UNIDADE III

Controle de Qualidade de
Produtos Farmacêuticos

Profa. Ma. Ariane Cavalcante

 Sumário – Unidade III

1. Tópico 1: Controle Microbiológico de Produtos Estéreis:

1.1 Principais Fontes de Contaminação Microbiana;
1.2 Microrganismos de Interesse Farmacêutico;
1.3 Cinética de Morte Microbiana: Aspectos Logarítmicos;
1.4 Teste de Esterilidade.

2. Tópico 2: Controle Microbiológico de Produtos

Não Estéreis:
2.1 Amostragem, Preparação da Amostra e Diluições Seriadas
Decimais para as Análises Microbiológicas;
2.2 Teste de Limite Microbiano e Métodos de Contagem;
2.3 Pesquisa de Patógenos.

3. Tópico 3: Validação Analítica:

3.1 Principais Parâmetros de Validação;
3.2 Validação de Métodos Microbiológicos.
 Tópico 1

1. Controle Microbiológico de Produtos Estéreis:

1.1 Principais Fontes de Contaminação Microbiana;

1.2 Microrganismos de Interesse Farmacêutico;
1.3 Cinética de Morte Microbiana: Aspectos Logarítmicos;
1.4 Teste de Esterilidade.
 Introdução

 Adição intencional ou a presença acidental de microrganismos, principalmente, as bactérias

e os fungos, bem como a existência de seus subprodutos, tais como as toxinas,
em produtos manipulados.

 A contaminação microbiana de um produto farmacêutico ou correlato pode comprometer a

sua eficácia terapêutica, a estabilidade, e modificar as suas propriedades físicas e químicas,
além de ser um fator de risco para o desenvolvimento de infecções e toxinfecções.
 Principais fontes de contaminação microbiana

 Fontes diretas – entram, diretamente, em contato com o produto terminado ou quando o

produto é originado a partir de potenciais fontes de contaminação.

 Exemplos: matérias-primas; água; materiais de acondicionamento.

 Fontes indiretas – não entram em contato direto com o produto final, mas que, por atividades
inerentes ao processo, podem ser um importante risco de contaminação microbiana.

 Exemplos: equipamentos; ambiente; operadores.

 Microrganismos de interesse farmacêutico

 Os microrganismos de maior preocupação para as indústrias farmacêuticas podem ser

classificados em dois grandes grupos: aqueles que causam a deterioração do produto e
aqueles que são, potencialmente, infecciosos.

 O que determina a capacidade deteriorante de um microrganismo é a sua capacidade de

produzir enzimas que degradam as moléculas, como: açúcares, aminoácidos, proteínas etc.

No Brasil, de acordo com a Farmacopeia Brasileira, 6ª edição, os microrganismos

pesquisados são:
 Microrganismos de interesse farmacêutico

Bactérias Gram-negativas bile tolerantes:

 Enterobactérias, tais como Yersinia enterocolitica, Shigella spp., Enterobacter spp.,
Klebsiella spp. e Serratia spp.;
 Condições precárias de higiene, a manipulação inadequada durante a produção do produto
ou a contaminação do mesmo, após o seu processamento.
Escherichia coli:
 Frequentemente, é utilizada como o microrganismo indicador de contaminação fecal.
Salmonella spp.:
 As manifestações clínicas da salmonelose podem incluir a febre tifoide, as gastroenterites, as
bacteremias, entre outras complicações.
Staphylococcus aureus:
 Microbiota da pele e mucosa nasal de alguns indivíduos;
 Infecções ao nível superficial dizem respeito ao
desenvolvimento de dermatites, mastites e abscessos. Já ao
nível invasivo, S. aureus pode ser responsável por
pneumonias, osteomielite, endocardite e sepse.
 Principais fontes de contaminação microbiana

Clostridium spp.:
 Especialmente, é importante de ser pesquisado em formulações farmacêuticas, pois possui a
habilidade de formar uma estrutura de resistência denominada esporo bacteriano;
 Pode produzir toxinas como produto de seu metabolismo, resultando em doenças, como a
gangrena, o tétano, o botulismo e a intoxicação alimentar.

Candida albicans:
 Espécie de fungo pertencente à microbiota intestinal e geniturinária de grande parte
dos humanos.
 Interatividade

Baseado nos seus conhecimentos, até aqui, adquiridos, analise a sentença a seguir:
“Bactéria residente da microbiota normal do intestino de homens e animais. Cepas
diarreiogênicas ou enteropatogênicas são capazes de desencadear as doenças debilitantes do
sistema gastrointestinal que, em situações extremas, podem levar os indivíduos acometidos ao
óbito. A presença desses microrganismos é um indicativo de contaminação fecal, sendo que o
isolamento em amostras de água e produtos farmacêuticos indica a precariedade higiênica dos
processos produtivos”.
A qual microrganismo a sentença anterior está se referindo?

a) Salmonella spp.
b) Staphylococcus aureus.
c) Clostridium spp.
d) Escherichia coli.
e) Enterobacter spp.
 Resposta

Baseado nos seus conhecimentos, até aqui, adquiridos, analise a sentença a seguir:
“Bactéria residente da microbiota normal do intestino de homens e animais. Cepas
diarreiogênicas ou enteropatogênicas são capazes de desencadear as doenças debilitantes do
sistema gastrointestinal que, em situações extremas, podem levar os indivíduos acometidos ao
óbito. A presença desses microrganismos é um indicativo de contaminação fecal, sendo que o
isolamento em amostras de água e produtos farmacêuticos indica a precariedade higiênica dos
processos produtivos”.
A qual microrganismo a sentença anterior está se referindo?

a) Salmonella spp.
b) Staphylococcus aureus.
c) Clostridium spp.
d) Escherichia coli.
e) Enterobacter spp.
 Cinética de morte microbiana: aspectos logarítmicos

 Produtos farmacêuticos estéreis são aqueles que devem comprovar a ausência absoluta de
microrganismos viáveis, ou seja, aqueles capazes de se reproduzir.
 Esterilização é entendida como o processo pelo qual é possível destruir todas as formas de
vida que estariam hábeis a se desenvolver durante os períodos de conservação, e de
utilização de produtos farmacêuticos e correlatos.

 Processos são realizados com o vapor d’água sob pressão ou um gás esterilizante, como o
óxido de etileno. Quando as populações microbianas são submetidas a tais tratamentos, elas
não morrem imediatamente.
 1.000.000 células microbianas (106, em escala logarítmica) –
1 minuto, 90% da população deverá morrer.
 100.000 células (105, em escala logarítmica) mais 1 minuto,
90% destes microrganismos devem morrer.
 10.000 células sobreviventes (104, em escala logarítmica).
 Teste de esterilidade

Empregado para:
 Insumos;
 Produtos farmacêuticos; e
 Correlatos.

 De acordo com as Farmacopeias, deve garantir a esterilidade, e verifica a qualidade do

processo de esterilização empregado durante a fabricação de produtos farmacêuticos
estéreis, revelando a presença de bactérias e/ou fungos, ou confirmando a ausência
dos mesmos.
 Teste de esterilidade

Preparo da amostra:

Método indireto:
 “Método de filtração em membrana”, já que o teste é executado utilizando-se as membranas
filtrantes com porosidade de, no máximo, 0,45 μm, as quais são eficientes em
reter os microrganismos.

Ilustração de um sistema de filtração a vácuo. Fonte: livro-texto.

 Teste de esterilidade

Método direto:

 Transferência direta e asséptica de massa (em gramas) ou volume (em mililitros)

preestabelecido de amostras em um volume estipulado dos meios de cultura apropriados
(TSB e meio fluido de tioglicolato);

 Utilizando uma pipeta, espátula ou seringa, todas esterilizadas, ou, até mesmo, vertendo,
diretamente, para o recipiente contendo o meio.
 Interatividade

Sobre os testes de esterilidade, assinale a alternativa correta:

a) O método indireto é também conhecido como método de filtração em membrana.

b) O método direto utiliza a filtração a vácuo, composto por um kitassato, um funil e uma
bomba a vácuo.
c) O método direto utiliza o sistema de vácuo para o teste de esterilidade.
d) O método direto difere do método indireto somente pela mudança de meio de
cultura usado.
e) Todas as alternativas estão corretas.
 Resposta

Sobre os testes de esterilidade, assinale a alternativa correta:

a) O método indireto é também conhecido como método de filtração em membrana.

b) O método direto utiliza a filtração a vácuo, composto por um kitassato, um funil e uma
bomba a vácuo.
c) O método direto utiliza o sistema de vácuo para o teste de esterilidade.
d) O método direto difere do método indireto somente pela mudança de meio de
cultura usado.
e) Todas as alternativas estão corretas.
 Tópico 2

2. Controle Microbiológico de Produtos Não Estéreis:

2.1 Amostragem, Preparação da Amostra e Diluições Seriadas Decimais para as

Análises Microbiológicas;
2.2 Teste de Limite Microbiano e Métodos de Contagem;
2.3 Pesquisa de Patógenos.
 Introdução

 Para checar se a carga microbiana dos produtos não estéreis está dentro dos limites
estabelecidos pelas legislações vigentes, é necessário que as amostras do lote sejam
coletadas, preparadas e analisadas, de forma quantitativa e qualitativa, sendo que a
frequência de execução dos testes dependerá da origem da matéria-prima e do
produto acabado.
 Amostragem, preparação da amostra e diluições seriadas decimais para as
análises microbiológicas
Etapa 1: Pré-análise Microbiológica:
 Coletar três amostras no início, quatro amostras no meio e três ao final do processo. A
análise será realizada a partir da mistura do conteúdo de todas as amostras coletadas;
 Solubilizar a amostra em determinado diluente, sendo que o tampão cloreto de sódio-
peptona pH 7,0, o tampão fosfato pH 7,2 e o caldo caseína-soja são os mais frequentemente
recomendados pelas Farmacopeias.

Etapa 2: Pré-análise Microbiológica:

 A amostra deverá ser diluída sucessivas vezes, utilizando o
mesmo diluente usado na solubilização;
 Essas diluições seriadas são resultado de uma técnica em que
uma porção de amostra a ser analisada é diluída em uma série
de tubos contendo um volume prefixado de diluente.
 Amostragem, preparação da amostra e diluições seriadas decimais para as
análises microbiológicas
Diluição seriada:
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

Xarope expectorante

9,0 mL de
diluente

Diluições 1:10 1:100 1:1.000 1:10.000

ou 10-1 ou 10-2 ou 10-3 ou 10-4
Diluição seriada de um xarope expectorante. Fonte: Adaptado de: livro-texto.
 Teste de limite microbiano e métodos de contagem

 No Brasil, a Farmacopeia Brasileira, atualmente, em sua 6ª edição, é quem define os limites

microbianos nos produtos farmacêuticos não estéreis, sendo que tais limites podem variar
dependendo da via de administração (oral, tópica, retal, vaginal e inalatória) e do tipo de
microrganismo que pode ser encontrado (bactérias aeróbicas, fungos e patógenos).

Contagem em placas:
 Método mais utilizado para se quantificar as bactérias e os
fungos, supostamente, presentes em uma amostra. Esta
técnica leva em consideração que cada bactéria/fungo cresce
e se divide para produzir uma colônia, o que nem sempre é
verdade, pois, hoje, sabe-se que uma colônia pode, muitas
vezes, resultar não apenas de uma única célula, mas também
de agregados microbianos.

 Semeadura por profundidade (pour plate).

 Semeadura em superfície (spread plate).
Teste de limite microbiano e métodos de contagem

1 1 ou 0,1 mL 0,1 mL
Inoculação
Inoculação em 1 em uma placa
uma placa vazia.
contendo meio
sólido.

Diluição
bacteriana

2 Espalhamento
do inóculo em
2 Adição de toda a superfície.

ágar nutriente
fundido.

3
Agitação em
círculo para
homogeneizar.

3 As colônias
4 As colônias Técnicas de contagem de
crescem na crescem, apenas,
superfície e no na superfície microrganismos pelas técnicas de
interior do meio do meio. pour plate e spread plate.
solidificado.
Fonte: Adaptado de: TORTORA, G.
J.; CASE, C. L.; FUNKE, B.
R. Microbiologia, 12. ed. Artmed
Editora, 2016. p. 168.
 Teste de limite microbiano e métodos de contagem

Filtração:

 Nesse método de contagem microbiana é necessário utilizar o sistema de filtração a vácuo;

 Se houver a presença de microrganismos, os mesmos ficarão retidos na superfície da
membrana filtrante;
 Deve-se recuperar a membrana e depositá-la sobre a superfície do meio de cultura ágar
caseína-soja previamente solidificado;
 Incubar a, aproximadamente, 32,5 °C, durante três a cinco dias, para a determinação do
número de microrganismos aeróbicos totais.
 Teste de limite microbiano e métodos de contagem

Número mais provável (NMP):

 Meios de cultura líquidos (frequentemente, utiliza-se o caldo caseína-soja), utilizando vários

tubos, o que faz com que também seja conhecida como a “técnica de tubos múltiplos”.

Adiciona-se, individualmente, a amostra de forma a ter três diluições:

 1:10 (10-1);
 1:100 (10-2); 3X
 1:1000 (10-3).
 Tubos incubados a, aproximadamente, 32,5 °C, durante três
a cinco dias;
 Após esse período, anotar o número de tubos positivos e o
número de tubos negativos, ou seja, os tubos que turvaram e
os que não turvaram;
 O número de tubos positivos e negativos deve ser confrontado
com uma tabela disponibilizada pelas Farmacopeias.
 Pesquisa de patógenos

 Métodos de contagem não permitem identificar qual é o microrganismo ali presente, ou seja,
o seu gênero e a sua espécie.
Ex.:
 Bactérias Gram-negativas bile tolerantes;
 Transferência de 1 g ou 1 mL da amostra a ser avaliada para 9 mL de caldo caseína-soja;
 Incubação a 22,5 °C, por duas a cinco horas, sendo o tempo necessário para reativar
as bactérias;
 Homogeneizar essa solução e transferir 1 mL para o caldo de enriquecimento para as
enterobactérias Mossel;
 Incubar a 32,5 °C, por 24 a 48 horas;
 Cultivar a solução resultante em placas contendo ágar violeta/
vermelho neutro glicose, as quais devem ser incubadas sob a
mesma temperatura durante 18 a 24 horas;
 Se houver a presença de bactérias Gram-negativas bile
tolerantes na amostra, observar-se-á a presença de colônias
vermelhas ou avermelhadas.
 Interatividade

Em se tratando da contagem em placas, existem métodos mais utilizados para se quantificar as

bactérias e os fungos que possam estar presentes na amostra analisada.
Sabendo que existem duas maneiras de se realizar a contagem, analise as sentenças a seguir
e assinale a alternativa correta:
I. A semeadura por profundidade aplica a amostra a ser analisada na superfície do meio
de cultura.
II. A semeadura em superfície baseia-se na aplicação da amostra antes da adição do meio
líquido e a amostra é espalhada com o auxílio da alça de Drigalski.
III. Pour plate (semeadura por profundidade); spread plate (semeadura em superfície).

a) I e III estão corretas.

b) II e III estão corretas.
c) I, II e III estão corretas.
d) I e II estão corretas.
e) Somente a III está correta.
 Resposta

Em se tratando da contagem em placas, existem métodos mais utilizados para se quantificar as

bactérias e os fungos que possam estar presentes na amostra analisada.
Sabendo que existem duas maneiras de se realizar a contagem, analise as sentenças a seguir
e assinale a alternativa correta:
I. A semeadura por profundidade aplica a amostra a ser analisada na superfície do meio
de cultura.
II. A semeadura em superfície baseia-se na aplicação da amostra antes da adição do meio
líquido e a amostra é espalhada com o auxílio da alça de Drigalski.
III. Pour plate (semeadura por profundidade); spread plate (semeadura em superfície).

a) I e III estão corretas.

b) II e III estão corretas.
c) I, II e III estão corretas.
d) I e II estão corretas.
e) Somente a III está correta.
 Tópico 3

3. Validação Analítica:

3.1 Principais Parâmetros de Validação;

3.2 Validação de Métodos Microbiológicos.
 Introdução

 O Controle de Qualidade emprega grande diversidade de técnicas analíticas e, muitas vezes,

é necessário o desenvolvimento de novo método analítico, adaptação, ou a implementação
de um método já normalizado ou descrito na literatura técnica, e isso envolve um processo
de avaliação que estima as características e a sua eficiência na rotina do laboratório.
 Principais parâmetros de validação

RDC n. 166/2017:

 A validação analítica, de acordo com a Resolução anterior, como sendo a avaliação

sistemática de um método por meio de ensaios experimentais, de modo a confirmar e
fornecer as evidências objetivas de que os requisitos específicos para o seu uso pretendido
são atendidos.
Principais parâmetros de validação

A B

Precisão:
Proximidade entre os resultados obtidos.

Exatidão:
Proximidade dos resultados obtidos pelo
método em estudo, em relação ao valor Baixa Precisão Alta Precisão
verdadeiro da amostra. Alta Exatidão Alta Exatidão

C D

Precisão e exatidão. Fonte: Baixa Precisão Alta Precisão

Adaptado de: livro-texto. Baixa Exatidão Baixa Exatidão
 Validação de métodos microbiológicos

 Linearidade: método, de acordo com a RDC n. 166/2017, definido como a capacidade de

obter as respostas analíticas proporcionais de um analito em uma amostra. Deve-se
selecionar uma faixa de concentração para ser avaliada. Utilizando, no mínimo, cinco
concentrações diferentes da SQR (Substância Química de Referência) para as soluções
preparadas, pelo menos, em triplicata.
 Limite de detecção: definido como a obtenção da menor quantidade do analito presente em
uma amostra, que pode ser detectado; entretanto, não necessariamente, será possível
quantificá-lo sob as condições experimentais estabelecidas.
 Limite de quantificação: definido como a menor quantidade
do analito em uma amostra, que pode ser determinado com
precisão e exatidão aceitáveis sob as condições experimentais
estabelecidas no método analítico.
 Validação de métodos microbiológicos

 Robustez: parâmetro tipicamente realizado no desenvolvimento do método analítico que

indica a sua capacidade em resistir às pequenas e deliberadas variações das
condições analíticas.
 Estabilidade: amostras expostas à temperatura ambiente por, no mínimo, 6 horas, sob
refrigeração ou congelamento, de acordo com as condições de estocagem e tempo, em que
as amostras permanecem nessas condições. Os resultados são comparados com as
soluções recém-preparadas.
 Validação de métodos microbiológicos

Indicadores biológicos que, devido à sensibilidade diferenciada de cada tipo, foram divididos
em 6 classes:

 Classe 1: indicam se a unidade foi exposta ou não ao agente esterilizante (fita zebrada);

 Classe 2: restringe-se às autoclaves que operam com uma bomba a vácuo;

 Classe 3: são designados a reagir com um único parâmetro de esterilização,

por exemplo, a temperatura;
 Validação de métodos microbiológicos

 Classe 4: capazes de reagir, simultaneamente, com dois ou mais parâmetros críticos de

esterilização, como, por exemplo, a temperatura e o tempo;

 Classe 5: indicados para a validação de processos de esterilização que operarão com os

parâmetros de temperatura, pressão e tempo, mundialmente definidos;

 Classe 6: considerados emuladores para a temperatura específica de operação (134 °C), em

tempos específicos e predeterminados.
 Interatividade

Qual é a RDC que dispõe sobre a validação de métodos analíticos?

a) RDC n. 167, de 2017.

b) RDC n. 167, de 2007.
c) RDC n. 234, de 2018.
d) RDC n. 166, de 2017.
e) RDC n. 166, de 2018.
 Resposta

Qual é a RDC que dispõe sobre a validação de métodos analíticos?

a) RDC n. 167, de 2017.

b) RDC n. 167, de 2007.
c) RDC n. 234, de 2018.
d) RDC n. 166, de 2017.
e) RDC n. 166, de 2018.
 Referências

 BRASIL. ANVISA. Farmacopeia Brasileira. 6. ed., v. I. Brasília, 2019p.

 BRASIL. ANVISA. Farmacopeia Brasileira. 6. ed., v. II. Brasília, 2019q.
ATÉ A PRÓXIMA!