentada
3p VASU, M. et al.
2014.
55
miR-151a-3p, miR-181b-5p, miR-320a, miR-328, miR-433, miR-
Soro Reduzida
489, miR-572, miR-663a
miR-365a-3p, miR-619-5p, miR-664a-3p Aumentada KICHUKOVA

30
miR-3135a, miR-328-3p, miR-197-5p, miR-500a-5p, miR-424-5p Reduzida et al., 2017
miR-484, miR-21, miR-212, miR-23a, miR-598, miR-95, miR-

129, miR-43, miR-7, miR-15a, miR-27a, miR-15b, miR-148b, Aumentada
Córtex miR-132, miR-128, miR-93 ABU-ELNEEL,
13
cerebelar miR-93, miR-106a, miR-539, miR-652, miR-550, miR-432, miR- K. et al. 2008.
193b, miR-181d, miR-146b, miR-140, miR-381, miR-320a, miR- Reduzida
106b
MOR, M. et al.
Cérebro miR-142-5p, miR-142-3p, miR-451a, miR-144-3p Aumentada 12
2015.
miR-34b Reduzida HUANG et al.,

15
miR-let-7a, miR-let-7d, miR-103a, miR-1228 Aumentada 2015.
Sangue
HIRSCH et al.,
miR134-5p, miR138-5p Aumentada 7
2018
miR-628-5p, miR-127-3p, miR-335-3p, miR-2467-5p, miR-28-
5p, miR-191-5p, miR-3529-5p, miR-218-5p, miR-7-5p, miR-140- Aumentada HICKS, S. D. et
Saliva 3p 24
al. 2016.
miR-27a-3p, miR-30e-5p, miR-23-3p, miR-32-5p Reduzida
55
2.4.3 Expressão de MicroRNA na saliva
A saliva é gerada dentro das glândulas salivares por células acinares, coletada em
pequenos canais e, posteriormente, liberada para a cavidade oral. As três glândulas
salivares maiores (parótidas, submandibulares e sublinguais) contribuem com 90% do
total de saliva. Cada glândula salivar (Figura 5) é altamente permeável e envolta por
capilares, o que permite a livre troca de moléculas do sangue para as células acinares
adjacentes (YOSHIZAWA et al., 2013).
Investigadores postulam que as moléculas derivadas do sangue entram nos tecidos

salivares via transcelular (por exemplo, transporte passivo e ativo) ou paracelular (por
exemplo, a ultrafiltração extracelular) (DROBITCH; SVENSSON, 1992; HAECKEL;
HÄNECKE, 1993; JUSKO; MILSAP, 1993). Isto sugere que a absorção pelas glândulas
salivares de biomarcadores circulantes de doenças sistêmicas poderiam, possivelmente,
alterar a composição bioquímica das secreções salivares. Consequentemente, fluidos
orais podem conter informações moleculares capazes de informar sobre o estado atual de
saúde do indivíduo (YOSHIZAWA et al., 2013).A maioria dos miRNA detectáveis no
soro e na saliva está concentrada em exossomas. Os exossomas são microvesículascom
cerca de 30-100 nm de tamanho, e são segregadas por uma variedade de tipos de células,
tais como células epiteliais, linfócitos T e B, mastócitos, células dendríticas e neurônios
(BLANDFORD; GALLOWAY; MOORE, 2018; GALLO et al., 2012).
O transporte extracelular de miRNA através exossomas e outras microvesículas é um

mecanismo epigenético estabelecido, através da qual as células podem alterar a sua
expressão gênica própria e das células ao seu redor (HICKS et al., 2016). Para que isso
ocorra, o miRNA vesicular é liberado para o espaço extracelular e posteriormente penetra
nas células vizinhas para então bloquear a tradução do RNAm em proteínas (HU;
DRESCHER; CHEN, 2012). A natureza extracelular deste processo permite a medição
do material genético do sistema nervoso central através do recolhimento simples de saliva
(GALLO et al., 2012; HICKS et al., 2016; SUN et al., 2018).
Este método através da coleta de saliva minimiza muitas limitações associadas às

outras técnicas, como a análise do tecido cerebral post-mortem (lesão cerebral anóxica e
degradação de RNA), leucócitos periféricos (relevância de mudanças de expressão) ou
soro (punção dolorosa para coleta de sangue) (HICKS et al., 2016).
56
Figura 5 - Mecanismo de transporte de moléculas do plasma para os ductos salivares. A

imagem demonstra a proximidade da glândula com os sistema vascular. As glândulas
salivares são muito vascularizadas, o que permite passagem de constituintes do sangue. As
células acinares das glândulas absorvem moléculas presentes na corrente sanguinea e
secretam na cavidade oral. Alterações na constituição do sangue podem posteriormente
alterar a constituição da saliva. Biomarcadores presentes no sangue também estariam
alterados na saliva, permitindo o diagnóstico de patologias sistemicas com coleta de
secreções salivares. Adaptado de (YOSHIZAWA et al., 2013).
A utilização de saliva para a detecção de doenças orais tem sido amplamente

demonstrada (CHENG; REES; WRIGHT, 2014). Estudos para detecção de tumores de
cabeça e pescoço (SALAZAR et al., 2014) e pâncreas (HUMEAU et al., 2015; XIE et
al., 2015) também têm sido descritos, inclusive com o uso do termo “biópsia líquida”
(KAI; DITTMAR; SEN, 2018). E o interesse por biomarcadores salivares para doenças
neuropsiquiátricas tem aumentado nos últimos anos, incluindo patologias como doença
de Parkinson, doença de Alzheimer, doença de Huntington, esclerose múltipla e esclerose
lateral amiotrófica (FARAH et al., 2018).
Estudo de 2016 utilizando saliva como amostra biológica de 24 crianças com

diagnóstico de TEA encontrou uma diferença na expressão de 14 miRNA nesses sujeitos
em comparação aos controles. Além disso, este trabalho revelou correlações significativas
entre desempenho na escala VABS e a expressão de 13 desses 14 miRNA. Notavelmente,
nove dos miRNA demonstraram apenas aspecto negativo nas correlações (isto é, maior
expressão do miRNA foi associada com menor escore na escala VABS), enquanto quatro
57
deles apresentaram apenas correlação positiva. Os miRNA com correlações positivas às

pontuações na VABS apresentaram uma expressão reduzida nos indivíduos com TEA, ao
passo que cada miRNA com correlações negativas para pontuações na VABS tinham uma
expressão aumentada no TEA (HICKS et al., 2016).
3 JUSTIFICATIVA
O TEA é um distúrbio crônico e na maioria das vezes com graves prejuízos no

funcionamento cognitivo, emocional e comportamental. A maioria dos pacientes
apresenta déficit cognitivo moderado ou grave, e não adquirem capacidade de viver de
forma independente. A prevalência do TEA o torna uma das desordens do
desenvolvimento neurológico mais frequente, representando uma grande preocupação de
saúde pública, gerando altos custos econômicos para a sociedade e grande sofrimento
para a família. Seu diagnóstico precoce, além de aliviar as preocupações prolongadas
das famílias, acelera oportunidades de beneficiar a criança com intervenções
especializadas.
Atualmente não existem marcadores genéticos ou bioquímicos para o TEA e não há

nenhum tratamento capaz de reverter completamente seus sintomas, sendo necessária a
busca por novas abordagens diagnósticas e terapêuticas que modifiquem a história
natural da doença. Os trabalhos preliminares sugerem que as respostas neuroimunes
anormais poderiam ser alvos adequados para intervenção farmacológica e servirem de
biomarcadores para o TEA
Para fins de logística, o trabalho foi divido em dois projetos, ambos aprovados pelo
Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA).
ARTIGO 2 – USO DE RESVERATROL EM SUJEITOS DE PESQUISA

PEDIÁTRICOS COM DIAGNÓSTICO DE TRANSTORNO DO ESPECTRO
AUTISTA.
ARTIGO 3 - AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE microRNA EM SUJEITOS

PEDIÁTRICOS COM TRANSTORNO DO ESPECTRO AUTISTA.
58
4 OBJETIVOS RELACIONADOS AO ARTIGO 2: USO DE RESVERATROL EM
SUJEITOS DE PESQUISA PEDIÁTRICOS COM DIAGNÓSTICO DE
TRANSTORNO DO ESPECTRO AUTISTA
4.1 OBEJTIVO GERAL
Avaliar o efeito do Resveratrol na dose de 200mg/dia nos sintomas do Transtorno do

Espectro Autista (interação social, comunicação e comportamentos restritos e
estereotipados) em sujeitos pediátricos.
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

a) Avaliar tolerabilidade do uso do resveratrol;
b) Avaliar os possíveis efeitos adversos do resveratrol.
c) Avaliar as possíveis alterações laboratoriais causadas pelo resveratrol.
d) Avaliar a expressão de microRNA de interesse em células mononucleares do

sangue periférico (PBMCs) pré e após uso de resveratrol.
5 METODOLOGIA RELACIONADA AO ARTIGO 2: USO DE RESVERATROL
EM SUJEITOS DE PESQUISA PEDIÁTRICOS COM DIAGNÓSTICO DE
5.1 DELINEAMENTO DO ESTUDO
Este é um estudo terapêutico piloto (Fase I/II), na forma de ensaio clínico aberto, para
prova de conceito, monocêntrico, em sujeitos com diagnóstico de TEA de 10 a 18 anos
de idade.
59
5.2 AMOSTRA
A amostra foi obtida por conveniência. A pesquisa foi divulgada no ambulatório

de TEA do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA) por meio de cartazes. A
seleção seguiu a ordem de inscrições, incluindo no estudo os 5 primeiros voluntários em
acordo com os critérios de seleção.
5.2.1 Critérios de Inclusão
a) Diagnóstico de TEA de acordo com os critérios do DSM-5, confirmado

pelo julgamento do investigador;
b) Idade entre 10 e 18 anos;
c) Sujeitos em uso de tratamento psicofarmacológico considerado adequado
pelo investigador, em dose estável por no mínimo 4 semanas antes da
inclusão, sem necessidade de adequação da dose ao longo do estudo;
5.2.2 Critérios de Exclusão
a) Presença de síndromes associadas ao TEA, como a seguir: diagnóstico de

Síndrome de X frágil, Síndrome de Rett, Síndrome de Angelman,
Síndrome de Prader-Willi, Síndrome de Smith-Lemli-Opitz e Esclerose
Tuberosa;
b) Início de nova medicação ou interrupção de medicamento prévio que
possa gerar alteração comportamental (exemplo, Risperidona) causando
fator de confusão com RSV.
c) Necessidade modificação na rotina (exemplo, mudança de endereço,
terapias ou medicações) que possa gerar fator de confusão com RSV;
d) Estar em uso de anticonvulsivantes;
e) Apresentar doença sistêmica em atividade (como cardiopatia,
hepatopatia, nefropatia);
60
f) Qualquer condição que, no parecer do investigador, colocaria a

segurança do sujeito em risco após a exposição à substância em estudo;
Optou-se pela idade de inclusão mínima de 10 anos pela maior facilidade de

administração do medicamento, já que a apresentação do RSV é em cápsulas e crianças
menores poderiam ter dificuldade de deglutição. Além disso, aos 10 anos as crianças
apresentam uma massa corporal mais próxima ao de adultos, facilitando cálculo da dose.
5.3 INTERVENÇÃO
Os sujeitos receberam RSV na dose de 200mg/dia (duas cápsulas de 100mg em

tomada única diária pela manhã) por 90 dias. O RSV utilizado apresenta níveis de pureza
adequados para ensaios clínicos (99% trans-RSV, Farmácia Reativa, Porto Alegre, RS).
Optou-se pela dose de 200mg ao dia por três fatores:
1) Resultados de três ensaios pré-clínicos de eficácia quimiopreventiva sugerem

que repetidas doses baixas diárias de RSV (acima 2 mg/kg) são suficientes
para produzir concentrações plasmáticas máximas de RSV de até 2 μM
(GESCHER; STEWARD, 2003).
2) Aplicando os fatores de translalação de doses (REAGAN-SHAW; NIHAL;
AHMAD, 2008), as "doses humanas equivalentes" diárias. para
quimioproteção, seriam cerca de 2mg-78mg (com base nos dados nos ratos)
ou 12-290mg (com base nos camundongos) para uma pessoa de 60kg
(VANG et al., 2011).
3) Estudos em adultos utilizando 200mg ao dia sugerem segurança dessa
dosagem.
5.4 VARIÁVEIS EM ESTUDO
Nesse estudo foram avaliadas as seguintes variáveis:

a) valor da escala Clinical Global Impression-Improvement Scale (CGI-I);
61
b) valores das subescalas da Aberrant Behavior Checklist (ABC): I - irritabilidade,

agitação e choro; II - letargia e esquiva social; III - comportamento estereotipado;
IV - hiperatividade; V - fala inapropriada;
c) possíveis efeitos adversos;
d) expressão de miRNA (hsa-miR-21-5p, hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-25-3p, hsa-
miR-30c-5p, hsa-miR-106b-5p, hsa-miR-124-3p, hsa-miR-125a-5p, hsa-miR-
132-3p, hsa-miR-134-5p, hsa-miR-138-5p, hsa-miR-145-5p, hsa-miR-146a-5p,
hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-181b-5p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-195-5p, hsa-
miR-199-5p, hsa-miR-218-5p);
5.5 DESFECHO ESPERADO
Espera-se como desfecho da intervenção uma diminuição dos escores dos

instrumentos utilizados na avaliação dos sintomas do TEA e modificação na expressão
dos miRNA de interesse.
5.6 FERRAMENTAS DE PESQUISA
Clinical Global Impression (CGI) (Impressão Clínica Global):
Escala simples, de fácil aplicação, respondida pelo pesquisador, universalmente

reconhecida e utilizada em estudos terapêuticos com pacientes com desordens mentais
(GUY W, 1976), Anexo B. Apresenta 2 componentes:
-CGI-S: Clinical Global Impression – Severity Scale: avalia a severidade da doença, com
escores variando de 1 (normal, não doente) a 7 (doença mental extremamente grave). Esta
escala será aplicada apenas na primeira visita a fim de caracterização da amostra.
-CGI-I: Clinical Global Impression – Improvement Scale: avalia a melhora global desde
o início do tratamento, com escores variando de 1 (muito melhor) a 7 (muito pior);
Aberrant Behavior Checklist (ABC) (Lista de Checagem de Comportamento):

62
A ABC é um questionário constituído por 58 itens, elaborados para avaliação de

sintomas comportamentais em população com retardo mental. É um dos instrumentos
mais utilizados para avaliação de tratamentos nesse grupo de indivíduos. Seu uso em
sujeitos com TEA já foi testado, mostrando alta validade interna e externa, Anexo C.
A escala ABC apresenta 58 itens divididos em 5 subescalas:
I – irritabilidade, agitação e choro (15 itens);
II – letargia e esquiva social (16 itens);
III – comportamento estereotipado (7 itens);
IV – hiperatividade (16 itens);
V – fala inapropriada (4 itens)
A escala é acompanhada por um cabeçalho que deve ser preenchido com as

seguintes informações: Características demográficas (idade, sexo, grau de retardo),
qualquer diagnóstico médico ou psiquiátrico, uma lista das medicações em uso. Em
seguida há uma folha de respostas na qual a pontuação deve ser descrita nas subescalas,
para acompanhar a evolução do paciente em todos os cinco fatores avaliados no decorrer
do tratamento. Para cada item há as seguintes opções de pontuação: 0- não é problema;
1- o comportamento é um problema, mas em grau leve; 2- o problema tem gravidade
moderada; 3- o problema é grave (AMAN et al., 1985; LOSAPIO et al., 2011).
5.7 EXTRAÇÃO DE MICRORNA
Coleta de PBMCs
As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram coletadas a partir
de 5 ml de sangue periférico retirado de cada indivíduo por venopunção em tubos de
EDTA e isoladas por gradiente de densidade (Histopaque 1,077 g/ml; Sigma Aldrich, St.
Louis, Missouri) de acordo com as instruções do fabricante.
O sangue total foi centrifugado a 1200 rpm durante 15 minutos à temperatura
ambiente. O plasma foi retirado e imediatamente armazenado em TRIzol® (1:2). O
sangue foi reconstituído com PBS no mesmo volume de plasma retirado. O sangue
anticoagulado reconstituído foi depositado sobre o Histopaque-1077 e centrifugado a 400
63
g (rcf) durante 30 minutos à temperatura ambiente. Os linfócitos e outras células

mononucleares permanecem na interface plasma/Histopaque 1,077. As PBMCs foram
aspiradas, transferidas para um tubo de centrífuga cônico limpo e lavadas com solução
isotônica de salina tamponada com fosfato (PBS). Após nova centrifugação a 1500 rpm
durante 5 minutos a 4ºC, o sedimento contendo as células foi ressuspenso em PBS e as
células foram ressuspensas para contagem. As PBMCs purificadas foram marcadas com
azul de tripan (1:10) e contadas manualmente com um hemocitômetro. As células foram
também imediatamente armazenadas em TRIzol®.
Extração de RNA e Reação em Cadeia da Polimerase precedida por Transcrição Reversa

(RT-qPCR)
O RNA total das amostras de plasma foi isolado usando QIAzol® (QIAGEN,
Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante.
A síntese de DNA complementar (cDNA) foi realizada de acordo com (CHEN et
al., 2005). Foi adicionado 1.25 mM de 20 primers stem-loop (U6, RNU6, hsa-miR-21-
5p, hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-25-3p, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-106b-5p, hsa-miR-124-
3p, hsa-miR-125a-5p, hsa-miR-132-3p, hsa-miR-134-5p, hsa-miR-138-5p, hsa-miR-145-
5p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-181b-5p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-
195-5p, hsa-miR-199-5p, hsa-miR-218-5p) ao mix contendo RNA, oligo(dT)25V (5
mM), 250 mM de dNTPs (Ludwig, RS, Porto Alegre, Brasil) e água livre de RNase para
um volume total de 17 ml seguido de uma incubação a 65°C por 5 minutos e resfriamento
em gelo. A enzima MML-V RT (New England Biolabs, MA, USA) foi usada para a
síntese de cDNA de acordo com as instruções do fabricante. Cada mix de reação foi
incubado a 16°C por 30 minutos seguido de outros 30 minutos a 42°C. Todas as amostras
de cDNA foram diluídos 50 vezes em água livre de RNAse. Os primers stem-loop,
primers de iniciação e o primer universal reverso foram desenhados de acordo com
(CHEN et al., 2005). Todas as sequências dos primers são apresentadas na Tabela 7.
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) em Tempo Real foi realizada no
sistema de detecção de PCR em tempo real Bio-Rad CFX384 (Bio-Rad, Hercules, CA,
USA) usando SYBR Green I (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). O PCR foi realizado no
volume de 10 μL contendo 5 μL de cDNA diluído (1:50), 1× SYBR Green I (Invitrogen,
CA, USA), 0.1mM de dNTPs, 1× Tampão de PCR, 3mM MgCl , 0.25U de Taq DNA
2
64
Polimerase (Quatro G, RS, Porto Alegre, Brazil) e 200 nM de cada primer de iniciação e
reverso. Amostras foram analisadas em triplicatas biológicas em placa de 384 poços, e,
um controle foi incluído. Os genes de referência foram escolhidos de acordo com o
software GeNorm para determinar o número de miRNA necessários para normalização e
para identificar os miRNA mais pcr foram setadas como segue: uma etapa inicial de
ativação da polimerase por 5 min. a 95 °C, 40 ciclos de 15 segundos a 95 °C para
desnaturação, 10 segundos a 60 °C para anelamento e 10 segundos a 72 °C para
alongamento. A análise da curva de melting foi programada ao fim da corrida de PCR no
intervalo de 65 a 95 °C, e a temperatura aumentou gradualmente em 0.4 °C. O limite e as
linhas de base foram determinados manualmente usando o software do gerenciador Bio-
Rad CFX. Para calcular a expressão relativa dos miRNA foi utilizado o método 2 -ΔΔCt
(LIVAK; SCHMITTGEN, 2001). O teste t de Student foi realizado para comparar as

diferenças de expressão entre as diferentes amostras. As médias foram consideradas
significativamente diferentes quando p <0,05.
Tabela 7 - Sequência de primers dos 19 miRNA avaliados, incluindo primers de

iniciação, RT stem-loop e um universal reverso.
Tipo de
miRNA ID Sequências de miRNA Sequências de primers
primer
TCC GGC TAA CAG TCT ACA
Iniciação
GCC A
miR132-3p uaacagucuacagccauggucg GTC GTA TCC AGT GCA GGG
RT stem-
TCC GAG GTA TTC GCA CTG
loop
GAT ACG AC cgacca
TCC GGA AGC TGG TGT GAA
Iniciação
TC
miR138-5p agcugguguugugaaucaggccg GTC GTA TCC AGT GCA GGG
RT stem-
loop
GAT ACG AC cggcct
GTC GCG ATC CCT GAG ACC
Iniciação
CTT TA
miR125a-5p ucccugagacccuuuaaccuguga GTC GTA TCC AGT GCA GGG
RT stem-
loop
GAT ACG AC tcacag
GGG CGC TAG CAG CAC AGA
Iniciação
AAT A
miR195-5p uagcagcacagaaauauuggc GTC GTA TCC AGT GCA GGG
RT stem-
loop
GAT ACG AC gccaat
GAT GCG CCC AGT GTT CAG
Iniciação
ACT
miR199a-5p cccaguguucagacuaccuguuc GTC GTA TCC AGT GCA GGG
RT stem-
loop
GAT ACG AC gaacag
65
GGC TCT TGT GAC TGG TTG

Iniciação
ACC A
miR134-5p ugugacugguugaccagagggg GTC GTA TCC AGT GCA GGG
RT stem-
loop
GAT ACG AC cccctc
CTA GCT TAA GGC ACG CGG
Iniciação
TGA
miR124-3p uaaggcacgcggugaaugcc GTC GTA TCC AGT GCA GGG
RT stem-
loop
GAT ACG AC ggcatt
GCG CTG AAC ATT CAA CGC
Iniciação
TGT C
miR181a-5p aacauucaacgcugucggugagu GTC GTA TCC AGT GCA GGG
RT stem-
loop
GAT ACG AC actcac
GCT GCG CAA CAT TCA TTG
Iniciação
CTG TC
miR181b-5p aacauucauugcugucggugggu GTC GTA TCC AGT GCA GGG
RT stem-
loop
GAT ACG AC acccac
TCA GCA CAT TGC ACT TGT
Iniciação
CTC GG
miR25-3p cauugcacuugucucggucuga GTC GTA TCC AGT GCA GGG
RT stem-
loop
GAT ACG AC tcagac
CCG GCG CTA GCT TAT CAG
Iniciação
ACT GAT
miR21-5p uagcuuaucagacugauguuga GTC GTA TCC AGT GCA GGG
RT stem-
loop
GAT ACG AC tcaaca
GCT GTC ATC ACA TTG CCA
Iniciação
GGG A
miR23a-3p aucacauugccagggauuucc GTC GTA TCC AGT GCA GGG
RT stem-
loop
GAT ACG AC ggaaat
CGT GGC GTG AGA ACT GAA
Iniciação
TTC CA
miR146a-5p ugagaacugaauuccauggguu GTC GTA TCC AGT GCA GGG
RT stem-
loop
GAT ACG AC aaccca
GCC GTC CTT GTG CTT GAT
Iniciação
CTA ACC
miR218-5p uugugcuugaucuaaccaugu GTC GTA TCC AGT GCA GGG
RT stem-
loop
GAT ACG AC acatgg
GCG TCG CTG TAA ACA TCC
Iniciação
TAC ACT C
miR30c-5p uguaaacauccuacacucucagc GTC GTA TCC AGT GCA GGG
RT stem-
loop
GAT ACG AC gctgag
GGA GCG TCA ACG GAA TCC
Iniciação
CAA AAG
miR191-5p caacggaaucccaaaagcagcug GTC GTA TCC AGT GCA GGG
RT stem-
loop
GAT ACG AC cagctg
66
GGG CGC TAA AGT GCT GAC

Iniciação
AGT
miR106b-5p uaaagugcugacagugcagau
GTC GTA TCC AGT GCA GGG
RT stem-
loop
GAT ACG AC atctgc
TTG GAG GTC CAG TTT TCC
Iniciação
CAG GA
miR145-5p guccaguuuucccaggaaucccu
RT stem-
loop
GAT ACG AC agggat
Iniciação ATG AGT GCT CGC TTC GGC A

U6 augagugcucgcuucggca
RT stem-
loop
GAT ACG AC aaaata
ACG TAC GCA AGG ATG ACA
Iniciação
CGC
RNU6B acgtacgcaaggatgacacgc
RT stem-
loop
GAT ACG AC aaaaat
REVERSE 5′-CCA GTG CAG GGT CCG AGG
Iniciação
UNIVERSAL TA-3′
5.8 LOCAL DE REALIZAÇÃO
As escalas e as coletas de sangue foram realizadas no Centro de Pesquisas Clínicas

(CPC) do HCPA. As análises laboratoriais foram realizadas pelo Laboratório do Hospital
de Clínicas de Porto Alegre e a análise de expressão dos miRNA e interleucinas no
Laboratório de Plasticidade Neuroglial, Departamento de Bioquímica – UFRGS.
5.9 LOGÍSTICA
Um dia antes do início do tratamento com RSV foi aplicada as escalas (CGI e ABC)
para avaliação comportamental e coletado sangue por punção de veia periférica para
exames laboratoriais e avaliação da expressão de miRNA.
Após 45 dias de uso de RSV, novamente houve a coleta de sangue e entrevista com
os pais para verificar possíveis efeitos colaterais.
No 90º dia, foi realizada a terceira entrevista com os responsáveis e coletado nova
amostra de sangue.
67
A seleção dos participantes do estudo, a distribuição da medicação, a aplicação de

escalas e a avaliação clínica dos pacientes em todos os momentos foram realizadas pelo
mesmo pesquisador.
Os pesquisadores ficaram disponíveis aos familiares constantemente durante toda a
pesquisa. Essa seria prontamente interrompida se surgissem sintomas colaterais
moderados, severos ou difíceis de tratar ou a qualquer momento, se assim fosse a vontade
dos responsáveis pela criança.
Para fins de controle de adesão, o número de cápsulas era contabilizado no dia de
aplicação de escalas pelo pesquisador.
5.10 ASPECTOS ESTATÍSTICOS
5.10.1 Cálculo do tamanho da amostra
Como se tratava de um estudo piloto para prova de conceito e não existiam dados
de segurança do uso de RSV em crianças, optou-se por sua administração em número
reduzido de sujeitos, sem cálculo de tamanho amostral.
5.10.2 Análise dos resultados
Os dados foram armazenados em banco de dados criado em planilha Excel e após

transportados para o programa SPSS (Statistical Package for the Social Sciences), versão
21.0, onde foram processados e analisados.
Na análise descritiva, foram utilizados média, mediana e desvio padrão para as
variáveis quantitativas e as frequências absolutas e relativas para as variáveis qualitativas.
Na comparação valores de expressão dos miRNA, foi utilizado o teste t de Student
para amostras emparelhadas. Na comparação das médias de valores da escala ABC foram
usados o teste t de Wilcoxon e para o cálculo do tamanho do efeito foi utilizado a fórmula
d de Cohen, ajustada para n menor que 50. Para significância estatística, foi considerado
um valor de p igual ou menor a 0,05.
68
5.11 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS
Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do HCPA (registro no
Grupo de Pesquisas do HCPA – 17-0132). Os pais e/ou responsáveis assinaram o Termo
de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE), Apêndice A. O estudo foi cadastrado no
Registro Brasileiro de Ensaios Clínicos (ReBEC), registro 6356 e na International
Clinical Trials Registry Platform - World Health Organization (WHO), Número
Universal do Ensaio U1111-1213-6255.
Esta investigação encontra-se adequadamente alicerçada em normas e
conhecimentos cientificamente consagrados em experiências laboratoriais, in vitro e
conhecimento da literatura pertinente, conforme apresentado na revisão da literatura.
O protocolo seguiu todos os aspectos éticos e metodológicos da Resolução

466/2012 - Diretrizes e Normas Regulamentadoras de Pesquisas Envolvendo Seres
Humanos, e Resolução 251/97 - Normas de Pesquisa com Novos Fármacos,
Medicamentos, Vacinas e Testes Diagnósticos Envolvendo Seres Humanos.
Este é um projeto acadêmico, sem qualquer vínculo com a indústria farmacêutica

ou patrocínio. Por seu caráter exploratório, não há previsão de manutenção de tratamento
com RSV após o período preconizado.
69
6 OBJETIVOS RELACIONADOS AO ARTIGO 3: AVALIAÇÃO DA
EXPRESSÃO DE microRNA EM SUJEITOS PEDIÁTRICOS COM
6.1 OBEJTIVO GERAL
Avaliar o padrão de expressão de um conjunto de miRNA relacionados ao TEA e

sistema inflamatório em sujeitos pediátricos em comparação com seus respectivos
controles.
6.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
a) Avaliar o perfil de expressão de miRNA na saliva de sujeitos pediátricos com

diagnóstico de TEA e sujeitos com desenvolvimento normal.
b) Buscar, em banco de dados online, possíveis alvos para miRNA alterados.
7 METODOLOGIA RELACIONADA AO ARTIGO 3: AVALIAÇÃO DA
EXPRESSÃO DE microRNA EM SUJEITOS PEDIÁTRICOS COM
7.1 DELINEAMENTO DO ESTUDO
Este é um estudo transversal, caso-controle, monocêntrico, em sujeitos pediátricos

com diagnóstico de TEA com idade de 3 a 18 anos e controles com desenvolvimento
normal.
70
7.2 AMOSTRA
A amostragem foi por conveniência e proveniente do ambulatório de TEA da

Unidade de Neuropediatria do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA) para os casos
e da Ambulatório de Pediatria e Cirurgia Pediátrica para os controles.
Os indivíduos controles tiveram avaliação de desenvolvimento normal para

fazerem parte do estudo e foram pareados por idade e sexo. A avaliação do
desenvolvimento foi realizada pelo neuropediatra pesquisador que obteve as amostras de
saliva. Somente foram selecionados os controles com desenvolvimento compatível com
a idade cronológica e sem patologias que pudessem gerar distúrbios do comportamento.
7.2.1 Critérios de Inclusão
a) Diagnóstico de TEA de acordo com os critérios do DSM-5, confirmado

pelo julgamento do investigador;
b) Idade entre 3 e 18 anos;
c) Neuroimagem normal (tomografia computadorizada ou ressonância
magnética de crânio);
d) Investigação genética normal (cariótipo para meninas; cariótipo e pesquisa
de X-frágil para meninos);
7.2.2 Critérios de Exclusão
a) Presença de patologias associadas ao autismo, como a seguir:

diagnóstico de Síndrome de X frágil, Síndrome de Rett, Síndrome de
Angelman, Síndrome de Prader-Willi, Síndrome de Smith-Lemli-Opitz e
Esclerose Tuberosa;
b) Presença de cáries dentárias ou doença periodontal;
c) Presença de doença de vias aérea alta ou orofaringe que possam
prejudicar a coleta.
71
d) Qualquer condição que, no parecer do investigador, colocaria a segurança

do sujeito em risco.
7.3 VARIÁVEIS EM ESTUDO
Nesse estudo serão avaliadas as seguintes variáveis:

a) Expressão relativa de miRNA na saliva;
b) pontuação das subescalas da Aberrant Behavior Checklist (ABC): I -
irritabilidade, agitação e choro; II –l letargia e esquiva social; III -
comportamento estereotipado; IV - hiperatividade; V - fala inapropriada;
7.4 DESFECHO ESPERADO
Espera-se a expressão na saliva dos microRNA seja diferente entre casos e

controles.
7.5 LOCAL DE REALIZAÇÃO
As escalas e as coletas de saliva foram realizadas no Ambulatório de TEA e de

Pediatria do HCPA. A análise de expressão dos microRNA foi realizada no Laboratório
de Plasticidade Neuroglial, Departamento de Bioquímica – UFRGS.
7.6 LOGÍSTICA
As crianças e familiares foram convidados para participar da pesquisa nos

Ambulatórios de TEA e Pediatria do HCPA. Após os responsáveis assinarem o TCLE, a
criança era convidada a enxaguar a boca com água, e posteriormente a coleta de saliva,
cerca de 3 ml por expectoração, era realizada com cuidados para evitar contaminação –
uso de luvas, máscara e frasco esterilizado. Imediatamente após a coleta da saliva, essa
era transferida para um tubo de microcentrífuga e colocada em gelo. Posteriormente a
amostra era transferida para o laboratório de Plasticidade Neuroglial para análise
72
conforme o item 7.6.1 Para os casos houve aplicação da escala ABC imediatamente após
a coleta da saliva, para os controles o pesquisador realizou uma avaliação dos prontuários
médicos, uma breve anamnese com os responsáveis e com a criança visando descartar
patologias relacionadas ao desenvolvimento.
7.6.1 Coleta de saliva e análise de microRNA
As coletas ocorreram pela manhã, entre as 8 e 12 horas. A criança era convidada

a enxaguar a boca com água, e posteriormente a coleta de saliva, cerca de 3ml, era
realizada através de expectoração diretamente em frasco esterilizado. Para evitar
contaminação, o responsável pela coleta fazia uso de luvas e máscara. Imediatamente a
saliva era transferida para tubo de microcentrífuga e colocada em gelo, posteriormente
sendo transferida para o laboratório de Plasticidade Neuroglial.
O protocolo para isolamento do exossoma salivar foi adaptado de Machida e

colaboradores (MACHIDA et al., 2015). Imediatamente após a coleta, a saliva foi
colocada em gelo e em no máximo 2h centrifugada a 2000 g (rcf) durante 10 minutos a
4°C. O sobrenadante foi removido, transferido para um tubo de centrífuga estéril,
imediatamente acondicionado em reagente QIAzol® (diluição 1:2) e estocado em freezer
a -80°C para posterior extração de RNA total.

(RT-qPCR)
O RNA total das amostras de saliva foi isolado usando QIAzol® (QIAGEN,
5p, hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-25-3p, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-106b-5p, hsa-miR-124-
3p, hsa-miR-125a-5p, hsa-miR-132-3p, hsa-miR-134-5p, hsa-miR-138-5p, hsa-miR-145-
5p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-181b-5p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-
195-5p, hsa-miR-199-5p, hsa-miR-218-5p) ao mix contendo RNA, oligo(dT)25V (5
mM), 250 mM de dNTPs (Ludwig, RS, Porto Alegre, Brasil) e água livre de RNAse para
um volume total de 17 ml seguido de uma incubação a 65°C por 5 minutos e resfriamento
73
em gelo. A enzima MML-V RT (New England Biolabs, MA, USA) foi usada para a
síntese de cDNA de acordo com as instruções do fabricante. Cada mix de reação foi
incubado a 16°C por 30 minutos seguido de outros 30 minutos a 42°C. Todas as amostras
de cDNA foram diluídos 50 vezes em água livre de RNAse. Os primers stem-loop,
primers de iniciação e o primer universal reverso foram desenhados de acordo com
(CHEN et al., 2005).

CA, USA), 0.1mM de dNTPs, 1× Tampão de PCR, 3mM MgCl , 0.25U de Taq DNA
2
para identificar os miRNA mais estáveis para serem usados como normalizadores as
proteínas ribossomais HsRPS18 Fw (sequência de primer: TTC GGA ACT GAG GCC
ATG AT) e HsRPS18 Rv (sequência de primer: TTT CGC TCT GGT CCG TCT TG)
As condições de PCR foram setadas como segue: uma etapa inicial de ativação da
polimerase por 5 minutos a 95 °C, 40 ciclos de 15 segundos a 95 °C para desnaturação,
10 segundos a 60 °C para anelamento e 10 segundos a 72 °C para alongamento. A análise
da curva de melting foi programada ao fim da corrida de PCR no intervalo de 65 a 95 °C,
e a temperatura aumentou gradualmente em 0.4 °C. O limite e as linhas de base foram
determinados manualmente usando o software do gerenciador Bio-Rad CFX. Para
calcular a expressão relativa dos miRNA foi utilizado o método 2 -ΔΔCt
(LIVAK;
SCHMITTGEN, 2001). O teste t de Student foi realizado para comparar as diferenças de
expressão entre as diferentes amostras. As médias foram consideradas significativamente
diferentes quando p <0,05.
7.7 ASPECTOS ESTATÍSTICOS

74
7.7.1 Cálculo do tamanho da amostra
O estudo incluiu vinte e seis crianças diagnosticadas com TEA e vinte e seis crianças
com desenvolvimento normal, totalizando cinquenta e dois indivíduos. O cálculo do
tamanho da amostra (significância 5%, poder 80%) foi realizado no Núcleo de Assistência
em Estatística (NAE) do Instituto de Matemática e Estatística da UFRGS, através do
programa nQuery Advisor [MTTO-2]. Este número de amostras foi efetivo em
demonstrar alterações estatisticamente significativas no perfil de miRNA em pacientes
com TEA em trabalho prévio realizado pelo nosso grupo de pesquisa (estudo não
publicado).
7.7.2 Análise dos resultados

transportados para o programa SPSS (Statistical Package for the Social Sciences), versão
21.0, onde foram processados e analisados.
Na análise descritiva, foram utilizados média, mediana e desvio padrão para as
variáveis quantitativas e as frequências absolutas e relativas para as variáveis qualitativas.
Na comparação valores de expressão dos miRNA, foi utilizado o teste t de Student
para amostras independentes. Para significância estatística, foi considerado um valor de
p igual ou menor a 0,05.
7.8 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS
Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do HCPA (registro no
Grupo de Pesquisas do HCPA – 16-0567). Os pais e/ou responsáveis assinaram o TCLE
(Apêndices B e C).
O protocolo seguiu todos os aspectos éticos e metodológicos da Resolução
466/2012 - Diretrizes e Normas Regulamentadoras de Pesquisas Envolvendo Seres
Humanos. A dignidade e o bem-estar dos pacientes incluídos no estudo prevalecerão
sobre qualquer outro interesse, sejam econômicos, da ciência ou da comunidade.
75
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93
9 ARTIGO 1 - DISFUNÇÃO IMUNOLÓGICA NO TRANSTORNO DO

ESPECTRO AUTISTA: UM POTENCIAL ALVO TERAPÊUTICO
Disfunção imunológica no transtorno do espectro autista: um potencial alvo

terapêutico
Josemar Marchezan1,2,3,4, Iohanna Deckmann2,3,4,5, Eduardo Geyer Arrussul Winkler dos

Santos2,6, Rudimar Riesgo1,2,4,6,7.
1
Programa de Pós-Graduação em Saúde da Criança e Adolescente, Escola de Medicina,
Universidade Federal do Rio Grande do Sul-UFRGS, Porto Alegre, RS, Brasil.
2
Grupo de Pesquisa Translacional do Transtorno do Espectro Autista-GETTEA,
3
Laboratório de Plasticidade Neuroglial, Departamento de Bioquímica, Universidade
Federal do Rio Grande do Sul -UFRGS, Porto Alegre, RS, Brasil.
4
Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Neuroimunomodulação-INCT-NIM.
5
Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Bioquímica, Departamento de
Bioquímica, Universidade Federal do Rio Grande do Sul-UFRGS, Porto Alegre, RS,
Brasil.
6
Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Rio Grande do Sul-UFRGS, Porto
Alegre, RS, Brasil.
7
Departamento de Pediatria, Unidade de Neurologia Infantil, Hospital de Clínicas de
Porto Alegre.
RESUMO
O transtorno do espectro do autista (TEA) é um transtorno complexo do
neurodesenvolvimento com etiologia desconhecida e, atualmente, com poucas terapias
efetivas. Alterações no sistema imune no TEA têm sido demonstradas tanto em modelos
animais como em humanos. Assim, o desequilíbrio imunológico surge como uma
possível via para a intervenção farmacológica. Nesta revisão, os estudos foram
classificados em dois grandes grupos: 1) pesquisas clínicas cujos autores classificam as
drogas utilizadas como possuindo ação primária anti-inflamatória e imunomoduladora:
sulforafano, celecoxibe, lenalidomida, pentoxifilina, espironolactona, luteolina,
corticosteróides, imunoglobulina oral, imunoglobulina intravenosa, terapia celular,
extratos de linfócitos dialisáveis, minociclina e pioglitazona; e 2) outras terapias já
utilizadas ou atualmente em estudo no TEA, cujas características iniciais não eram nem
anti-inflamatórias nem imunomoduladoras, mas que estudos sugerem que possam ter
potencial de imunomodulação durante o tratamento: risperidona, vitamina D, ômega-3,
Ginkgo biloba e L-carnosina. , N-acetilcisteína e terapias de restauração de microbioma.
94
Esses estudos usaram diferentes metodologias de aquisição de dados e são revisados aqui.
Questões como estudos randomizados e controlados com placebo, maior número de
participantes, e o uso de biomarcadores para melhorar o tratamento do TEA também são
levantadas.
Palavras chave: TEA, autismo, sistema imune, terapia imune, neuroimunes.
Introdução
O transtorno do espectro do autista (TEA) é um transtorno do desenvolvimento e

seus principais sintomas são: 1) déficits na comunicação e interação sociais e 2) padrões
restritos e repetitivos de comportamento, interesses e atividades (ASSOCIATION, 2013).
O diagnóstico de autismo (usado aqui como sinônimo de TEA em todo o texto) aumentou
dramaticamente nas últimas décadas (GOTTFRIED et al., 2015; NORIEGA;
SAVELKOUL, 2014). Em 2018, o Center for Disease Control and Prevention (CDC)
estimou que a prevalência de TEA em 16,8 por 1.000 (uma em 59) crianças com 8 anos,
afetando 26,6 em 1.000 meninos e 6,6 em 1.000 meninas (razão de prevalência 4:1)
(BAIO et al., 2018). Isso representa um aumento de aproximadamente 150% entre os
anos 2000 e 2014 (BAIO et al., 2018), tornando o transtorno um problema de saúde
pública (BAXTER et al., 2015; BRENTANI et al., 2013). Estudos na Ásia, Europa e
América do Norte descrevem uma prevalência média de TEA em torno de 1%
(NORIEGA; SAVELKOUL, 2014).
Apesar do aumento no número de casos, os tratamentos atualmente disponíveis

melhoram parcialmente alguns sintomas do TEA, não revertendo completamente todos
os seus sintomas (BENVENUTO et al., 2013; MEAD; ASHWOOD, 2015;
ROSSIGNOL, 2009), e apenas duas drogas, risperidona e aripiprazol, são aprovadas pelo
Food and Drug Administration (FDA) para o tratamento dos sintomas disruptivo desses
pacientes (KAPLAN; MCCRACKEN, 2012; LECLERC; EASLEY, 2015; MARCUS et
al., 2009; MEAD; ASHWOOD, 2015; OWEN et al., 2009). Além disso, outros fatores
como 1) o prejuízo individual, com muitas facetas do funcionamento diário afetado
(MASI et al., 2017), 2) o substancial efeito econômico direto e indireto dos tratamentos
e 3) o sofrimento da família reforçam a necessidade da busca contínua por intervenções
eficazes (BUESCHER et al., 2014; KARST; VAN HECKE, 2012; MARCHEZAN et al.,
2017; SMITH; GREENBERG; MAILICK, 2014; WEISS et al., 2012).
95
O TEA é uma desordem do desenvolvimento complexa (NORIEGA;

SAVELKOUL, 2014), e embora várias definições e avanços tenham sido feitas, os
aspectos etiológicos permanecem obscuros (GOTTFRIED et al., 2015; NORIEGA;
SAVELKOUL, 2014; VERKHRATSKY; RODRÍGUEZ; PARPURA, 2014). No
entanto, a contribuição de fatores genéticos e ambientais para os sintomas é consenso na
comunidade científica, não deixando dúvidas sobre o aspecto multifatorial do transtorno.
(CAREAGA; VAN DE WATER; ASHWOOD, 2010; GOTTFRIED et al., 2015;
MCDOUGLE et al., 2015; NORIEGA; SAVELKOUL, 2014; VERKHRATSKY;
RODRÍGUEZ; PARPURA, 2014).
A disfunção imunológica tem sido uma característica reconhecida no TEA há

várias décadas e tem sido destacada em revisões recentes (CAREAGA; VAN DE
KRZYWDZIŃSKA; HOZYASZ, 2018; GOTTFRIED et al., 2015; MASI et al., 2015,
2017; MCDOUGLE et al., 2015; MEAD; ASHWOOD, 2015; NORIEGA;
SAVELKOUL, 2014; VERKHRATSKY; RODRÍGUEZ; PARPURA, 2014). Em 1976,
um estudo descreveu que 5 de 13 crianças com autismo tinham títulos de anticorpos
indetectáveis, apesar da vacina anterior para rubéola, enquanto todos os indivíduos
controle tinham títulos detectáveis, fazendo a primeira sugestão de uma ligação entre o
sistema imunológico e TEA (GŁADYSZ; KRZYWDZIŃSKA; HOZYASZ, 2018;
STUBBS, 1976). Nas últimas décadas, estudos em modelos animais e humanos
mostraram evidências de alterações no funcionamento do sistema imunológico central e
periférico no autismo, incluindo alterações na estimulação de células imunes, na geração
de auto-anticorpos, desequilíbrio de citocinas/quimiocinas e aumento da permeabilidade
da barreira hematoencefálica (BHE) (CAREAGA; VAN DE WATER; ASHWOOD,
2010; CHEZ; GUIDO-ESTRADA, 2010; GŁADYSZ; KRZYWDZIŃSKA; HOZYASZ,
2018; GOTTFRIED et al., 2015; MASI et al., 2015, 2017; MCDOUGLE et al., 2015;
MEAD; ASHWOOD, 2015; NORIEGA; SAVELKOUL, 2014; VERKHRATSKY;
RODRÍGUEZ; PARPURA, 2014). Interessantemente, muitos estudos também
demonstraram uma correlação entre os sintomas do TEA e os níveis de citocinas (AL-
AYADHI, 2005; AL-AYADHI; MOSTAFA, 2012, 2013, ASHWOOD et al., 2008,
2011a, 2011b; CAREAGA et al., 2017; EL-ANSARY et al., 2016; EL GOHARY et al.,
2015; ENSTROM et al., 2008; FERGUSON et al., 2016; HAN et al., 2017;
JYONOUCHI et al., 2005; JYONOUCHI; GENG; DAVIDOW, 2014; MAKINODAN et
96
al., 2017; NAPOLIONI et al., 2013; RICCI et al., 2013; ROSE; VAN DE WATER;
ASHWOOD, 2016; YANG et al., 2015), níveis de imunoglobulinas (IgM e IgG)
(HEUER et al., 2008), expressão de antígeno D8/17 de linfócitos B (HOLLANDER et
al., 1999), anticorpos séricos antineuronais (GOINES et al., 2011; MOSTAFA; AL-
AYADHI, 2012a; PIRAS et al., 2014), anticorpos anti-gangliosídio M1 (MOSTAFA;
AL-AYADHI, 2011) e anticorpos maternos (BRAUNSCHWEIG et al., 2012; PIRAS et
al., 2014). Esses dados suportam a hipótese de que um subgrupo de indivíduos com TEA
apresenta alguma forma de desregulação do sistema imune e que, pelo menos em parte,
essa desregulação possa contribuir para o fenótipo autista (CAREAGA; VAN DE
Muitos pesquisadores sugerem a possibilidade de que a disfunção imune no TEA

possa ser um alvo viável de intervenção farmacológica, e que um subgrupo de indivíduos
com autismo poderiam se beneficiar de terapias imunes (CAREAGA; VAN DE WATER;
ASHWOOD, 2010; CHEZ; GUIDO-ESTRADA, 2010; ESTES; MCALLISTER, 2015;
GŁADYSZ; KRZYWDZIŃSKA; HOZYASZ, 2018; GOTTFRIED et al., 2015;
LACIVITA et al., 2017; MCDOUGLE et al., 2015; MEAD; ASHWOOD, 2015;
MELTZER; VAN DE WATER, 2017; NORIEGA; SAVELKOUL, 2014;
VERKHRATSKY; RODRÍGUEZ; PARPURA, 2014). Esta revisão tem como objetivo
descrever drogas que agem sobre o sistema imunológico e foram estudadas em pacientes
com TEA.
Métodos
Os ensaios clínicos descritos nesta revisão foram obtidos através da procura no

banco de dados PubMed usando os termos e palavras chave: “autism”, “autistic”,
“autistic spectrum disorder”, “ASD”, “Rett”, “Asperger”, “Pervasive Developmental
Disorder” and “PDD” associado aos termos “treatment”, “inflammation”,
“immunological drugs”, “immune”, “inflammation”, “inflammatory”, “anti-
inflammatory”, “immunomodulation”, “immunology”, “immunological”,
“neuroinflammation”, “neuroinflammatory”, “antibody”, “antibodies”,
97
“immunoglobulin”, “lymphocyte”, “glial activation”, “cytokine”,

“immunomodulatory”, “BDNF” “sulforaphane”, “pregnenolone”, “celecoxib”,
“immunoglobulin”, “ACTH”, “lenalidomide”, “pentoxifylline”, “pioglitazone”,
“spironolactone”, “corticosteroids”, “probiotics”, “luteolin”, “transplant”, “stem
cells”, “cell therapy”, “autologous”, “vitamin D”, “risperidone”, “naloxone”,
“minocycline” and “lymphocyte extract”. A pesquisa incluiu os artigos em inglês,
espanhol e português, somente estudos conduzidos em humanos e sem limite de data de
publicação.
Descrição das constatações relacionadas à disfunção imunológica no TEA e

potenciais terapias.
A inclusão de artigos nesta revisão baseou-se nos critérios de classificação dos

artigos originais, que consideraram mecanismos de ação anti-inflamatórios ou
imunomoduladores das terapias no TEA: 1) Pesquisa clínica cujos autores classificam as
drogas utilizadas contendo ação primária anti-inflamatória e imunomoduladora, com as
seguintes terapias: sulforafano, celecoxibe, lenalidomida, pentoxifilina, espironolactona,
luteolina, corticosteróides, imunoglobulina oral, imunoglobulina intravenosa, terapia
celular, extratos de linfócitos dialisáveis, minociclina e pioglitazona (Tabela 1). Os efeitos
colaterais dessas terapias, descritos nesses estudos, encontram-se na Tabela 2; e 2) outras
terapias já utilizadas ou atualmente em estudo no autismo cujas características iniciais
não eram nem anti-inflamatórias nem imunomoduladoras, mas potencialmente
desempenham essa capacidade durante o tratamento: risperidona, vitamina D, ômega-3,
Ginkgo biloba, L-carnosina, N- acetilcisteína e terapias de restauração de microbioma.
Sulforafano
Sulforafano é um isotiocianato derivado de vários vegetais Brassica

(especialmente o brócolis) (TAROZZI et al., 2013) com atividade anticâncer (JUGE;
MITHEN; TRAKA, 2007) e potencial efeito protetivo em doenças neurodegenerativas
(TAROZZI et al., 2013). Seu efeito terapêutico baseia-se na regulação positiva da
98
transcrição gênica relacionada aos mecanismos de proteção contra estresse oxidativo,

inflamação, dano ao DNA e radiação (SINGH et al., 2014).
Um estudo randomizado, duplo-cego e controlado por placebo avaliou o efeito do

sulforafano por até 18 semanas em 40 pacientes do sexo masculino com TEA (26 tratados
com sulforafano e 14 tratados com placebo), na dose de 50-150 μmol por dia. No grupo
tratado, a média do escore da escala Aberrant Behavior Checklist (ABC) diferiu em 4, 10
e 18 semanas em comparação com o escore basal, e especialmente em 18 semanas, houve
uma diminuição de 34% na pontuação ABC e 17% na escala Social Responsiveness Scale
(SRS). Melhora significativa foi observada nas subescalas irritabilidade, letargia,
estereotipia e hiperatividade da ABC, e nas subescalas consciência social, comunicação
social, motivação social e comportamentos repetitivos da SRS. Após a suspensão do
tratamento com sulforafano, ambas as escalas tenderam a retornar ao escore basal. Na
análise da Clinical Global Impression Improvement Scale (CGI-I) com 18 semanas de
tratamento, pacientes que usaram sulforafano estavam muito melhor na interação social,
comunicação verbal e comportamento atípico comparado aos pacientes que receberam
placebo. O uso do sulforafano foi seguro e bem tolerado, porém houve um aumento de
peso maior do que no grupo placebo. Dois participantes tiveram crises epilépticas únicas
não provocadas e sua relação com o uso de sulforafano não pôde ser descartada. É
possível que as crises tenham ocorrido como reflexo de um efeito adverso do sulforafano
(SINGH et al., 2014). Após 2 anos, os pacientes foram novamente contatados. Entre 16
pacientes, uma família relatou uma melhora comportamental mantida mesmo após a
descontinuação do uso do sulforafano, e nove famílias continuavam fazendo uso da
substância e mantendo melhora (LYNCH et al., 2017).
Celecoxibe
Celecoxibe é um anti-inflamatório não esteroidal que age reduzindo a ativação da

COX-2 e inibindo a via NF-kB (ARIAS-NEGRETE; KELLER; CHADEE, 1995;
SAREDDY et al., 2012). Celecoxibe foi usado como terapia adjuvante no tratamento de
TEA num estudo randomizado, duplo-cego e controlado por placebo. Quarenta crianças
foram aleatoriamente alocadas para receber celecoxibe + risperidona ou placebo +
risperidona por 10 semanas. A dose utilizada foi de 200 mg/dia para pacientes com peso
inferior a 30 kg e 300 mg/dia para pacientes com mais de 30 kg. Na semana 10, o grupo
99
risperidona + celecoxibe demonstrou melhora significativas nas subescalas ABC

irritabilidade, interação social e no comportamento estereotipado quando comparado à
risperidona + placebo. Nenhuma diferença significativa foi observada em relação aos
sintomas extrapiramidais ou outros efeitos colaterais (ASADABADI et al., 2013).
Lenalidomida
Lenalidomida é um análogo da talidomida usado em síndromes mielodisplásicas

e mais recentemente para terapia após transplante autólogo de células-tronco
hematopoiéticas (PULTE et al., 2018). Este medicamento tem menor toxicidade e maior
potência moduladora do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e outras citocinas do que
a talidomida. A lenalidomida surge como possível tratamento em pacientes com níveis
elevados de TNF-α no soro ou líquido cefalorraquidiano (LCR), bem como de
interleucina 1 (IL-1), IL-6 ou proteína 1 de ligação ao metil-CpG (MeCP-1) (CHEZ et
al., 2012).
Um estudo aberto foi conduzido com 7 indivíduos com TEA do sexo masculino
com idades entre 6 e 12 anos e com níveis elevados de TNF-α no LCR (> 50 pg/ml) para
avaliar os efeitos da lenalidomida 2,5 mg/dia por 12 semanas, com avaliações nas
semanas 6 e 12. No final do estudo, os níveis de TNF-α do soro e LCR reduziram em
57%, mas esta redução não atingiu significância estatística. Seis crianças que
completaram o seguimento de 6 semanas mostraram diminuição dos sintomas do autismo
nas escalas Childhood Autism Rating Scale (CARS), CGI linguagem expressiva, CGI
linguagem receptiva, mas não houve variação na One-Word Receptive Language Testing
Scores (ROWPVT). Com 12 semanas de tratamento houve aumento da resposta positiva
na CGI linguagem expressiva, mas a CGI linguagem receptiva e a CARS mostraram
valores semelhantes. As diferenças nos escores de habilidades sociais não foram
significativas em comparação ao início do tratamento. Três pacientes foram retirados do
estudo por efeitos colaterais, e após a suspensão do uso, os sintomas desapareceram
(CHEZ et al., 2012).
Pentoxifilina
100
Pentoxifilina (PTX) é um análogo da xantina conhecido como inibidor da

fosfodiesterase (KRETH et al., 2010) com efeito modulador no TNF-α, IL-10 e interferon
gama (IFN-γ) (DOLATABADI et al., 2017), sendo proposto como um potencial
tratamento para pacientes com TEA nos anos 70 e 80. Gupta et al. descreveram 5 séries
de caso numa revisão de 1996 (GUPTA, 2000; GUPTA; RIMLAND; SHILLING, 1996):
1) Vinte e três crianças com TEA foram tratadas com PTX (150-600 mg/dia por via oral).
Dentro de um mês de terapia, a droga foi considerada “notavelmente eficaz” em 10 casos,
“razoavelmente eficaz” em oito casos, “levemente eficaz” em três casos e “não teve
efeito” em dois pacientes. Os efeitos colaterais incluíram náuseas, vômitos, hipotensão
arterial e cefaleia num pequeno número de pacientes (SOGAME S, 1978); 2) Trinta
crianças com TEA foram avaliadas após receber PTX (sem dosagem ou duração do
tratamento especificado). Seis pacientes (20%) apresentaram melhora acentuada no
comportamento e 14 (47%) apresentaram melhora leve dos sintomas (NAKANE A,
1980); 3) Shimoide tratou com PTX 20 pacientes masculinos com TEA (a maioria dos
pacientes recebeu 200 mg/dia) por 3 meses. Os pacientes foram avaliados pela Seiken’s
Critical List for Autistic Children e pelo comportamento em situações específicas. Em
35% dos pacientes, houve melhora em pelo menos duas das três avaliações. Os efeitos
colaterais foram limitados ao trato gastrointestinal (SHIMOIDE M, 1981); 4) O
tratamento de 18 crianças psicóticas e duas crianças com TEA (um menino de 5 anos e
uma menina de 7 anos) com PTX (200 mg/dia na maioria dos pacientes) durante 4 a 10
meses revelaram melhoras “altamente positivas” no comportamento (12 crianças) e na
linguagem (14 crianças). Nas crianças com TEA, observou-se melhora na pronúncia de
sílabas e palavras. Os efeitos colaterais incluíram agitação (três pacientes) e distúrbios do
sono (dois pacientes), que desapareceram sem a interrupção da PTX (TUREK S, 1981);
5) PTX foi administrada a 20 crianças com autismo infantil precoce na dose de 10 a 15
mg/kg/dia, divididas em duas doses durante 3 meses, com o objetivo de avaliar as
mudanças na atividade do eletroencefalograma (EEG) por meio de um software de análise
auto regressivo (ARASIS). A comparação do EEG antes e depois da PTX mostraram
diferenças significativas em 7 (39%) de 18 pacientes. Houve melhora no “brincar com
um amigo” e a “comunicação pessoal num teste psicopatológico” (SUZUKI M;
NAKASHITA Y; OGAWA T, 1984).
Um ensaio clínico, duplo-cego e controlado por placebo administrou, para 2

grupos de quarenta pacientes, PTX + risperidona ou risperidona + placebo por 10
101
semanas. Houve avaliações pré tratamento e nas semanas 2, 4, 6, 8 e 10. A dose de PTX
foi de 400 mg/dia para crianças entre 10 e 40kg e 600mg para crianças com peso acima
de 40kg. O grupo risperidona + PTX demonstrou melhora significativamente maior em
todas as subescalas ABC. Não houve diferença nos sintomas extrapiramidais ou no efeitos
adversos (AKHONDZADEH et al., 2010).
Espironolactona
A espironolactona é um esteróide sintético, pertencente à classe de drogas

"diuréticos poupadores de potássio" e conhecida como um antagonista competitivo da
aldosterona com potentes propriedades anti-inflamatórias, imunológicas e modificadoras
hormonais (BENDTZEN; HANSEN; RIENECK, 2003; KATO et al., 2014; MIURA et
al., 2006a, 2006b; PÉREZ et al., 2016). Tem sido utilizada para acne, hirsutismo e
puberdade precoce, demonstrando segurança e tolerabilidade (BRADSTREET et al.,
2007). Bradstreet et al. (2007) relataram um caso de um menino de 12 anos com TEA,
desregulação imune, alergias alimentares e níveis elevados de testosterona. Ele
demonstrou reduções significativas na gravidade e frequência de vários sintomas
disruptivos durante quatro semanas de administração diária de espironolactona na dose
de 2 mg/kg. Comparando os escores da escala ABC antes e após o uso de espironolactona,
houve uma melhora de 79% na irritabilidade, 93% na letargia, 60% na estereotipia, 72%
na hiperatividade e 67% na fala inadequada. Conforme a escala Peabody Picture
Vocabulary Test III (PPVT-III) houve um ganho na linguagem receptiva compatível com
21 meses, indicando um aumento no vocabulário maior que de um desvio padrão em
qualquer nível de idade avaliado (BRADSTREET et al., 2007).
Luteolina
A luteolina é um flavonoide natural com propriedades antioxidantes e anti-

inflamatórias, sendo encontrada em uma infinidade de plantas (MIDDLETON;
KANDASWAMI; THEOHARIDES, 2000). Fontes alimentares de luteolina incluem
cenouras, pimentões, orégano e azeite (LÓPEZ-LÁZARO, 2009). Em humanos, foi
demonstrado que a luteolina inibe a secreção de mediadores pró-inflamatórios a partir de
mastócitos (KEMPURAJ et al., 2005).
102
Em um estudo, 37 crianças com TEA (29 meninos e 8 meninas, com idades entre
4 e 14 anos) receberam uma formulação de flavonoides na dieta (NeuroProtek)
contendo principalmente luteolina (100 mg). 75,67% dos indivíduos tiveram melhora na
cor, forma ou cheiro das fezes; 51,35% tiveram menos "problemas alérgicos"; 40,54%
começaram a ter melhor contato visual; 40,54% mostraram mais retenção de aspectos
aprendidos; 37,83% tiveram mais interação social; 32,43% melhoraram atenção; e
10,81% melhoraram em falar palavras ou frases. Este estudo não possuía nenhum
instrumento psicométrico específico ou uma avaliação independente por um avaliador
externo. Os autores não esclarecem a duração do tratamento ou seguimento
(THEOHARIDES; ASADI; PANAGIOTIDOU, 2012).
Outro estudo aberto avaliou o mesmo suplemento dietético (100 mg de luteolina)

em 42 meninos e 8 meninas com idades entre 4 e 10 anos, por um período de 26 semanas.
Os desfechos primários foram escores em três domínios (comunicacional, atividade de
vida cotidiana e social) da Vineland Adaptive Behavior Scale (VABS). Os desfechos
secundários foram os escores das escalas ABC, Autism Treatment Evaluation Checklist
(ATEC) e CGI-I. Houve melhora significativa no funcionamento adaptativo
(comunicação, habilidades de vida diária e social), medido pela VABS, bem como no
comportamento geral, indicado pela redução nas pontuações da escala ABC. Houve um
período transitório (1-8 semanas) de aumento da irritabilidade em 27 dos 50 participantes.
(TALIOU et al., 2013).
Num estudo de 2015, 40 pacientes com TEA receberam formula dietética

contendo luteolina por 26 semanas, reduzindo os sintomas do TEA e níveis séricos de
TNF-α e IL-6. Inicialmente os níveis de IL-6 estavam elevados em indivíduos com TEA
(sem significância estatística); enquanto os de TNF-α foram significativamente maiores
nos pacientes com TEA. Curiosamente, havia dois subgrupos de indivíduos com TEA
neste estudo: com baixos e altos níveis séricos de IL-6 e TNF-α. O último grupo (n = 10)
teve melhora significativa nas pontuações do VABS para todos os domínios; o escore
composto do VABS também foi significativamente maior. Em 26 semanas de tratamento,
os pacientes com TEA melhoraram em vários domínios comportamentais equivalentes a
9,73 meses no domínio da comunicação, 8,09 meses no domínio social e 6,64 meses nas
habilidades de vida diária (TSILIONI et al., 2015).
103
Em um estudo recente, a associação de palmitoiletanolamida + luteolina (700 mg

+ 70 mg duas vezes ao dia por um ano) foi administrada a um paciente autista de 10 anos
de idade. A avaliação com o questionário ATEC mostrou uma diminuição nos escores,
mostrando melhora nos resultados comportamentais. O tratamento reduziu os
comportamentos estereotípicos, melhorou significativamente o domínio cognitivo
(observado por pais e professores) e, curiosamente, diminuiu a enurese do indivíduo após
14 meses de tratamento (BERTOLINO et al., 2017).
Corticosteróides
Os corticosteroides são drogas anti-inflamatórias que inibem a secreção de

mediadores pró-inflamatórios, alteram a atividade das células T e também podem
interferir na ativação da micróglia (SCHWEINGRUBER et al., 2012). Um estudo
retrospectivo com prednisona oral (2 mg/kg/dia por 9-12 meses) avaliou os pacientes com
TEA através da escala Clinical Language Status Questionnaire (CLSQ), Resposta
Evocada Auditiva Modulada por Frequência (FMAER) e EEG. Para o grupo tratado (20
participantes) 9/14 eletrodos avaliados para a FMAER à 4Hz tiveram modificação
estatisticamente significativa, mais importantemente no eletrodo temporal póstero-
inferior esquerdo (TP9). Por outro lado, nenhuma diferença foi observada no grupo
controle (24 indivíduos não tratados). Os EEG dos grupos tratado e controle não
mostraram diferenças. Grupo tratado com esteróide também teve um aumento
significativo na média CLSQ após a terapia (DUFFY et al., 2014).
Shenoy et al. relataram resposta à terapia com esteróides em um caso de autismo

secundário à uma síndrome autoimune. O paciente foi tratado com diferentes regimes de
prednisolona oral, com uma dose média de 0,5 mg/kg/dia. Os sintomas de TEA
melhoraram progressivamente durante o período de um ano após o término da terapia
com corticosteroides (SHENOY; ARNOLD; CHATILA, 2000). Em um estudo
semelhante, uma criança com regressão de linguagem e de comportamento aos 22 meses
de idade (diagnosticada posteriormente com Transtorno Global do Desenvolvimento)
recebeu prednisona (2mg/kg/dia) por 28 semanas. Foram observados melhora da fala,
melhora da responsividade à comunicação verbal, melhora nas relações sociais e
diminuição de estereotipias motoras (STEFANATOS; GROVER; GELLER, 1995).
104
Morderkar e colaboradores descrevem 2 pacientes com diagnóstico de Transtorno

Desintegrativo da Infância que também foram tratados com corticosteroides,
apresentando melhora clínica semelhante. Após 2 mg/kg de tratamento diário com
prednisona, o primeiro paciente apresentou recuperação da fala no 11º dia de terapia. O
segundo sujeito, com tratamento de uma semana na mesma dose, apresentou melhora
progressiva da fala ao longo de 48 meses (MORDEKAR et al., 2009).
Na década de 90, vários estudos foram realizados com Org 2766, um Análogo
Sintético do Hormônio Adrenocorticotrófico (4-9). No entanto, Org 2766 não possui
atividade esteroidogênica substancial e exerce seus efeitos através de uma interação com
sistemas opioides endógenos (BUITELAAR et al., 1990, 1992a, 1992b, 1996;
VERBATEN et al., 1996). Outro estudo aberto com o neuroesteróide pregnenolona
encontrou melhora nos pacientes com TEA. Considerando que este fármaco não alterou
os níveis de cortisol, os autores sugerem que a pregnenolona atuaria através da modulação
dos receptores GABAA, alterando a relação de excitação/inibição em sistemas neurais
chave (FUNG et al., 2014; MARX et al., 2009).
Imunoglobulina Oral
A imunoglobulina oral, constituída predominantemente por IgG, é um

medicamento preparado a partir de imunoglobulinas obtidas de soro humano e bovino ou
leite bovino. Vários estudos demonstram sua sobrevivência à exposição gástrica e
resistência à digestão proteolítica no trato gastrointestinal (JASION; BURNETT, 2015).
Schneider et al. administraram imunoglobulina oral em um estudo piloto com 12

indivíduos com TEA, considerando a hipótese de que os distúrbios gastrointestinais
crônicos no TEA seriam secundários à deficiência na imunidade da mucosa. Após quatro
semanas, 50% dos indivíduos apresentaram melhora nos sintomas gastrintestinais
(SCHNEIDER et al., 2006).
Similarmente, Handen et al. testaram a eficácia da imunoglobulina humana oral

em sintomas gastrointestinais no TEA. Cento e vinte e cinco crianças com TEA foram
tratadas com diferentes doses de imunoglobulina (140 mg/dia, 420 mg/dia ou 840 mg/dia)
ou placebo. O desfecho primário foi avaliado pela Modified Global Improvement Scale
105
(MGIS), que não apresentou diferenças significativas entre os grupos (HANDEN et al.,
2009).
Imunoglobulina intravenosa
Imunoglobulina intravenosa (IVIG) é um tratamento que contém um conjunto de

várias moléculas de IgG do plasma humano (mais de 95% de IgG não modificada)
(RÜTTER; LUGER, 2001). Embora seja amplamente utilizado, o mecanismo de ação da
IVIG para o tratamento de doenças autoimunes ainda não está claro (MCDOUGLE et al.,
2015).
Um ensaio clínico com 12 crianças com autismo do sexo masculino que receberam
uma dose única de IVIG (0,4 g/kg) ou placebo e foram avaliadas após 6 ou 13 semanas
de tratamento. Houve melhora significativa da irritabilidade, hiperatividade, contato
visual inadequado e fala inadequada na escala ABC, além de melhores escores na
sonolência. Não houve efeitos colaterais causados pelo tratamento (NIEDERHOFER;
STAFFEN; MAIR, 2003).
Em um ensaio clínico aberto, 5 crianças diagnosticadas com autismo receberam

infusões mensais de IVIG na dose de 400 mg/kg por 6 meses. Não houve melhora e
efeitos colaterais não são citados (DELGIUDICE-ASCH et al., 1999). Em outro estudo
aberto, 10 crianças com TEA e anormalidades imunológicas (como aumento da
porcentagem de linfócitos que expressam o antígeno DR) receberam de uma a seis
infusões de IVIG de 154 a 375 mg/kg, de acordo com o paciente. Em 5 casos, nenhuma
melhora foi percebida; em 4 casos, os pais notaram uma leve melhora na atenção e
hiperatividade, mas não houve diferenças nos sintomas nucleares do autismo. Uma
criança de 5 anos de idade que recebeu infusões de 375 mg/kg teve um alívio notável dos
sintomas autistas (por exemplo, começou a falar pela primeira vez). Não houve efeitos
adversos. (PLIOPLYS, 1998).
Um recente estudo piloto investigou a eficácia e tolerabilidade da IVIG através de

dez infusões de 1 g/kg a cada 21±7 dias em 14 pacientes com TEA e desequilíbrio
imunológico (por exemplo, disfunção de células T ou B, infecções recorrentes, entre
outros). A melhora nos sintomas comportamentais foi medida através das escalas SRS,
PPVT, Children’s Communication Checklist-2 (CCC-2), ABC and Autism Diagnostic
106
Observation Scale (ADOS). Na SRS, houve melhora significativa no escore global, de

maneirismos, de cognição social e motivação social. In CCI-2, avanços na fala e domínio
semântico foram reportados. Não houve alterações na escala ABC. Por outro lado, os
escores da escala ADOS mudaram significativamente nos comportamentos
estereotipados e interesses restritos, na comunicação e interação social e na interação
social recíproca. Em relação aos marcadores imunológicos após o tratamento, houve
alterações no TNF-α e na IL-1β. Os eventos adversos à IVIG incluíram cefaleias de leve
intensidade e reações no local da infusão (MELAMED et al., 2018).
Terapia Celular
Conceitualmente, a terapia celular com células-tronco hematopoiéticas (CTH) -

como derivadas de cordão ou de medula óssea - pode ajudar no equilíbrio da cascata
inflamatória através da regulação imunológica (SINISCALCO; BRADSTREET;
ANTONUCCI, 2013). Um ensaio aberto estudou 36 pacientes com TEA tratados com
placebo, Células Mononucleares de Sangue de Cordão (CBMNC) ou a combinação de
Células-Tronco Mesenquimais Derivadas do Cordão Umbilical (UCMSCs) + CBMNC.
O único evento adverso relatado durante o período de acompanhamento foi febre baixa
autolimitada em cinco indivíduos no grupo de tratamento combinado. Do mesmo modo,
não ocorreram anomalias hepáticas, renais, hematológicas e metabólicas significativas
após a terapêutica. Com 24 semanas pós tratamento ambos os grupos de intervenção
mostraram melhora significativa nos escores da CARS e ABC em comparação aos valores
de base, e o grupo de tratamento combinado apresentou melhores resultados do que o
grupo CBMNC. Diferenças estatisticamente significativas também foram observadas na
avaliação da CGI nos dois grupos de tratamento em comparação com os controles em 24
semanas pós-tratamento (LV et al., 2013).
A eficácia e segurança da terapia com Células Tronco Fetais (FSC) foi verificada
em 45 indivíduos com TEA através dos escores ATEC e ABC, além de exames
laboratoriais. Após 6 meses de terapia, a contagem de células B diminuiu
significativamente, enquanto as contagens de CD3 e CD4 aumentaram 12 meses após o
tratamento. Uma redução significativa na pontuação geral da ATEC foi observada 12
meses após a terapia e escores totais da ABC nos sexto e décimo segundo meses. Nenhum
efeito colateral foi observado (BRADSTREET et al., 2014).
107
Inicialmente, Sharma et al. utilizaram Células Mononucleares de Medula Óssea

Autólogas (BMMNCs) por via intratecal em um menino de 14 anos. Foi observada
melhora sintomática, com mudança na escala CARS de autismo severo para não autista,
e verificado um aumento da função cerebral por tomografia por emissão de pósitrons
(PET-CT) (SHARMA et al., 2013a). Posteriormente, realizaram um estudo aberto para
prova de conceito utilizou o transplante intratecal de BMMNCs em associação com
terapia comportamental em 32 pacientes com TEA. Houve diferença significativa entre
os escores CGI-I pré e pós-tratamento e os escores totais da Indian Scale for Assessment
of Autism (ISAA). Todos os domínios do ISAA também apresentaram decréscimos
significativos. Os escores da Functional Independence Measure (FIM) e do Wee-FIM não
apresentaram diferença. A PET-CT detectou alterações no metabolismo da glicose em
diferentes regiões cerebrais. Crises epilépticas e eventos adversos menores, como
cefaleia, náusea, vômito e dor relacionada ao procedimento foram relatados (SHARMA
et al., 2013b).
Um ensaio aberto avaliou os efeitos da administração intratecal da terapia celular

com Concentrado de Medula Óssea Autóloga (BMAC) em 10 indivíduos com autismo.
A pontuação média de ISAA dos pacientes diminuiu (melhorou) 8% nos primeiros 3
meses após a infusão do BMAC e diminuiu mais 6% no período de 3 para 6 meses. As
alterações de pontuação do Wee-FIM não alcançaram significância estatística. Os
pacientes não apresentaram reações adversas (BANSAL et al., 2016).
Outro ensaio clínico aberto testou a segurança e a viabilidade da infusão de Sangue

de Cordão Autólogo a 25 crianças com TEA. Melhoras significativas no comportamento
foram encontradas em uma ampla gama de medidas de resultado: VABS-II, CGI-I,
Pervasive Developmental Disorder Behavior Inventory (PDDBI) e Expressive One-Word
Picture Vocabulary Test-4 (EOWPVT). A maioria das alterações comportamentais
observadas ocorreu durante os primeiros 6 meses e foram mantidas entre 6 e 12 meses.
QI não-verbal mais alto foi associado a maiores ganhos. O Eye-Gaze Tracking mostrou
um aumento de 20% na chance de as crianças olharem os olhos de uma atriz. Eventos
adversos leves foram observados: reações alérgicas à infusão, alterações na pele, agitação
e infecções comuns na infância (DAWSON et al., 2017).
Por fim, um relato de série de casos descreveu melhora em 3 crianças com autismo
após a infusão de Células-Tronco Embrionárias Humanas (hESCs). Melhora na
comunicação, na atenção ao olhar e no desempenho cognitivo foram observadas.
108
Verificou-se também aumento na perfusão sanguínea cerebral refletida no PET-CT. Não

foram observados efeitos colaterais (SHROFF, 2017).
Extratos de linfócitos dialisáveis
Os extratos de linfócitos dialisáveis (DLE) são complexos de substâncias de baixo

peso molecular com possível ação de transferência de imunidade mediada por células,
principalmente devido à ação de pequenos peptídeos chamados “fatores de transferência”
(ARNAUDOV; KOSTOVA, 2015). Um estudo publicado em 1996 relatou o
acompanhamento de quarenta pacientes de 5 anos de idade com autismo infantil clássico
e pseudo-autismo após três anos e meio de terapia com DLE. Vinte e oito pacientes
apresentaram melhora e 10 apresentaram remissão de sintomas autistas. O artigo não
esclarece os critérios usados para definir autismo e pseudo-autismo (FUDENBERG,
1996).
Minociclina
A minociclina é um antibiótico da família das tetraciclinas com potentes efeitos

anti-inflamatórios e neuroprotetores (ROSENBLAT; MCINTYRE, 2018; SOCZYNSKA
et al., 2012). O mecanismo imunomodulador exato da minociclina não está claro (KIM;
SUH, 2009). A minociclina diminui a ativação microglial, modula as vias envolvidas na
neuroinflamação, como as redes de citocinas e quimiocinas (por exemplo, IL-6, IL-1β e
TNF-α) e reduz a atividade de algumas metaloproteinases (ORSUCCI et al., 2009; YONG
et al., 2004). Ensaios clínicos em pacientes com síndrome do X-frágil demonstraram que
a minociclina é eficaz e segura na melhora da função comportamental (LEIGH et al.,
2013; PARIBELLO et al., 2010).
Um estudo piloto avaliou onze crianças com autismo tratadas com minociclina
(1,4 mg/kg/dia) + vitamina B6 (0,6 m/kg, para prevenir os potenciais para efeitos
colaterais vestibulares) (PARDO et al., 2013). A melhora clínica foi insignificante, com
as pontuações do CGI-S permanecendo estáveis e apenas duas das dez crianças
demonstrando "pouco melhor" no CGI-I. As pontuações compostas do VABS também
mostraram pouca ou nenhuma mudança. Os eventos adversos relatados pelos pais
incluíram: sintomas gastrintestinais e respiratórios superiores, hematúria, ganho de peso,
109
pica, hiperatividade, infecção do trato urinário, otite média, epistaxe, coloração de dentes,
aumento da agressividade, auto-agressividade, sensibilidade à luz, aumento do apetite e
aumento dos rituais. As avaliações laboratoriais demonstraram alterações significativas
no perfil de expressão do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e do fator de
crescimento hepático (HGF) no LCR e no soro. Entre as citocinas avaliadas, apenas a IL-
8 foi significativamente reduzida no soro após o tratamento, sem alterações no LCR. Não
foram observadas alterações significativas pré e pós-tratamento nos perfis das
metaloproteinases do plasma.
Ghaleiha et al. conduziram um estudo randomizado, duplo-cego, controlado por

placebo com 50 crianças com TEA que receberam minociclina (50 mg duas vezes ao dia)
+ risperidona ou placebo + risperidona por 10 semanas A dose de risperidona foi de 1
mg/dia para pacientes com peso inferior a 20 kg e 2 mg/dia para aqueles que pesavam 20
kg ou mais. Uma redução de pontuação significativamente maior nas subescalas
irritabilidade e hiperatividade da escala ABC ocorreu no grupo minociclina em
comparação com o grupo placebo na semana 10 (GHALEIHA et al., 2016).
Pioglitazone
A pioglitazona pertence ao grupo das tiazolidinedionas e atua por via do receptor

PPAR- (DEROSA; SAHEBKAR; MAFFIOLI, 2018). Este medicamento é
frequentemente usado como agente antidiabético e oferece proteção cardiovascular
adicional e melhora do perfil lipídico (YANDRAPALLI; ARONOW, 2017). Os ligantes
do PPAR- possuem efeitos anti-inflamatórios, regulando negativamente ou
positivamente os diferentes componentes da resposta inflamatória (YESSOUFOU;
WAHLI, 2010). As tiazolidinedionas foram testadas em distúrbios inflamatórios como a
psoríase (YESSOUFOU; WAHLI, 2010) e asma (ROGLIANI et al., 2018). Os efeitos da
pioglitazona nas doenças neuropsiquiátricas também foram estudados (NIERENBERG et
al., 2018).
Um estudo aberto avaliou o uso de pioglitazona em 25 indivíduos com TEA por

12 a 16 semanas com doses diárias de 30mg (idades 3-5 anos) ou 60mg (idades 6-17 anos
de idade). Houve redução significativa em quatro subescalas ABC após a administração
de pioglitazona: hiperatividade, irritabilidade, letargia e estereotipia. 76% dos pacientes
apresentaram uma redução de 50% em pelo menos uma subescala, e houve uma tendência
110
dos participantes mais jovens se beneficiarem mais com a pioglitazona. Observaram-se

elevações transitórias e autolimitadas nas contagens de leucócitos, níveis de glicose e
enzimas hepáticas (BORIS et al., 2007).
Ghaleiha et al. conduziram um ensaio clínico duplo-cego controlado por placebo

com uso de pioglitazona (30 mg/dia) como tratamento adjuvante à risperidona em 44
pacientes com TEA (idade entre 4 e 12 anos de idade) durante 10 semanas. O grupo da
pioglitazona apresentou melhora significativamente maior em três subescalas ABC:
hiperatividade, irritabilidade e letargia. A frequência de efeitos adversos foi semelhante
entre os grupos intervenção e controle (GHALEIHA et al., 2015).
Risperidone
A risperidona, um antipsicótico atípico, é amplamente utilizada no tratamento de

crianças com autismo, diminuindo distúrbios comportamentais nesse transtorno, como
irritabilidade, agressividade e ansiedade (MCCRACKEN et al., 2002). Estudos sugerem
efeitos imunorreguladores do tratamento com risperidona, uma vez que a risperidona
desencadeia várias alterações imunológicas (expressão de citocinas inflamatórias, IL-1β,
TNF-α, entre outras) (BAUMEISTER; CIUFOLINI; MONDELLI, 2016;
MACDOWELL et al., 2013; NOTO et al., 2015). No autismo, o tratamento com
risperidona foi associado à diminuição dos níveis séricos de Eotaxina e proteína
quimiotática de monócitos-1 (MCP-1). Além disso, os valores médios de IL-5 foram
significativamente maiores no grupo que respondeu à risperidona do que em não
respondedores. (CHOI et al., 2014). Por outro lado, um estudo anterior com indivíduos
com TEA não encontrou alterações nos marcadores inflamatórios séricos após o uso da
risperidona, apesar da melhoria clínica (TOBIASOVA et al., 2011). Portanto, a
associação entre alterações imunológicas e resposta clínica é uma possibilidade que deve
ser melhor investigada.
Suplementos
Vitamina D
111
A deficiência de vitamina D tem sido implicada como um potencial fator

ambiental ligado a alguns distúrbios autoimunes e desempenha um papel
imunomodulador (MOSTAFA; AL-AYADHI, 2012b; SAAD et al., 2016). Vários
estudos encontraram níveis mais baixos de vitamina D em crianças com TEA do que em
controles saudáveis (KOČOVSKÁ et al., 2014; MEGUID et al., 2010; TOSTES et al.,
2012). Mostafa e Al-Ayadhi sugerem que a deficiência de vitamina D possa estar
envolvida na produção de auto-anticorpos em pacientes com autismo (MOSTAFA; AL-
AYADHI, 2012b), e Cannell que a vitamina D possa reduzir a gravidade dos sintomas
do TEA por meio de ações anti-inflamatórias (CANNELL, 2013). Um relato de caso (JIA
et al., 2015), juntamente com ensaios abertos e controlados (FENG et al., 2017; SAAD
et al., 2016), observaram a redução dos escores dos sintomas de TEA após suplementação
de vitamina D3. No entanto, recentes ensaios clínicos controlados com placebo
encontraram resultados divergentes após a suplementação de vitamina D3 no TEA
(KERLEY et al., 2017; SAAD et al., 2018).
Omega-3
Os ácidos graxos ômega-3 possuem propriedades anti-inflamatórias e de

modulação imunológica (LAYÉ et al., 2018; MADORE et al., 2016; MAZAHERY et al.,
2017). Suplementação com ômega-3 diminui a expressão gênica de NF-κB, IL-12 e IL-
13 (SALLAM et al., 2010), proteína-2 inflamatória de macrófagos (MIP2), IL-6
(ZHANG et al., 2015), IL-17A (FARJADIAN et al., 2016) e TNF-α (ALLAM-NDOUL
et al., 2016; FARJADIAN et al., 2016; ZHANG et al., 2015; ZHAO et al., 2004). Apesar
de ser usado amplamente como tratamento alternativo para o TEA (POSAR; VISCONTI,
2016a, 2016b), a suplementação com Omega-3para crianças com TEA não pode ser
recomendada baseado nas evidências atuais (CHENG et al., 2017; HORVATH;
ŁUKASIK; SZAJEWSKA, 2017; LI; LI; XIANG, 2017; MAZAHERY et al., 2017;
POSAR; VISCONTI, 2016b; SATHE et al., 2017).
Ginkgo biloba
Ginkgo biloba (Ginkgoaceae) é uma antiga planta chinesa com efeito anti-
inflamatório (MACLENNAN; DARLINGTON; SMITH, 2002) e um dos fitoterápicos
112
mais utilizados no mundo (ERNST, 2002). Os efeitos da Ginkgo biloba no TEA foram
estudados num ensaio aberto (NIEDERHOFER, 2009) e num ensaio clínico duplo-cego
e controlado por placebo como adjuvante na terapia com risperidona (HASANZADEH
et al., 2012), com 3 e 47 pacientes, respectivamente. Ela se mostrou segura e bem
tolerada, mas não demonstrou eficácia em sintomas autistas.
L-Carnosina
L-Carnosina é um dipeptídeo dos aminoácidos β-alanina e l-histidina. É

facilmente absorvida no trato digestivo, penetra na barreira hematoencefálica, tem alta
biodisponibilidade e ação estabilizadora da membrana. (PROKOPIEVA et al.,
2016). Carnosina é conhecida por ser um agente antioxidante e neuroprotetor,
(STVOLINSKY et al., 1999; WANG et al., 2000) reduzindo a inflamação e a
neurodegeneração através da diminuição da síntese de TNF-α e óxido nítrico
(FLEISHER-BERKOVICH et al., 2009). Os possíveis efeitos benéficos da L-carnosina
nos sintomas de TEA podem ser atribuídos às atividades imunomoduladoras,
antioxidantes, glutamatérgicas, moduladoras de NMDA e GABA. (HAJIZADEH-
ZAKER et al., 2018). Dois ensaios clínicos randomizados e controlados por placebo
estudaram L-carnosina em crianças com TEA na dose de 800 mg/dia. Chez et al.
avaliaram 31 crianças por 8 semanas e encontraram mudanças em múltiplos domínios no
grupo que recebeu carnosina (linguagem receptiva, atenção social e comportamento)
(CHEZ et al., 2002). Posteriormente, Hajizadeh-Zaker et al. usaram L-carnosina +
risperidona ou placebo + risperidona por 10 semanas em 50 crianças. Eles encontraram
melhora na subescala ABC hiperatividade no grupo que fez uso da L-carnosina
(HAJIZADEH-ZAKER et al., 2018). Um recente ensaio clínico controlado por placebo
usando 500 mg de L-carnosina durante 2 meses observou redução na duração do sono,
nas parassonias e nos escores de distúrbios do sono, mas não ocorreu mudança no
comportamento das crianças com TEA (MEHRAZAD-SABER; KHEIROURI;
NOORAZAR, 2018).
N-acetilcisteína
113
N-acetilcisteína (NAC) é um pré-fármaco de cisteína, biodisponível oralmente e

conhecido por seu uso na superdosagem de acetaminofeno (ATKURI et al., 2007). Com
propriedades anti-inflamatórias através de vários processos celulares (DEEPMALA et al.,
2015), a NAC é um precursor da glutationa e antioxidante direto e, portanto, inibe eventos
a montante que levam à ativação do NF-κB e outras citocinas pró-inflamatórias
(DEEPMALA et al., 2015). Em linhagens celulares de macrófagos ativados por
lipopolissacarídeos a NAC atua inibindo as citocinas inflamatórias TNF-α, IL-1β e IL-6,
em nível proteico e de microRNA (PALACIO; MARKERT; MARTÍNEZ, 2011; PINAR
KARAPINAR et al., 2016).
Marler et al. relataram um caso de um menino de 4 anos de idade que apresentou

melhora na auto-agressividade refratária após o uso de NAC, com os sintomas retornando
após o término da medicação e melhorando novamente após seu reinício (MARLER;
SANDERS; VEENSTRA-VANDERWEELE, 2014). Outro relato de caso também
descreve melhora na agressividade severa em adolescentes após uso de NAC associado à
quetiapina (STUTZMAN; DOPHEIDE, 2015). Ghanizadeh relatou ganhos em interação
social, comunicação, hiperatividade, interesses restritos e comportamentos agressivos em
um menino de 8 anos de idade, após o uso do NAC (GHANIZADEH; DERAKHSHAN,
2012). Um estudo randomizado, controlado por placebo demonstrou uma redução
significativa nos sintomas de irritabilidade em 29 crianças com TEA (HARDAN et al.,
2012). Além disso, dois ensaios clínicos randomizados controlados por placebo de NAC
em conjunto com a risperidona para tratamento da irritabilidade em pacientes com TEA
(50 e 40 participantes) também mostraram uma redução significativa nas pontuações da
subescala ABC irritabilidade nos grupos tratados com NAC (GHANIZADEH;
MOGHIMI-SARANI, 2013; NIKOO et al., 2015). Mais recentemente, dois ensaios
randomizados controlados por placebo falharam em encontrar benefício no uso de NAC
em crianças com autismo (DEAN et al., 2017; WINK et al., 2016).
Terapias restauradora de microbiomas
Existe uma elevada prevalência de distúrbios gastrointestinais em pacientes com

TEA, tais como alterações do hábito intestinal, dor abdominal crônica e flatulência.
Curiosamente, os sintomas gastrointestinais não tratados podem piorar os principais
sintomas comportamentais. Um mecanismo proposto para esses fenômenos é uma ruptura
114
no “eixo intestino-cérebro”, uma comunicação entre o sistema nervoso entérico e o

sistema nervoso central. Tem sido sugerido que o eixo do intestino-cérebro transmite
sinais fundamentais para o neurodesenvolvimento, e que seu mau funcionamento poderia
estar associado ao aparecimento de distúrbios neuropsiquiátricos, como o TEA (LI;
ZHOU, 2016).
A microbiota intestinal pode ser o agente de ruptura no eixo do intestino-cérebro,

através de efeitos indiretos no sistema imune inato. Sugere-se que as alterações no
microbioma intestinal estão relacionadas com redução da integridade da barreira
intestinal, conduzindo a um aumento da absorção de toxinas (por exemplo,
lipopolissacarídeos). Lipopolissacarídeos pode atuar sobre os hepatócitos, induzindo a
secreção de TNF-α, que por sua vez estimula a produção de citocinas pró-inflamatórias
sistemicamente, levando, em última instância, à ativação microglial no SNC
(DOENYAS, 2018). Portanto, com base nessas afirmações, os pesquisadores sugerem
que as estratégias para restaurar o microbioma fisiológico do intestino, como a
suplementação com probióticos e o transplante de microbiota fecal, podem ser capazes
de melhorar os sintomas gastrointestinais e comportamentais no TEA. (YANG; TIAN;
YANG, 2018). Em 2000, Sandler et al. descreveram uma série de pacientes com TEA e
diarreia crônica. O tratamento com o vancomicina foi bem sucedido em proporcionar
melhora a curto prazo em 8 de 10 crianças, mas os ganhos não se mantiveram (CHEZ;
GUIDO-ESTRADA, 2010; SANDLER et al., 2000).
Uma revisão de Kałużna-Czaplińska et al. apresentou resultados com suplemento

dietético probiótico, que diminuiu o biomarcador urinário fúngico (D-arabinitol) e
melhorou a capacidade de concentração e a independência em indivíduos diagnosticados
com TEA (KAŁUŻNA-CZAPLIŃSKA; BŁASZCZYK, 2012). Da mesma forma, um
estudo aberto publicado em 2017 testou os efeitos da transferência de microbiota fecal
em indivíduos com autismo; os autores relataram uma melhora de sintomas
gastrointestinais de até 80% e uma melhora significativa dos distúrbios comportamentais.
(KANG et al., 2017). Por fim, um ensaio clínico randomizou os sujeitos pediátricos para
receber placebo ou suplemento dietético probiótico durante os primeiros 6 meses de vida.
Enquanto 6 dos 35 indivíduos do grupo de controle desenvolveram ou Transtorno do
déficit de atenção e hiperatividade ou Síndrome de Asperger mais tarde na vida, nenhum
do grupo probiótico teve o mesmo resultado (PÄRTTY et al., 2015).
115
DISCUSSÃO
O TEA é um transtorno complexo do neurodesenvolvimento (NORIEGA;

SAVELKOUL, 2014) e estudos em modelos animais e em humanos demonstram
alterações no sistema imune no espectro (CAREAGA; VAN DE WATER; ASHWOOD,
2010; CHEZ; GUIDO-ESTRADA, 2010; GŁADYSZ; KRZYWDZIŃSKA; HOZYASZ,
2018; GOTTFRIED et al., 2015; MASI et al., 2015, 2017; MCDOUGLE et al., 2015;
MEAD; ASHWOOD, 2015; NORIEGA; SAVELKOUL, 2014; VERKHRATSKY;
RODRÍGUEZ; PARPURA, 2014). Vários trabalhos correlacionam sintomas do TEA e
estado imunológico (AL-AYADHI, 2005; AL-AYADHI; MOSTAFA, 2012, 2013,
ASHWOOD et al., 2008, 2011a, 2011b; BRAUNSCHWEIG et al., 2012; CAREAGA et
al., 2017; EL-ANSARY et al., 2016; EL GOHARY et al., 2015; ENSTROM et al., 2008;
FERGUSON et al., 2016; GOINES et al., 2011; HAN et al., 2017; HEUER et al., 2008;
HOLLANDER et al., 1999; JYONOUCHI et al., 2005; JYONOUCHI; GENG;
DAVIDOW, 2014; MAKINODAN et al., 2017; MOSTAFA; AL-AYADHI, 2011;
NAPOLIONI et al., 2013; PIRAS et al., 2014; RICCI et al., 2013; ROSE; VAN DE
WATER; ASHWOOD, 2016; YANG et al., 2015), apoiando a hipótese de que há um
subgrupo de indivíduos com TEA que poderia se beneficiar de terapias com ação
imunológica (CAREAGA; VAN DE WATER; ASHWOOD, 2010; CHEZ; GUIDO-
ESTRADA, 2010; ESTES; MCALLISTER, 2015; GŁADYSZ; KRZYWDZIŃSKA;
HOZYASZ, 2018; GOTTFRIED et al., 2015; LACIVITA et al., 2017; MCDOUGLE et
al., 2015; MEAD; ASHWOOD, 2015; MELTZER; VAN DE WATER, 2017;
NORIEGA; SAVELKOUL, 2014; VERKHRATSKY; RODRÍGUEZ; PARPURA,
2014).
A capacidade anti-inflamatória/modulação imunológica tem sido proposta em

drogas rotineiramente utilizadas para doenças neurológicas e psiquiátricas, apesar de seu
mecanismo original de ação. O aripiprazol, um antipsicótico aprovado pelo FDA para
uso no autismo (LECLERC; EASLEY, 2015), exibe propriedades imunológicas em
experimentos in vitro (SEKI et al., 2013) e na esquizofrenia intensifica a sinalização anti-
inflamatória (SOBIŚ et al., 2015). O ácido valpróico, um ácido graxo de cadeia curta
usado como estabilizador de humor e antiepiléptico (LENG; CHUANG, 2006), pode ter
efeitos anti-inflamatórios e antioxidantes (SONG et al., 2015; SUDA et al., 2013;
XIMENES et al., 2013). O papel potencial da transmissão serotoninérgica e dos
receptores NMDA na modulação da neuroinflamação também tem sido estudada e
116
poderia abrir novas perspectivas terapêuticas para abordar os déficits comportamentais

no TEA. (CHEZ; GUIDO-ESTRADA, 2010; LACIVITA et al., 2017). Buspirona
(BUITELAAR et al., 1992a; CHUGANI et al., 2016; GHANIZADEH;
AYOOBZADEHSHIRAZI, 2015; MCCORMICK, 1997), fluoxetina (ALCAMÍ
PERTEJO; PERAL GUERRA; GILABERTE, 2000; CHANTILUKE et al., 2015;
FATEMI et al., 1998; HOLLANDER et al., 2005, 2012), escitalopram (OWLEY et al.,
2005, 2010), citalopram (KING et al., 2009), sertralina (HELLINGS et al., 1996;
MCDOUGLE et al., 1998; STEINGARD et al., 1997), D cicloserina (MINSHAWI et al.,
2016; POSEY et al., 2004; URBANO et al., 2014, 2015; WINK et al., 2016), amantadina
(KING et al., 2001) e memantina (CHEZ et al., 2007; JOSHI et al., 2016; OWLEY et al.,
2006) já foram utilizados em pesquisa clínicas no autismo. Finalmente, o naltrexone, um
potente antagonista opioide que já foi testado no TEA (BARRETT; FEINSTEIN; HOLE,
1989; BOUVARD et al., 1995; CAMPBELL et al., 1990, 1993; FELDMAN; KOLMEN;
GONZAGA, 1999; GONZALEZ et al., 1994; KNABE; SCHULZ; RICHARD, 1990;
KOLMEN et al., 1995, 1997; LEBOYER et al., 1992; WALTERS et al., 1990;
WILLEMSEN-SWINKELS et al., 1995b, 1995a, 1999; WILLEMSEN-SWINKELS;
BUITELAAR; VAN ENGELAND, 1996; WILLIAMS et al., 2001; ZINGARELLI et al.,
1992) também poderia ter ação imunomoduladora (SCIFO et al., 1996).
Atualmente, nenhuma terapia disponível pode reverter os principais sintomas do

autismo. O uso de terapias baseadas no sistema imunológico pode ser uma possível via
de tratamento para alguns indivíduos, mas poucos estudos direcionados à
imunomodulação foram realizados em pacientes com TEA. Esses estudos abrangem uma
ampla variedade de classes de medicamentos, incluindo produtos vegetais, suplementos
alimentares, probióticos, antibióticos, agentes anti-inflamatórios, imunomoduladores,
terapias celulares e até substâncias curiosas, como o leite de camela. (AL-AYADHI et
al., 2015; BASHIR; AL-AYADHI, 2014). A maioria desses estudos consiste em relatos
de casos ou ensaios abertos, sem grupo controle. Poucos ensaios são controlados por
placebo e têm um número suficiente de participantes para gerar resultados confiáveis. A
heterogeneidade das populações estudadas (considerando idade, origem étnica e
gravidade dos sintomas), a disparidade nos critérios diagnósticos de TEA e a variedade
de instrumentos de avaliação psicológica dificultam a comparação de diferentes achados.
Além disso, muitos dos trabalhos mostram importantes falhas metodológicas. Resultados
discrepantes entre diferentes estudos sobre a mesma terapia também são frequentes, e os
117
sintomas de TEA que mostraram melhora variam consideravelmente entre um trabalho e

outro. Por último, há poucas publicações sobre cada intervenção, portanto, mais estudos
são necessários para obter dados consistentes.
Também é possível que apenas parte dos pacientes incluídos nos estudos
realizados apresentasse disfunção imunológica contribuindo para a etiologia dos
sintomas. Assim, mesmo que tais pacientes respondessem positivamente à terapia
empregada, tais resultados ficariam encobertos pelos não respondedores durante a análise
dos dados. O desenvolvimento de potenciais biomarcadores de desregulação imune e sua
correlação com a variabilidade fenotípica permitiriam a pré-seleção de pacientes com
maior potencial de ganhos com intervenções imunomoduladoras (AHMAD et al., 2017;
FREGEAC; COLLEAUX; NGUYEN, 2016; HU; EHLI; BOOMSMA, 2017; INGA
JÁCOME et al., 2016; NORIEGA; SAVELKOUL, 2014). Portanto, marcadores
inflamatórios, incluindo alvos de microRNA, tem potencial para o desenvolvimento de
tratamentos individualizados no futuro. (SINGH, 2009) (Figure 1).
Apesar das discrepâncias nos resultados e limitações metodológicas encontradas

nos estudos citados nesta revisão, a existência de um subgrupo de pacientes com TEA
que respondem ao tratamento imunológico não pode ser excluída. Estudos para investigar
essa possibilidade devem ser realizados, e a eficácia de terapias previamente testadas em
humanos ou modelos animais deve ser avaliada. Drogas com potencial anti-inflamatório,
como donepezila, resveratrol e fingolimode demonstraram resultados positivos em
modelos animais de TEA (BAKHEET et al., 2016, 2017; BAMBINI-JUNIOR et al.,
2014; BHANDARI; KUHAD, 2017; HIRSCH et al., 2018; KARVAT; KIMCHI, 2014;
KIM et al., 2014; WU et al., 2017), sugerindo potencial terapêutico promissor e
incentivando que pesquisas adicionais sejam realizadas.
CONCLUSÃO
O desenvolvimento de terapias eficazes para o TEA é urgente. Apesar da

disfunção imunológica ser uma via potencial para intervenção medicamentosa num
subgrupo de indivíduos com TEA, poucos estudos visando uma ação imunomoduladora
foram realizados. A maioria desses estudos não é controlada por placebo e usa
metodologias diferentes, tornando a interpretação dos resultados um desafio. O uso de
potenciais biomarcadores como ferramentas de triagem pode permitir a seleção de
118
indivíduos específicos para ensaios clínicos e, no futuro, determinar quais pacientes

poderiam se beneficiar de determinadas terapias. Estudos com maior número de
participantes, randomizados e controlados com placebo, seja com intervenções já
descritas em humanos ou com novas terapias de estudos translacionais em modelos
animais, são necessários.
AGRADECIMENTOS
Ao Programa de Pós-Graduação em Saúde da Criança e do Adolescente da Faculdade de

Medicina (UFRGS) e ao Grupo de Pesquisa Translacional em Desordem do Espectro
Autista (GETTEA-UFRGS) pela oportunidade de trabalhar no projeto.
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Figura 1 - Endofenótipos imunológicos no autismo. A identificação de marcadores

específicos relacionados a diferentes subgrupos de TEA pode ajudar a reduzir a
heterogeneidade de participantes em ensaios clínicos. Além disso, ensaios com modelos
animais permitem o estudo translacional de novas drogas, possíveis alvos e biomarcadores.
134
Tabela 1 – Resumo dos estudos com terapias imunomoduladoras no TEA

n
Terapia Estudo Dose Período Instrumentos Resultados Ref.
(TEA)
Ensaio
clínico
Redução nos escores
duplo-cego, 50–150 4-18 ABC, SRS, (SINGH et
Sulforafano 40 ABC, SRS e CGI-I
randomizado μmol semanas CGI-S, CGI-I al., 2014)
comparado ao placebo
e controlado
por placebo
Uma família relatou
manutenção da melhora
comportamental
Série de Não mesmo após suspensão (LYNCH et
Sulforafano 3 anos 16 Descritivo
casos descrita do medicamento. Nove al., 2017)
famílias continuaram o
uso da medicação com
manutenção dos ganhos
Ensaio
clínico Melhora nas subescalas
(ASADABA
duplo-cego, 200-300 10 irritabilidade, esquiva
Celecoxibe 40 ABC DI et al.,
randomizado mg semanas social e comportamento
2013)
e controlado estereotipado
por placebo
Melhora em todas as
(BRADSTRE
Relato de 4 ABC, PPVT- subescalas ABC.
Espironolactona 2 mg/kg 1 ET et al.,
caso semanas III Ganhos na linguagem
2007)
no PPVT-III
Redução de 57% no
TNF-α sérico. Redução
nos escores da CARS,
CARS,
Ensaio melhora na CGI
12 ADOS, (CHEZ et al.,
Lenalidomida clínico 2,5 mg 7 linguagem expressiva e
semanas ROWPVT, 2012)
aberto receptiva com 6
CGI-I
semanas e somente
expressiva com 12
semanas
Ensaio
clínico
(AKHONDZ
duplo-cego, 400-600 10 Melhora em todas as
Pentoxifilina 40 ABC, ESRS ADEH et al.,
randomizado mg semanas subescalas ABC
2010)
e controlado
por placebo
“Muito efetivo” em 10
casos, “moderadamente
Ensaio
150-600 Não efetivo” em8 casos, (SOGAME S,
Pentoxifilina clínico 23 Descritivo
mg descrita “levemente efetivo” em 1978)
aberto
3 casos, e “não efetivo”
em 2 casos
Seis pacientes (20%)
com importante
Ensaio
Não Não melhora (NAKANE A,
Pentoxifilina clínico 30 Descritivo
descrita descrita comportamental e 14 1980)
aberto
(47%) leve melhora
nos sintomas
135
n
(TEA)
Seiken’s
Critical List
for Autistic
Ensaio 35% com melhora em
Children e (SHIMOIDE
Pentoxifilina clínico 200 mg 3 meses 20 pelo menos 2 critérios
avaliação dos M, 1981)
aberto de avaliação
pacientes em
situações
diversas
Ensaio
4 a 10 Melhora na pronuncia (TUREK S,
Pentoxifilina clínico 200 mg 2 Descritivo
meses de palavras e sílabas 1981)
aberto
EEG, "lista de EEG após tratamento

sintomas para com melhora em 39% (SUZUKI M;
Ensaio
10-15 TEA", Parent- dos casos. Melhora no NAKASHITA
Pentoxifilina clínico 3 meses 20
mg/kg Child "brincar com amigo” e Y; OGAWA
aberto
Relationship "comunicação num T, 1984)
Test teste psicológico"
Melhora em
características das
(THEOHARI
fezes, "alergias”,
Série de 200 mg/10 Não DES; ASADI;
Luteolina 37 Descritivo contato visual,
casos kg descrito PANAGIOTI
aprendizagem,
DOU, 2012)
interação, atenção e
fala
Ensaio Ganhos na função

100 mg/10 26 VABS, ABC, (TALIOU et
Luteolina clínico 50 adaptativa (VABS) e
kg semanas ATEC, CGI-I al., 2013)
aberto comportamento (ABC)
Melhora nas
estereotipias motoras,
Relato de 700 mg + (BERTOLIN
Luteolina 12 meses 1 ATEC hiperatividade e
caso 70 mg bid O et al., 2017)
habilidades cognitivas.
Redução da enurese.
Melhora na
comunicação,
Ensaio
26 independência diária e (TSILIONI et
Luteolina clínico 100 mg 40 VABS
semanas domínio social. al., 2015)
aberto
Melhora no escore total
da VABS
Modificação nas
Série de Não CLSQ, (DUFFY et
Prednisolona 2 mg/kg 44 respostas na FMAER e
casos reportado FMAER, EEG al., 2014)
melhora de linguagem
REEL,
(SHENOY;
Vineland,
Relato de Ganhos na habilidade ARNOLD;
Prednisolona 0.5 mg/kg 1 ano 1 Rosetti, Child
caso social, fala e atenção CHATILA,
Autism Rating
2000)
Scale
136
n
(TEA)
(STEFANAT
OS;
Relato de 28 Melhora na linguagem
Prednisona 0.5 mg/kg 1 WISC-R GROVER;
caso semanas e comportamento
GELLER,
1995)
30 meses
Série de (MORDEKA
Prednisolona 2 mg/kg e 48 2 Descritivo Melhora na linguagem
casos R et al., 2009)
meses
Ensaio
clínico
Melhora nas subescalas
duplo-cego, 10 (PARDO et
Minociclina 100 mg 50 ABC, ESRS irritabilidade e
randomizado semanas al., 2013)
hiperatividade
e controlado
por placebo
Ensaio CGI-I, VABS,

(LEIGH et al.,
Minociclina clínico 1.4 mg/kg 6 meses 11 DAS-II, Sem respostas positivas
2013)
aberto NVDQ

Ensaio hiperatividade,
12-16 (BORIS et al.,
Pioglitazona clínico 30-60 mg 25 ABC irritabilidade, letargia e
semanas 2007)
aberto comportamento
estereotipado
Ensaio
clínico
duplo-cego, 10 (GHALEIHA
Pioglitazona 30 mg 40 ABC hiperatividade,
randomizado semanas et al., 2015)
irritabilidade e letargia
e controlado
por placebo
Ensaio
clínico
Imunoglobulina duplo-cego, 140, 420 12 Sem diferença do (HANDEN et
125 MGIS
Humana Oral randomizado ou 880 mg semanas placebo al., 2009)
e controlado
por placebo
Ensaio Melhora dos sintomas

Imunoglobulina 8 GSI, ABC, (SCHNEIDE
clínico 420 mg 12 gastrointestinais e
Humana Oral semanas CGI-S R et al., 2006)
aberto comportamento
Ensaio
clínico (NIEDERHO
ABC, Lista de Melhora no escores da
Imunoglobulina duplo-cego, 400 mg/kg 13 FER;
12 sintomas, ABC e lista de
Intravenosa randomizado dose única semanas STAFFEN;
CPRS sintomas
e controlado MAIR, 2003)
por placebo
137
n
(TEA)
Ritvo-
Freeman Real
Ensaio
Imunoglobulina 400 mg/kg/ Life Rating Sem respostas (PLIOPLYS,
clínico 6 meses 5
Intravenosa mensal Scale, C- significativas 1998)
aberto
YBOCS, CGI-
AD, A-NIMH
154 to 375
Ensaio (DELGIUDIC
Imunoglobulina mg/kg por 19 Melhora dos sintomas
clínico 10 Descritivo E-ASCH et
Intravenosa dose (1-6 semanas em 1 caso
aberto al., 1999)
doses)
CCC-2, SRS,
Ensaio
Imunoglobulina 1 g/kg (10 31 ABC, CGI-S, Melhora da linguagem (MELAMED
clínico 14
Intravenosa doses) semanas CGI-I, ADOS, e interação social et al., 2018)
aberto
PPVT.
Grupo combinado
obteve mais benefício
2 x 106 que o grupo CBMNC
4
Células Troncos Ensaio CBMNCs isolado, e ambos
infusões CARS, ABC, (LV et al.,
Mononucleares e clínico /kg e 106 36 apresentaram melhora
(1 a cada CGI 2013)
Mesenquimais aberto UCMSCs mais pronunciadas que
5-7 dias)
/kg as terapias
comportamentais
isoladas
Ensaio Redução da agitação, (BRADSTRE

Células Tronco
clínico * 2 dias 45 ATEC, ABC melhora no contato ET et al.,
Fetais
aberto visual, apetite e afeto 2014)
CARS reduziu de
Medula Óssea 56
severo para não autista,
Autóloga Relato de × 106 Dose (SHARMA et
1 CARS porém a impressão
derivada de caso MNCs única al., 2013a)
geral era de autismo
Mononucleares intratecal
moderado
Melhora na
4 sessões coordenação visual,
Células Tronco Série de SPECT, (SHROFF,
** de 4-6 3 equilíbrio,
Embrionárias casos descritivo 2017)
semanas processamento
sensorial, escrita e fala
Ensaio
Concentrado de Dose ISAA, Wee- Melhora nos escores da (BANSAL et
clínico 5 ml/kg 10
Medula Óssea única FIM ISAA al., 2016)
aberto
138
n
(TEA)
VABS-II,
Ensaio 7 CGI-S, CGI-I, Melhora do contato
Sangue de 1-5 x 10 Dose (DAWSON et
clínico 25 PDDBI, visual e dos escores em
Cordão Autólogo células/kg única al., 2017)
aberto EOWPVT-4. todas as escalas
EGT.
Medula Óssea
Ensaio ISAA, CGI-I,
Autóloga – 8.19 x 107 Dose Melhora em todas as (SHARMA et
clínico 32 FIM, Wee-
derivada de células única escalas al., 2013b)
aberto FIM
Monócitos
3 dias a
Extratos de Ensaio
cada 6- Melhora e reversão de (FUDENBER
Linfócitos clínico 150 IU 40 SSSA
12 sintomas G, 1996)
Dialisáveis aberto
semanas
*1.6 ml de suspensão de células hepáticas com contagem de células > 30 x 10ˆ6 células/ml a cada infusão;
2.29 ± 0.49 ml células progenitoras neuronais com contagem de células > 8.70 x 10ˆ6/ml por infusão
**0.25 ml of hESCs (< 4 milhões de células) IM uma vez ao dia; 1 ml (< 16 milhões de células) dados 2
vezes por semana IV; 1 to 5 ml a cada 7 dias por rotas suplementares; spray nasal aplicado 2 vezes na
semana.
Social Responsiveness Scale (SRS), Clinical Global Impression Severity (CGI-S) Scale, Clinical Global
Impression Improvement (CGI-I) Scale, Peabody Picture Vocabulary Test III (PPVT-III), Receptive and
Expressive One-Word Picture Vocabulary Tests (ROWPVT), Autism Diagnostic Observation Schedule
(ADOS), Childhood Autism Rating Scale (CARS), Extrapyramidal Symptoms Rating Scale (ESRS),
Seiken’s Critical List for Autistic Children, Vineland Adaptive Behavior Scales, Second Edition (VABS),
Ability Scales Second Edition (DAS-II), Mullen Scales (NVDQ), Modified Global Improvement Scale
(MGIS), Gastrointestinal severity index (GSI), Autism Treatment Evaluation Checklist (ATEC), Clinical
Language Status Questionnaire (CLSQ) Receptive-expressive emergent language test (REEL), Wechsler
Intelligence Scale for Children-Revised (WISC-R), Children Yale-Brown Obsessive Compulsive Scale (C-
YBOCS), Autism Modification of the NIMH Global Obsessive-Compulsive Scale (A-NIMH), Symptom
severity score average (SSSA), Indian Scale for Assessment of Autism (ISAA), Functional Independent
Measure (FIM), Functional Independent Measure for children (Wee-FIM).
139
Tabela 2 – Eventos adversos
Terapia Evento adverso Ref. Terapia Eventos adversos Ref.
Elevação de leucócitos,
Ganho de peso e possível (BORIS
(SINGH et glicemia e enzimas
Sulforafano associação com crise Pioglitazona et al.,
al., 2014) hepáticas transitórias e
epiléptica 2007)
autolimitadas
(HAND
Erupção cutânea e
(CHEZ et Imunoglobulin Alterações de pele e EN et
Lenalidomida redução da contagem de
al., 2012) a Humana Oral subcutâneo al.,
leucócitos transitórios
2009)
(SCHN
Náuseas, vômitos, (SOGAME Imunoglobulin Vômitos e erupção EIDER
Pentoxifilina
hipotensão e cefaleia S, 1978) a Humana Oral cutânea et al.,
2006)
(MELA
Imunoglobulin
Limitados ao sistema (SHIMOID Cefaléia e reação no local MED et
Pentoxifilina a
gastrointestinal E M, 1981) da infusão al.,
Intravenosa
2018)
Células Tronco
(TALIOU (LV et
Mononucleares
Luteolina Aumento da irritabilidade et al., Febre autolimitada al.,
e
2013) 2013)
Mesenquimais
Síndrome de Cushing,
Reação alérgica, (DAWS
irritabilidade. Sangue de
(DUFFY et alterações de pele, ON et
Prednisolona Sangramento Cordão
al., 2014) agitação e infecções da al.,
gastrointestinal e Autólogo
infância 2017)
hipercalcemia
Sintomas gastrointestinais
e respiratórios altos;
PICA; hematúria; ganho
de peso; hiperatividade;
Medula Óssea Cefaléia, náuseas e (SHAR
infecção do trato urinário,
(LEIGH et Autóloga – vômitos, dor no local da MA et
Minociclina otite média; epistaxe;
al., 2013) derivada de infusão e crises al.,
manchas nos dentes; piora
Mononucleares epilépticas 2013b)
da agressividade,
balanceio de cabeça,
fotossensibilidade, apetite
e rituais
140
10 ARTIGO 1 - IMMUNOLOGICAL DYSFUNCTION IN AUTISM SPECTRUM

DISORDER: A POTENTIAL TARGET FOR THERAPY
Immunological dysfunction in autism spectrum disorder: a potential target for

therapy
Josemar Marchezan1,3,4, Eduardo Geyer Arrussul Winkler dos Santos1,3,5, Iohanna

Deckmann1,2,3,6, Rudimar dos Santos Riesgo1,3,4,7
1
Translational Research Group in Autism Spectrum Disorders-GETTEA, Universidade
Federal do Rio Grande do Sul -UFRGS, Porto Alegre, RS, Brazil.
2
Neuroglial Plasticity Group, Department of Biochemistry, Universidade Federal do Rio
Grande do Sul -UFRGS, Porto Alegre, RS, Brazil.
3
National Institute of Science and Technology on Neuroimmunomodulation-INCT-NIM.
4
Postgraduate Program in Child and Adolescent Health, School of Medicine, Federal
University of Rio Grande do Sul;
5
School of Medicine, Federal University of Rio Grande do Sul
6
Postgraduate Program in Biological Sciences: Biochemistry, Biochemistry Department,
Federal University of Rio Grande do Sul
7
Department of Pediatrics, Child Neurology Unit, Hospital de Clínicas de Porto Alegre;
ABSTRACT
Autism spectrum disorder (ASD) is a complex neurodevelopment disorder with

an unknown etiology and currently few effective therapies. Alterations in immune system
in ASD have being demonstrated both in animal models and in humans; thus, the immune
imbalance arises as a possible pathway for drug intervention. In this review, the studies
were classified into two major groups: 1) clinical research whose authors classify the
drugs used with primary anti-inflammatory and immunomodulatory action with the
following therapies: sulforaphane, celecoxib, lenalidomide, pentoxifylline,
spironolactone, flavonoid luteolin, corticosteroids, oral immunoglobulin, intravenous
immunoglobulin, cell therapy, dialyzable lymphocyte extracts, minocycline and
pioglitazone; and 2) other therapies already used or currently under study in ASD whose
initial characteristics were neither anti-inflammatory nor immunomodulatory, but they
played this potential immunomodulation capacity throughout the treatment: risperidone,
vitamin D, omega-3, Ginkgo biloba, L-carnosine, N-acetylcysteine, microbiome
restoration therapies. These studies used different data acquisition methodologies and
141
are reviewed here. We raised questions such as randomized and placebo-controlled

studies with greater number of participants, and the use of biomarkers to refine the
treatment of autistic subjects.
Keywords: ASD, autism, immune system, immune therapy, neuroimmune
Introduction
Autism spectrum disorder (ASD) is a developmental disorder and its core

symptoms are 1) deficits in social interaction, communication and language, and 2)
repetitive and stereotypical behaviors and/or restricted repertoire of interests [1]. Autism
(used here as synonymous with ASD throughout the text) diagnosis has increased
dramatically in the past decades [2,3]. In 2018, the Center for Disease Control and
Prevention (CDC) estimated the prevalence of ASD to be 16.8 per 1,000 (one in 59)
children aged 8 years, affecting 26.6 in 1,000 boys and 6.6 in 1,000 girls (prevalence
ratio 4:1) [4]. This represents an increase of approximately 150% between 2000 and 2014
[4], making the disorder a public health problem [5,6]. Studies in Asia, Europe and North
America report an average prevalence of ASD around 1% [3].
Despite the increase in the number of cases, the treatments available today
partially improve some symptoms presented by the subjects, not completely reversing all
the symptoms of ASD [7–9], and only two drugs, risperidone and aripiprazole, are
approved by the Food and Drug Administration (FDA) for the treatment of disruptive
symptoms in these patients [8,10–14]. Besides, some factors such as 1) the individual
injury, with many facets of daily functioning affected [15], 2) the substantial direct and
indirect economic effect of treatments and 3) the family suffering reinforce the need for
continuous search for effective interventions [16–20].
ASD is a complex neurodevelopment disorder [3], and although a number of

definitions and improvements have been made, etiological aspects remain unclear
[2,3,21]. However, the contribution of both genetic and environmental factors to the
symptoms is consensus in autism research community, leaving no doubt of the
multifactorial aspect of the spectrum [2,3,21–23].
Immunological dysfunction has been a recognized feature in autism spectrum

disorder for several decades and has been highlighted in recent revisions [2,3,8,15,21–
142
26]. In 1976 a study found that 5 of 13 autistic children had undetectable antibody titers
despite previous vaccine for rubella, while every control subject had detectable titers,
making the first suggestion of a link between the immune system and ASD [26,27]. Over
the past few decades, studies in animal models and humans have shown evidence of
alterations in central and peripheral immune system functioning in ASD, including
stimulation of immune cells, generation of autoantibodies, cytokine/chemokine
imbalance and increased permeability of the blood–brain barrier (BBB) [2,3,8,15,21–26].
Interestingly, many studies have also demonstrated a correlation between ASD status and
cytokine levels and secretion [28–46], levels of immunoglobulin (IgM e IgG) [47], B
lymphocyte antigen D8/17 expression [48], serum antineuronal antibodies [49–51], anti-
ganglioside M1 antibodies [52] and maternal antibody status [51,53]. These data support
the hypothesis that there is a subgroup of ASD individuals that has some form of immune
system dysregulation, and that, at least in part, this dysregulation may contribute to the
autistic phenotype [2,3,8,15,21–26].
Many researchers suggest the possibility that immune dysfunction in ASD may
be a viable pathway for drug intervention, and a subgroup of ASD individuals could
benefit from immune-based therapies [2,3,8,21–24,26,54–56]. This review aims to
describe drugs that act on the immune system and have been studied in patients with
autism.
Methods
The studies in this review were obtained from a comprehensive search of PubMed
using the terms and keywords “autism”, “autistic”, “autistic spectrum disorder”, “ASD”,
“Rett”, “Asperger”, “Pervasive Developmental Disorder” and “PDD” associated to the
terms “treatment”, “inflammation”, “immunological drugs”, “immune”, “inflammation”,
“inflammatory”, “anti-inflammatory”, “immunomodulation”, “immunology”,
“immunological”, “neuroinflammation”, “neuroinflammatory”, “antibody”,
“antibodies”, “immunoglobulin”, “lymphocyte”, “glial activation”, “cytokine”,
“immunomodulatory”, “BDNF” “sulforaphane”, “pregnenolone”, “celecoxib”,
“immunoglobulin”, “ACTH”, “lenalidomide”, “pentoxifylline”, “pioglitazone”,
“spironolactone”, “corticosteroids”, “probiotics”, “luteolin”, “transplant”, “stem cells”,
“cell therapy”, “autologous”, “vitamin D”, “risperidone”, “naloxone”, “minocycline” and
143
“lymphocyte extract”. The search included articles in English, Spanish and Portuguese.
Only studies conducted in humans were included.
Description of findings relating immunological dysfunction in ASD and potential

therapies
The inclusion of articles in this review was based on the classification criteria of
the original articles, who considered anti-inflammatory or immunomodulatory
mechanisms of action in ASD therapies: 1) Clinical research whose authors classify the
drugs used with primary anti-inflammatory and immunomodulatory action with the
following therapies: sulforaphane, celecoxib, lenalidomide, pentoxifylline,
spironolactone, flavonoid luteolin, corticosteroids, oral immunoglobulin, intravenous
immunoglobulin, cell therapy, dialyzable lymphocyte extracts, minocycline and
pioglitazone (Table 1). The side effects of these therapies are also described (Table 2);
and 2) other therapies already used or currently under study in ASD whose initial
characteristics were neither anti-inflammatory nor immunomodulatory, but they played
this potential immunomodulation capacity throughout the treatment: risperidone, vitamin
D, omega-3, Ginkgo biloba, L-carnosine, N-acetylcysteine, microbiome restoration
therapies.
Sulforaphane
Sulforaphane is an isothiocyanate derived from various Brassica vegetables

(especially broccoli) [57] with anticancer effect [58] and potential protective effect in
neurodegenerative diseases [57]. This therapeutic effect is based in up-regulation of gene
transcription related to cell mechanisms of protection against oxidative stress,
inflammation, DNA-damaging electrophiles and radiation [59].
A placebo-controlled, double-blind, randomized trial evaluated the effect of

sulforaphane for up to 18 weeks in 40 male patients with ASD (26 sulforaphane-treated
and 14 placebo-treated), at a dose of 50-150 μmol per day. In the treatment group, the
Aberrant Behavior Checklist (ABC) mean score differed at 4, 10, and 18 weeks compared
to baseline score, and especially at 18 weeks, there was a 34% decrease in the ABC score
and 17% in the Social Responsiveness Scale (SRS) score. Significant improvement was
observed in irritability, lethargy, stereotypy and hyperactivity subscales of the ABC, and
144
in awareness, communication, motivation and mannerism subscales of SRS. After

stopping sulforaphane treatment, both ABC and SRS subscores tended to return to the
baseline score. On subscale analysis of Clinical Global Impression Improvement Scale
(CGI-I) scores at 18th week, sulforaphane users were much improved on social
interaction, aberrant behavior and verbal communication compared to placebo-treated
subjects. Sulforaphane treatment was safe and well-tolerated, but higher weight gain over
the period was observed compared with placebo. Two participants had single unprovoked
seizures; their relation to sulforaphane use could not be ruled out, is possible that seizures
occurred as a reflex of an adverse effect of sulforaphane [59]. After 2 years, the
researchers reassessed the patients’ progress. Among 16 patients, one family reported a
maintained behavioral improvement even after the discontinuation of sulforaphane use,
and nine families were still taking sulforaphane with improvement [60].
Celecoxib
Celecoxib is a nonsteroidal anti-inflammatory drug that reduces the production of

cytokine-induced activation of COX-2 and inhibits NF-kB pathway [61,62]. Celecoxib
was used as associated therapy in the ASD treatment in a randomized, double-blind,
placebo-controlled study. Forty children were randomly allocated to
celecoxib+risperidone or placebo+risperidone groups for 10 weeks. The used dose was
200 mg/day for patients weighing less than 30 kg and 300 mg/day for patients over 30
kg. At week 10, the risperidone+celecoxib group demonstrated significant improvements
in irritability, social withdrawal and stereotypic behavior evaluated in ABC subscales
when compared to risperidone + placebo. No significant difference was observed between
the two groups regarding extrapyramidal symptoms or other side effects [63].
Lenalidomine
Lenalidomide is an analogue of thalidomide used in myelodysplastic syndromes

and more recently for therapy after autologous hematopoietic stem cell transplantation
[64]. This medication has lower toxicity and greater modulatory potency of tumor
necrosis factor alpha (TNF-α) and other immunomodulatory cytokines than
thalidomide. The lenalidomine arises as a possible treatment in patients with elevated
145
TNF-α in serum or cerebrospinal fluid (CSF), as well as interleukin 1 (IL-1), IL-6, or

methyl CpG-binding protein 1 (MeCP-1) [65].
An open-label study was conducted with 7 autistic males subjects aged 6 to 12

years with elevated TNF-α in CSF (>50 pg/mL) to evaluate the effects of daily treatment
with lenalidomide (2.5 mg) for 12 weeks, with evaluation at weeks 6 and 12. At the end
of the study, serum and CNS TNF-α were reduced by 57%, but this reduction did not
reach statistical significance. Six children who completed the 6-week follow-up showed
decreased symptoms of autism based on the Childhood Autism Rating Scale (CARS),
CGI expressive language, CGI receptive language but not in One-Word Receptive
Language Testing Scores (ROWPVT). With 12 weeks of follow-up the CGI expressive
language remained improved from baseline, but CGI assessment of receptive language
and CARS showed similar values. Differences in social skills scores were not significant
compared to baseline. Three patients were withdrawn from the study because of reactions
to the drug, and after stopping use, the symptoms disappeared [65].
Pentoxifylline
Pentoxifylline (PTX) is a xanthine analog known as a phosphodiesterase inhibitor [66]
with modulatory effects on cytokines such TNF-α, IL-10 and interferon gamma (IFN-γ)
[67], being proposed as a potential treatment for autistic patients in the 1970s and 1980s.
Gupta et al. described 5 case series in a 1996 review [68,69]: 1) twenty-three ASD
children were treated with PTX (150-600 mg/day orally). Within 1 month of therapy, the
drug was considered to be “remarkably effective” in 10 cases, “fairly effective” in eight
cases, “slightly effective” in three cases, and had “no effect” in two patients. The side
effects, in a small number of patients, included nausea, vomiting, low blood pressure and
headache [70]; 2) Thirty ASD children were evaluable after receiving PTX (without
dosage or duration of treatment specified). Six patients (20%) showed marked
improvement in behavior and 14 (47%) showed slight amelioration of symptoms [71]; 3)
Shimoide treated 20 male ASD patients with PTX (most of the patients received 200
mg/day) for 3 months. Patients were evaluated by mental development scale for young
146
children, Seiken’s Critical List for Autistic Children, and patient’s behavior in specific
situations. In 35% of patients, improvement was observed in at least two of three
assessments. Side effects were limited to gastrointestinal tract [72]; 4) Results of
treatment of 18 psychotic and two autistic children (a boy of 5 years and a girl of 7 years)
with PTX (200 mg/day in the majority of patients) for 4 to 10 months revealed “highly
positive” improvements in behavior (12 children) and in language (14 children). In the
autistic children, improvement in pronunciation of syllables and words was noted. The
side effects included excitation (three patients) and disturbed sleep (two patients), which
disappeared without discontinuation of PTX [73]; 5) PTX was administered to 20 children
with early infantile autism at 10 to 15 mg/kg/day split in two doses, for 3 months, with
the aim of evaluating electroencephalogram (EEG) activity changes through
autoregressive analysis software (ARASIS). EEG before and after PTX showed
significant differences in 7 (39%) of 18 patients. The “playing with a friend” and
"personal communication in a psychopathological test” were improved [74].
A placebo-controlled, double-blind trial randomized forty patients to either PTX+
risperidone or placebo + risperidone for 10 weeks, with evaluations at baseline and at
weeks 2, 4, 6, 8 and 10. The dose of PTX was 400 mg/day for children between 10 and
40 kg and 600 mg for children weighing above 40 kg. The group risperidone +
pentoxifylline demonstrated significantly greater improvement in five ABC subscales:
irritability, social withdrawal, stereotypic behavior, hyperactivity, and inappropriate
speech. No differences in extrapyramidal symptoms or side effects were observed [75].
Spironolactone
Spironolactone is a synthetic 17-lactone steroid, belonging to "potassium-sparing
diuretics" class of drugs and known as a competitive aldosterone antagonist [76] with
potent anti-inflammatory, immunologic and hormone modifying properties [77–80].

147
Currently, this drug has been used for acne, hirsutism and precocious
puberty, demonstrating safety and tolerability [81]. Bradstreet et al. (2007) reported a
case of a 12-year-old autistic boy with immune dysregulation, food allergies and elevated
testosterone levels. He demonstrated significant reductions in both severity and frequency
of several aberrant symptoms during four weeks of spironolactone daily administration
(dose of 2 mg/kg). Comparing the ABC scores before and after the spironolactone
implementation, there was a 79% improvement in irritability, an 83% decrease in
lethargy, a 60% reduction of stereotypy, a 72% reduction of hyperactivity and a 67%
decrease in inappropriate speech. There was a receptive language gain of 21 months,
indicating an increase in vocabulary greater than one standard deviation at either age
level evaluated Peabody Picture Vocabulary Test III (PPVT-III) [81].
Flavonoid luteolin
Luteolin is a natural flavonoid with antioxidant and anti-inflammatory properties

found in a myriad of plants [82]. Dietary sources of flavonoid luteolin include carrots,
peppers, oregano and olive oil [83]. In humans, luteolin has been demonstrated to inhibit
secretion of pro-inflammatory mediators from mast cells [84].
In a study, 37 ASD children (29 boys and 8 girls, ranging from 4 to 14 years old)
received a dietary flavonoid formulation (NeuroProtek) containing mainly luteolin (100
mg). 75,67% of subjects had improvement in stool color, shape or smell; 51,35% got
fewer "allergic problems"; 40,54% started to have better eye contact; 40,54% showed
more retention of learned aspects; 37,83% had more social interaction; 32,43% improved
their attention to directions; and 10,81% got better in speaking words or sentences. This
study lacked any specific psychometric instrument or an independent assessment by and
external evaluator. The authors do not clarify treatment or follow-up duration [85].
Another open-label trial assessed the same dietary supplement (100 mg of

luteolin) in 42 boys and 8 girls aged 4-10 years, for a 26-week period. Primary outcomes
were age-equivalent scores in the 3 domains (Communication, Daily Living Skills, and
148
Social domain) of the Vineland Adaptive Behavior Scale (VABS). Secondary outcomes
were the ABC, the Autism Treatment Evaluation Checklist (ATEC) and the CGI-I scores.
There was significant improvement in adaptive functioning (communication domain,
daily living skills and social domain) as measured by using the VABS age-equivalent
scores, as well as in overall behavior as indicated by the reduction in ABC subscale
scores. There was a transient period (1-8 weeks) of increased irritability in 27 of the 50
participants. [86].
In a 2015 work, 40 patients diagnosed with ASD received luteolin-containing

dietary formulation for 26 weeks, reducing autism symptoms and TNF and IL-6 seric
levels. At baseline, IL-6 levels were elevated in ASD subjects (with no statistical
significance); TNF seric levels were significantly higher in ASD patients. Interestingly,
there were 2 subgroups of ASD subjects in this study: low and high serum IL-6 and TNF
levels. The latter group (n = 10) had significant improvement in the VABS age-equivalent
scores for all domains; the VABS composite score was significantly higher as well. In 26
weeks of treatment, ASD patients improved in several behavioral domains equivalent to
9.73 months in the communication domain, 8.09 months in the social domain and 6.64
months in the daily living abilities [87].
In a recent study, an association of palmitoylethanolamide + luteolin (700 mg +

70 mg twice a day for one year) was given to a 10-year-old male autistic patient. The
evaluation with the ATEC questionnaire showed a decrease in scores, showing
improvement in behavioral results. The treatment reduced stereotypic behaviors,
significantly improved the cognitive domain (observed by parents and teachers) and,
curiously, decreased enuresis of the subject after 14 months of treatment [88].
Corticosteroids
Corticosteroids are anti-inflammatory drugs that inhibit secretion of pro-
inflammatory mediators, alter T cells activity and may also interfere with microglial
activation [89]. One retrospective study with oral prednisone (2 mg/kg/day for 9-12
months) treatment assessed ASD patients regarding Clinical Language Status
Questionnaire (CLSQ) scoring, Frequency Modulated Auditory Evoked Response

149
(FMAER) testing and EEG. For the treated group (20 participants), 9/14 electrode
measurements of FMAER’s 4 Hz response had a statistically significant modification,
more importantly at left posterior-inferior temporal electrode (TP9). On the other hand,
no difference was seen in the control group (24 non-treated subjects). The EEGs from
treated and control groups showed no differences. Steroid-treated group also had a
significant increase in the mean CLSQ after therapy [90].
Shenoy et al. reported response to steroid therapy in a case of ASD secondary to
an autoimmune syndrome. The patient was treated with different regimens of oral
prednisolone, with an average dose of 0.5 mg/kg daily. The ASD symptoms improved
progressively during the course of 1 year following the end of corticosteroid therapy [91].
In a similar study, a child with language and behavior regression at 22 months of age
(diagnosed later with Pervasive Developmental Disorder) received prednisone
(2mg/kg/day) for 28 weeks. The results observed were speech amelioration, better
responsiveness to verbal communication, improved social relationships and decrease of
motor stereotypies [92].
Morderkar and collaborators reported 2 patients diagnosed with childhood
disintegrative disorder that were also treated with corticosteroids, showing similar clinical
improvement. After 2 mg/kg daily prednisone treatment, the first patient showed a
recovery of speech at day 11 of therapy. The second subject, with treatment of one week
in the same dose, had progressive speech improvement over the course of 48 months [93].
In the 90's, several studies were conducted with Org 2766, a Synthetic Analog of
the Adrenocorticotrophic Hormone (4-9). However, Org 2766 has no substantial
steroidogenic activity and may exert its effects via an interaction with endogenous opioid
systems [94–98]. Another open-label study using neurosteroid pregnenolone found
improvements in ASD patients. Considering that this drug did not alter cortisol levels, the
150
authors suggest that pregnenolone would act by modulating GABAA receptors, altering
ratio of excitation/inhibition in key neural systems [99,100].
Oral immunoglobulin
Oral immunoglobulin, constituted predominantly of IgG, is a medication prepared

from immunoglobulins obtained from human and bovine serum and bovine milk. Several
studies demonstrate its survival at gastric exposure and resistance to proteolytic digestion
in gastrointestinal tract [101].
Schneider et al. administered oral immunoglobulin in a pilot study with 12 male
ASD subjects, considering the chronic gastrointestinal disturbances in ASD due to
underlying deficiency in mucosal immunity. By the fourth week assessment, 50% of
subjects had improvement in gastrointestinal symptoms [102].
Similarly, Handen and colleagues tested oral human immunoglobulin efficacy in

gastrointestinal symptoms in ASD. One hundred and twenty-five ASD children were
treated with different doses of immunoglobulin (140 mg/day, 420 mg/day or 840 mg/day)
or placebo. The primary outcome was measurement by a Modified Global Improvement
Scale (MGIS), which had no significant changes between the groups [103].
Intravenous immunoglobulin
Intravenous immunoglobulin (IVIG) is a treatment that contains a pool of several

molecules of IgG from the human plasma (more than 95% unmodified IgG) [104].
Although it is widely used, the mechanism of action of IVIG for the treatment of
autoimmune disorders is still unclear [23].
A letter reported a clinical trial with 12 male ASD children receiving a single dose
of IVIG (0.4 g/kg) or placebo evaluated after 6 or 13 weeks of therapy. There were
significant improvements in irritability, hyperactivity, inadequate eye contact and

151
inappropriate speech in ABC scale, besides better scores on drowsiness. There were no
side effects caused by the treatment [105].
In an open clinical trial, 5 children diagnosed with autism received monthly IVIG
infusions at the dose of 400 mg/kg for 6 months. No improvement was noted and side
effects are not cited [106]. In another open label trial, 10 ASD children with blood
immunologic abnormality, such as increased percentage of lymphocytes expressing the
DR antigen, received from one to six IVIG infusions of 154 to 375 mg/kg according to
the patient. In 5 cases, no improvement was perceived; in 4 cases, parents noticed mild
amelioration of attention and hyperactivity, but no differences in core symptoms of
autism. One child of 5 years old who received 375 mg/kg infusions had remarkable relief
of autistic symptoms (e.g. started to speak for the first time). There were no adverse
effects [107].
A recent pilot study investigated the efficacy and tolerability of IVIG through ten
infusions of 1 g/kg every 21±7 days in 14 autistic patients with immunological imbalance
(e.g. T or B cell dysfunction, recurrent infections, among others). The amelioration in
behavioral symptoms was measured through SRS, PPVT, Children’s Communication
Checklist-2 (CCC-2), ABC and Autism Diagnostic Observation Scale (ADOS) scales. In
SRS, there was significant improvement in overall score, autistic mannerisms score,
social cognition score and social motivation score. In CCI-2, advances in speech and
semantics domains were reported. In ABC, scores did not alter. On the other hand, the
ADOS scores changed significantly in stereotyped behaviors and restricted interests, in
communication and social interaction and in reciprocal social interaction. In relation to
immunological markers after treatment, there were alterations in TNF-α and IL-1β.
Adverse events to intravenous immunoglobulin included mild headaches and infusion-
site reactions [108].

152
Cell therapy
Conceptually, cellular therapy with hematopoietic stem cells (HSC) – as cord-

derived and bone marrow-derived - may help the inflammation balance through immune
regulation [109]. An open trial studied 36 ASD patients treated with placebo, Cord Blood
Mononuclear Cells (CBMNC) or Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells
(UCMSCs) + CBMNC association. The only adverse event reported during the follow-
up period was a self-limited low-grade fever in five subjects in the combination treatment
group. Similarly, no significant hepatic, renal, hematological and metabolic abnormalities
occurred after therapy. Both intervention groups showed significant improvement on
CARS and total ABC scores at 24 weeks in comparison to baseline, and the combination
group presented better results than the CBMNC group. Statistically significant
differences were also shown on CGI evaluation in the two treatment groups compared to
controls at 24 weeks post-treatment [110].
The efficacy and safety of Fetal Stem Cells (FSC) therapy was verified in 45 ASD
subjects through ATEC and ABC scores, and laboratory tests and clinical examination.
After 6 months of therapy, B cell counts decreased significantly, while CD3 and CD4
counts were increased in 12 months post-treatment. A Significant lowering of ATEC
overall score was seen 12 months after therapy and total ABC scores in the sixth and
twelfth months. No side effects were observed [111].
Initially, Sharma et al. used Autologous Bone Marrow Mononuclear Cells

(BMMNCs) intrathecally in a 14-year-old boy, noting symptomatic improvement, with
change in CARS from severely autistic to non-autistic, and enhanced brain function by
positron emission tomography-computed tomography (PET-CT) [112]. Posteriorly, an
open label proof of concept study used intrathecal BMMNCs transplantation in
association with occupational, speech and psychological therapies in 32 ASD patients.
There was significant difference between prior and post-treatment CGI-I scores and total
Indian Scale for Assessment of Autism (ISAA) scores. All ISAA domains also showed
significant decreases. Functional Independence Measure (FIM) and Wee-FIM scores had
no difference. PET-CT detected changes in glucose metabolism in the form of FDG
uptake in different cerebral regions. Seizures and minor adverse events , such as
headache, nausea, vomiting and pain related to procedure were reported [113].
153
An open-label trial tested the effects of intrathecal administration of Autologous

Bone Marrow Concentrate (BMAC) cell therapy in 10 subjects with autism. Mean ISAA
score of the patients decreased (improved) 8% in the first 3 months after BMAC injection,
and further diminished 6% from 3 to 6 months. Wee-FIM scoring changes did not reach
statistical significance. The patients showed no adverse reactions [114].
Another open-label clinical trial tested the safety and feasibility of administering
Autologous Cord Blood infusion to 25 ASD children. Significant improvements in
behavior were found across a wide range of outcome measures: VABS-II Socialization
domain, CGI-I, Pervasive Developmental Disorder Behavior Inventory (PDDBI) and
Expressive One-Word Picture Vocabulary Test - 4 (EOWPVT). Most of the observed
behavioral changes occurred during the first 6 months and were sustained between 6 and
12 months. Higher nonverbal IQ was associated with greater improvements. The Eye-
Gaze Tracking showed a 20% increase in the chance of children to gaze at an actress’s
eyes. Mild adverse events were seen: allergic reactions to infusion, skin changes, agitation
and common childhood infections [115].
Lastly, a case series report describes improvement in 3 children with autism after
infusion of Human Embryonic Stem Cells (hESCs). Better communication, attention to
gaze and cognitive performance were observed, besides improvement in brain blood
perfusion reflected in the PET-CT. No side effects to the treatment were noted [116].
Dialyzable lymphocyte extract
Dialyzable lymphocyte extracts (DLE) are complexes of low-molecular-weight

substances with possible action of cell-mediated immunity transfer, mainly due to action
of small peptides called transfer factors [117]. A study published in 1996 reported a
follow-up of forty 5-year-old patients with classical infantile autism and pseudo-autism
after three and a half years of DLE therapy. Twenty-eight patients showed improvement
and 10 had remission of autistic symptoms. The article doesn’t clarify the criteria used to
define autism and pseudo-autism [118].
Minocycline
Minocycline is a tetracycline antibiotic with potent anti-inflammatory and

neuroprotective effects [119,120]. The exact immunomodulatory mechanism of
154
minocycline is not clear [121]. Minocycline decreases microglial activation, modulates

pathways involved in neuroinflammation, such as cytokine and chemokine networks (for
example, IL-6, IL-1β and TNF-α) and reduces the activity of some metalloproteinases
[122,123]. Clinical trials on patients with X-fragile syndrome have shown minocycline to
be effective and safe in improving behavioral function [124,125].
An open-label pilot trial was assessed with eleven ASD children treated with
minocycline (1.4 mg/kg/day) + vitamin B6 (0.6 mg/kg, to mitigate the potential for
vestibular side effects) therapy [126]. Clinical improvements were negligible, with CGI-
S scores remaining stable and only two of ten children demonstrating ‘minimal
improvement’ on the CGI-I. VABS composite scores also showed little or no change.
Adverse events reported by parents included gastrointestinal and upper respiratory
symptoms, hematuria, weight gain, PICA, hyperactivity, urinary tract infection, otitis
media, epistaxis, teeth staining, increased aggression, head-banging, sensitivity to lights,
increased appetite and ritualistic behavior. Laboratory assays demonstrated significant
changes in the expression profile of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and
hepatic growth factor (HGF) in CSF and serum. Among the evaluated cytokines, only IL-
8 was significantly reduced in serum after treatment, with no changes in CSF. No
significant pre- and post-treatment changes were seen in the profiles of plasma
metalloproteinases.
Ghaleiha et al. conducted a randomized, double-blind, placebo-controlled trial

with 50 ASD children that received minocycline (50 mg twice a day) + risperidone or
placebo+risperidone for 10 weeks. The risperidone dose was 1 mg/day for patients
weighing less than 20 kg and 2 mg/day for those weighing 20 kg or more. Significantly
greater score reduction in the irritability and hyperactivity/noncompliance subscales in
ABC scale occurred in the minocycline group compared with the placebo group at week
10 [127].
Pioglitazone
Pioglitazone belongs to the thiazolidinedione group and works via peroxisome
proliferator-activated receptor gamma (PPAR-) [128]. This drug is frequently used as an
anti-diabetic agent and offers additional cardiovascular protection and lipid profile
155
improvement [129]. PPAR ligands also have anti-inflammatory effects, down-regulating
or up-regulating different components of the inflammatory response [130].
Thiazolidinediones have been tested in inflammatory disorders such as psoriasis [130]
and asthma [131]. Pioglitazone effects on neuropsychiatric diseases have also been
studied [132].
An open-label study evaluated the use of pioglitazone in 25 ASD subjects (ages

ranging from 3 to 17 years) for 12 to 16 weeks with daily doses of 30mg (ages 3-5 years
old) or 60mg (ages 6-17 years old). Analysis revealed significant decrease in four ABC
subscales after the administration of pioglitazone: hyperactivity, irritability, lethargy and
stereotypy. 76% of the patients showed a 50% reduction in at least one subscale, and there
was a tendency for younger participants to benefit more from pioglitazone. Transitory
and self-limited elevations in white blood counts, glucose levels and liver enzymes were
noted [133].
Ghaleiha et al. conducted a double-blind placebo-controlled trial of pioglitazone

(30 mg/day) as adjunctive treatment to risperidone during 10 weeks in 44 patients with
ASD (aged 4-12 years old). Pioglitazone group showed significantly greater improvement
in three ABC subscales: hyperactivity, irritability and lethargy. Frequency of adverse
effects was similar between intervention and control groups [134].
Risperidone
Risperidone, an atypical antipsychotic, is widely used in the treatment of children

with autism by decreasing major behavioral disturbances in this disorder, such as
irritability, aggression and anxiety [135]. Studies suggest immunoregulatory effects of
risperidone treatment, since risperidone rescued several immunological changes
(expression of inflammatory cytokines, IL-1β, TNF-α, among others) [136–138]. In
autism, risperidone treatment was associated with decreases in serum levels of Eotaxin
and monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1). In addition, mean values of IL-5 were
significantly higher in the group that responded to risperidone than in no responders
[139]. On the other hand, a previous study with subjects with ASD found no changes in
serum inflammatory markers after risperidone use despite clinical improvement [140].
156
Therefore, the association between immunological changes and clinical response is a

possibility that should be further investigated.
Supplements
1) Vitamin D
Vitamin D deficiency has been implicated as a potential environmental factor

linked to some autoimmune disorders and plays an immunomodulatory role [141,142].
Several studies have found lower levels of vitamin D in ASD children than in healthy
controls [143–145]. Mostafa and Al-Ayadhi reported that vitamin D deficiency could be
involved in autoantibody production in patients with autism [141], and Cannell suggested
that vitamin D may reduce the severity of autism symptoms through its anti-inflammatory
actions [146]. A case report [147], along with open and controlled trials [142,148], has
observed ASD symptom scores reduction after vitamin D3 supplementation. However,
recent placebo-controlled clinical trials have found divergent results following vitamin
D3 supplementation in ASD [149,150].
2) Omega-3
Omega-3 fatty acids have anti-inflammatory and immune modulation properties

[151–153]. Supplementation with omega-3 decreases NF-κB, IL-12 and IL-13 gene
expression [154], macrophage inflammatory protein-2 (MIP2), IL-6 [155], IL-17A [156]
and TNF-α [155–158]. Despite being widely used as an alternative practice in children
with ASD [159,160], Omega-3 supplementation cannot be recommended for ASD
children based on current available evidence [151,160–164].
3) Ginkgo biloba
Ginkgo biloba (Ginkgoaceae) is an ancient Chinese tree with anti-inflammatory

effect [165] and one of the most globally consumed phytomedicines [166]. The effect of
Ginkgo biloba on ASD has been studied in an open trial [167] and a double-blind,
placebo-controlled trial as adjuvant therapy to risperidone [168], with 3 and 47 patients,
respectively. It appears to be safe and well tolerated but did not demonstrate efficacy in
autistic symptoms.
157
4) L-Carnosine
L-Carnosine is a dipeptide of the β-alanine and l-histidine amino acids. It is easily

absorbed in the digestive tract, penetrates through blood-brain barrier, has high
bioavailability and membrane-stabilizing action [169]. Carnosine is a known antioxidant
and neuroprotective agent [170,171] and reduces inflammation and neurodegeneration by
lowering TNF-α and nitric oxide synthesis [172]. The beneficial effects of L-carnosine
on ASD symptoms could be attributed to immunomodulatory, antioxidant, glutamatergic,
NMDA- and GABA-modulatory activities [173]. Two randomized, placebo-controlled
trials studied L–carnosine in ASD children in the dose of 800 mg/day. Chez et al.
evaluated 31 children for 8 weeks and found changes in multiple domains in the group
that was given carnosine (receptive speech, social attention and behavior.) [174].
Posteriorly, Hajizadeh-Zaker et al. used L-carnosine+risperidone or placebo+risperidone
for 10 weeks in 50 children. They found improvement in the hyperactivity/noncompliance
ABC subscale in the L-carnosine group [173]. A recent placebo-controlled clinical trial
using 500 mg of L-carnosine for 2 months observed reduction in sleep duration,
parasomnias and total sleep disorders score, but no change in behavior in ASD children
[175].
5) N-acetylcysteine
N-acetylcysteine (NAC) is an orally bioavailable prodrug of cysteine known for

its use in acetaminophen overdose [176]. With anti-inflammatory properties through
several cellular processes [177], NAC is a glutathione precursor and direct antioxidant,
and hence inhibits upstream events leading to NF-κB activation and other
proinflammatory cytokines [177]. NAC also acts inhibiting the inflammatory cytokines
TNF-α, IL- 1β and IL-6, at the protein and microRNA levels, in lipopolysaccharides
(LPS)-activated macrophage cell lines [178,179].
Marler et al. reported a case of a 4-year-old boy who showed improvement in

refractory self-injury after NAC use, with symptoms returning after stopping the
medication and improving again after its restart [180]. Other case report also describes
improvement in severe aggression in adolescents after use of NAC associated with
quetiapine [181]. Ghanizadeh reported gains in social interaction, communication,
hyperactivity, limited interests and aggressive behaviors in a 8-year-old boy after NAC
158
use [182]. A randomized, placebo-controlled trial by Hardan et al. demonstrated a

significant reduction in irritability symptoms in 29 children with ASD [183].
Additionally, two randomized, placebo-controlled trials of NAC in conjunction with
risperidone for treatment of irritability in patients with ASD (50 and 40 participants) also
showed a significant reduction in ABC Irritability subscale scores in the NAC-treated
groups [184,185]. More recently, two randomized, placebo-controlled trials found no
benefit of NAC in children with autism [186,187].
6) Microbiome restoration therapies
There is an elevated prevalence of gastrointestinal (GI) disturbances in patients

with ASD, such as fluctuations in bowel habits, chronic abdominal pain and flatulence.
Interestingly, untreated GI symptoms may worsen core behavioral symptoms. A proposed
mechanism for these phenomena is a disruption in the “gut-brain axis”, a communication
between enteric nervous system and CNS. It has been suggested that the gut-brain axis
conveys fundamental signals for neurodevelopment, and that its malfunctioning could be
associated with the onset of neuropsychiatric disorders, such as ASD [188].
Gut microbiota might be the agents of disruption in the gut-brain axis, through
indirect effects on the innate immune system. Changes in gut microbiome are thought to
be related to decreased integrity of intestinal barrier, leading to augmentation of toxins
absorption (e.g. lipopolysaccharides). Lipopolysaccharides (LPS) can act on hepatocytes,
inducing secretion of TNF-α, which in turn stimulates production of pro-inflammatory
cytokines systemically, ultimately leading to brain microglial activation [189]. Hence,
based on these statements, researchers suggest that strategies of restoring physiological
gut microbiome, such as probiotic supplementation and fecal microbiota transplant, might
be able to improve GI and behavioral symptoms in ASD [190]. Sandler et al. described
in 2000 a series of autistic patients with regressive autistic traits and chronic diarrhea.
Treatment with the antibiotic vancomycin was successful in providing short-term
improvement in 8 of 10 children, but the gains did not endure [24,191].
One research paper by Kałużna-Czaplińska et al. presented results with probiotic

dietary supplement, which decreased fungal urinary biomarker (D-arabinitol) and
improved ability of concentration and carrying out others in subjects diagnosed with ASD
[192]. Similarly, an open-label study published in 2017 tested the effects of fecal
159
microbiota transfer on autistic subjects, and the authors reported an improvement of GI

symptoms as high as 80%, and also a significant amelioration of behavioral disturbances
[193]. Lastly, a clinical trial randomized infant participants to receive either placebo or
probiotic dietary supplement during the first 6 months of life. While 6 of 35 subjects in
the control group developed either Attention Deficit and Hyperactivity Disorder or
Asperger Syndrome later in life, none of the probiotic group had the same outcome [194].
Discussion
ASD is a complex neurodevelopment disorder [3], and studies in animal models

and humans demonstrate alterations in immune system in the spectrum [2,3,8,15,21–26].
Several studies correlate ASD symptoms and immune status [28–48,50–53], supporting
the hypothesis that there is a subgroup of ASD individuals who could benefit from
immune-based therapies [2,3,8,21–24,26,54–56].
The ability of anti-inflammation/immunological modulation has been proposed in

drugs routinely used for neurological and psychiatric diseases in spite of their original
mechanism of action. Aripiprazole, an antipsychotic approved by the FDA for use in ASD
[14], displays immunological properties in in vitro experiments [195] and limits
inflammatory processes by enhancing anti-inflammatory signaling in schizophrenia
[196]. Valproic acid, a short-chain fatty acid used as a mood stabilizer and anti-epileptic
drug [197], may have anti-inflammatory as well as antioxidative effects [198–200]. The
potential role of serotonergic transmission and NMDA receptors in the modulation of
neuroinflammation has also been studied and could open new therapeutic perspectives to
address behavioral deficits in ASD [24,54]. Buspirone [95,201–203], fluoxetine [204–
208], escitalopram [209,210], citalopram [211], sertraline [212–214], D cycloserine
[186,215–218], amantadine [219] and memantine [220–222] have already been used in
clinical research in autism. Finally, naltrexone, a potent opiate antagonist tested in ASD
for improvement of behavioral changes [223–239], could also possess
immunomodulatory action [240].
Currently, no available therapy can reverse the core symptoms of autism. The use
of immune-based therapies may be a possible treatment route for some individuals, but
few studies aimed at immunomodulation were performed in ASD patients. These studies
cover an extensive range of drug classes, including plant products, dietary supplements,
160
probiotics, antibiotics, anti-inflammatory agents, immunomodulators, cell therapies and

even curious substances such as camel milk [241,242]. Most of these studies consist of
case reports or open trials, with no control group. Few trials are placebo-controlled and
have a sufficient number of participants to generate reliable findings. The heterogeneity
of studied populations (considering age, ethnic origin and severity of symptoms), the
disparity in ASD diagnostic criteria and the variety of psychological evaluation tools
make it difficult to compare different findings. In addition, many of the reports show
important methodological flaws. Discrepant results between different studies on the same
therapy are also frequent, and the ASD symptoms which show improvement vary
considerably. Lastly, there are few publications on each intervention, so further studies
are needed in order to obtain consistent data.
It is possible that only part of the patients included in studies had immune
dysfunction contributing to their symptoms’ etiology. Consequently, positive responses
to a specific therapy in these patients could be overlooked when analyzed among a pool
of non-responders. The development of potential biomarkers of immune dysregulation
and their correlation with phenotypic variability should increase the possibility of pre-
selecting patients with greater potential for gains with immunomodulatory interventions.
Inflammatory markers, including miRNA targets,seem to hold potential for the
development of individualized treatment strategies in the future [3,243–247]. (Figure 1).
Despite discrepancies in results and methodological limitations found in the

studies cited in this review, the existence of a subgroup of ASD patients who are true
responders to immunological treatment cannot be excluded. Studies to investigate this
possibility must be carried out, and the effectiveness of therapies previously tested in
humans or animal models should be evaluated. Drugs with anti-inflammatory potential
such as donepezil, resveratrol, fingolimod have demonstrated positive findings in animal
models of ASD [248–255], demonstrating their promising therapeutic potential, so further
research is encouraged.
Conclusions
The development of effective therapies in ASD is urgent. Despite immune

dysfunction being a possible pathway for drug intervention in a subgroup of ASD
individuals, few studies aiming an immunomodulatory action were performed. Besides,
161
the use of potential biomarkers as screening tools may enable the selection of specific
subjects for clinical trials and, in the future, determine which patients could benefit from
a particular therapy. Most of the studies included in this review are not placebo-controlled
and use different methodologies, making the interpretation of different results a
challenge. Studies with a greater number of participants, randomized and placebo-
controlled, either with interventions already described in humans or with new therapies
from translational studies in animal models are needed.
Acknowledgements
We are grateful to the Postgraduate Program in Child and Adolescent Health, School of
Medicine (UFRGS) and Translational Research Group in Autism Spectrum Disorder
(GETTEA- UFRGS) for the opportunity to work on the project.
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Figure 1. Immunological endophenotypes in autism. The identification of specific markers

related to different ASD subgroups may assist in reducing the heterogeneity of participants in
clinical trials. In addition, animal model trials enable the translational study of new drugs,
possible targets and biomarkers.
178
Table 1 – Summary of studies with immunomodulatory therapies in ASD

n
Therapy Study Dosage Period Measures Finding Ref.
(ASD)
Placebo-
controlled,
Reduction in the ABC, SRS and
double- 50–150 4-18 ABC, SRS,
Sulforaphane 40 CGI-I scores compared to (59)
blind, μmol weeks CGI-S, CGI-I
placebo
randomized,
clinical trial
One of these families reported
that the behavioral improvement
was maintained even after the
Not discontinuation of sulforaphane
Sulforaphane Case series 3 years 16 Descriptive (60)
reported use, and nine families are either
still taking SF with sustained
improvement (Follow-up of
paper)
Placebo-
controlled,
Improvements in irritability,
double- 200-300
Celecoxib 10 weeks 40 ABC social withdrawal, and (63)
blind, mg
stereotypic behavior subscales
randomized,
clinical trial
Improvement in irritability,
lethargy, stereotypy,
ABC, PPVT-
Spironolactone Case report 2 mg/kg 4 weeks 1 hyperactivity and inappropriate (81)
III
speech in ABC scale. Increase in
language gain in PPVT-III
Serum TNF-α reduction in 57%.

Decreased symptoms of autism
CARS,
based on the CARS scores, CGI
Open-label ADOS,
Lenalidomide 2,5 mg 12 weeks 7 expressive language, CGI (65)
study ROWPVT,
receptive language at 6 weeks
CGI-I
and CGI expressive language at
12 weeks
Placebo-
Improvement in irritability,
controlled,
social withdrawal, stereotypic
double- 400-600
Pentoxifylline 10 weeks 40 ABC, ESRS behavior, hyperactivity and (75)
blind, mg
inappropriate speech in ABC
randomized,
scale
clinical trial
“Remarkably effective” in 10
cases, “fairly effective” in eight
Open-label 150-600 Not
Pentoxifylline 23 Descriptive cases, “slightly effective” in three (70)
study mg reported
cases, and had “no effect” in two
patients
Six patients (20%) showed

Open-label Not Not marked improvement in behavior
Pentoxifylline 30 Descriptive (71)
study reported reported and 14 (47%) showed slight
amelioration of symptoms
179
n
(ASD)
Seiken’s
Critical List
for Autistic
35% of patients, improvement
Open-label Children and
Pentoxifylline 200 mg 3 months 20 was observed in at least two of (72)
study patients’
three assessments
behavior in
specific
situations
Open-label 4 to 10 Improvement in pronunciation of

Pentoxifylline 200 mg 2 Descriptive (73)
study months syllables and words
EEG, "check EEG before and after

list for pentoxifylline showed significant
autistic differences 39% of patients.
Open-label 10-15
Pentoxifylline 3 months 20 children", Improvement in "playing with a (74)
study mg/kg
Parent-Child friend” and "personal
Relationship communication in a
Test psychopathological test"
Improvements in stool
characteristics, "allergic
200 not
Luteolin Case series 37 Descriptive problems, eye contact, retention (85)
mg/10 kg reported
of learning, social interaction,
attention to directions and speech
Benefit in adaptive functioning

Open-label 100 VABS, ABC,
Luteolin 26 weeks 50 (VABS scores) and in the overall (86)
study mg/10 kg ATEC, CGI-I
behavior (ABC).
Improvement in motor
700 mg +
stereotypies, hyperactivity and
Luteolin Case report 70 mg 12 months 1 ATEC (88)
cognitive abilities. Diminishment
bid
of enuresis.
Improvements in age-equivalent
Open-label communication, daily living
Luteolin 100 mg 26 weeks 40 VABS (87)
study skills and social domains.
Improvement in composite score.
CLSQ, Changes in FMAER responses,

Not
Prednisolone Case series 2 mg/kg 44 FMAER, improvement of language (90)
reported
EEG functions
180
n
(ASD)
REEL,
Vineland,
0.5 Improvement of social abilities,
Prednisolone Case report 1 year 1 Rosetti, Child (91)
mg/kg speech and attention span
Autism
Rating Scale
0.5 Improvement in language skills

Prednisone Case report 28 weeks 1 WISC-R (92)
mg/kg and behavior
30 months
Prednisolone Case series 2 mg/kg and 48 2 Descriptive Improvement in speech (93)
months
Placebo-
controlled,
Improvement in irritability and
double-
Minocycline 100 mg 10 weeks 50 ABC, ESRS hyperactivity/noncompliance (126)
blind,
subscales
randomized,
clinical trial
CGI-I,
Open-label 1.4
Minocycline 6 moths 11 VABS, DAS- No clinical improvements (125)
study mg/kg
II, NVDQ
Improvement in hyperactivity,
Open-label 12-16
Pioglitazone 30-60 mg 25 ABC irritability, lethargy and (133)
study weeks
stereotypy subscales
Placebo-
controlled,
double- Improvement in hyperactivity,
Pioglitazone 30 mg 10 weeks 40 ABC (134)
blind, irritability and lethargy subscales
randomized,
clinical trial
Placebo-
controlled,
140, 420
Oral Human double- Absence of difference from
or 880 12 weeks 125 MGIS (103)
Immunoglobulin blind, placebo
mg
randomized,
clinical trial
181
n
(ASD)
Oral Human Open-label GSI, ABC Improvement of GI symptoms

420 mg 8 weeks 12 (102)
Immunoglobulin study and CGI-S and behavior
Placebo-
controlled, 400 ABC,
Amelioration of most ratings on
Intravenous double- mg/kg Symptom
13 weeks 12 ABC factors and Symptom (105)
Immunoglobulin blind, single Checklist,
Checklist scores
randomized, dose CPRS
clinical trial
Ritvo-
Freeman
400 Real Life
Intravenous Open-label
mg/kg/ 6 months 5 Rating Scale, No significant difference (107)
Immunoglobulin study
monthly C-YBOCS,
CGI-AD, A-
NIMH
154 to
375
Intravenous Open-label mg/kg Only 1 child had autism core
19 weeks 10 Descriptive (106)
Immunoglobulin study per dose symptoms relief
(1-6
doses)
CCC-2, SRS,
ABC, CGI-S,
CGI-I,
ADOS,
PPVT.
1 g/kg
Intravenous Open-label CD154, toll- Ameliorating of speech and
(10 31 weeks 14 (108)
Immunoglobulin study like receptor- social interactions
doses)
4, memory B
cells,
FOXp3,
lymphocyte
stimulation.
2 x 106
Mononuclear CBMNC 4 Combination group was more
and Open-label s /kg and infusions CARS, ABC beneficial than CBMNC alone,
36 (110)
Mesenchymal study 106 (1 every and CGI and both were more effective
Stem Cells UCMSC 5-7 days) than only behavioral therapy
s /kg
Open-label Less agitation; improvement in

Fetal Stem Cells * 2 days 45 ATEC, ABC (111)
study eye contact, appetite and affect
182
n
(ASD)
Autologous Bone 56 CARS reduced from severely

Marrow- × 106 autistic to
Single
Derived Case report MNCs 1 CARS non-Autistic but the general (112)
infusion
Mononuclear intrathec impression on clinical assessment
Cells ally showed mild autism.
4 sessions Improvements in eye

Embryonic Stem SPECT,
Case series ** of 4-6 3 coordination, balance, sensory (116)
Cells descriptive
weeks processing, writing and speaking.
Bone Marrow
Open-label Single ISAA, Wee-
Aspirate 5 ml/kg 10 Improvements in ISAA (114)
study infusion FIM
Concentrate
VABS-II,
7 CGI-S, CGI- Improved eye contact,
Autologous Open-label 1-5 x 10 Single
25 I, PDDBI, improvement in all scales (115)
Cord Blood study cells / kg infusion
EOWPVT-4 employed
scales. EGT.
Autologous Bone
Marrow- ISAA, CGI-I,
Open-label 8.19 x Single
Derived 32 FIM, Wee- Improvement in all scores (113)
study 107 cells infusion
Mononuclear FIM
Cells
Dialyzable 3 days
Open-label Amelioration and reversion of
Lymphocyte 150 IU every 6-12 40 SSSA (118)
study symptoms
Extract weeks
*1.6 ml of liver cells suspension with cell count > 30 x 10ˆ6 cells / ml each transplantation; 2.29 ± 0.49 ml
of brain progenitor cells with cell count > 8.70 x 10ˆ6/ml per transplantation
**0.25 mL of hESCs (< 4 million cells) IM once-a-day; 1 mL (< 16 million cells) given twice a week IV;
1 to 5 mL every 7 days by supplemental routes; nasal spray administered twice a week
Social Responsiveness Scale (SRS), Clinical Global Impression Severity (CGI-S) Scale, Clinical Global
Impression Improvement (CGI-I) Scale, Peabody Picture Vocabulary Test III (PPVT-III), Receptive and
Expressive One-Word Picture Vocabulary Tests (ROWPVT), Autism Diagnostic Observation Schedule
(ADOS), Childhood Autism Rating Scale (CARS), Extrapyramidal Symptoms Rating Scale (ESRS),
Seiken’s Critical List for Autistic Children, Vineland Adaptive Behavior Scales, Second Edition (VABS),
Ability Scales Second Edition (DAS-II), Mullen Scales (NVDQ), Modified Global Improvement Scale
(MGIS), Gastrointestinal severity index (GSI), Autism Treatment Evaluation Checklist (ATEC), Clinical
Language Status Questionnaire (CLSQ) Receptive-expressive emergent language test (REEL), Wechsler
Intelligence Scale for Children-Revised (WISC-R), Children Yale-Brown Obsessive Compulsive Scale (C-
YBOCS), Autism Modification of the NIMH Global Obsessive-Compulsive Scale (A-NIMH), Symptom
severity score average (SSSA), Indian Scale for Assessment of Autism (ISAA), Functional Independent
Measure (FIM), Functional Independent Measure for children (Wee-FIM).
183
Table 2 – Side events
Therapy Side effects Ref. Therapy Side effects Ref.
Transitory and self-limited

Greater weight gains
elevations in white blood
Sulforaphane possible association with (59) Pioglitazone (133)
counts, glucose levels and
seizures
liver enzymes
Rash and transient drop of Oral Human Skin and subcutaneous
Lenalidomide (65) (103)
absolute neutrophil count Immunoglobulin tissues disorders
Nausea, vomiting, low blood Oral Human

Pentoxifylline (70) Vomiting, skin rash (103)
pressure and headache Immunoglobulin
Limited to the Intravenous Mild headaches and infusion

Pentoxifylline (72) (108)
gastrointestinal tract Immunoglobulin site reactions
Mononuclear
and
Luteolin Increased irritability (86) Self-limited low-grade fever (110)
Mesenchymal
Stem Cells
Cushing syndrome,
Allergic reaction, skin
irritability. GI bleeding and Autologous Cord
Prednisolone (90) changes, agitation, (115)
hypercalcemia (both self- Blood
childhood infections
limited).
Gastrointestinal and upper
respiratory symptoms;
PICA; hematuria; weight
gain; hyperactivity; urinary Autologous Bone
Headache, nausea and
tract infection; otitis media; Marrow-Derived
Minocycline (125) vomiting, pain in procedure (113)
epistaxis; teeth staining; Mononuclear
site, seizures
increased aggression, head- Cells
banging, sensitivity to lights,
appetit and ritualistic
behavior
184
11 ARTIGO 2 - EFEITO DO TRATAMENTO COM RESVERATROL EM

SUJEITOS PEDIÁTRICOS COM TRANSTORNO DO ESPECTRO AUTISTA –
UM ESTUDO PILOTO.
Efeito do tratamento com resveratrol em sujeitos pediátricos com transtorno do

espectro autista – um estudo piloto
Josemar Marchezan1,2,3,4, Iohanna Deckmann2,3,4,5, Guilherme Cordenonsi da

Fonseca2,3,4,6, Rogerio Margis4,6, Rudimar Riesgo1,2,4,7, Carmem Gottfried2,3,4,5.
1
Programa de Pós-Graduação em Saúde da Criança e Adolescente, Faculdade de
Medicina, Universidade Federal do Rio Grande do Sul-UFRGS, Porto Alegre, RS, Brasil.
2
3
4
5
Brasil
6
Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular, Centro de Biotecnologia,
Universidade Federal do Rio Grande do Sul-UFRGS, Porto Alegre, RS, Brasil
7
Porto Alegre;
RESUMO
Introdução: O transtorno do espectro autista (TEA) envolve uma interação complexa

de fatores de risco genéticos e ambientais, com alterações imunológicas, inflamatórias,
desbalanço redox e alterações na conexão sináptica ao longo do desenvolvimento. O
resveratrol (RSV) é polifenol de origem vegetal, presente especialmente nas cascas e
sementes de uvas, com importantes propriedades antioxidantes, anti-inflamatórias e
neuroprotetoras. Objetivos: Avaliar a eficácia e segurança do RSV em sujeitos
pediátricos com diagnóstico de Transtorno do Espectro Autista (TEA). Metodologia:
Por meio de ensaio clínico piloto, aberto, administrou-se RSV 200mg ao dia pelo
período de 90 dias em 5 pacientes com autismo. Os desfechos foram medidos através
185
da escala Aberrant Behavior Checklist (ABC) e Clinical Global Impression –

Improvement (CGI-I), da avaliação de exames laboratoriais e da expressão de 8
microRNA. Resultados: Todos os participantes eram do sexo masculino, com idade
entre 10 e 13 anos. Os resultados demonstram redução significativa nos escores da
escala ABC total (p=0,042) e da subescala Irritabilidade (p=0,041). As subescalas
Comportamento estereotipado (p=0,066), Hiperatividade (p=0,068) e Letargia e esquiva
social (p=0,078) tiveram redução limítrofe para significância. Ao fim dos 90 dias de
tratamento, pela escala CGI-I, três (60%) dos cinco participantes estavam melhor, 1
ligeiramente melhor e 1 não apresentou alterações. Não houve efeitos adversos, nem
variações laboratoriais associados ao uso do RSV. Dos 8 microRNA avaliados, houve
diferença de expressão pré e pós resveratrol em 3 microRNA (miR-124-3p, miR-125a-
5p e miR-195-5p). Conclusões: Os resultados deste estudo piloto sugerem que o RSV
é seguro no uso em pacientes pediátricos e que possa ter um papel no tratamento dos
sintomas do TEA, inclusive induzindo alterações na expressão de microRNA com
função moduladora inflamatória.
Palavras-chave: Resveratrol. Neuroinflamação. Inflamação. Autismo. Transtorno do

espectro autista.
Introdução
O transtorno do espectro autista (TEA) é um distúrbio do desenvolvimento

neurológico de base biológica caracterizado por alterações em dois domínios
comportamentais principais: 1) déficits na comunicação e interação sociais e 2) padrões
restritos e repetitivos de comportamento, interesses e atividades (ASSOCIATION, 2013).
A última prevalência estimada de TEA pelo Center for Disease Control and Prevention
(CDC) é de 16,8 por 1000 crianças (1 em 59), afetando 26.6/1000 meninos e 6,6/1000
meninas. Essa prevalência representa um aumento de aproximadamente 150% entre os
anos 2000 e 2014 (BAIO et al., 2018).
A etiologia do TEA permanece não completamente elucidada (GŁADYSZ;

KRZYWDZIŃSKA; HOZYASZ, 2018). Contudo, o número crescente de publicações,
especialmente na última década, não deixa dúvidas quanto ao aspecto multifatorial do
espectro e indica uma interação complexa entre fatores genéticos/ambientais e fatores do
sistema imunológico (GOTTFRIED et al., 2015).
A disfunção imunológica tem sido uma característica reconhecida nos distúrbios

do espectro autista há várias décadas e tem sido destacada em revisões recentes
(CAREAGA; VAN DE WATER; ASHWOOD, 2010; CHEZ; GUIDO-ESTRADA,
2010; GŁADYSZ; KRZYWDZIŃSKA; HOZYASZ, 2018; GOTTFRIED et al., 2015;
186
MASI et al., 2015, 2017; MCDOUGLE et al., 2015; MEAD; ASHWOOD, 2015;
2014). Muitos pesquisadores sugerem a possibilidade de que a disfunção imune no TEA
possa ser caminho viável para a intervenção farmacológica, e um subgrupo de indivíduos
com TEA poderia se beneficiar de terapias de base imunológica (CAREAGA; VAN DE
O Resveratrol (RSV) é uma molécula simples inicialmente isolada em extrato

derivado da planta Cassia quinquangulata, originária do Peru, durante a procura por novos
agentes quimiopreventivos contra o câncer (JANG et al., 1997). Os polifenóis,
especialmente o trans-RSV, vem recebendo atenção especial da comunidade científica
devido aos inúmeros estudos mostrando seu papel terapêuticos em diversas doenças, como
câncer, doenças cardíacas, diabetes tipo 2 e doenças neurodegenerativas. É provável que
diferentes mecanismos estejam envolvidos, mas a modulação da inflamação seria o
mecanismo unificador (VANG et al., 2011).
Nos últimos anos, estudos em modelos animais de TEA usando RSV tanto no
período pré-natal como pós-natal sugerem que ele possa atenuar os sintomas do espectro
(incluindo melhora do comportamento social, redução do comportamento repetitivo e
alterações na sensibilidade) e melhorar disfunção imune (AHMAD et al., 2018;
BAKHEET et al., 2016, 2017; BAMBINI-JUNIOR et al., 2014; BHANDARI; KUHAD,
2017; FONTES-DUTRA et al., 2018; HIRSCH et al., 2018a; LI et al., 2009).
Uma vez que os critérios para diagnóstico do TEA são clínicos e resultam de
análises comportamentais, os microRNA surgem como uma importante ferramenta
biomarcadora. Eles poderiam auxiliar no diagnóstico precoce, na mensuração de risco de
desenvolvimento do TEA, na avaliação do prognóstico, na caracterização de subgrupos
de pacientes e na definição de subconjuntos de indivíduos que responderiam mais
favoravelmente a tratamentos específicos (ANDERSON, 2015; GOLDANI et al., 2014;
ZWAIGENBAUM; PENNER, 2018). Os microRNA (miRNA) são pequenos RNA não-
codificantes com 19-25 nucleotídeos que atuam como reguladores da tradução de RNA
mensageiros em suas respectivas proteínas, controlando diversos processos celulares
(AMBROS, 2004). Níveis alterados de alguns miRNA têm sido implicados em várias
187
desordens do SNC (DE SMAELE; FERRETTI; GULINO, 2010; SAUGSTAD, 2010). No

entanto, ainda há poucos estudos demonstrando o papel dos miRNA no TEA (KAMAL;
MUSHTAQ; GREIG, 2015).
No presente estudo, foi administrado RSV a crianças com TEA para

avaliação de possíveis efeitos terapêuticos, tolerabilidade e segurança. Também
avaliada sua ação sobre a expressão de diferentes miRNA.
Materiais e Métodos
Delineamento do Estudo e Logística
Este é um estudo piloto na forma de ensaio clínico aberto para avaliação de eficácia
e tolerabilidade de RSV 200mg ao dia em sujeitos pediátricos com diagnóstico de TEA.
O estudo ocorreu de outubro de 2017 a janeiro de 2018. Os pacientes foram recrutados no
Ambulatório de TEA do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA), e as escalas e
coletas de sangue foram realizadas no Centro de Pesquisas Clínicas (CPC) do HCPA. As
análises laboratoriais foram realizadas pelo Laboratório de Análises Clínicas do HCPA e
a análise de expressão dos microRNA no Laboratório de Plasticidade Neuroglial,
Departamento de Bioquímica – UFRGS.
Sujeitos
Foram incluídos no estudo pacientes do sexo masculino com diagnóstico de
TEA pelos critérios do Manual Diagnóstico e Estatístico de Doenças Mentais, 5ª
edição (ASSOCIATION, 2013) com idade entre 10 e 18 anos. Medicamentos
psicotrópicos eram permitidos desde que estivessem com as doses estáveis por no
mínimo 4 semanas antes da inclusão, sem necessidade de adequação da dose ao longo
do estudo.
Os sujeitos foram excluídos do estudo se apresentassem qualquer um dos critérios
a seguir: 1) Presença de doenças com características comuns ao autismo, como:
Síndrome de X frágil, Síndrome de Rett, Síndrome de Angelman, Síndrome de Prader-
Willi, Síndrome de Smith-Lemli-Opitz e Esclerose Tuberosa; 2) Necessidade de ajuste
de dose ou interrupção de medicação de base no período do estudo; 3) Uso de
188
anticonvulsivantes; 4) Presença de doença sistêmica em atividade (como cardiopatia,

hepatopatia, nefropatia); 5) Qualquer condição que, no parecer do investigador,
colocaria a segurança do sujeito em risco após a exposição à substância em estudo.
Intervenção
Os sujeitos receberam RSV na dose de 200mg/dia (duas cápsulas de 100mg em

tomada única diária pela manhã) por 90 dias. O RSV utilizado apresenta níveis de pureza
adequados para ensaios clínicos (99% trans-RSV, Farmácia Reativa, Porto Alegre, RS).
Medidas de resposta
Os sintomas do espectro autista foram avaliados através da escalas Lista de

Checagem de Comportamento (do inglês, Aberrant Behavior Checklist, ABC) (AMAN
et al., 1985; LOSAPIO et al., 2011) e Impressão Global Clínica – Melhora (do inglês,
Clinical Global Impression – Improvement, CGI-I) (GUY W, 1976) previamente e após
90 dias de tratamento.
Para melhor avaliar os efeitos adversos da administração do RSV, optou-se
por coleta de exames laboratoriais por punção de veia periférica, antes do início do uso
e após 45 e 90 dias. Nessas amostras foram realizadas as seguintes análises:
hemograma com plaquetas, transaminase glutâmica oxalacética (TGO),
transaminase glutâmica pirúvica (TGP), amilase, bilirrubina total e frações, glicose,
colesterol total, colesterol HDL, triglicerídeos, desidrogenase lática e creatinina.
Também foram avaliadas a expressões de um conjunto de 8 microRNA
relacionados com sistema imune e plasticidade neural (hsa-miR-21-5p, hsa-miR-25-3p,
hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-124-3p, hsa-miR-125a-5p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-191-
5p, hsa-miR-195-5p) antes e após 90 dias de tratamento.
Extração de microRNA
Coleta de PBMCs
189
As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram coletadas a partir

de 5 ml de sangue periférico retirado de cada indivíduo por venopunção em tubos de
EDTA e isoladas por gradiente de densidade (Histopaque 1,077 g/ml; Sigma Aldrich, St.
Louis, Missouri) de acordo com as instruções do fabricante.
O sangue total foi centrifugado a 1200 rpm durante 15 minutos à temperatura

ambiente. O plasma foi retirado e imediatamente armazenado em TRIzol® (1:2). O
sangue foi reconstituído com PBS no mesmo volume de plasma retirado. O sangue
anticoagulado reconstituído foi depositado sobre o Histopaque-1077 e centrifugado a 400
g (rcf) durante 30 minutos à temperatura ambiente. Os linfócitos e outras células
mononucleares permanecem na interface plasma/Histopaque 1,077. As PBMCs foram
aspiradas, transferidas para um tubo de centrífuga cônico limpo e lavadas com solução
isotônica de salina tamponada com fosfato (PBS). Após nova centrifugação a 1500 rpm
durante 5 minutos a 4ºC, o sedimento contendo as células foi ressuspenso em PBS e as
células foram ressuspensas para contagem. As PBMCs purificadas foram marcadas com
azul de tripan (1:10) e contadas manualmente com um hemocitômetro. As células foram
também imediatamente armazenadas em TRIzol®.

(RT-qPCR)
O RNA total das amostras de plasma foi isolado usando QIAzol® (QIAGEN,

5p, hsa-miR-25-3p, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-124-3p, hsa-miR-125a-5p, hsa-miR-146a-
5p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-195-5p) ao mix contendo RNA, oligo(dT)25V (5 mM),
250 mM de dNTPs (Ludwig, RS, Porto Alegre, Brasil) e água livre de RNase para um
volume total de 17 ml seguido de uma incubação a 65°C por 5 minutos e resfriamento em
gelo. A enzima MML-V RT (New England Biolabs, MA, USA) foi usada para a síntese
de cDNA de acordo com as instruções do fabricante. Cada mix de reação foi incubado a
16°C por 30 minutos seguido de outros 30 minutos a 42°C. Todas as amostras de cDNA
190
foram diluídos 50 vezes em água livre de RNAse. Os primers stem-loop, primers de

iniciação e o primer universal reverso foram desenhados de acordo com (CHEN et al.,
2005).

CA, USA), 0.1mM de dNTPs, 1× Tampão de PCR, 3mM MgCl2, 0.25U de Taq DNA
para identificar os miRNA mais pcr foram setadas como segue: uma etapa inicial de
ativação da polimerase por 5 min. a 95 °C, 40 ciclos de 15 segundos a 95 °C para
desnaturação, 10 segundos a 60 °C para anelamento e 10 segundos a 72 °C para
alongamento. A análise da curva de melting foi programada ao fim da corrida de PCR no
intervalo de 65 a 95 °C, e a temperatura aumentou gradualmente em 0.4 °C. O limite e as
linhas de base foram determinados manualmente usando o software do gerenciador Bio-
Rad CFX. Para calcular a expressão relativa dos miRNA foi utilizado o método 2-ΔΔCt
(LIVAK; SCHMITTGEN, 2001). O teste t de Student foi realizado para comparar as
diferenças de expressão entre as diferentes amostras. As médias foram consideradas
significativamente diferentes quando p <0,05.
Considerações éticas
O protocolo foi aprovado pela Comitê de Ética em Pesquisa do HCPA (CPE-
HCPA) sob número 17-0132 (CAAE 65862917100005327). Os pais e/ou responsáveis
assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.
Análise estatística
Como se tratava de um estudo piloto para prova de conceito e não existiam dados
de segurança do uso de RSV em crianças, optou-se por sua administração em número
reduzido de sujeitos, sem cálculo de tamanho amostral.
191

transportados para o programa SPSS (Statistical Package for the Social Sciences),
versão 21.0, onde foram processados e analisados.
Na análise descritiva, foram utilizados média e desvio-padrão para as variáveis
quantitativas e as frequências absolutas e relativas para as variáveis qualitativas.
Para a comparação das médias de valores da escala ABC foi usado o teste t de
Wilcoxon para amostras emparelhadas, e para o cálculo do tamanho do efeito foi
utilizada a fórmula d de Cohen, ajustada para n menor que 50. Na comparação de
valores de expressão dos miRNA, incluiu-se um valor por normalizador em cada
amostra (HIRSCH et al., 2018b) e foi utilizado teste t de Student para amostras
emparelhadas. Para significância estatística, foi considerado um valor de p igual ou
menor a 0,05.
Resultados
A amostra foi constituída de 5 crianças do sexo masculino. A idade variou de

10 a 13 anos, com média de 11,8 (±1,1) anos. Dois pacientes apresentavam
inteligência normal (sujeitos 3 e 5), conforme medidas de QI por testes psicométricos;
os demais apresentavam funcionamento compatível com deficiência intelectual leve
(sujeito 4) e deficiência intelectual moderada (sujeitos 1 e 2). Três dos sujeitos
apresentavam comunicação verbal preservada (sujeitos 3, 4 e 5), um falava somente
frases curtas (sujeito 1) e um apresentava somente fala ecolálica (sujeito 2). Dois
pacientes faziam uso de medicações psicotrópicas (40%), sertralina e aripiprazol.
Todos os pacientes faziam pelo menos um tratamento não medicamentoso. As
características da amostra estão resumidas na Tabela 1.
Ao fim dos 90 dias de tratamento, pela escala CGI-I, três (60%) dos cinco
participantes estavam melhor, 1 ligeiramente melhor e 1 não apresentou alterações.
Comparando-se as médias dos escores da escala ABC, verificou-se uma redução
no escore total da escala e todas as suas subescalas. O escore total e a subescala
Irritabilidade apresentaram diferença estatisticamente significativa (Tabela 2). Na
Tabela 3 encontram-se os escores de todos os sujeitos e sua variação após o uso de
RSV.
Dos 8 miRNA avaliados em PBMCs, o algoritmo GeNorm classificou os 21-
5p, 30c-5p e 191-5p como os mais estáveis, e eles foram usados como normalizadores
192
para avaliar a expressão relativa do demais miRNA. Dos 5 restantes, três miRNA
apresentaram aumento significativo na expressão relativa após 90 dias do uso de RSV:
miR-124-3p (p=0,021), miR-125a-5p (p=0,036) e miR-195-5p (1,61515E-07) (Figura
1).
Nenhum paciente apresentou efeitos colaterais, e o RSV foi bem tolerado.
Todos os pacientes completaram o estudo e não ocorrem alterações laboratoriais
durante a pesquisa, resultados descritos na Tabela 4.
Discussão
Até o momento, nenhum tratamento disponível é capaz de reverter

completamente os principais sintomas do TEA (BENVENUTO et al., 2013;
EISSA et al., 2018). Apenas dois medicamentos, risperidona e aripiprazol, são
aprovados pelo Food and Drug Administration (FDA) para o tratamento de sintomas
disruptivos nesses pacientes (EISSA et al., 2018; SHARMA; GONDA; TARAZI, 2018)
e estão associados a eventos metabólicos adversos, como ganho de peso, dislipidemia
e hiperglicemia (YOUNG; FINDLING, 2015). O comprometimento individual,
afetando muitas facetas do funcionamento diário (MASI et al., 2017), o efeito
econômico direto e indireto dos tratamentos e o sofrimento da família reforçam a
necessidade de busca contínua por intervenções efetivas (BUESCHER et al., 2014;
KARST; VAN HECKE, 2012; MARCHEZAN et al., 2017; SMITH; GREENBERG;
MAILICK, 2014; WEISS et al., 2012).
Pelo nosso conhecimento, esse é o primeiro trabalho com uso de RSV tanto em
crianças quanto em pacientes com diagnóstico de TEA. Assim como nos modelos
animais, nosso estudo sugere que o RSV possa reduzir os sintomas do TEA. Verificamos
que após 3 meses do uso do medicamento, 3 crianças estavam melhor e uma ligeiramente
melhor pela escala CGI-I. Houve também redução nos escores da escala ABC, com
significância estatística no escore total e subescala Irritabilidade. As subescalas Letargia
e esquiva social, Comportamento estereotipado e Hiperatividade apresentaram melhora
com p<0,1, caracterizando uma resposta marginalmente significante; possivelmente,
esses achados apresentariam diferença significativa com amostras maiores. Os dois
pacientes (sujeitos 3 e 5) com inteligência normal foram aqueles com melhores respostas,
mostrando uma possível tendência do RSV a ser mais eficaz nos pacientes com maior
capacidade cognitiva. Na nossa amostra, 60% dos pacientes apresentavam fala preservada
193
e 20% não apresentava comunicação verbal efetiva, o que poderia justificar a baixa
resposta na subescala Fala inapropriada.
O RSV foi bem tolerado, e nenhum paciente apresentou efeitos colaterais. Estudos
prévios em adultos referiram reações adversas leves e autolimitadas, principalmente com
doses maiores que 500mg ao dia (ALMEIDA et al., 2009; ELLIOTT et al., 2009;
HEEBØLL et al., 2016; LA PORTE et al., 2010; VODUC et al., 2014), e ausência de
efeitos colaterais em estudos com doses menores que 500mg (BEDADA; NEERATI,
2016; FAGHIHZADEH; ADIBI; HEKMATDOOST, 2015; LIN; SUN; LIN, 2016;
MACEDO et al., 2015; PATEL et al., 2010; POLLEY et al., 2016; THAZHATH et al.,
2016; TURNER et al., 2015; WONG et al., 2011, 2013; ZORTEA et al., 2016). Alguns
estudos anteriores em adultos descreveram alterações hematológicas e aumento do
colesterol, contudo, no trabalho atual não ocorreram alterações após 45 ou 90 dias do uso
da medicação (BO et al., 2016; HEEBØLL et al., 2016; VODUC et al., 2014).
Após o tratamento com RSV, houve um aumento de expressão dos microRNA
miR-124-3p, miR-125a-5p e miR-195-5p. Recente estudo do nosso grupo não verificou
diferença expressão desses três miRNA no sangue de pacientes com TEA em relação aos
controles (HIRSCH et al., 2018c), contudo, estudos anteriores encontraram o miR-195-
5p com aumento de expressão em linfócitos e soro de crianças com TEA (MUNDALIL
VASU et al., 2014; SARACHANA et al., 2010). Além disso, nosso grupo evidenciou que
o RSV pode modificar a expressão de miRNA em modelo animal de autismo (HIRSCH
et al., 2018a).
Os miRNA cuja expressão foi alterada pelo RSV estão associados a inflamação.
Estudos em modelos animais e humanos mostraram evidências de alterações no
funcionamento do sistema imunológico central e periférico no TEA, incluindo
estimulação de células imunes, geração de auto-anticorpos, desequilíbrio de
citocinas/quimiocinas e aumento da permeabilidade da barreira hematoencefálica
(GOTTFRIED et al., 2015).
O miR-124 é conhecido por ser abundante em neurônios, estando associado à
diferenciação neuronal (MAKEYEV et al., 2007; MISHIMA et al., 2007). Em modelos
de trauma cranioencefálico e medular, o aumento do miR-124-3p tem efeito inibitório
na neuroinflamação através da redução de TNF-α, IL-1β e IL-6 e aumento da IL-10. O
miR-124 também suprime a sinalização mTOR, via reguladora da resposta inflamatória
cuja desregulação está relacionada à esclerose tuberosa e TEA (HASBANI; CRINO,
2018; HUANG et al., 2018; LOUW et al., 2016; ONORE et al., 2017; WINDEN;
194
EBRAHIMI-FAKHARI; SAHIN, 2018). Interessantemente, o RSV tem efeitos benéficos

em modelos de lesão medular através da inibição da via mTOR (ZHOU et al., 2018).
O miR-125a-5p regula negativamente a expressão de quimiocina CCL5 através
da via fator de fator Kruppel-like 13 (KLF13) em células T ativadas, e sua regulação
negativa teria papel na autoimunidade relacionada ao lúpus eritematoso sistêmico
(WANG et al., 2012; ZHAO et al., 2010). O aumento da sua expressão tem efeito
negativo na regulação da via NFκB (KIM et al., 2012), além de um papel importante na
supressão da ativação de macrófagos (BANERJEE et al., 2013; GRAFF et al., 2012). Na
doença de Graves, uma doença autoimune, a expressão de miR-125a em PBMCs
encontra-se reduzida (INOUE et al., 2014).
O miR-195 está associado à inibição da ativação pró-inflamatória de macrófagos,
reduzindo significativamente os níveis de citocinas inflamatórias como IL-1β, IL-6 e
TNF-α (BRAS et al., 2017). Também suprime o processo inflamatório através das vias
do TNF-α/NF‑κB e VEGF/PI3K/Akt (MA et al., 2018).
Apesar de observar melhoras nos sintomas do TEA, o número reduzido da
amostra, a natureza aberta do estudo e o potencial efeito placebo secundário à expectativa
da família impossibilitam conclusões definitivas sobre benefícios do RSV em pacientes
com TEA. Contudo, os resultados indicam que o RSV pode ser seguro infância, pode
reduzir sintomas do TEA e alterar alvos moleculares (miR-124-3p, miR-125a-5p e miR-
195-5p) com papel nas respostas inflamatórias.
Conclusões
Os resultados deste estudo piloto, apesar do tamanho reduzido da amostra,

sugerem a segurança do uso de RSV em crianças e seu possível efeito benéfico nos
sintomas do TEA. O RSV também aumentou a expressão dos miR-124, miR-125a-5p
e miR-195-5p, microRNA com ação na modulação da resposta inflamatória. Novos
ensaios clínicos controlados por placebo são necessários para confirmar o potencial
terapêutico e a segurança do RSV em crianças com TEA. O papel dos miR-124-3p,
miR-125a-5p, miR-195-5p e outros miRNA na fisiopatogenia do TEA também merece
ser alvo de novas pesquisas.
Agradecimentos
195
Ao Fundo de Investimento em Pesquisas e Eventos (FIPE-HCPA), ao

Programa de Pós-graduação em Saúde da Criança e do Adolescente – Faculdade
de Medicina (UFRGS) e ao Grupo de Pesquisas Translacionais em Transtorno
do Espectro Autista (GETTEA- UFRGS).
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200
Tabela 1 – Característica da Amostra.
Sujeito Idade QI CGI-G Exames Terapias Medicamentos
PEA, EEG, Cariótipo,

DI Moderadamente Psico, Fono, TO,
1 12 Pesquisa de X-frágil e Sem uso
mod doente escola
RNM normais
Audiometria, EEG,
DI Marcadamente Cariótipo, Pesquisa de
2 12 Fono, escola Sem uso
mod doente X-frágil e RNM
normais
Cariótipo, Pesquisa de Psicopedagogia,

Moderadamente
3 13 133 X-frágil e EEG musicoterapia, Sem uso
doente
normais escola
EEG, Cariótipo,
DI Moderadamente Psico, Fono, TO, Sertralina e
4 10 Pesquisa de X-frágil e
leve doente escola Aripiprazol
RNM normais
Psico,
Moderadamente EEG com paroxismos
5 12 120 psicopedagogia, Sertralina
doente focais
escola
DI – Deficiência Intelectual; Mod – moderada; PEA – potencial evocado auditivo; EEG –

eletroencefalograma; RNM – Ressonância Nuclear Magnética; Psico – psicologia; Fono -
fonoaudiologia; TO – Terapia Ocupacional.
Tabela 2. Médias dos escores da escala Aberrant Behavior Checklist antes e após
tratamento com Resveratrol.
Tamanho do
Subescala Pré-RVS Pós-RVS P
efeito
Escore total 70,0± 9,48 56,2 ±17,1 0,042 0,561
Irritabilidade 17,0± 5,52 12,4± 3,57 0,041 0,557

Letargia e 20,4±7,36 16,8±8,28 0,078 0,259
esquiva social
Comportamento 7,00±2,44 5,20±3,56 0,066 0,332
estereotipado
Hiperatividade 19,40±5,17 17,20±6,45 0,068 0,212
Fala 6,20±4,26 4,60±4,15 0,109 0,214

inapropriada
*Média±DP
Tabela 3 - Escores da escala Aberrant Behavior Checklist antes e após tratamento com Resveratrol.
Sujeito 1 Sujeito 2 Sujeito 3 Sujeito 4 Sujeito 5

Escala ABC
Pré Pós Variação % Pré Pós Variação % Pré Pós Variação % Pré Pós Variação % Pré Pós Variação %
Escore total 85 82 -4 73 65 -11 67 44 -34 61 49 -20 64 41 -36
Irritabilidade 9 8 -11 20 16 -20 19 12 -37 23 16 -30 14 10 -29
Letargia 27 28 4 23 21 -9 20 13 -35 8 6 -25 24 16 -33
Estereotipia 9 8 -11 10 10 0 6 3 -50 6 3 -50 4 2 -50
Hiperatividade 28 27 -4 20 18 -10 16 13 -19 18 18 0 15 10 -33
Fala inapropriada 12 11 -8 0 0 0 6 3 -50 6 6 0 7 3 -57
201
Tabela 4 – Exames laboratoriais.
Sujeito 1 Sujeito 2 Sujeito 3 Sujeito 4 Sujeito 5
Exames Pré 45 dias 90 dias Pré 45 dias 90 dias Pré 45 dias 90 dias Pré 45 dias 90 dias Pré 45 dias 90 dias
RSV RSV RSV RSV RSV RSV RSV RSV RSV RSV RSV RSV RSV RSV RSV
Hemoglobina 13,5 13,2 13,1 15,3 15,1 14,5 15,4 15,2 15,3 11,6 11,7 11,4 14,6 14,5 14,3
Hematócrito 38,3 37,5 36,9 44,8 44 43,1 43,8 43 42,8 35 35,4 35,1 42,8 42,6 42,1
Leucócitos 5710 6320 4620 5490 6700 5690 9810 8120 7620 9510 8910 8890 9000 11240 7290
Seg (%) 44,4 56,5 48,7 42,8 48,5 38,7 46,1 44,3 32,2 49,4 59,6 49,5 44,9 68,5 39
Linf (%) 37,7 27,7 33,1 40,8 35,1 45,5 36,7 37,7 43,6 39 28,1 39 42,3 20,1 48,4
Plaquetas 340000 304000 287000 237000 235000 216000 355000 303000 283000 302000 304000 324000 313000 295000 327000
DHL 250 190 180 234 195 178 224 169 158 171 181 183 180 155 151
Triglicerídeos 57 59 50 45 39 46 60 80 74 189 111 112 135 87 79
Colesterol
167 159 173 109 110 109 172 164 175 177 174 186 138 128 130
Total
Colesterol
53 49 53 47 49 50 57 61 57 39 40 42 31 34 25
HDL
Glicose 83 85 81 92 94 90 93 87 85 89 86 87 85 92 83
Creatinina 0,49 0,45 0,46 0,8 0,72 0,71 0,69 0,69 0,6 0,51 0,54 0,55 0,68 0,62 0,64
BT 0,5 0,3 0,5 0,4 0,4 0,7 0,3 0,4 0,5 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3
BI 0,4 0,2 0,3 0,3 0,2 0,4 0,2 0,2 0,3 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
BD 0,1 0,1 0,2 0,1 0,2 0,3 0,1 0,2 0,2 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
TGO 26 20 21 21 20 19 18 14 16 16 18 17 17 15 17
TGP 21 20 19 16 18 16 11 12 12 13 16 17 17 15 18
Amilase 55 59 56 59 55 54 94 92 87 46 38 42 26 26 25
Seg – segmentados; Linf – linfócitos; DHL – desidrogenase lática; HDL - lipoproteína de alta densidade; BT – bilirrubina total; BI – bilirrubina indireta; BD – bilirrubina
direta; TGO - transaminase glutâmico-oxalacética; TGP - transaminase glutâmico-pirúvico.
202
203
Figura 1. Expressão relativa de miRNA antes e depois do tratamento com RSV. As

barras representam o Erro Padrão da Média. *P<0,05.
204
12 ARTIGO 2 - THE EFFECTS OF RESVERATROL TREATMENT ON

PEDIATRIC SUBJECTS DIAGNOSED WITH AUTISM SPECTRUM
DISORDER – A PILOT STUDY.
The effects of resveratrol treatment on pediatric subjects diagnosed with autism

spectrum disorder – a pilot study.
Josemar Marchezan1,2,3,4, Iohanna Deckmann2,3,4,5, Guilherme Cordenonsi da

Fonseca2,3,4,6, Rogerio Margis4,6, Rudimar Riesgo1,2,4,7, Carmem Gottfried2,3,4,5.
1
Programa de Pós-Graduação em Saúde da Criança e Adolescente, Faculdade de
Medicina, Universidade Federal do Rio Grande do Sul-UFRGS, Porto Alegre, RS, Brasil.
2
3
4
5
Brasil
6
7
Porto Alegre;
ABSTRACT
Introduction: Autism spectrum disorder (ASD) is a condition that displays complex
interactions among genetic and environmental risk factors, immunological and
inflammatory alterations, redox imbalances, and modifications in synaptic connections
throughout development. Resveratrol (RSV) is a plant-originated polyphenol present on
grape peels and seeds, with important antioxidant, anti-inflammatory, and
neuroprotective properties. Objectives: To evaluate the efficacy and safety of RSV
in pediatric subjects diagnosed with Autism Spectrum Disorder (ASD). Methods:
In an open- label pilot clinical study, 200mg of RSV was administered daily, for 90 days,
to five patients diagnosed with ASD. Outcomes were measured via clinical laboratory
results, eight different microRNA expressions, and the Aberrant Behavior Checklist
205
(ABC) and Clinical Global Impression – Improvement (CGI-I) scale. Results: All
participants were male, aged between 10 and 13 years old. Results demonstrated a
significant reduction in the ABC total score (P = 0.042) and in the Irritability subscale
(P = 0.041). The Stereotypical Behavior (P = 0.066), Hyperactivity (P = 0.068) and
Lethargy/Social Withdrawal (P = 0.078) subscales demonstrated a slight reduction in
score, albeit not significant. At the end of the 90-day trial period, as measured by the
CGI-I scale, three (60%) of the five subjects demonstrated marked improvement; one
subject demonstrated mild improvement, and one subject demonstrated no alterations in
behavior. No adverse effects were observed, and RSV administration did not alter
clinical laboratory results. Of the eight microRNAs evaluated, three (miR-124-3p, miR-
125a-5p, and miR-195-5p) showed differences in expression before and after RSV
treatment. Conclusion: Results of this pilot study suggest that RSV is safe for use in the
pediatric population and may be useful in the treatment of ASD symptoms by altering
the expression of microRNAs that modulate inflammatory responses.
Keywords: Resveratrol. Neuroinflammation. Inflammation. Autism. Autism spectrum

disorder.
Introduction
Autism spectrum disorder is a neurodevelopmental disorder characterized by two

principal behavioral components: 1) difficulty with communication and social
interactions, and 2) restrictive and repetitive behaviors, interests and activities
(ASSOCIATION, 2013). According to the Center for Disease Control and Prevention
(CDC), ASD is prevalent in 16,8 out of every 1000 children (1 in 59), affecting 26.6/1000
boys and 6,6/1000 girls. This prevalence represents an increase of approximately 150%
between the years 2000 and 2014 (BAIO et al., 2018).
The etiology of ASD has not yet been completely elucidated (GŁADYSZ;
KRZYWDZIŃSKA; HOZYASZ, 2018). The growing number of publications, especially
in the last decade, however, leaves no doubt that it is a multifactorial disease which
demonstrates a complex interaction among genetic, environmental and immune
components (GOTTFRIED et al., 2015).
Immune dysfunction has been a well-recognized characteristic among autism

spectrum disorders for decades, and has been the focus of several recent publications
(CAREAGA; VAN DE WATER; ASHWOOD, 2010; CHEZ; GUIDO-ESTRADA,
2010; GŁADYSZ; KRZYWDZIŃSKA; HOZYASZ, 2018; GOTTFRIED et al., 2015;
MASI et al., 2015, 2017; MCDOUGLE et al., 2015; MEAD; ASHWOOD, 2015;
206
2014). Many suggest the possibility that the immune dysfunction present in ASD may
serve as a pharmacological target, and that a subgroup of patients diagnosed with ASD
may benefit from immune-based therapies (CAREAGA; VAN DE WATER;
ASHWOOD, 2010; CHEZ; GUIDO-ESTRADA, 2010; GŁADYSZ;
Resveratrol (RSV) is a simple molecule, initially isolated from the peruvian Cassia
quinquangulata plant, during a search for new cancer preventing agents (JANG et al.,
1997). Polyphenols, especially trans-RSV, have received great attention from the
scientific community as a result of several studies demonstrating its therapeutic role in a
plethora of conditions, including cancer, type 2 diabetes, and cardiovascular and
neurodegenerative diseases. It is possible that different mechanisms of action are involved,
but the modulation of inflammatory processes is the common denominator of them all
(VANG et al., 2011).
Over the last years, studies employing pre- and/or post-natal administration of RSV
in ASD animal models suggested that RSV may target ASD symptoms (including
improving social behavior, reducing repetitive behavior and altering sensitivity) and lessen
immune dysfunction (AHMAD et al., 2018; BAKHEET et al., 2016, 2017; BAMBINI-
JUNIOR et al., 2014; BHANDARI; KUHAD, 2017; FONTES-DUTRA et al., 2018;
HIRSCH et al., 2018a; LI et al., 2009).
Since the criteria for diagnosing ASD are clinical, via behavioral analysis,
evaluating circulating microRNAs may serve as a biomarker tool. This analysis could be
useful for the early diagnosis of ASD, for measuring the risk of developing ASD, for
determining the prognosis of ASD, and for the characterization of specific subgroups that
may or may not respond well to certain treatment modalities (ANDERSON, 2015;
GOLDANI et al., 2014; ZWAIGENBAUM; PENNER, 2018). MicroRNAs (miRNA) are
small (19-25 nucleotides) non-coding RNAs that regulate the translation of messenger
RNA into their respective proteins, controlling several different cellular processes
(AMBROS, 2004). Altered levels of specific miRNAs have been shown to be involved in
a plethora of central nervous system disorders (DE SMAELE; FERRETTI; GULINO,
2010; SAUGSTAD, 2010), however few studies have demonstrated the role of miRNA in
ASD (KAMAL; MUSHTAQ; GREIG, 2015).
207
In the present study, RSV was administered to children diagnosed with ASD in
order to evaluate its possible therapeutic effects, tolerability, and safety. Effects of RSV
on the expression of eight different miRNAs was also evaluated.
Methods
Study Design and Logistics
This is an open-label pilot clinical study designed to evaluate the efficacy and
tolerability of administering 200mg/day RSV to pediatric patients diagnosed with ASD.
The study took place from October 2017 until January 2018. Subjects were recruited in
the outpatient ASD clinic of the Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA), and scales
and biological samples were applied and collected at the Clinical Studies Center (Centro
de Pesquisas Clínicas) of the same hospital. Laboratory analysis were carried out at the
Basic Clinical Laboratory (Laboratório de Análises Clínicas) of the HCPA and microRNA
expression was evaluated at the Neuroglial Plasticity Laboratory (Laboratório de
Plasticidade Neuroglial) of the Biochemistry Department of the Federal University of Rio
Grande do Sul (Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Brazil).
Subjects
Five male patients aged 10-18 years, diagnosed with ASD according to the criteria
described in the fifth edition of the Diagnostic and Statistical Manual of Mental
Disorders (DSM-V) (ASSOCIATION, 2013), were included in the study.
Psychotropic medication was allowed as long as all subjects were utilizing the
same dose for at least four weeks before entering the study, and as long as no dose
adjustments were necessary throughout the study period.
Subjects were excluded from the study if they presented with any of the following
criteria: 1) Other diseases whose clinical presentation is similar to autism, such as
Fragile X Syndrome, Rett Syndrome, Angelman Syndrome, Prader-Willi Syndrome,
Smith-Lemli-Opitz Syndrome and Tuberous Sclerosis complex; 2) Dose adjustment or
interruption of any psychotropic medication during the study; 3) Use of anti-seizure
medication; 4) Other active systemic diseases such as cardiovascular, liver or kidney
pathologies; 5) Any other condition in which the administration of 200mg RSV was
208
deemed not safe by the principal investigator.
Intervention
Subjects received 200mg RSV daily (two 100mg capsules as a single morning dose)
for 90 days. The RSV employed in this study presented adequate purity for use in clinical
trials (99% trans-RSV, Farmácia Reativa, Porto Alegre, RS).
Response measures
ASD symptoms were evaluated via the Aberrant Behavior Checklist (AMAN
et al., 1985; LOSAPIO et al., 2011) and the Clinical Global Impression – Improvement,
CGI-I) scale (GUY W, 1976) before and after 90 days of treatment with RSV.
In order to evaluate the adverse effects of RSV, if any, peripheral blood was
collected for clinical laboratory exams before, 45 days, and 90 days after use of 200mg
RSV daily. The following clinical laboratory exams were performed, soon after
peripheral phlebotomy: complete blood count, platelet count, alanine aminotransferase
(ALT), aspartate aminotransferase (AST), amylase, total, direct and indirect bilirubin,
blood glucose, total cholesterol, high-density lipoprotein cholesterol, triglycerides,
lactate dehydrogenase and creatinine.
The expression levels of 8 different miRNAs (hsa-miR-21-5p, hsa-miR-25-3p,
hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-124-3p, hsa-miR-125a-5p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-191-
5p, hsa-miR-195-5p) with proven roles in neural plasticity and the immune system were
also evaluated before and after treatment.
microRNA extraction
Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) Isolation
Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were harvested from 5mL peripheral
blood obtained via phlebotomy. Blood was collected into a blood collection tube
209
containing EDTA and submitted to density gradient centrifugation (Histopaque 1,077

g/ml; Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri), according to the manufacturer’s instructions,
for PBMC isolation.
Whole blood was centrifuged at 1200 rpm for 15 minutes at room temperature.
Plasma was separated and immediately added to TRIzol® (1:2). The remaining blood
components were then resuspended in enough phosphate buffered saline (PBS) to restore
the initial whole blood volume. This was then placed over Histopaque-1077 and
centrifuged at 400 g for 30 minutes at room temperature. Lymphocytes and other
mononuclear cells remained at the plasma/Histopaque-1077 interface. These were
aspirated, placed in a conical tube, washed with PBS and centrifuged at 1500 rpm for 5
minutes at 4ºC. The pellet containing all cells was resuspended in PBS. Part of the cells
were then prepared with Trypan Blue (1:1) for manual counting in a hemocytometer,
while the remaining cells were stored in TRIzol®.
RNA Extraction, Reverse Transcription and Polimerase Chain Reaction (RT-qPCR)
Total RNA from the plasma samples was isolated using QIAzol® (QIAGEN,
Hilden, Germany), according to the manufacturer’s instructions. cDNA synthesis was
undertaken according to Chen and collaborators (CHEN et al., 2005). Briefly, 1.25 mM
stem-loop primers for each miRNA (U6, RNU6, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-25-3p, hsa-
miR-30c-5p, hsa-miR-124-3p, hsa-miR-125a-5p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-191-5p,
hsa-miR-195-5p) were added to a mix containing RNA, oligo(dT)25V (5 mM), 250 mM
dNTPs (Ludwig, RS, Porto Alegre, Brazil) and RNAse-free water in a final volume of 17
L. This was submitted to an incubation step at 65°C for 5 minutes, and then placed on
ice. The MML-V RT enzyme (New England Biolabs, MA, USA) was used for cDNA
synthesis according to the manufacturer’s instructions. Each reaction mix was incubated
at 16ºC for 30 minutes followed by another 30 minutes at 42ºC. All cDNA samples were
diluted 50 X in RNAse-free water. Stem loop primers, initiation primers and the universal
reverse primer were designed according to Chen and collaborators (CHEN et al., 2005).
Real-time PCR was performed in a Bio-Rad CFX384 system (Bio-Rad, Hercules,

CA, USA) utilizing SYBR Green I (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). The PCR reaction
210
took place in a total volume of 10 μL containing 5 μL of diluted cDNA (1:50), 1 X SYBR

Green I (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 0.1 mM dNTPs, 1 X Buffer, 3 mM MgCl2,
0.25 U Taq DNA polymerase (Quatro G, Porto Alegre, RS, Brazil) and 200 nM of each
forward and reverse primer. Samples were analyzed in triplicates in a 384-well plate, in
which a control was also included. Reference genes were chosen according to the
GeNorm software, in order to determine the necessary miRNAs for normalization and to
identify the most stable miRNAs to be used as normalizers. In order to determine miRNA
amplification, PCR was set up as follows: an initial 5-minute step at 95ºC, followed by
40 cycles of 15 seconds at 95ºC for denaturation, 10 seconds at 60ºC for annealing and
10 seconds at 72ºC for elongation. Melting curve analysis was programmed at the end of
the PCR reaction at the 65ºC and 95ºC interval, with readings at every 0.4ºC increase in
temperature. Baselines and limits were determined manually using the Bio-Rad CFX
software. To calculate relative miRNA expression, the 2-ΔΔCt (LIVAK; SCHMITTGEN,
2001) method was employed. Student’s t test was performed to compare the differences
in expression among samples. Means were considered significantly different when P <
0.05.
Ethical considerations
This study protocol was approved by the Research Ethics Committee (Comitê de
Ética em Pesquisa) of the HCPA, under number 17-0132 (CAAE
65862917100005327). Each subject’s parent or guardian signed an informed consent
declaration.
Statistical Analysis
Given that this is a pilot study designed for proof of concept and given that there
were no safety data regarding the use of RSV in children, a limited number of subjects
were included, without calculating sample size.
Data was entered in an Excel data sheet and afterwards uploaded to the Statistical
Package for the Social Sciences (SPSS) program, v. 21.0, were data was processed and
analyzed.
For the descriptive analysis, quantitative variables were described using mean
and standard deviation, and qualitative variables were described using absolute and
211
relative frequencies.
Mean values obtained from the ABC scale were compared amongst each other
using the Wilcoxon t test; Cohen’s d formula was employed for effect size, corrected
for n < 50.
When comparing miRNA expression values, a baseline value was included for
each reference gene in each sample (HIRSCH et al., 2018b). P values  0.05 were
considered statistically significant. The Student’s t-test was performed to compare the
differences in expression among the different samples. P values  0.05 were considered
statistically significant.
Results
The study sample consisted of five boys aged 10 to 13 years, with a mean of
11.8 (±1.1) years of age. Two patients presented normal intelligence (subjects 3 and 5),
according to IQ and psychometric tests; the remaining patients presented mild
intellectual impairment (subject 4) and moderate intellectual impairment (subjects 1
and 2). Three patients (subjects 3, 4, and 5) demonstrated preserved verbal
communication; one patient (subject 1) communicated using short phrases only, and
one patient (subject 2) presented echolalic speech. Two patients (40%) used
psychotropic medication (sertraline and aripiprazole). All patients made use of at least
one non-drug treatment. Patient characteristics are summarized in Table 1.
At the end of the 90-day treatment, three out of five (60%) patients presented
improvement, one patient presented mild improvement and one patient presented no
improvement, as measured by the CGI-I scale.
Comparing the ABC scale score means, there was a reduction in total score and
in all subscale scores, where total score and the Irritability subscale score presented
statistically significant differences (Table 2). Table 3 shows total and subscale scores
for each patient, before and after RSV treatment.
Of the eight miRNAs tested in PBMCs, the GeNorm algorithm classified 21-
5p, 30c-5p, and 191-5p as being the most stable. Therefore, these were used as
normalizers when evaluating relative expression of the remaining miRNAs. Of the five
remaining miRNAs, three miRNAs (miR-124-3p, miR-125a-5p, and miR-195-5p)
presented a statistically significant increase in relative expression after 90 days of RSV
treatment (P = 0.021, P = 0.036, and P = 1,61515E-07, respectively; Figure 1).
212
All patients tolerated RSV well, and none presented adverse effects. All patients
completed the study. There were no alterations in clinical laboratory results during the
90-day treatment period, as demonstrated in Table 4.
Discussion
To this date, there are no available treatments that completely revert ASD’s main
symptoms (BENVENUTO et al., 2013; EISSA et al., 2018). Only two
medications, risperidone and aripiprazole, are approved by the Food and Drug
Administration (FDA) for the treatment of disruptive symptoms in ASD patients (EISSA
et al., 2018; SHARMA; GONDA; TARAZI, 2018). However, these are associated with
metabolic adverse effects, such as weight gain, dyslipidemia and hyperglycemia
(YOUNG; FINDLING, 2015). Individual impairment, which affects many aspects of
everyday functions (MASI et al., 2017), the direct and indirect economic burden of
treatments, and the impact on family suffering strengthens the need for effective
interventions in ASD (BUESCHER et al., 2014; KARST; VAN HECKE, 2012;
MARCHEZAN et al., 2017; SMITH; GREENBERG; MAILICK, 2014; WEISS et al.,
2012).
To our knowledge, this is the first study using RSV in children and in patients
diagnosed with ASD. Similar to what has been observed in animal models, our study
suggests that RSV may reduce ASD symptoms. We verified that, after three months of
RSV use, three patients showed improvement and one patient showed mild improvement,
according to the CGI-I scale. There was also a reduction in all ABC scale scores, with the
total score and the Irritability subscale score being statistically significant.
The Lethargy/Social Withdrawal, Stereotypic Behavior, and
Hyperactivity/Noncompliance domains demonstrated mild improvement, with P < 0.1.
Possibly, these findings would have been significant in a larger sample size. The best
responders were those patients with normal intelligence (subjects 3 and 5), which
suggests that RSV may be more effective in patients with preserved cognitive abilities.
In our sample, 60% of the patients had normal speech patterns, while 20% did not
show effective communication skills, which may justify their poor response in the
Inappropriate Speech domain.
RSV was well tolerated, and there were no observed adverse effects. Previous
studies in adults reported mild adverse reactions which were self-limiting, especially in
213
doses above 500 mg/day (ALMEIDA et al., 2009; ELLIOTT et al., 2009; HEEBØLL et
al., 2016; LA PORTE et al., 2010; VODUC et al., 2014); no side effects were reported
when doses below 500 mg/day were employed (BEDADA; NEERATI, 2016;
FAGHIHZADEH; ADIBI; HEKMATDOOST, 2015; LIN; SUN; LIN, 2016; MACEDO
et al., 2015; PATEL et al., 2010; POLLEY et al., 2016; THAZHATH et al., 2016;
TURNER et al., 2015; WONG et al., 2011, 2013; ZORTEA et al., 2016). Other studies
in adults described hematologic alterations and an increase in cholesterol; in our study,
no effects were observed after 45 and 90 days of RSV use (BO et al., 2016; HEEBØLL
et al., 2016; VODUC et al., 2014).
After RSV treatment, there was an increase in the expression of miR-124-3p, miR-
125a-5p, and miR-195-5p miRNAs. A recent study published by our group did not find
differences in the expression levels of these three miRNAs in ASD patients when
compared to control patients (HIRSCH et al., 2018c). However, other studies found that
miR-195-5p is overexpressed in the lymphocytes and serum of children diagnosed with
ASD (MUNDALIL VASU et al., 2014; SARACHANA et al., 2010). Moreover, our
group reported that RSV is able to modify miRNA expression in an ASD animal model
(HIRSCH et al., 2018a).
All miRNAs whose expression levels were altered after RSV treatment play a role
in inflammation. Studies using animal models and with human subjects demonstrated that
both the central and peripheral immune system are altered in ASD. These alterations
include, but are not limited to, immune activation, self-antibody formation,
cytokine/chemokine imbalance, and an increase in the permeability of the blood-brain
barrier (GOTTFRIED et al., 2015).
miR-124 is known for being highly expressed in neurons, and is associated with
neuronal differentiation (MAKEYEV et al., 2007; MISHIMA et al., 2007). In brain and
spinal cord injury models, an increase in miR-124-3p has an inhibitory effect in
neuroinflammation via decreased expression of TNF-α, IL-1β, and IL-6, and increased
expression of IL-10. miR-124 also downregulates the mTOR pathway, which is involved
in the inflammatory response and has been associated with tuberous sclerosis and ASD
(HASBANI; CRINO, 2018; HUANG et al., 2018; LOUW et al., 2016; ONORE et al.,
2017; WINDEN; EBRAHIMI-FAKHARI; SAHIN, 2018). Interestingly, RSV has
beneficial effects in spinal cord injury models by inhibiting the mTOR pathway (ZHOU
et al., 2018).
214
miR-125a-5p downregulates the expression of the CCL5 chemokine via the

Kruppel-like 13 (KLF13) pathway in activated T cells, and this effect seems to play a role
in autoimmune events involved in systemic lupus erythematosus (WANG et al., 2012;
ZHAO et al., 2010). Its overexpression has a negative effect on the regulation of the
NFκB pathway, (KIM et al., 2012), and has an important role in the suppression of
macrophage activation (BANERJEE et al., 2013; GRAFF et al., 2012). In Graves’
disease, of autoimmune etiology, miR-125a expression in PBMCs is reduced (INOUE et
al., 2014).
miR-195 is associated with inhibition of the pro-inflammatory activation of
macrophages, significantly reducing the concentration of inflammatory cytokines such as
IL-1β, IL-6, and TNF-α (BRAS et al., 2017). It also inhibits the inflammatory process via
inhibition of the TNF-α/NF‑κB and VEGF/PI3K/Akt pathways (MA et al., 2018).
Even though we observed an improvement in ASD symptoms with RSV use, the
small sample size and the fact that this was an open label study, in which potential placebo
effects resulting from the families’ high expectation for improvement render it impossible
to conclude whether RSV is beneficial for children diagnosed with ASD. However, one
may conclude that RSV may be safe for use in the pediatric population, may diminish
SAD symptoms and alter the expression levels of miR-124-3p, miR-125a-5p, and miR-
195-5p, which play a role in inflammatory responses.
Conclusion
Regardless of the small sample size, the results of this pilot study suggest that use
of RSV in children in safe and may be beneficial in controlling ASD symptoms. RSV
also increased expression of miR-124-3p, miR-125a-5p, and miR-195-5p, all of which
play a role in inflammatory responses. New placebo-controlled clinical trials are
necessary to fully evaluate the safety and therapeutic potential of RSV in children
diagnosed with ASD. The role of miR-124-3p, miR-125a-5p and miR-195-5p, as well
as other miRNAs, in the etiology and pathogenesis of ASD should be further explored.
Acknowledgements
We would like to thank the HCPA Research and Events Investment Fund
(Fundo de Investimento em Pesquisas e Eventos; FIPE-HCPA), the Graduate
215
Program in Child and Adolescent Health of the UFRGS Medical School

(Programa de Pós-graduação em Saúde da Criança e do Adolescente – Faculdade
de Medicina - UFRGS), and the Autism Spectrum Disorder Translational
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220
Table 1 – Patient Characteristics.
Subject Age IQ CGI-I Exams Therapies Medications
AEP, EEG, Cariotype,

II Psych, Phono,
1 12 Moderately Ill Fragile X, and NMR None
mod OT, school
normal
Audiometry, EEG,
II
2 12 Severely Ill Cariotype, Fragile X, Phono, school None
mod
and NMR normal
Psychopedagogy,
Cariotype, Fragile X,
3 13 133 Moderately Ill musical therapy, None
and EEG normal
school
EEG, Cariotype,
II Psych, Phono, Sertraline e
4 10 Moderately Ill Fragile X, and NMR
mild OT, school Aripiprazole
normal
Psych,
Focal paroxysmal
5 12 120 Moderately Ill psychopedagogy, Sertraline
EEG
school
ID – intellectual impairment; Mod – moderate; AEP – auditory evoked potential; EEG –

electroencephalography; NMR – nuclear magnetic resonance; Psych – psychology; Phono -
phonoaudiology; OT –occupational therapy.
Table 2. Mean Aberrant Behavior Checklist scores before and after treatment with
Resveratrol.
Subescale/Domain Pre-RSV Post-RSV P Effect Size
Total score 70.0± 9.48 56.2 ±17.1 0.042 0.561
Irritability 17.0± 5.52 12.4± 3.57 0.041 0.557

Lethargy/Social 20.4±7.36 16.8±8.28 0.078 0.259
Withdrawal
Stereotypic 7.00±2.44 5.20±3.56 0.066 0.332
Behavior
Hyperactivity 19.40±5.17 17.20±6.45 0.068 0.212
Inappropriate 6.20±4.26 4.60±4.15 0.109 0.214

Speech
*Mean±SD
Table 3 – Individual Aberrant Behavior Checklist scores before and after treatment with Resveratrol.
Subject 1 Subject 2 Subject 3 Subject 4 Subject 5

ABC Scale % % % % %
Pre Post Pre Post Pre Post Pre Post Pre Post
Variation Variation Variation Variation Variation
Total score 85 82 -4 73 65 -11 67 44 -34 61 49 -20 64 41 -36
Irritability 9 8 -11 20 16 -20 19 12 -37 23 16 -30 14 10 -29
Lethargy 27 28 4 23 21 -9 20 13 -35 8 6 -25 24 16 -33
Stereotipic
9 8 -11 10 10 0 6 3 -50 6 3 -50 4 2 -50
behavior
Hyperactivity 28 27 -4 20 18 -10 16 13 -19 18 18 0 15 10 -33
Inappropiate
12 11 -8 0 0 0 6 3 -50 6 6 0 7 3 -57
speech
221
Table 4 – Laboratory Exams.
Subject 1 Subject 2 Subject 3 Subject 4 Subject 5
Exams Pre 45 days 90 days Pre 45 days 90 days Pre 45 days 90 days Pre 45 days 90 days Pre 45 days 90 days
RSV RSV RSV RSV RSV RSV RSV RSV RSV RSV RSV RSV RSV RSV RSV
Hemoglobin 13.5 13.2 13.1 15.3 15.1 14.5 15.4 15.2 15.3 11.6 11.7 11.4 14.6 14.5 14.3
Hematocrit 38.3 37.5 36.9 44.8 44.0 43.1 43.8 43.0 42.8 35.0 35.4 35.1 42.8 42.6 42.1
Leukocytes 5710 6320 4620 5490 6700 5690 9810 8120 7620 9510 8910 8890 9000 11240 7290
Segmented
44.4 56.5 48.7 42.8 48.5 38.7 46.1 44.3 32.2 49.4 59.6 49.5 44.9 68.5 39.0
(%)
Lymphocytes
37.7 27.7 33.1 40.8 35.1 45.5 36.7 37.7 43.6 39.0 28.1 39.0 42.3 20.1 48.4
(%)
Platelets 340000 304000 287000 237000 235000 216000 355000 303000 283000 302000 304000 324000 313000 295000 327000
LDH 250 190 180 234 195 178 224 169 158 171 181 183 180 155 151
Triglycerides 57 59 50 45 39 46 60 80 74 189 111 112 135 87 79
Total
167 159 173 109 110 109 172 164 175 177 174 186 138 128 130
Cholesterol
HDL
53 49 53 47 49 50 57 61 57 39 40 42 31 34 25
Cholesterol
Glucose 83 85 81 92 94 90 93 87 85 89 86 87 85 92 83
Creatinine 0.49 0.45 0.46 0.8 0.72 0.71 0.69 0.69 0.6 0.51 0.54 0.55 0.68 0.62 0.64
TB 0.5 0.3 0.5 0.4 0.4 0.7 0.3 0.4 0.5 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3
IB 0.4 0.2 0.3 0.3 0.2 0.4 0.2 0.2 0.3 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
DB 0.1 0.1 0.2 0.1 0.2 0.3 0.1 0.2 0.2 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
AST 26 20 21 21 20 19 18 14 16 16 18 17 17 15 17
ALT 21 20 19 16 18 16 11 12 12 13 16 17 17 15 18
Amylase 55 59 56 59 55 54 94 92 87 46 38 42 26 26 25
LDH – lactate dehydrogenase; HDL – high density lipoprotein; TB – total bilirubin; IB –indirect bilirubin; DB – direct bilirubin; AST – aspartate aminotransferase; ALT –
alanine aminotransferase
222
223
Figure 1. Relative miRNA expression before and after treatment with RSV. Bars
represent mean  standard error. *P < 0.05.
224
13 ARTIGO 3 - AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE microRNA EM SUJEITOS

PEDIÁTRICOS COM TRANSTORNO DO ESPECTRO AUTISTA.
Avaliação da expressão de microRNA em sujeitos pediátricos com transtorno do

espectro autista.
Josemar Marchezan1,2,3,4, Iohanna Deckmann2,3,4,5, Guilherme Cordenonsi da Fonseca2,3,4,5,

Giovanna Carello-Collar2,3,4, Mauro M. Hirsch2,3,4,6, Rogerio Margis2,5, Carmem
Gottfried2,3,4,6, Rudimar Riesgo1,2,4,7.
1
2
3
4
5
6
Bioquímica, Universidade Federal do Rio Grande do Sul-UFRGS, Porto Alegre, RS, Brasil
7
Departamento de Pediatria, Unidade de Neurologia Infantil, Hospital de Clínicas de Porto
Alegre;
RESUMO

neurológico caracterizado por alterações na comunicação, interação social e padrões
restritos e repetitivos de comportamento. Atualmente, o diagnóstico se dá exclusivamente
por avaliação comportamental, uma vez que não existe um marcador biológico.
Numerosos biomarcadores têm sido propostos para o TEA como potenciais ferramentas
para predição de diagnóstico e terapias. Dessa forma, os microRNA se apresentam como
excelentes candidatos para estudos de biomarcadores, possuindo estabilidade e resistência
à degradação. No presente estudo, foi avaliada a expressão de um conjunto de 18
microRNA na saliva tanto de sujeitos pediátricos com TEA quanto com desenvolvimento
típico. Foi possível isolar o miR-191 a partir das amostras de saliva e verificar aumento na
225
expressão nos pacientes com TEA. O miR-191 está envolvido com sistema imune,
maturidade cortical e remodelação duradoura da coluna associada à depressão sináptica de
longa duração. Dessa forma, esse miR-191 pode estar envolvido no desbalanço destas vias
no TEA. Uma vez que a saliva é um fluido biológico de acesso fácil e não invasivo,
encorajamos novas pesquisas para isolamento de microRNA na saliva visando uso futuro
como biomarcadores, bem como busca por alvos farmacológicos.
Palavras chave: TEA, autismo, inflamação, microRNA, biomarcador
Introdução

neurológico caracterizado por déficits na comunicação, interação social e padrões restritos
e repetitivos de comportamento (ASSOCIATION, 2013). Do ano de 2000 até 2014 houve
um aumento de sua prevalência em 150% e atualmente o Center for Disease Control and
Prevention (CDC) estima uma prevalência de TEA em 16,8 por 1000 crianças (BAIO et
al., 2018). Apesar dos avanços no conhecimento sobre o transtorno, seu diagnóstico
permanece clínico (GADIA; TUCHMAN; ROTTA, 2004; GOLDANI et al., 2014;
SHARMA; GONDA; TARAZI, 2018). Numeroso biomarcadores têm sido propostos para
o TEA, incluindo marcadores bioquímicos, morfológicos, imunológicos, hormonais,
neurofisiológicos, neuroanatômicos e neuropsicológicos (AHMAD et al., 2017; FULCERI
et al., 2018; HEUNIS; ALDRICH; DE VRIES, 2016; INGA JÁCOME et al., 2016; LI;
KARNATH; XU, 2017; MASI et al., 2017; RUGGERI et al., 2014), pois poderiam
auxiliar no diagnóstico precoce, na mensuração de risco de desenvolvimento do TEA, na
avaliação do prognóstico, na caracterização de subgrupos de pacientes e na definição de
subconjuntos de indivíduos que responderiam mais favoravelmente a tratamentos
específicos (ANDERSON, 2015; GOLDANI et al., 2014; ZWAIGENBAUM; PENNER,
2018).
Dentre as propostas moleculares de marcadores biológicos, destacam-se os

microRNA. MicroRNA (miRNA) são um grupo de pequenos RNA não-codificantes com
cerca de 22 nucleotídeos, cuja alterações têm sido implicados em várias desordens
neuropsiquiátricas (BELZEAUX; LIN; TURECKI, 2017; GEAGHAN; CAIRNS, 2015;
HOSS et al., 2014; QIU; TAN; ZENG, 2015; YIN et al., 2014). Especialmente no TEA,
estudos em humanos tem encontrado diferença na expressão de miRNA em relação à
controles no córtex cerebelar (ABU-ELNEEL et al., 2008), cérebro (MOR et al., 2015),
226
linfócitos (SARACHANA et al., 2010; TALEBIZADEH; BUTLER; THEODORO,

2008), soro (KICHUKOVA et al., 2017; MUNDALIL VASU et al., 2014), sangue
(HIRSCH et al., 2018; HUANG et al., 2015) e saliva (HICKS et al., 2016).
O uso de perfis de miRNA como biomarcadores tem recebido atenção significativa

nos últimos anos (BLANDFORD; GALLOWAY; MOORE, 2018), pois apresentam
notável estabilidade e resistência à degradação, especialmente em comparação com RNA
mensageiro (KICHUKOVA et al., 2017); são estáveis em diferentes fluidos corporais;
estão envolvidos na patogênese das doenças; e a detecção pode ser realizada no início da
doença (STOICEA et al., 2016). No presente estudo, foi avaliada a expressão de um
conjunto de miRNA a partir da saliva de sujeitos pediátricos com TEA e respectivos
controles com desenvolvimento normal.
Métodos
Sujeitos
Os indivíduos foram recrutados no ambulatório de Transtorno do Espectro Autista

da Unidade de Neuropediatria do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA) para os
casos e da Ambulatório de Pediatria e Cirurgia Pediátrica para os controles, após
autorização dos pais e/ou responsáveis através do Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido (aprovação no Comitê de Ética em Pesquisa do HCPA: 16-0567).
Para o grupo controle, foram selecionados indivíduos com desenvolvimento
compatível com a idade cronológica, sem patologias que pudessem gerar distúrbios do
comportamento e na mesma faixa etária dos pacientes com TEA. Para o grupo TEA, foram
utilizados os seguintes critérios de inclusão: diagnóstico de TEA de acordo com os critérios
do DSM-5, confirmado pelo julgamento do investigador; idade entre 3 e 18 anos;
neuroimagem normal (tomografia computadorizada ou ressonância magnética de crânio);
e investigação genética normal (cariótipo para meninas; cariótipo e pesquisa de X-frágil
para meninos). Foram excluídos os sujeitos com síndromes como Síndrome de X frágil,
Síndrome de Rett, Síndrome de Angelman, Síndrome de Prader-Willi, Síndrome de Smith-
Lemli-Opitz e Esclerose Tuberosa; com presença de cáries dentárias ou doença
periodontal; com presença de doença de vias aérea alta ou orofaringe que pudessem
prejudicar a coleta.
227
As coletas ocorreram pela manhã, entre as 8 e 12 horas. A criança era convidada a

enxaguar a boca com água, e posteriormente expectorar cerca de 3 ml de saliva diretamente
em frasco esterilizado, permanecendo em gelo por no máximo 2h até o momento do
processamento.
O protocolo para isolamento do exossoma salivar foi adaptado de Machida e

colaboradores (MACHIDA et al., 2015). A amostra foi centrifugada a 2000 g (rcf) durante
10 minutos a 4°C, o sobrenadante foi removido, transferido para um tubo de centrífuga
estéril, imediatamente acondicionado em reagente QIAzol® (diluição 1:2) e estocado em
freezer a -80°C para posterior extração de RNA total.

(RT-qPCR)
O RNA total das amostras de saliva foi isolado usando QIAzol® (QIAGEN, Hilden,
Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante.
al., 2005). Foi adicionado 1.25 mM de 20 primers stem-loop (U6, RNU6, hsa-miR-21-5p,
hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-25-3p, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-106b-5p, hsa-miR-124-3p,
hsa-miR-125a-5p, hsa-miR-132-3p, hsa-miR-134-5p, hsa-miR-138-5p, hsa-miR-145-5p,
hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-181b-5p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-195-
5p, hsa-miR-199-5p, hsa-miR-218-5p) ao mix contendo RNA, oligo(dT)25V (5 mM), 250
mM de dNTPs (Ludwig, RS, Porto Alegre, Brasil) e água livre de RNAse para um volume
total de 17 ml seguido de uma incubação a 65°C por 5 minutos e resfriamento em gelo. A
enzima MML-V RT (New England Biolabs, MA, USA) foi usada para a síntese de cDNA
de acordo com as instruções do fabricante. Cada mix de reação foi incubado a 16°C por 30
minutos seguido de outros 30 minutos a 42°C. Todas as amostras de cDNA foram diluídos
50 vezes em água livre de RNAse. Os primers stem-loop, primers de iniciação e o primer
universal reverso foram desenhados de acordo com protocolo estabelecido (CHEN et al.,
2005).
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) em Tempo Real foi realizada no sistema
de detecção de PCR em tempo real Bio-Rad CFX384 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)
usando SYBR Green I (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). O PCR foi realizado no volume
de 10 μL contendo 5 μL de cDNA diluído (1:50), 1× SYBR Green I (Invitrogen, CA, USA),
0.1mM de dNTPs, 1× Tampão de PCR, 3mM MgCl , 0.25U de Taq DNA Polimerase
2
228
(Quatro G, RS, Porto Alegre, Brazil) e 200 nM de cada primer de iniciação e reverso.
Amostras foram analisadas em triplicatas biológicas em placa de 384 poços, e, um controle
foi incluído. Os genes de referência foram escolhidos de acordo com o software GeNorm
para determinar o número de miRNA necessários para normalização e para identificar os
miRNA mais estáveis para serem usados como normalizadores. As condições de PCR
foram setadas como segue: uma etapa inicial de ativação da polimerase por 5 minutos a 95
°C, 40 ciclos de 15 segundos a 95 °C para desnaturação, 10 segundos a 60 °C para
anelamento e 10 segundos a 72 °C para alongamento. A análise da curva de melting foi
programada ao fim da corrida de PCR no intervalo de 65 a 95 °C, e a temperatura aumentou
gradualmente em 0.4 °C. O limite e as linhas de base foram determinados manualmente
usando o software do gerenciador Bio-Rad CFX. Para calcular a expressão relativa dos
miRNA foi utilizado o método 2 -ΔΔCt
(LIVAK; SCHMITTGEN, 2001).
Análise estatística
Foi utilizado o teste t de Student para amostras independentes, considerando um

valor de p igual ou menor a 0,05 como significativo, através do programa SPSS (Statistical
Package for the Social Sciences), versão 21.0. Os dados são mostrados como média e
desvio padrão para as variáveis quantitativas e frequências absolutas e relativas para as
variáveis qualitativas.
Resultados
Determinamos a expressão relativa de miRNA na saliva obtida de 26 pacientes com
TEA, comparando com controles na mesma faixa etária (7 a 17 anos, média 11,1 anos). O
algoritmo GeNorm classificou as proteínas ribosomais HsRPS18 Fw e HsRPS18 Rv como
estáveis e foram usadas como normalizadores para avaliar a expressão relativa do miRNA.
De todos os miRNA, houve amplificação somente do miR-191, com aumento

significativo no grupo de pacientes com TEA (p=0,029), Figura 1. Os níveis dos 17 miRNA
restantes não tiveram seus níveis detectados através da técnica usada no presente estudo.
Discussão
229
Neste trabalho, identificamos a expressão aumentada do miR-191 em amostras de

saliva de pacientes com autismo em relação a normotípicos. Sugerimos, aqui, a avaliação
de miRNA isolados a partir de saliva, um fluido biológico de acesso fácil e não invasivo,
como uma possível ferramenta biomarcadora com especial ênfase no diagnóstico precoce
de TEA. Estudo prévio estudo avaliando a expressão de miRNA em saliva, de um total de
246 detectados e quantificados, evidenciou que 14 miRNA foram diferencialmente
expressos em indivíduos com TEA em comparação com controles. Além disso, houve
correlações significativas entre desempenho na escala Vineland Adaptive Behavior Scales
(VABS) e a expressão de miRNA (HICKS et al., 2016).
No atual estudo encontramos um aumento de expressão do miR-191 entre crianças

com TEA em relação aos controles, resultado semelhante a trabalhos anteriores que
descreveram um aumento de expressão de miR-191 em linfócitos e saliva de pacientes com
TEA, inclusive com uma correlação negativa com o escore composto da escala VABS
(HICKS et al., 2016; SARACHANA et al., 2010). O miR-191 é abundantemente expresso
no cérebro (SHAO et al., 2010) e sugere-se que possa contribuir para o desenvolvimento
cortical através da regulação negativa do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF)
(KIM et al., 2004; MELLIOS et al., 2008; VARENDI et al., 2014) e apresenta um papel
na depressão sináptica de longa duração (HU et al., 2014), um enfraquecimento da
transmissão sináptica por diminuição da entrada de cálcio que dura por horas. Se um miRNA
fundamental para essa via estiver aumentado, os seus alvos proteicos estarão diminuídos,
prejudicando talvez essa depressão, favorecendo a excitação. É sugerido também que o
miR-191 possa ter um papel na manutenção da homeostase imune (LYKKEN; LI, 2016),
sendo recentemente associado a condições inflamatórias e autoimunes em humanos e
camundongos (CASERTA et al., 2016; NAGPAL; KULSHRESHTHA, 2014) inclusive
com a hipótese de seu uso como biomarcador no diagnóstico diferencial de doenças
inflamatórias intestinais (LIN et al., 2013). Estudos também encontraram um aumento de
expressão do miR-191 em pacientes com esclerose múltipla (VISTBAKKA et al., 2017,
2018), lesão cerebral traumática (YANG et al., 2016) e doença de Alzheimer (KUMAR et
al., 2013).
Apesar do fácil acesso, a saliva é um dos locais onde há ampla produção de

ribunocleases (RNAses) (PERSANO; VECCHIO; POMPA, 2015). A presença de RNAse
em amostra biológica cujo objetivo é o isolamento de RNA e microRNA representa um
sério problema para a contaminação e degradação de amostras em biologia molecular.
230
Dessa forma, apesar de ser um método promissor de análise de perfil molecular de

pacientes, existe ainda uma dificuldade no isolamento de exossomas provenientes de
amostra de saliva. Além disso, fatores como tipo de tubo usado para coleta, tempo da
coleta ao processamento, velocidade de centrifugação e tempo e ciclos de congelamento e
descongelamento também afetam a qualidade e a expressão de miRNA (MITCHELL et al.,
2016; SUN et al., 2018). Em conjunto, todos esses fatores podem estar relacionados com
a identificação de pouco material genético relativo aos 17 microRNA que tiveram baixa
expressão neste trabalho.
Diversos miRNA podem ser isolados da saliva usando tanto a reação em cadeia da
polimerase quanto kits comerciais disponíveis; A padronização de um protocolo de
isolamento pode permitir a antecipação de diagnósticos de diversas doenças que hoje só
podem ser diagnósticas por alterações comportamentais. Dessa forma, encorajamos futuros
estudos explorando as alterações moleculares no TEA.
Conclusão
Nesse estudo, foi possível isolar e quantificar a expressão do microRNA miR-191

dentre um conjunto de 18 miRNA avaliados em amostras de saliva de pacientes
diagnosticados com TEA. Observou-se aumento significativo de sua expressão nesse grupo
de pacientes, relacionando vias importantes que possam estar envolvidas na fisiopatologia
do TEA. Uma vez que a saliva é um fluido biológico de acesso fácil e não invasivo,
encorajamos novas pesquisas para isolamento de microRNA na saliva visando ao uso
futuro como biomarcadores e busca por alvos farmacológicos.
Agradecimentos
Ao Fundo de Investimento em Pesquisas e Eventos (FIPE-HCPA), ao Programa

de Pós-graduação em Saúde da Criança e do Adolescente – Faculdade de Medicina
(UFRGS) e ao Grupo de Estudos Translacionais em Transtorno do Espectro
Autista (GETTEA- UFRGS).
231
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Sciences, v. 15, n. 2, p. 3262–3271, 2014.
Figura 1. Expressão relativa de miRNA em crianças com TEA e controles. As barras
representam o Erro Padrão da Média. *P<0,05.
234
14 ARTIGO 3 - ANALYSIS OF microRNA EXPRESSION LEVELS IN PEDIATRIC

PATIENTS DIAGNOSED WITH AUTISM SPECTRUM DISORDER.
Analysis of microRNA expression levels in pediatric patients diagnosed with autism

spectrum disorder.
Josemar Marchezan1,2,3,4, Iohanna Deckmann2,3,4,5, Guilherme Cordenonsi da Fonseca2,3,4,5,

Giovanna Carello-Collar2,3,4, Mauro M. Hirsch2,3,4,6, Rogerio Margis2,5, Carmem
Gottfried2,3,4,6, Rudimar Riesgo1,2,4,7.
1
2
3
4
5
6
Bioquímica, Universidade Federal do Rio Grande do Sul-UFRGS, Porto Alegre, RS, Brasil
7
Departamento de Pediatria, Unidade de Neurologia Infantil, Hospital de Clínicas de Porto
Alegre;
ABSTRACT
Autism spectrum disorder is a neurodevelopmental disorder characterized by
difficulty with communication and social interactions, and restrictive and repetitive
behaviors, interests and activities. Currently, diagnosis is made exclusively by evaluating
behavioral components, since there has yet to be a biological marker deemed suitable for
this disease. Several biomarkers have been suggested as potential tools for aiding in the
diagnosis of ASD and for evaluating disease progression. microRNAs, which are stable
and more resistant to degradation, have shown promise as biomarker candidates. In the
present study, a group of 18 microRNAs were evaluated in the saliva of pediatric patients
diagnosed with ASD and in control pediatric patients. miR-191 isolated from saliva
samples was overexpressed in patients diagnosed with ASD. miR-191 is involved in
immune processes, cortical development and long-lasting remodeling of the spine
235
associated with long-term synaptic depression. Therefore, it is possible that miR-191 may
be involved in the imbalance found in these pathways in ASD patients. Given that saliva
is easily obtainable, we encourage more studies that explore microRNA isolation from this
biological fluid as potential biomarkers, as well as for discovering new therapeutic targets.
Introduction
Autism spectrum disorder (ASD) is a neurodevelopmental disorder characterized

by difficulty with communication and social interactions, and restrictive and repetitive
behaviors, interests and activities (ASSOCIATION, 2013). Between 2000 and 2014, there
an 150% increase in its prevalence, and currently the Center for Disease Control and
Prevention (CDC) estimates a prevalence of 16,8 for every 1000 children (BAIO et al.,
2018). In spite of the research advances regarding ASD, its diagnosis remais a clinical one
(GADIA; TUCHMAN; ROTTA, 2004; GOLDANI et al., 2014; SHARMA; GONDA;
TARAZI, 2018). Several biomarkers have been proposed for aiding in the diagnosis of
ASD, including biochemical, morphological, immunological, hormonal
neurophysiological, neuroanatomic and neurpsychological biomarkers (AHMAD et al.,
2017; FULCERI et al., 2018; HEUNIS; ALDRICH; DE VRIES, 2016; INGA JÁCOME et
al., 2016; LI; KARNATH; XU, 2017; MASI et al., 2017; RUGGERI et al., 2014), for these
could aid in the early diagnosis of ASD, in measuring the risk of developing ASD, in
determining the prognosis of ASD, and in the characterization of specific subgroups that
may or may not respond well to certain treatment modalities (ANDERSON, 2015;
GOLDANI et al., 2014; ZWAIGENBAUM; PENNER, 2018).
MicroRNAs stand out among the proposed biomarkers for ASD. These are a groupd
of non-coding RNAs, of approximately 22 nucleotides long, and which have been implied
in several neuropsychiatric conditions (BELZEAUX; LIN; TURECKI, 2017;
GEAGHAN; CAIRNS, 2015; HOSS et al., 2014; QIU; TAN; ZENG, 2015; YIN et al.,
2014). With regards to ASD, human studies have shown a difference in miRNA expression
levels in comparison to healthy controls in the cerebellar cortex (ABU-ELNEEL et al.,
2008), brain (MOR et al., 2015), lymphocytes (SARACHANA et al., 2010;
TALEBIZADEH; BUTLER; THEODORO, 2008), blood serum (KICHUKOVA et al.,
2017; MUNDALIL VASU et al., 2014), whole blood (HIRSCH et al., 2018; HUANG et
al., 2015), and saliva (HICKS et al., 2016).
236
The use of miRNA profiles as biomarkers have received attention over the last few
years (BLANDFORD; GALLOWAY; MOORE, 2018), for they are more stable in
comparison to messenger RNA (mRNA) (KICHUKOVA et al., 2017), are stably present
in most biological fluids, are involved in the pathogenesis of many diseases, and may be
detected in the initial stages of most pathological conditions (STOICEA et al., 2016). In
the present study, a set of miRNAs present in the saliva of pediatric patients diagnosed with
ASD was compared to those present in a pediatric control population.
Methods
Subjects
Individuals were recruited for this study at the ASD outpatient clinic at the
Neuropediatric Unit of the Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA). Individuals were
recruited as controls at the Pediatric or Pediatric Surgery outpatient clinic in the same
hospital. Parents and/or guardians authorized their participation in the study and signed an
Informed Consent form. This study received approval of the Research Ethics Committee
(CEP-HCPA) and is registered under number 16-0567.
For the control group, individuals who displayed behavior compatible with their
chronological age and who were not diagnosed with any conditions that might affect
behavior were age-matched to the ASD cases. Inclusion criteria for pediatric patients
diagnosed with ASD were as follows: clinical diagnosis of ASD, according to the 5th
edition of the Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders (DSM-5), as per the
principal investigator’s judgement; age between 3 and 18 years old; normal neuroimaging
exams (computerized tomography or nuclear magnetic resonance); and normal genetic
parameters (karyotype for girls; karyotype and Fragile X results for boys). Subjects with
Fragile X syndrome, Rett syndrome, Angelman syndrome, Prader-Willi syndrome, Smith-
Lemli-Opitz syndrome, and tuberous sclerosis were excluded from the study, as well as
subjects with dental caries, periodontal disease, or with any condition of the upper
respiratory tract or oropharynx that may interfere with the saliva sample collection.
Sample collection took place in the morning, from 8:00 AM until 12:00 PM. The
subject was invited to rinse his/her mouth with water to expectorate approximately 3 mL
237
of saliva directly into a sterilized cup soon after. The cup was kept under refrigeration for
up to two hours until sample processing.
The protocol for isolation of the salivary exosome was adapted from Machida and
colleagues (MACHIDA et al., 2015). The sample was centrifuged at 2000 g (rcf) for 10
minutes at 4ºC. The supernatant was then transferred to a sterile centrifuge tube, to which
QIAzol® reagent was added 1:2 and stored at -80°C until total RNA extraction.
RNA Extraction, Reverse Transcription and Polimerase Chain Reaction (RT-

qPCR)
Total RNA from saliva samples was isolated using QIAzol® (QIAGEN, Hilden,
Germany), according to the manufacturer’s instructions.
cDNA synthesis was undertaken according to Chen and collaborators (CHEN et al.,
2005). Briefly, 1.25 mM stem-loop primers for each miRNA (U6, RNU6, hsa-miR-21-5p,
hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-25-3p, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-106b-5p, hsa-miR-124-3p,
hsa-miR-125a-5p, hsa-miR-132-3p, hsa-miR-134-5p, hsa-miR-138-5p, hsa-miR-145-5p,
hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-181b-5p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-195-
5p, hsa-miR-199-5p, hsa-miR-218-5p) were added to a mix containing RNA,
oligo(dT)25V (5 mM), 250 mM dNTPs (Ludwig, RS, Porto Alegre, Brazil) and RNAse-
free water in a final volume of 17 L. This was submitted to an incubation step at 65°C for
5 minutes, and then placed on ice. The MML-V RT enzyme (New England Biolabs, MA,
USA) was used for cDNA synthesis according to the manufacturer’s instructions. Each
reaction mix was incubated at 16ºC for 30 minutes followed by another 30 minutes at 42ºC.
All cDNA samples were diluted 50 X in RNAse-free water. Stem loop primers, initiation
primers and the universal reverse primer were designed according to Chen and
collaborators (CHEN et al., 2005).
Real-time PCR was performed in a Bio-Rad CFX384 system (Bio-Rad, Hercules,
CA, USA) utilizing SYBR Green I (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). The PCR reaction
took place in a total volume of 10 μL containing 5 μL of diluted cDNA (1:50), 1 X SYBR
Green I (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 0.1 mM dNTPs, 1 X Buffer, 3 mM MgCl2, 0.25
U Taq DNA polymerase (Quatro G, Porto Alegre, RS, Brazil) and 200 nM of each forward
and reverse primer. Samples were analyzed in triplicates in a 384-well plate, in which a
238
control was also included. Reference genes were chosen according to the GeNorm
software, in order to determine the necessary miRNAs for normalization and to identify
the most stable miRNAs to be used as normalizers. In order to determine miRNA
amplification, PCR was set up as follows: an initial 5-minute step at 95ºC, followed by 40
cycles of 15 seconds at 95ºC for denaturation, 10 seconds at 60ºC for annealing and 10
seconds at 72ºC for elongation. Melting curve analysis was programmed at the end of the
PCR reaction at the 65ºC and 95ºC interval, with readings at every 0.4ºC increase in
temperature. Baselines and limits were determined manually using the Bio-Rad CFX
software. To calculate relative miRNA expression, the 2-ΔΔCt method was employed
(LIVAK; SCHMITTGEN, 2001).
Statistical analysis
Data is shown as mean  standard deviation for quantitative variable and as absolute
and relative frequencies for qualitative variables. The Student’s t test was employed for
independent samples, where P  0.05 was considered significant. Results were analyzed
with the Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) program, v. 21.0.
Results
The relative miRNA expression in the saliva of 26 patients compared to their
respective case-matched controls (7-17 years old, mean 11.1 years) was determined. The
GeNorm algorithm classified ribosomal proteins HsRPS18 Fw and HsRPS18 Rv as stable,
and these were used as normalizers in order to evaluate relative miRNA expression.
Of all miRNA tested, only mir-191 amplified, and was significantly more expressed
in the saliva of patients diagnosed with ASD, as compared to their case-matched controls
(P = 0.029, Figure 1). The remaining 17 miRNAs were not detected by the methods
employed in this study.
Discussion
In this study, we identified an increased expression. of miR-191 in saliva samples

obtained from pediatric patients diagnosed with ASD, in comparison to age-matched
239
controls. We opted for miRNA analysis in saliva because these samples are easily
obtainable via non-invasive methods, and because miRNA may be employed as a
biomarker for the early diagnosis of ASD. A previous study evaluating miRNA expression
in saliva showed that 14 different miRNAs, out of 246 that were detected and quantified,
were differentially expressed in patients diagnosed with ASD in comparison to healthy
controls. Moreover, these expression profiles demonstrated significant correlations with
the Vineland Adaptive Behavior Scales (VABS) (HICKS et al., 2016).
Here, we found that expression of miR-191 is increased in patients diagnosed with

ASD in comparison to controls, a finding which corroborates other studies which reported
an increase in miR-191 in lymphocytes and saliva of patients diagnosed with ASD,
correlating negatively with the VABS composite score (HICKS et al., 2016;
SARACHANA et al., 2010). MiR-191 is widely expressed in the brain, (SHAO et al.,
2010), and it is suggested that it may contribute to cortical development via the negative
regulation of brain-derived neurotrophic fator (BDNF) (KIM et al., 2004; MELLIOS et al.,
2008; VARENDI et al., 2014). It also plays a role in long-term synaptic depression (HU et
al., 2014), which is a weakening in synaptic transmission as a result of calcium depletion
that lasts hours. If a miRNA which is crucial for this pathway is overexpressed, its protein
targets will consequently decrease in concentration, harming synaptic depression and
favoring excitation. It is suggested that miR-191 might also play a role in immune
homeostasis (LYKKEN; LI, 2016), as it was recently associated with inflammatory and
immune conditions in mice (CASERTA et al., 2016; NAGPAL; KULSHRESHTHA,
2014). Other groups have also suggested its use as a biomarker for the differential diagnosis
of inflammatory intestinal disease (LIN et al., 2013). Studies have also found an increase
in miR-191 expression in patients diagnosed with multiple sclerosis (VISTBAKKA et al.,
2017, 2018), traumatic brain injury (YANG et al., 2016), and Alzheimer’s disease
(KUMAR et al., 2013).
Although saliva is easily obtainable, it is also rich in ribonucleases (RNAses)

(PERSANO; VECCHIO; POMPA, 2015). The presence of RNAse in a biological sample
obtained for RNA and microRNA isolation poses a serious problem, increasing the chances
of sample contamination and degradation. Therefore, even though miRNA analysis is a
promising tool for analyzing the molecular blueprints of each patient, the challenge of
isolating exosomes from saliva samples remains. Moreover, other factors such as the type
of tube used during sample collection, sample processing time, centrifugation speed and
240
freeze-thaw cycles all affect the quality and chances of detecting miRNAs (MITCHELL et
al., 2016; SUN et al., 2018). Taken together, these factors may explain why only one
miRNA out of 18 was identified in our patient cohort.
Several miRNA may be isolated from saliva via PCR and/or commercially available
kits. Establishing a miRNA isolation protocol for subsequent miRNA analysis may
contribute to the early diagnosis of diseases that, nowadays, can only be diagnosed via
observation of behavioral changes. We therefore encourage further studies that explore
specific molecular alterations in patients diagnosed with ASD.
Conclusion
In the present study, out of a total of 18 microRNAs, microRNA miR-191 was

isolated and quantified from saliva samples of pediatric patients diagnosed with ASD. A
significant increase in miR-191 expression was observed in these patients, suggesting that
important pathways regulated by miR-191 might be involved in the pathogenesis of ASD.
Since saliva is an easily obtainable biological fluid via non-invasive methods, we
encourage further research exploring microRNA isolation protocols in saliva, with hopes
of discovering new disease biomarkers and therapeutic targets.
Acknowledgements
We would like to thank the HCPA Research and Events Investment Fund (Fundo
de Investimento em Pesquisas e Eventos; FIPE-HCPA), the Graduate Program in
Child and Adolescent Health of the UFRGS Medical School (Programa de Pós-
graduação em Saúde da Criança e do Adolescente – Faculdade de Medicina -
UFRGS), and the Autism Spectrum Disorder Translational Research Group
(Grupo de Pesquisas Translacionais em Transtorno do Espectro Autista -
GETTEA- UFRGS).
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Figure 1. Relative expression of mir-191 in children diagnosed with ASD, in comparison to

age-matched controls. Bars represent mean  standard error. *P<0.05.
244
15 CONSIDERAÇÕES FINAIS
O prejuízo individual causado pelo TEA afeta várias faces do funcionamento diário
e, muitas vezes, impede a independência na vida adulta. O substancial efeito econômico
direto e indireto dos tratamentos e o sofrimento do indivíduo e de sua família reforçam a
necessidade da busca contínua por intervenções efetivas. A prevalência do TEA aumentou
dramaticamente nas últimas décadas e apesar dos avanços do conhecimento sobre o
transtorno, aspectos de sua etiologia permanecem não esclarecidos. Evidências acumuladas
até o momento sugerem que fatores genéticos, ambientais, inflamatórios, imunológicos e
metabólicos desempenham um papel proeminente no distúrbio. Até o momento não existe
um marcador biológico para o TEA ou terapia que reverta completamente seus sintomas.
Os miRNA surgem como possíveis biomarcadores para doenças do sistema nervoso
central, incluindo o TEA. Eles podem auxiliar no diagnóstico precoce, no prognóstico, na
caracterização de subgrupos de pacientes e na definição de subconjuntos de indivíduos
que responderiam mais favoravelmente a tratamentos específicos. A busca por
biomarcadores salivares para doenças neuropsiquiátricas tem aumentado nos últimos anos,
uma vez que a saliva é um fluido biológico de acesso fácil e não invasivo, minimizando
muitas limitações associadas às outras técnicas.
Existe a possibilidade de que a disfunção imune no TEA possa ser caminho viável
para a intervenção farmacológica, e um subgrupo de indivíduos com TEA poderia se
beneficiar de terapias de base imunológica. O resveratrol apresenta capacidade de
modulação da resposta inflamatória e atividade neuroprotetora. Em modelos animais de
autismo o resvertrol melhora os sintomas comportamentais típicos do TEA.
No estudo piloto, pela primeira vez administrou-se resveratrol a crianças ou a
indivíduos com autismo. Assim, trata-se de um estudo com número pequeno de
participantes, mas com relevância clínica, pois sugeriu que o resveratrol possa melhorar os
sintomas do TEA em alguns pacientes, além de ter sido seguro e bem tolerado nessa faixa
etária. Além disso, houve mudança na expressão de três de marcadores moleculares
relacionados à processos inflamatórios, miR-124-3p, miR-125a-5p e miR-195-5p, o que
reforça a necessidade da investigação desses microRNA tanto como biomarcadores no
TEA como de sua ação na etiopatogenia da doença.
Também verificamos, apesar das dificuldades metodológicas de manipulação de
amostra de saliva, um aumento expressão do miR-191 em crianças com TEA em relação
245
à controles. O miR-191 está relacionando vias importantes que podem estar envolvidas na
fisiopatologia do TEA.
Apesar das limitações do estudo atual, seus resultados são promissores. Estudos
maiores, randomizados, duplo-cegos e controlados por placebo com a administração de
resveratrol em crianças e adolescentes com autismo serão necessários para melhor avaliar
a sua eficácia. Além disso, novas pesquisas utilizando microRNA, tanto na tentativa de
compreender seu papel na etiopatogenia do TEA, quanto sua utilidade como biomarcador,
são incentivadas.
246
APÊNDICES
APÊNDICE A – TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO –

VOLUNTÁRIOS PARA USO DE RESVERATROL.
Título do Projeto: USO DE RESVERATROL EM SUJEITOS DE PESQUISA

PEDIÁTRICOS COM DIAGNÓSTICO DE TRANSTORNO DO ESPECTRO AUTISTA.
A criança ou adolescente pelo qual você é responsável está sendo convidado a

participar de uma pesquisa cujo objetivo é avaliar o efeito de Resveratrol nos sintomas do
autismo, isto é, se o resveratrol melhora os sintomas do autismo. Esta pesquisa está sendo
realizada pela Unidade de Neurologia Infantil do Hospital de Clínicas de Porto Alegre
(HCPA).
Se você concordar com a participação na pesquisa, os procedimentos envolvidos
são os seguintes: a criança ou adolescente irá tomar Resveratrol (uma substância
encontrada na casca da uva) na dose de 200mg por via oral (pela boca), uma vez ao dia, de
forma contínua pelo período de 90 dias (3 meses). Para verificar se o resveratrol está tendo
efeito, você terá que responder um questionário sobre o comportamento da criança ou
adolescente que você é responsável antes do início do tratamento, com 45 dias de
tratamento e com 90 dias de tratamento. Essas perguntas serão realizadas em consultas no
Centro de Pesquisas Clínicas do HCPA, com cerca de 1 hora de duração. Nessas consultas
a criança ou adolescente também será examinado e os sinais vitais (temperatura, pressão
arterial, pulso e respiração) serão avaliados. Também para melhor avaliar os efeitos do
resveratrol serão coletados exames de sangue, uma amostra antes do início do tratamento,
e após 45 e 90 dias do uso do resveratrol (cerca de 5ml de sangue em cada coleta).
O material biológico coletado (sangue) será armazenado de forma codificada. Após
a realização das análises previstas neste projeto, as amostras serão armazenadas. Este
material, além de ser utilizado neste estudo, poderá ser utilizado em outros estudos futuros
do nosso grupo. Neste caso, um novo projeto de pesquisa será submetido para apreciação
do Comitê de Ética em Pesquisa e você será chamado para reconsentir com o uso do
material. Neste caso você,
( ) Autoriza que as amostras sejam armazenadas para pesquisas futuras.
( ) Não autoriza que as amostras sejam armazenadas para pesquisas futuras.
Os possíveis riscos ou desconfortos decorrentes da participação na pesquisa são
efeitos colaterais do resveratrol. Nas pesquisas anteriores com o resveratrol em pacientes
adultos, os efeitos colaterais mais comuns foram: náuseas, vômitos, diarreia e alergia na
pele. Além disso, na coleta de sangue, pode haver desconforto da picada da agulha e
poderão ocorrer complicações locais como dor e hematoma (roxo).
O possível benefício decorrente da participação na pesquisa é a possível redução
(melhora) dos sintomas do autismo, como melhora da interação social e diminuição das
estereotipias e do apego a rotinas. É importante que você entenda que não existe garantia
de que este tratamento funcionará para melhorar os sintomas do seu a criança ou
adolescente pelo qual você é responsável. Mesmo que haja benefícios na criança ou
247
adolescente pelo qual você é responsável com o uso da substância, por se tratar de um
estudo inicial, ela não será fornecida para utilização após o término da pesquisa.
A participação na pesquisa é totalmente voluntária, ou seja, não é obrigatória. Caso
você decida não autorizar a participação, ou ainda, retirar a autorização após a assinatura
desse Termo, não haverá nenhum prejuízo ao atendimento que o participante da pesquisa
recebe ou possa vir a receber na instituição.
Não está previsto nenhum tipo de pagamento pela participação na pesquisa e não
haverá nenhum custo com respeito aos procedimentos envolvidos, porém, poderá haver
ressarcimento por despesas decorrentes da participação, como transporte até o hospital,
cujos custos serão absorvidos pelo orçamento da pesquisa.
Caso ocorra alguma intercorrência ou dano, resultante da pesquisa, o participante
receberá todo o atendimento necessário, sem nenhum custo pessoal.
Os dados coletados durante a pesquisa serão sempre tratados confidencialmente. Os
resultados serão apresentados de forma conjunta, sem a identificação dos participantes, ou
seja, os nomes não aparecerão na publicação dos resultados.
Caso você tenha dúvidas, poderá entrar em contato com o pesquisador responsável
Rudimar dos Santos Riesgo, pelo telefone 51 999875545, com o pesquisador Josemar
Marchezan, pelo telefone 51 999073034 ou com o Comitê de Ética em Pesquisa do
Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA), pelo telefone (51) 33597640, ou no 2º andar
do HCPA, sala 2227, de segunda à sexta, das 8h às 17h.
Esse Termo é assinado em duas vias, sendo uma para o participante e seu
responsável e outra para os pesquisadores.
____________________________________
Nome do participante da pesquisa:
____________________________________
Assinatura (se aplicável)
____________________________________
Nome do responsável
____________________________________
Assinatura
____________________________________
Nome do pesquisador que aplicou o Termo
____________________________________
Assinatura
Local e Data: _________________________
248
APÊNDICE B – TERMO DE CONSENTIMENRO LIVRE E ESCLARECIDO –

AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE MICRORNA – CASOS.
Título do Projeto: AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE microRNA EM SUJEITOS

PEDIÁTRICOS COM TRANSTORNO DO ESPECTRO AUTISTA
A criança pela qual você é responsável está sendo convidada a participar de uma
pesquisa cujo objetivo é avaliar alterações genéticas no autismo através da dosagem de
alguns microRNA (pequenas partículas simples de material genético) na saliva e verificar
se essas alterações genéticas têm relação com o comportamento desses pacientes. Esta
pesquisa está sendo realizada pela Unidade de Neurologia Infantil do Hospital de Clínicas
de Porto Alegre (HCPA).
são os seguintes: a criança realizará a coleta de uma amostra de saliva, no total de 3ml
(meia colher de sopa) e o (a) senhor(a) responderá a 4 questionários sobre o comportamento
do paciente. Para facilitar a coleta, a produção de saliva poderá ser estimulada com ácido
cítrico (ácido encontrado naturalmente em algumas frutas como o limão), o que poderá
gerar algum desconforto.
devidos a coleta de saliva. Não é necessário “picar” a criança e existem poucas
complicações, como por exemplo náuseas (ânsia de vômito). Para limitar ao máximo
possível estes riscos, a criança estará sob supervisão rigorosa no momento desta coleta.
O possível benefício decorrente da participação na pesquisa é o aumento do
conhecimento sobre o autismo, que poderá beneficiar futuros pacientes. A pesquisa não
trará benefícios diretos aos participantes.
ressarcimento por despesas decorrentes da participação, por exemplo transporte, cujos
custos serão absorvidos pelo orçamento da pesquisa.
O material biológico coletado será armazenado de forma codificada. Após a
realização das análises previstas neste projeto, as amostras serão armazenadas. Este
249
( ) Não autoriza que as amostras sejam armazenadas para pesquisas futuras."
Dr. Rudimar dos Santos Riesgo pelo telefone 51 33598486, com o pesquisador Dr. Josemar
Marchezan, pelo telefone 51 33598486 / 51 999073034 ou com o Comitê de Ética em
Pesquisa do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA), pelo telefone (51) 33597640,
ou no 2º andar do HCPA, sala 2227, de segunda à sexta, das 8h às 17h.
____________________________________
____________________________________
____________________________________
____________________________________
Assinatura
____________________________________
____________________________________
Assinatura
Local e Data: _________________________
250
APÊNDICE C – TERMO DE CONSENTIMENRO LIVRE E ESCLARECIDO –

AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE MICRORNA - CONTROLES
Título do Projeto: AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE microRNA EM SUJEITOS

PEDIÁTRICOS COM TRANSTORNO DO ESPECTRO AUTISTA
A criança pela qual você é responsável está sendo convidada a participar de uma
pesquisa cujo objetivo é avaliar alterações genéticas no autismo através da dosagem de
alguns microRNA (pequenas partículas simples de material genético) na saliva e verificar
se essas alterações genéticas têm relação com o comportamento desses pacientes. Esta
pesquisa está sendo realizada pela Unidade de Neurologia Infantil do Hospital de Clínicas
de Porto Alegre (HCPA).
Os dados dos pacientes com autismo serão comparados com o de pessoas de mesma
idade e sexo sem a doença. Isto significa que estamos convidando a criança a qual você é
responsável para participar do projeto porque ela não tem a doença. Esses são o que
chamamos de controles do estudo.
são os seguintes: a criança realizará a coleta de uma amostra de saliva, no total de 3ml
(meia colher de sopa). Para facilitar a coleta, a produção de saliva poderá ser estimulada
com ácido cítrico (ácido encontrado naturalmente em algumas frutas como o limão), o que
poderá gerar algum desconforto.
devidos a coleta de saliva. Não é necessário “picar” a criança e existem poucas
complicações, como por exemplo náuseas (ânsia de vômito). Para limitar ao máximo
possível estes riscos, a criança estará sob supervisão rigorosa no momento desta coleta.
O possível benefício decorrente da participação na pesquisa é o aumento do
conhecimento sobre o autismo, que poderá beneficiar futuros pacientes. A pesquisa não
trará benefícios diretos aos participantes.
ressarcimento por despesas decorrentes da participação, por exemplo transporte, cujos
custos serão absorvidos pelo orçamento da pesquisa.
O material biológico coletado será armazenado de forma codificada. Após a
realização das análises previstas neste projeto, as amostras serão armazenadas. Este
251
( ) Não autoriza que as amostras sejam armazenadas para pesquisas futuras."
Dr. Rudimar dos Santos Riesgo pelo telefone 51 33598486, com o pesquisador Dr. Josemar
Marchezan, pelo telefone 51 33598486 / 51 999073034 ou com o Comitê de Ética em
Pesquisa do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA), pelo telefone (51) 33597640,
ou no 2º andar do HCPA, sala 2227, de segunda à sexta, das 8h às 17h.
____________________________________
____________________________________
____________________________________
____________________________________
Assinatura
____________________________________
____________________________________
Assinatura
Local e Data: _________________________
252
ANEXOS
ANEXO A – CRITÉRIOS DIAGNÓSTICOS PARA TRANSTORNO DO ESPECTRO
AUTISTA SEGUNDO O DSM-5.
Critérios diagnósticos segundo o DSM-5 (ASSOCIATION, 2013):

a) déficits persistentes na comunicação social e na interação social em múltiplos
contextos, conforme manifestado pelo que segue, atualmente ou por história prévia:
 déficits na reciprocidade socioemocional, variando, por exemplo, de abordagem
anormal e dificuldade para estabelecer uma conversa normal a compartilhamento
reduzido de interesses, emoções ou afeto, a dificuldade para iniciar ou responder a
interações sociais;
 déficits nos comportamentos comunicativos não verbais usados para interação
social, variando, por exemplo, de comunicação verbal e não verbal pouco
integrada a anormalidades no contato visual e linguagem corporal ou déficits na
compreensão e uso de gestos, a ausência total de expressões faciais e
comunicação não verbal;
 déficits no desenvolvimento, na manutenção e no entendimento dos
relacionamentos, variando, por exemplo, de dificuldades no ajuste de
comportamentos em contextos sociais sutis; a dificuldades em compartilhar
brincadeiras imaginativas ou fazer amigos; a ausência de interesses em pares;
b) padrões restritos e repetitivos de comportamento, interesses ou atividades,
conforme manifestado por pelo menos dois dos seguintes, atualmente ou por história
prévia:
 movimentos motores, uso de objetos ou fala estereotipados ou repetitivos;
 insistência nas mesmas coisas, adesão inflexível a rotinas ou padrões ritualizados
de comportamento verbal ou não verbal;
 interesses fixos e altamente restritos que são anormais em intensidade ou foco,
 hiper ou hiporreatividade a estímulos sensoriais ou interesse incomum por
aspectos sensoriais do ambiente;
c) os sintomas devem estar presentes precocemente no período do desenvolvimento
(mas podem não se tornar plenamente manifestos até as demandas sociais excedam as
capacidades limitadas ou podem ser mascarados por estratégias aprendidas mais tarde na
vida);
d) os sintomas causam prejuízo clinicamente significativo no funcionamento social,
profissional ou em outras áreas importantes da vida do indivíduo no presente;
e) essas perturbações não são mais bem explicadas por deficiência intelectual ou por atraso
global do desenvolvimento. Deficiência intelectual e TEA costumam ser comórbidos; para
fazer o diagnóstico da comorbidade de TEA e deficiência intelectual, a comunicação social
deve estar abaixo do esperado para o nível geral de desenvolvimento.
253
ANEXO B – ESCALA CLINICAL GLOBAL IMPRESSION (CGI)
Clinical Global Impression – Severity Scale
Considerando a sua experiência com esta doença, quão mentalmente doente está o
paciente neste momento?
1. Normal, não doente;

2. Limítrofe para a doença mental;
3. Levemente doente;
4. Moderadamente doente;
5. Marcadamente doente;
6. Gravemente doente;
7. Doença mental extremamente grave.
Clinical Global Impression – Improvement Scale
Comparando a condição do paciente no início do tratamento, qual o grau de

alteração que ocorreu?
1. Muito melhor;
2. Melhor;
3. Ligeiramente melhor;
4. Sem alteração;
5. Ligeiramente pior;
6. Pior;
7. Muito pior.
254
ANEXO C - ABERRANT BEHAVIOR CHECKLIST (ABC)
Instruções:
A escala de sintomas ABC comunitária foi elaborada para ser usada em pacientes que
vivem em comunidade. Por isso o termo paciente é usado para se referir à pessoa que está
sendo avaliada, que pode ser uma criança em idade escolar, um adolescente ou um adulto.
Pontue o comportamento do paciente em relação às quatro últimas semanas. Para cada item
decida se o comportamento é um problema e circule o número apropriado:
0 = não é problema;
1 = o comportamento é um problema, mas em grau leve;
2 = o problema tem gravidade moderada;
3 = o problema é grave.
Quando estiver julgando o comportamento do paciente, tenha em mente os pontos a seguir:
a) Considere a frequência com que cada comportamento acontece de forma relativa. Por
exemplo, se um paciente tem em média mais acessos de fúria do que a maioria de outros
pacientes que você conhece, ou do que a maioria dos seus colegas de classe, a gravidade é
provavelmente moderada (2) ou grave (3), mesmo que ocorra somente uma ou duas vezes
por semana. Outros comportamentos, como desobediência, provavelmente precisam
ocorrer com maior frequência para merecer a pontuação máxima.
b) Considere a opinião de outros cuidadores do paciente, caso você tenha acesso a essa
informação. Se o paciente tem problemas com outros, mas não com você, tente levar em
conta a situação de maneira geral.
c) Tente considerar se um determinado comportamento interfere no desenvolvimento,
funcionamento ou relacionamento dele/dela. Por exemplo, balançar o corpo ou retraimento
social podem não perturbar outras crianças ou adultos, mas certamente atrapalha o
funcionamento ou desenvolvimento individual.
Não se detenha muito tempo em cada item, sua primeira impressão geralmente é a correta.
1. Excessivamente ativo(a) em casa, na escola, no trabalho ou em qualquer lugar 0 1

2 3.
2. Fere-se de propósito 0 1 2 3.
3. Indiferente, lento(a), parado(a) 0 1 2 3.
4. Agressivo(a) com outras crianças ou adultos (verbalmente ou fisicamente) 0 1 2 3.
5. Procura se isolar dos outros 0 1 2 3
6. Movimentos corporais repetitivos e sem sentido 0 1 2 3
7. Barulhento(a) (ruídos grosseiros e inapropriados) 0 1 2 3
8. Grita inapropriadamente 0 1 2 3
9. Fala excessivamente 0 1 2 3
10. Crises de birra/acesso de fúria 0 1 2 3
11. Comportamentos estereotipados; movimentos anormais, repetitivos 0 1 2 3
12. Preocupado(a), fixa o olhar no vazio 0 1 2 3
255
13. Impulsivo(a) (age sem pensar) 0 1 2 3

14. Irritável e queixoso(a) 0 1 2 3
15. Inquieto(a), incapaz de permanecer sentado(a) 0 1 2 3
16. Retraído(a); prefere atividades solitárias 0 1 2 3
17. Estranho, comportamento esquisito 0 1 2 3
18. Desobediente; difícil de controlar 0 1 2 3
19. Grita em momentos inapropriados 0 1 2 3
20. Expressão facial imóvel, fixa; falta de resposta emocional 0 1 2 3
21. Incomoda os outros 0 1 2 3
22. Fala repetitiva 0 1 2 3
23. Não faz nada a não ser ficar sentado(a) e olhar os outros 0 1 2 3
24. Não é cooperativo 0 1 2 3
25. Depressivo(a) 0 1 2 3
26. Resiste a qualquer forma de contato físico 0 1 2 3
27. Movimenta ou balança a cabeça de trás para frente repetidamente 0 1 2 3
28. Não presta atenção às instruções 0 1 2 3
29. Os pedidos têm que ser atendidos imediatamente 0 1 2 3
30. Isola-se de outras crianças ou de adultos 0 1 2 3
31. Tumultua as atividades em grupo 0 1 2 3
32. Fica sentado(a) ou em pé na mesma posição por muito tempo 0 1 2 3
33. Fala sozinho(a) em voz alta 0 1 2 3
34. Chora por mínimos aborrecimentos e machucados 0 1 2 3
35. Movimentos repetitivos das mãos, do corpo ou da cabeça 0 1 2 3
36. O humor muda rapidamente 0 1 2 3
37. Não acompanha as atividades estruturadas (não reage) 0 1 2 3
38. Não permanece sentado (ex. durante as lições ou outras atividades, refeições etc.)
0 1 23
39. Não fica sentado(a) nem por um tempo mínimo 0 1 2 3
40. Difícil alcançá-lo(la), contatá-lo(la) ou chegar até ele(ela) 0 1 2 3
41. Chora e grita inapropriadamente 0 1 2 3
42. Prefere ficar sozinho(a) 0 1 2 3
43. Não tenta se comunicar por palavras ou gestos 0 1 2 3
44. Distrai-se com facilidade 0 1 2 3
45. Balança ou agita as mãos ou pés repetidamente 0 1 2 3
46. Repete várias vezes uma palavra ou frase 0 1 2 3
47. Bate os pés, ou faz barulho estrondoso com objetos ou bate portas com força 0 1 2
3
48. Constantemente corre ou pula em torno do cômodo 0 1 2 3
49. Balança o corpo para trás e para frente repetidamente 0 1 2 3
50. Causa machucados em si mesmo 0 1 2 3
51. Não presta atenção quando falam com ele(ela) 0 1 2 3
52. Pratica violência contra si próprio 0 1 2 3
53. Inativo(a), nunca se move espontaneamente 0 1 2 3
54. Tende a ser excessivamente ativo(a) 0 1 2 3
55. Reage negativamente ao contato afetivo 0 1 2 3
56. Ignora propositalmente as instruções 0 1 2 3
57. Tem acesso de fúria ou birra quando contrariado 0 1 2 3
58. Demonstra pouca reação social aos outros 0 1 2 3

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SAÚDE DA CRIANÇA E DO

TRANSTORNO DO ESPECTRO AUTISTA E

Porto Alegre, Brasil

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SAÚDE DA CRIANÇA E DO

TRANSTORNO DO ESPECTRO AUTISTA E

A apresentação desta Tese é exigência

Orientador: Prof. Dr. Rudimar dos Santos Riesgo

Coorientadora: Profa. Dra. Carmem Gottfried

Porto Alegre, Brasil

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SAÚDE DA CRIANÇA E DO

ESTA TESE FOI DEFENDIDA PUBLICAMENTE EM:

E, FOI AVALIADA PELA BANCA EXAMINADORA COMPOSTA POR:

Prof. Dr. Lauro José Gregianini

Dra. Josiane Ranzan

Profa. Dra. Clarissa Aires Roza

com gratidão e saudade.

A minha esposa Luiza, pelo amor, carinho e apoio incondicional.

Introdução: O diagnóstico do transtorno do espectro autista (TEA) permanece clínico. A

Palavras-chave: Transtorno do espectro autista. TEA. Disfunção imune. Resveratrol.

Introduction: Diagnosis of autism spectrum disorder (ASD) is purely clinical. Immune

Figura 1 - Índice de Preferência Social. ................................................................................... 47

Figura 2 - Tempo de interação social. ..................................................................................... 48

Figura 3 - Biogênese dos miRNA. ........................................................................................... 50

Figura 4 - Rede/relações entre miRNA .................................................................................... 51

Figura 5 - Mecanismo de transporte de moléculas do plasma para os ductos salivares. .......... 56

Tabela 3 - Genes alterados em TEA e correlacionados com função imune. ............................ 35

Tabela 4 - Citocinas alteradas no TEA. .................................................................................... 37

Tabela 5 - Doses e efeitos colaterais em ensaios clínicos com resveratrol. ............................. 45

Tabela 6 - MicroRNA com expressão alterada em sujeitos com TEA. .................................... 54

ABA Applied Behavior Analysis

2 REVISÃO DA LITERATURA .......................................................................................... 20

2.1 TRANSTORNO DO ESPECTRO AUTISTA ............................................................... 20

2.1.1 Aspectos Históricos ........................................................................................... 20

2.1.2 Aspectos epidemiológicos ................................................................................. 21

2.1.3 Manifestações clínicas e diagnóstico ............................................................... 22

2.1.4 Etiologia e Neurobiologia ................................................................................. 24

2.1.5 Tratamento ........................................................................................................ 27

2.1.6 Prognóstico ........................................................................................................ 29

2.2 TEA E O SISTEMA IMUNOLÓGICO ......................................................................... 29

2.3 RESVERATROL ........................................................................................................... 40

2.3.1 Biodisponibilidade e farmacocinética em humanos ........................................... 41

2.3.2 Estudos de toxicidade do RSV em animais ......................................................... 43

2.3.3 Resveratrol e estudos em humanos ...................................................................... 43

2.3.4 Resveratrol: efeito neuroprotetor e anti-inflamatório ....................................... 43

2.3.5 Resveratrol e Transtorno do Espectro Autista ................................................... 44

2.4.1 MicroRNA e TEA .................................................................................................. 51

2.4.2 MicroRNA e Biomarcadores ................................................................................ 52

2.4.3 Expressão de MicroRNA na saliva ...................................................................... 55

4 OBJETIVOS RELACIONADOS AO ARTIGO 2: USO DE RESVERATROL EM

4.1 OBEJTIVO GERAL ....................................................................................................... 58

5 METODOLOGIA RELACIONADA AO ARTIGO 2: USO DE RESVERATROL EM

5.1 DELINEAMENTO DO ESTUDO ................................................................................. 58

5.2.1 Critérios de Inclusão ............................................................................................. 59

5.2.2 Critérios de Exclusão ............................................................................................ 59

5.3 INTERVENÇÃO ............................................................................................................ 60

5.4 VARIÁVEIS EM ESTUDO ........................................................................................... 60

5.5 DESFECHO ESPERADO .............................................................................................. 61