CENTRO UNIVERSITÁRIO DA GRANDE DOURADOS

THAINÁ ASSIS

ESTÁGIO SUPERVISIONADO EM ANÁLISES CLÍNICAS:

MICRO-IMUNO

Dourados
2023
 CENTRO UNIVERSITÁRIO DA GRANDE DOURADOS

THAINÁ ASSIS

ESTÁGIO SUPERVISIONADO EM ANÁLISES CLÍNICAS:

MICRO-IMUNO

Trabalho apresentado na Disciplina de Estágio

Supervisionado em Análises Clínicas do 4
ano, Curso de Biomedicina, Faculdade de
Ciências da Saúde.

Prof. Fabricio de M.P. dos Santos.

Dourados
2023
COLORAÇÃO DE GRAM

A coloração de Gram é um método utilizado para a coloração e diferenciação de

cores em uma amostra microscópica. É através dela que distinguimos se a amostra é
positiva ou negativa.
O processo da coloração de Gram envolve várias etapas. Primeiramente, uma
amostra contendo as placas é fixada em uma lâmina de vidro. Em seguida, a amostra é
tratada com um corante violeta de cristal. O corante violeta é retido pelas células
bacterianas, tornando-as roxas.
Após as cores iniciais, a lâmina é tratada com um agente de fixação, o lugol, que
ajuda a fixar o corante nas células bacterianas. Em seguida, a lâmina é lavada com um
agente descolorante, como o álcool ou a acetona, que remove o corante das bactérias
Gram-negativas.
Após a etapa de descoloração, as bactérias Gram-positivas permanecem roxas,
enquanto as Gram-negativas perdem a cor e ficam incolores. Para diferenciar as
bactérias Gram-negativas, é necessário realizar uma etapa de contracoloração,
utilizando um corante de contraste, geralmente o fucsina. As bactérias Gram-negativas
são coradas de rosa ou vermelho pela fucsina, enquanto as Gram-positivas permanecem
com as cores roxas.

As bactérias Gram-positivas possuem uma parede celular espessa de

peptideoglicano, enquanto as Gram-negativas possuem uma parede celular mais fina de
peptideoglicano, além de uma membrana externa lipopolissacarídica.
 A distinção entre bactérias Gram-positivas e Gram-negativas é de grande
importância na microbiologia, pois as diferentes características dessas bactérias têm
instruções na escolha do tratamento antibiótico adequado. Além disso, a coloração de
Gram também pode fornecer informações sobre a morfologia e a organização das
bactérias, auxiliando na identificação preliminar de diferentes espécies bacterianas.

TESTES RÁPIDOS

Testes rápidos são uma forma conveniente de realizar triagens para várias
condições de saúde. Os testes rápidos para sífilis, HIV, HCV e beta-HCG (hormônio
gonadotrófico coriônico humano) são amplamente utilizados para detectar essas
condições.
O teste rápido para sífilis detecta a presença de anticorpos produzidos pelo
organismo em resposta à infecção pela bactéria Treponema pallidum, através de uma
pequena amostra de soro ou sangue total do paciente. A sífilis é uma infecção bacteriana
transmitida principalmente por contato sexual
O HIV (vírus da imunodeficiência humana) é a causa da AIDS. Os testes rápidos
de HIV também usam uma amostra de sangue ou fluido oral para detectar a presença de
anticorpos contra o vírus e identificam tanto o HIV1 quanto o HIV2.
O HCV (vírus da hepatite C) é transmitido principalmente por contato com
sangue infectado, como o compartilhamento de agulhas durante o uso de drogas
injetáveis. Os testes rápidos para HCV também usam amostras de sangue para detectar a
presença de anticorpos contra o vírus. Alguns testes também podem detectar a presença
do RNA do HCV, confirmando a infecção ativa.
O beta-HCG é um hormônio produzido durante a gravidez. Os testes rápidos de
beta-HCG são usados para detectar a presença desse hormônio no sangue ou na urina.
Esses testes são amplamente utilizados para confirmar a gravidez.

AGLUTINAÇÃO EM LÁTEX

A aglutinação em látex é uma técnica imunológica usada para detectar a

presença de antígenos específicos em uma amostra. Nessa técnica, partículas de látex
são expostas com antígenos ou anticorpos e, quando em contato com o antígeno ou
anticorpo correspondente na amostra, ocorre a formação de aglutinados visíveis ao olho
nu.
A formação dos aglutinados pode ocorrer devido à ligação entre os antígenos e
anticorpos, provocada em uma reação de aglutinação positiva, indicando a presença do
antígeno ou anticorpo de interesse na amostra. Por outro lado, se não houver interação
entre o antígeno e anticorpo, não houve aglutinação, causada em uma reação negativa.
A aglutinação em látex pode ser usada para diversas finalidades, como a
detecção de antígenos bacterianos, virais ou fúngicos em amostras clínicas, a
identificação de grupos sanguíneos ou a pesquisa de mecanismo específico em soros
para diagnóstico de doenças infecciosas.
 Os exames mais comuns feitos com a técnica do imunolátex são: PCR, ASLO E
FATOR REUMATÓIDE.

PCR (PROTEÍNA C REATIVA)

A PCR (Proteína C Reativa) é uma proteína produzida pelo fígado em resposta a

processos inflamatórios no corpo. É um marcador de fase aguda, o que significa que
seus níveis podem aumentar rapidamente em resposta a lesões, infecções ou
inflamações.
A PCR é frequentemente medida através de exames de sangue e exames de
imunolátex que comprovam a infecção, quando essa está com os níveis acima de 6mg/L
e é utilizada como um indicador não específico de fisiologia no organismo. Quando
ocorre um processo inflamatório, a produção de PCR aumenta, e seus níveis podem ser
detectados no sangue em questão de horas após o início da inflamação.

F.R (FATOR REUMATÓIDE)

O fator reumatoide (FR) é um anticorpo autoimune presente no sangue de

algumas pessoas com doenças autoimunes, principalmente na artrite reumatoide. É um
marcador laboratorial usado para auxiliar no diagnóstico e no monitoramento dessa
doença.
 O FR é um anticorpo que reage contra a própria imunoglobulina G (IgG), que é
um tipo de anticorpo normalmente presente no sangue. Na artrite reumatóide, o sistema
imunológico do indivíduo produz FR que ataca como IgG, formando imunes complexos
que podem causar inflamação nas articulações e outros tecidos do corpo.
O teste do fator reumatoide é realizado através de uma análise de sangue, que
mede a presença e a quantidade desse anticorpo. No entanto, é importante ressaltar que
o FR não é um teste diagnóstico exclusivo para a artrite reumatoide, pois pode estar
presente em outras condições autoimunes e também em pessoas saudáveis

ASLO (ANTIESTREPTOLISINA O)

A Antiestreptolisina O é um anticorpo produzido pelo sistema imunológico em

resposta à infecção por Streptococcus do grupo A. O teste de ASLO é usado para
detectar e quantificar a presença desse anticorpo no sangue.
Quando uma pessoa é infectada pelo Streptococcus do grupo A, bactérias que
causam infecções como faringite estreptocócica ou escarlatina, o sistema imunológico
produz para combater a infecção. A Antiestreptolisina O é um desses produzidos.
O teste de ASLO mede os níveis de Antiestreptolisina O no sangue e é usado
para confirmar uma infecção recente pelo Streptococcus do grupo A. Sempre, os níveis
de ASLO começam a aumentar cerca de uma a três semanas após a infecção e podem
permanecer elevados por vários meses. Níveis elevados de ASLO indicam uma resposta
imunológica prévia à infecção por Streptococcus do grupo A.

IDENTIFICAÇÃO DE COCOS GRAM-POSITIVOS

Os cocos Gram-positivos são bactérias que exibem uma coloração violeta ou

roxa após a coloração de Gram. Essas bactérias possuem uma parede celular composta
principalmente por uma camada espessa de peptideoglicano, que retém o corante violeta
durante o processo de coloração. Após a coloração, eles aparecem como esferas ou
cocos sob um microscópio.
Com base nisso, os três grupos de maior interesse clinico são: Sthaphylococcus
(S. aureus, S. Epidermidis, S. Saprophyticus), Streptococcus (S. pyogenes, S.
pneumoniae, S. agalactiae) e Enterococcus (E. faecalis e E. Falcium). Vamos falar
brevemente sobre cada um.
- Sthapylococcus: É um gênero de bactérias gram-positivas, catalase positiva, que
inclui várias espécies. Essas bactérias têm a forma de cocos e formam aglomerados ou
grupos semelhantes a cachos.
- S. aureus: Pode ser encontrado normalmente na pele e nas mucosas das pessoas
sem causar danos. No entanto, em certas condições, pode causar uma variedade de
infecções, como infecções de pele (por exemplo, furúnculos e impetigo), infecções
respiratórias, infecções do trato urinário e até infecções graves, como bacteremia
(presença de bactérias no sangue) e pneumonia
- S. Epidermidis: É considerada parte da flora normal da pele humana. No entanto,
em certas situações, como a presença de dispositivos médicos implantados, pode causar
infecções relacionadas a cateteres, infecções de feridas e infecções do trato urinário.
- S. Saprophyticus: É considerada parte da microbiota normal do trato
gastrointestinal humano e, ocasionalmente, pode ser encontrada na flora vaginal em
mulheres saudáveis. No entanto, também é conhecida por ser um agente causador de
infecções do trato urinário em mulheres jovens sexualmente ativas.
- Streptococcus: É um gênero de bactérias gram-positivas que são caracterizadas pela
sua forma de cocos agrupados em cadeias ou pares. Essas bactérias são amplamente
distribuídas no ambiente e também podem fazer parte da microbiota normal do corpo
humano.
- S. pyogenes: Também conhecido como Grupo A de Streptococcus (GAS), é uma
das espécies mais patogênicas do gênero. Pode causar infecções na garganta, como
faringite estreptocócica (popularmente conhecida como "dor de garganta
estreptocócica"), além de infecções cutâneas, como impetigo e celulite. Também pode
causar infecções mais graves, como fascite necrosante (infecção bacteriana profunda
dos tecidos) e febre reumática.
- S. pneumoniae: Também conhecido como pneumococo, é uma causa comum de
infecções respiratórias, incluindo pneumonia, sinusite e otite média. Também pode
causar infecções invasivas, como meningite e bacteremia.
- S. agalactiae: Também conhecido como Grupo B de Streptococcus (GBS), é uma
espécie comumente encontrada na flora vaginal e gastrointestinal de muitas pessoas. No
entanto, em certas situações, pode causar infecções graves em recém-nascidos, como
sepse (infecção generalizada) e meningite.
- Enterococcus: É um gênero de bactérias gram-positivas que fazem parte da
microbiota normal do trato gastrointestinal humano e de outros animais. Essas bactérias
têm a forma de cocos e podem ocorrer em pares (diplococos) ou em cadeias curtas. São
bactérias são oportunistas e podem causar infecções em várias partes do corpo,
incluindo o trato urinário, o trato gastrointestinal, o sistema respiratório, a pele e as
feridas.
- Enterococcus faecalis: É a espécie mais comum e clinicamente relevante de
Enterococcus. Pode colonizar naturalmente o trato gastrointestinal humano e é um dos
principais patógenos encontrados em infecções associadas a cuidados de saúde, pois
pode causar infecções do trato urinário, infecções intra-abdominais, bacteremia
(presença de bactérias no sangue) e infecções relacionadas a cateteres. Essa espécie
possui uma ampla gama de resistência a antibióticos, incluindo resistência a
vancomicina em alguns casos.
- Enterococcus faecium: Também é uma espécie comum de Enterococcus associada
a infecções hospitalares. É um patógeno oportunista que pode causar infecções do trato
urinário, bacteremia, infecções intra-abdominais e infecções de feridas. Assim como
Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium também pode apresentar resistência a
múltiplos antibióticos, incluindo resistência à vancomicina em alguns casos.
A identificação precisa dos cocos Gram-positivos requer uma combinação de
técnicas microbiológicas e testes laboratoriais. Vamos começar falando sobre a catalase.

CATALASE POSITIVA

O teste de catalase, é um teste rápido que consiste em colocar uma amostra de

bactéria ou levedura em contato com o peróxido de hidrogênio (H2O2) e pesquisar a
formação de bolhas de oxigênio (catalase positiva). A função da catalase é proteger os
tecidos contra os efeitos tóxicos da água oxigenada formada durante o metabolismo
celular, uma vez que aceleram a decomposição dessa substância em H2O e O2. Quando
essa enzima se encontra na presença do peróxido de hidrogênio (H2O2) ela degrada o
mesmo, com formação de H2O e O2 onde libera oxigênio, e pode ser formado através
da formação de bolhas.
 Quando estamos diante de uma espécie de bactéria e não temos certeza se estão
arranjados em grupos/cachos ou em fileiras, montamos uma lâmina com gotas de
peróxido de hidrogênio e misturamos uma pequena porção da colônia em cada gota. Se
no momento houver bolhas, significa que estamos diante da espécie de Staphylococcus
sp. Caso não tenha a presença das bolhas, significa que a catalase é negativa e nesse
caso, estamos diante de um Streptococcus ou Enterococcus Sp.
Caso a catalase se apresente de forma positiva, faremos o teste de coagulase, que
tem como fundamento identificar qual a espécie da bactéria. Caso a coagulase também
se apresente positiva, trata-se de Staphylococcus aureus. O teste da coagulase é feito
através de uma pequena porção da colônia sobre 500ul de plasma de coelho e após
determinado tempo encubado é possível observar a formação ou não de um coágulo.
Para essa formação, a enzima converte o fibrinogênio em fibrina formando um coágulo
que atuará como proteção da bactéria contra os fagócitos e a isolando de outros sistemas
de defesa do hospedeiro.
Na coagulasse positiva, realizamos os testes de manitol e DNAse. O teste com
ágar manitol é usado como meio seletivo e diferencial para o isolamento e identificação
a partir da amostra. Se a colônia ficar amarela com as zonas amarelas, consideramos que
o manitol é positivo, se não houver nenhum crescimento, o manitol é negativo. Essa
coloração no ágar manitol acontece por ele ser indicador de pH.
O teste da DNAse que é realizado juntamente com o manitol, consiste na
inoculação da colônia em meio de cultura contendo DNA. Se houver formação de um
halo transparente ao redor das colônias após aplicação de ácido clorídrico, a DNAse se
torna positiva. Caso ela seja negativa, a superfície do meio de cultura ficará com aspecto
leitoso sem halo em volta das colônias.
Sendo a coagulasse negativa, nós fazemos o teste de sensibilização a
Novobiocina. Essa prova consiste em diferenciar cepas de S. Saprophyticus ou S.
Epidermidis. O S. Saprophyticus tem resistência conferida à Novobiocina, enquanto o S.
Epidermidis apresenta sensibilidade ao antibiótico. A técnica baseia-se em semear em
ágar Müller-Hinton a colônia que desejamos identificar com o disco da Novobiocina 5
mg. Após a incubação por 24h, podemos visualizar a formação do halo de inibição em
volta do antibiótico. Caso esse halo esteja presente, isso significa que a colônia é
sugestiva de S.epidermidis que tem sensibilidade a Novobiocina.
 Dnase e manitol Novobiocina

CATALASE NEGATIVA

Na catalase negativa podemos identificar colônias como Streptococcus e

Enterococcus.
O gênero Streptococcus é composto por bactérias esféricas ou em forma de
cadeia, que são catalase negativas. Essas bactérias são anaeróbias facultativas, o que
significa que podem crescer tanto na presença quanto na ausência de oxigênio.
Streptococcus pode ser classificado em vários grupos, com base em critérios como sua
capacidade de hemólise (alfa, beta ou gama), propriedades antigênicas e características
bioquímicas.
O gênero Enterococcus também consiste em bactérias gram-positivas, esféricas
ou em forma de cadeia. Ao contrário dos Streptococcus, as espécies de Enterococcus
são catalase negativas e têm a capacidade de crescer em meios de cultura contendo altas
concentrações de sal e bile. Além disso, as espécies de Enterococcus também podem
desenvolver resistência a múltiplos antibióticos, tornando o tratamento dessas infecções
mais desafiador.
Primeiro identificamos as hemólises, que são divididas em alfa-hemólise, beta-
hemólise e gama-hemólise.
Alfa- hemólise: A alfa-hemólise é um tipo de hemólise parcial. As bactérias que
exibem alfa-hemólise produzem enzimas chamadas de hemolisinas, que causam a
destruição parcial das hemácias. Como resultado, forma-se uma zona verde ao redor das
colônias bacterianas no meio de cultura contendo sangue. Assim que a colonia for
identificada como alfa-hemólise, fazemos a prova de sensibilidade a Optoquina que é
indicada para diferenciação entre S. pneumoniae e Streptococcus do grupo Viridans.
Após a incubação por 24h, caso seja visualizado um halo de inibição em volta da
Optoquina, podemos dizer que é sugestivo de S.pneumoniae.
Beta-hemólise: Na placa que é visível a beta-hemólise, podemos visualizar um
halo transparente em toda a placa, pois houve destruição total de hemácias pela bactéria.
Podemos dizer que é uma hemólise completa. Após a identificação da beta-hemólise,
utilizamos um disco de Bacitracina para identificar colônias como S. Pyogenes ou
Streptococcus sp. Caso seja sensível ao antibiótico, fazemos o teste de PYR para
comprovar a presença do S. Pyogenes. Caso a bactéria seja resistente, fazemos o teste de
camp para identificar a cepa do S.agalactiae.
Gama-hemólise: A gama-hemólise refere-se à ausência de hemólise. As
bactérias que exibem gama-hemólise não produzem enzimas hemolíticas e, portanto,
não causam nenhuma alteração visível nas hemácias ou no meio de cultura ao redor das
colônias bacterianas. Nessa, nós fazemos o teste no ágar bile-esculina e caso seja
positivo, realizamos o teste de MTS, porém, se for negativo, estamos diante de espécie
de Streptococcus sp. O teste da bile-esculina tem por finalidade, diferenciar
Enterococcus de Streptococcus grupo D. A presença da bile no meio de cultura inibe o
crescimento de microorganismos Gram-negativos. A hidrólise da esculina em
esculetina, reage com o citrato férico presente no meio formando um complexo negro,
que garante a diferenciação entre os dois gêneros. O MTS é um meio de tolerância ao
sal que em contato com a colônia se apresenta amarelo e turvo.
 MTS E BILE-ESCULINA PYR

UROCULTURA

A urocultura é um exame laboratorial realizado para detectar e identificar

bactérias ou outros microorganismos causadores de infecção do trato urinário. É uma
ferramenta importante no diagnóstico de infecções urinárias, permitindo a identificação
do agente causador e determinando a sensibilidade aos antibióticos.
O processo da urocultura geralmente envolve os seguintes passos:
Coleta da amostra: É coletada uma amostra de urina limpa e de meio da micção
média (após a limpeza da área genital) ou, em alguns casos, pode ser necessária uma
coleta de urina por cateterização ou punção suprapúbica.
 Inoculação do meio de cultura: A amostra de urina é colocada em um meio de
cultura específico, geralmente uma placa de Petri contendo um gel ou agar nutritivo.
Incubação: A placa de cultura é incubada em condições apropriadas de
temperatura e tempo para permitir o crescimento de quaisquer microorganismos
presentes na amostra.
Identificação e contagem: Após a incubação, os microorganismos que crescem
na placa são identificados e contados. Isso é feito por meio da análise das características
das colônias, testes bioquímicos e, em alguns casos, testes moleculares.
Teste de sensibilidade a antibióticos: Se for identificado um crescimento
significativo de bactérias na cultura, os microorganismos são testados quanto à sua
sensibilidade a diferentes antibióticos. Isso é feito expondo as bactérias a diferentes
antibióticos e observando a resposta de crescimento.
As doenças mais comuns do trato urinário são: Uretite e cistite (trato urinário
baixo) e pielonefrite (trato urinário alto).
Realizamos a urocultura em ágar cled e macconkey que possuem caraterísticas
distintas. O ágar cled é um meio de cultura rico em nutrientes e permite o crescimento
de bactérias tanto gram-positivas, quanto gram-negativas. Já o ágar macconkey, é um
meio de cultura seletivo para gram-negativo.
A urocultura é realizada com a inoculação de uma pequena amostra de urina
estriada em ágar cled e macconkey e após 24h da sua incubação, verificamos as
colonias e contamos para o laudo final. O resultado é expresso em UFC/mL.

ÁGAR CLED E MACCONKEY

ANTIBIOGRAMA

O antibiograma é um teste laboratorial realizado para determinar a sensibilidade

de uma determinada bactéria a diferentes antibióticos. O objetivo principal do
antibiograma é auxiliar os médicos na escolha do tratamento mais eficaz contra
infecções bacterianas.
O teste é realizado através da utilização dos discos contendo antibiótico no meio
de cultura estriado com a colonia de bactérias que desejamos verificar. Após a
incubação, notamos a formação de um halo de inibição, que é inversamente
proporcional a C.I.M (concentração inibitória mínima). A interpretação da
suscetibilidade se baseia na medida do halo de inibição ao crescimento bacteriano
formado ao redor do disco. As bordas do halo devem ser lidas no completo crescimento
e avaliados a olho nu, aferir o diâmetro com uma régua. Caso haja colônias dentro dos
alunos de contaminação verificar se é necessário repetir o teste.
A interpretação dos resultados se dá com base nas zonas de inibição observadas,
os resultados são interpretados de acordo com as diretrizes estabelecidas por organismos
de referência, como o Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) ou o European
Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST). Essas diretrizes
fornecem critérios para determinar se a bactéria é sensível, intermediária ou resistente a
cada antibiótico testado.