N-2482 ABR / 92

CONTAGEM DE BACTÉRIAS
REDUTORAS DE SULFATO SÉSSEIS

Método de Ensaio

Cabe à CONTEC - Subcomissão Autora, a orientação quanto à interpretação do texto

desta Norma. O Órgão da PETROBRAS usuário desta Norma é o responsável pela
adoção e aplicação dos itens da mesma.
Requisito Mandatório: Prescrição estabelecida como a mais adequada e que deve ser
CONTEC utilizada estritamente em conformidade com esta Norma. Uma eventual resolução de
Comissão de Normas não seguí-la ("não-conformidade" com esta Norma) deve ter fundamentos técnico-
Técnicas gerenciais e deve ser aprovada e registrada pelo Órgão da PETROBRAS usuário desta
Norma. É caracterizada pelos verbos: “dever”, “ser”, “exigir”, “determinar” e outros
verbos de caráter impositivo.

Prática Recomendada (não-mandatória): Prescrição que pode ser utilizada nas

condições previstas por esta Norma, mas que admite (e adverte sobre) a possibilidade
de alternativa (não escrita nesta Norma) mais adequada à aplicação específica. A
alternativa adotada deve ser aprovada e registrada pelo Órgão da PETROBRAS usuário
desta Norma. É caracterizada pelos verbos: “recomendar”, “poder”, “sugerir” e
“aconselhar” (verbos de caráter não-impositivo). É indicada pela expressão: [Prática
Recomendada].
SC - 20
Cópias dos registros das "não-conformidades" com esta Norma, que possam contribuir
Técnicas Analíticas
para o aprimoramento da mesma, devem ser enviadas para a CONTEC - Subcomissão
de Laboratório
Autora.

As propostas para revisão desta Norma devem ser enviadas à CONTEC - Subcomissão
Autora, indicando a sua identificação alfanumérica e revisão, o item a ser revisado, a
proposta de redação e a justificativa técnico-econômica. As propostas são apreciadas
durante os trabalhos para alteração desta Norma.

“A presente Norma é titularidade exclusiva da PETRÓLEO BRASILEIRO

S.A. - PETROBRAS, de uso interno na Companhia, e qualquer reprodução
para utilização ou divulgação externa, sem a prévia e expressa autorização
da titular, importa em ato ilícito nos termos da legislação pertinente,
através da qual serão imputadas as responsabilidades cabíveis. A
circulação externa será regulada mediante cláusula própria de Sigilo e
Confidencialidade, nos termos do direito intelectual e propriedade
industrial.”

Apresentação

As normas técnicas PETROBRAS são elaboradas por Grupos de Trabalho –

GTs (formados por especialistas da Companhia e das suas Subsidiárias), são comentadas pelos
Representantes Locais (representantes das Unidades Industriais, Empreendimentos de Engenharia,
Divisões Técnicas e Subsidiárias), são aprovadas pelas Subcomissões Autoras – SCs (formadas por
técnicos de uma mesma especialidade, representando os Órgãos da Companhia e as Subsidiárias) e
aprovadas pelo Plenário da CONTEC (formado pelos representantes das Superintendências dos
Órgãos da Companhia e das suas Subsidiárias, usuários das normas). Uma norma técnica
PETROBRAS está sujeita a revisão em qualquer tempo pela sua Subcomissão Autora e deve ser
reanalisada a cada 5 (cinco) anos para ser revalidada, revisada ou cancelada. As normas técnicas
PETROBRAS são elaboradas em conformidade com a norma PETROBRAS N -1. Para
informações completas sobre as normas técnicas PETROBRAS, ver Catálogo de Normas Técnicas
PETROBRAS.

PROPRIEDADE DA PETROBRAS
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| CONTAGEM DE BACTÉRIAS |
| | N-2482
| REDUTORAS DE SULFATO SÉSSEIS |
| | ABR/1992
| Método de Ensaio |
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1 OBJETIVO

Esta Norma prescreve o método para contagem de bactérias redutoras de

sulfato (BRS) sésseis em água, petróleo e seus derivados.

2 RESUMO

Corpos-de-prova (CP’s) são colocados no sistema (Nota 1) de forma a

produzirem, após um determinado tempo, colônias de bactérias aderidas
às suas superfícies. Pode-se, também, utilizar resíduos do próprio
meio, isto é, bioincrustação de tubulações e equipamentos por
exemplo. Estes são retirados do sistema, sonificados e os resíduos
obtidos da sonificação são diluídos em fluidos apropriados. As
diluições são então submetidas à contagem de bactérias redutoras de
sulfato (BRS) plantônicas conforme Norma PETROBRAS N-2463. O
resultado obtido em unidades formadoras de colônias (u.f.c.) de
BRS/100 mL é convertido ao u.f.c. de BRS/cm2 ou u.f.c. de BRS/g,
utilizando-se os dados de volume de diluição e área do corpo-de-prova
ou massa de bioincrustação, respectivamente.

Nota 1: Os CP’s podem ser colonizados em sistemas de campo (ANEXO A)

ou sistemas simulados de laboratório (ANEXO B).

3 SIGNIFICADO E USO

As BRS plantônicas ao colonizar nas superfícies de tubulações, linhas

e equipamentos tornam-se sésseis (aderidas). Face condições
adequadas, tais como: desaeração, presença de nutrientes, temperatura
e pH, reproduzem-se, podendo ocasionar danos de corrosão, deposição e
carreamento de sólidos produzidos nas reações de seus excretas com
produtos do meio, dentre outros.

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Origem: CONTEC - Subcomissão no 20 - Técnicas Analíticas de
Laboratório.
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Toda Norma é dinâmica, estando sujeita a revisões. Comentários
e sugestões, para seu aprimoramento, devem ser encaminhados à
Comissão de Normas Técnicas da PETROBRAS - CONTEC.
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Palavras-chave: bactérias - BRS - contagem - NMP - sésseis.
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4 INTERFERENTES

A inoculação de corpos de prova contendo sulfeto ferroso (FeS) pode

escurecer o meio de cultura, fornecendo resultado falso positivo.
Nestes casos, comparar a observação visual inicial com a obtida após
o tempo de incubação. Ao final de uma detecção positiva, o meio
torna-se nitidamente mais enegrecido.

5 DEFINIÇÕES

As definições de termos utilizados nesta Norma obedecem à norma

PETROBRAS N-2465.

6 NORMAS E/OU DOCUMENTOS COMPLEMENTARES

Na aplicação desta Norma é necessário consultar:

N-2282 - Segurança em testes de formação e produção na

presença de gás sulfídrico - Procedimento;
N-2462 - Detecção de bactérias redutoras de sulfato -
Método de Ensaio;
N-2463 - Contagem de bactérias redutoras de sulfato
plantônicas - Método de Ensaio;
N-2464 - Preparação de meio de cultura e de fluido para
microbiologia - Procedimento;
N-2465 - Microbiologia - Terminologia.

7 PRECAUÇÕES DE SEGURANÇA

7.1 Antes de iniciar qualquer manuseio com reagentes, materiais e

equipamentos, consultar e aplicar os procedimentos apropriados de
segurança e de operação dos equipamentos.

7.2 O ANEXO C contém algumas informações de segurança referentes aos

reagentes e produtos de reação.

7.3 Proceder ao descarte dos meios de cultura utilizados, conforme

indicado no ANEXO D.

7.4 Esterilizar todo o material utilizado, antes de ser descartado,

à temperatura de 121oC/1,1 atm, por 30 min.

8 APARELHAGEM E MATERIAIS

8.1 Agitador de tubos.

8.2 Recravadeira de selos de alumínio.

8.3 Estufa incubadora.

8.4 Selos de alumínio auto-rasgáveis para os frascos tipo

antibiótico.

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8.5 Seringas plásticas descartáveis ou seringas de vidro
esterilizadas, de 5 mL e de 1 mL de capacidade.

8.6 Bico de Bunsen ou câmara de fluxo laminar.

8.7 Autoclave para operar a 121oC/1,1 atm.

8.8 Ultra-sonificador de 40 Hz.

8.9 Placa de aquecimento.

9 REAGENTES, MEIOS DE CULTURA E SOLUÇÕES

9.1 Meio de cultura para BRS, conforme norma PETROBRAS N-2464.

9.2 Fluidos de diluição, conforme Norma PETROBRAS N-2464.

9.3 Parafina.

9.4 Solução de ácido nítrico (HNO3), 10% v/v.

9.5 Nitrogênio ultrapuro, superseco, filtrado em filtro de algodão

cardado estéril ou similar.

9.6 Fluidos de limpeza para corpos de prova preparado conforme ANEXO

E (solução de Clarke).

10 PROCEDIMENTO

10.1 Colonização em corpos de prova no campo

10.1.1 Dispositivo

O dispositivo de colonização de bactérias proposto é descrito no

desenho do ANEXO A.

10.1.1.1 Deve ser confeccionado por material cujas características sejam

compatíveis com o sistema de trabalho, isto é, o material deverá ser:
inerte ao meio e aos CP’s; resistente às pressões de teste e ao impacto; e
não maleável.

10.1.1.2 Os CP’s devem ser confeccionados por materiais idênticos ao

sistema de trabalho, geralmente aço carbono.

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10.1.2 Ponto de amostragem

10.1.2.1 A escolha do ponto para a colocação do dispositivo é de

suma importância. Sugere-se escolher aqueles que:

- não sejam próximos a joelhos, reduções ou aumentos de

linha, reunião de linhas, etc.;
- estejam situados em trechos retilíneos, cujas
características dinâmicas e de processo sejam as mais
próximas do sistema como um todo.

10.1.2.2 O dispositivo pode ser colocado à pressão do sistema

(tangencialmente) em um “by-pass” ou como alternativa, com saída à
pressão atmosférica (lateralmente).

10.1.3 Colonização

a) montar os dispositivos com os CP’s (ANEXO F);

b) escolher o ponto de amostragem e a forma de colocação
(pressão do sistema ou atmosférica). Com a válvula do
ponto de amostragem fechada, instalar o dispositivo. Abrir
a válvula e deixar fluir;
c) deixar colonizar por um certo tempo que depende do grau de
contaminação do sistema. Sugere-se 30 a 45 dias.

10.1.4 Obtenção da amostra

a) fechar a válvula de entrada de fluxo. Retirar CP’s do

dispositivo, com auxílio de uma pinça esterilizada,
evitando ao máximo a exposição ao ar;
b) abrir um frasco de diluição com fluido apropriado,
conforme a norma PETROBRAS N-2464 (Nota 2) e introduzir o
CP colonizado. Desaerar, se possível, o fluido com
nitrogênio e lacrar com rolha de borracha e selo de
alumínio. Conservar o CP sob resfriamento, aproximadamente
4oC, até o laboratório;
c) encher a cuba do ultra-sonificador com água destilada.
Imergir o frasco de diluição contendo o CP. Sonificar por
40 minutos (Notas 3 e 4);
d) abrir o frasco, retirar o CP, inocular em frasco de
detecção conforme Norma PETROBRAS N-2462 e lacrar com
rolha de borracha e selo de alumínio. Incubar por 28 dias
(Nota 5) à temperatura próxima a do ponto de amostragem
(Notas 6 e 7).
e) lacrar o frasco de diluição novamente. Homogeneizar com
agitador de tubos e proceder à contagem de BRS plantônicas
conforme Norma PETROBRAS N-2463;
f) ao final de 28 dias, verificar o crescimento no ensaio de
número mais provável (NMP) e no frasco de detecção de BRS
contendo o CP;
g) esterilizar todos os frascos e materiais utilizados no
ensaio. Descartar meios e fluidos esterilizados, conforme
ANEXO D;
h) caso o CP seja utilizado para determinação da taxa de
corrosão, retirá-lo do frasco de detecção, decapar com
solução de Clarke, neutralizar com solução saturada de
bicarbonato de sódio, lavar com água destilada, lavar com

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éter, secar e determinar a massa com precisão de 0,1 mg
conforme ANEXO E.

Nota 2: A salinidade do fluido de diluição deve ser próxima a da

amostra.

Nota 3: Para que a eficiência de sonificação não diminua, à água do

banho ultra-sonificador deve ser trocada freqüentemente
devido ao rápido aquecimento da mesma.

Nota 4: Sugere-se que não sejam sonificados mais do que dois frascos
de diluição de 50 mL contendo um CP, por vez.

Nota 5: Esse período de 28 dias pode ser reduzido conforme a

experiência do campo para um determinado meio de cultura e
para um determinado tipo de amostra e/ou com a introdução de
um sistema de agitação durante a incubação.

Nota 6: Recomenda-se que o ensaio negativo à temperatura próxima da

amostra, fora da faixa de 32 a 42oC, seja repetido a 37oC, uma
vez que o microorganismo pode se desenvolver, quando
submetido a outra condição de temperatura.

Nota 7: O ensaio de contagem deve ser feito em duplicata.

10.2 Colonização em corpos de prova no laboratório

10.2.1 Preparar um dessecador, conforme o ANEXO B.

10.2.2 Esterilizar o dessecador contendo meio de cultura, CP’s e

óleo nujol, em autoclave a 121oC/1,1 atm, por 15 min.

10.2.3 Inocular, com auxílio de uma seringa, através do orifício do

vácuo do dessecador, uma amostra que tenha apresentado detecção
positiva de BRS.

10.2.4 Promover vácuo no dessecador e agitá-lo de forma a dispersar

a amostra no meio de cultura.

10.2.5 Incubar o dessecador em estufa à temperatura próxima à da

amostra, permitindo variação de +/- 5oC (Nota 6) até que se obtenha um
biofilme sobre os CP’s.

10.2.6 Abrir o dessecador em capela, exaurindo os gases formados

(H2S)

10.2.7 Proceder como no item 10.1.4

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10.3 Bioincrustação

Na limpeza e manutenção do sistema de trabalho (tubulações,

oleodutos, equipamentos) tem-se oportunidade de se retirar amostras
de bioincrustação para detecção e contagem de BRS. Neste caso, não há
precisão quanto a uma medida de área e portanto, uma outra
referência, a de massa, deve ser utilizada.

10.3.1 Coleta de amostra

A amostra deve ser coletada em frasco estéril, sendo retirada do

ponto de amostragem por raspagem com espátula esterilizada e
reservada em frasco tipo antibiótico de 50 mL, esterilizado ou
através da sonificação de uma peça (ex.: pedaços de tubulações,
válvulas, etc.).

10.3.2 Procedimento

10.3.2.1 Amostra sólida (raspagem)

a) tomar a massa de aproximadamente 1 g da amostra;

b) introduzir a amostra em um frasco de diluição contendo
50 mL de fluido de diluição;
c) lacrar com rolha de borracha e selo de alumínio;
d) sonificar por 40 minutos em um ultra-sonificador;
e) proceder à contagem de bactérias redutoras de sulfato
(BRS) plantônicas conforme Norma PETROBRAS N-2463;
f) esterilizar todos os frascos e materiais utilizados no
ensaio. Descartar meios e fluidos esterilizados.

10.3.2.2 Peças do sistema

a) onificar a peça do sistema por 40 minutos, no ultra-

sonificador, em um frasco estéril contendo fluido de
diluição;
b) filtrar em uma membrana de 0,22 um estéril, com sua
massa previamente determinada, e descartar o fluido;
c) tomar a massa da membrana com o resíduo;
d) proceder conforme os itens 10.3.2.1.b a 10.3.2.1.f.

11 RESULTADOS

11.1 Cálculos

11.1.1 Contagem de BRS sésseis

11.1.1.1 A Contagem das BRS sésseis deve ser feita conforme equação
a seguir:

NMP p x 50
NMP s =
A

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Onde:

NMP s = NMP de BRS sésseis, u.f.c de BRS/cm2;

NMP p = NMP de BRS plantônicas, u.f.c. de BRS/mL;
A = área do CP, cm2.

11.1.1.2 O resultado da detecção de BRS no CP sonificado deve ser

informado. a fim de verificar a qualidade da sonificação a nível da
superfície do CP.

11.1.1.3 O tempo de colonização dos CP’s no sistema de trabalho deve

ser reportado.

11.1.2 Taxa de corrosão

11.1.2.1 Calcular a taxa de corrosão conforme equação a seguir:

Dm x 365 x 1.000
TC estimada = -------------------
S x t x d

Onde:

TC = taxa de corrosão, mm/ano;

Dm = perda de massa, (g);
S = área exposta da superfície do CP, mm2;
t = tempo, dias;
d = densidade do material do CP, g/cm3.

11.1.2.2 A avaliação da taxa de corrosão para sistemas em campos de

produção de petróleo, segundo a NACE RP 0775/87 fornece:

0,025 mm/ano ...................... TC baixa;

0,025 a 0,126 mm/ano .............. TC moderada;
0,127 a 0,254 mm/ano .............. TC alta;
0,254 mm/ano ...................... TC severa.

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11.1.2.3 Pode-se, para a correta avaliação da estimativa da taxa de

corrosão, ser tomado um CP preparado para uso, imergi-lo em um frasco
de detecção por 28 dias e proceder à limpeza como no ANEXO E. A
diferença de massa assim obtida é devido à exposição ao próprio meio
de cultura e funciona como um ensaio em branco, devendo ser
descontado no cálculo da taxa de corrosão.

11.1.3 Bioincrustação

Calcular conforme equação a seguir:

NMP p x 50
NMP s =
Ma
Onde:

NMP s = NMP de BRS sésseis, u.f.c de BRS/g de amostra;

NMP p = NMP de BRS plantônicas, u.f.c. de BRS/mL;
Ma = massa da amostra.

/ANEXO A

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ANEXO C - INFORMAÇÕES DE SEGURANÇA

C.1 NITROGÊNIO

- Gás comprimido sob alta pressão.

- O nitrogênio reduz a quantidade de oxigênio necessária à
respiração.
- Manter a válvula do cilindro fechada, quando não estiver em
uso.
- Não estocar cilindros em locais que não tenham ventilação
adequada.
- Usar sempre uma válvula reguladora de pressão.
- Manter a válvula redutora fechada antes de abrir a válvula do
cilindro.
- Não transferir o gás de um cilindro para outro.
- Não fazer mistura de gases no cilindro.
- Nunca deixar o cilindro cair.
- Assegurar de que o cilindro está preso no suporte.
- Não ficar na frente da saída da válvula do cilindro durante
manuseio.
- Não expor o cilindro aos raios solares e manter longe do
calor.
- Manter o cilindro longe de ambiente corrosivo.
- Não usar cilindros que não estejam identificados.
- Não usar cilindros amassados ou danificados.
- Não usar para inalação.

C.2 ÁCIDO NÍTRICO

C.2.1 Características

Líquido corrosivo, odor característico, altamente irritante e

sufocante. Em contato com a pele e os olhos causa severas
queimaduras, conjuntivite e ulceração córnea. Seus vapores podem
causar edema pulmonar, bronquite, broncopneumonia e nefrite.

C.2.2 Primeiros socorros

C.2.2.1 Em contato com a pele e os olhos, lavar em abundância e

procurar um especialista.

C.2.2.2 Em caso de ingestão, lavar completamente a boca, beber

bastante água e em seguida leite de magnésia. Procurar um
especialista.

C.2.3 EPI’s

Na manipulação, usar óculos de segurança, luvas de borracha e

avental. O uso deve ser efetuado em capela com boa exaustão. Diluir
sempre pela adição do ácido na água.

C.3 HIDRÓXIDO DE SÓDIO

C.3.1 Características

Pastilhas, escamas ou palitos deliqüescentes. Em contato com a pele e

os olhos causa queimaduras graves. Se ingerido causa severos danos e
irritações internas. Reação exotérmica com limitada quantidade de
água.
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C.3.2 Primeiros socorros

Em contato com a pele e os olhos, lavar com água em abundância. Se

ingerido, lavar a boca com água e beber vinagre ou ácido acético 1%.

C.3.3 EPI’s

Usar protetor facial ou óculos de segurança e luvas de borracha.

C.4 SULFETO DE HIDROGÊNIO (H2S)

C.4.1 H2S (gás sulfídrico ou sulfeto de hidrogênio) é extremamente

tóxico e por ser mais pesado que o ar, se acumula nas regiões mais
baixas.

C.4.2 É um gás venenoso, e dependendo da concentração é capaz de

paralisar o sistema respiratório e matar em questão de minutos.

C.4.3 O limite de tolerância de exposição ao gás sulfídrico, é de

8 ppm para uma jornada de oito horas diárias, conforme NR-15 da
Portaria no 3214 do Ministério do Trabalho.

C.4.4 É um gás hipersensibilizante, isto é, a exposição freqüente

torna o organismo cada vez mais vulnerável.

C.4.5 Em baixas concentrações tem odor forte e desagradável,

semelhante ao de ovo podre. Para concentrações entre 8 e 50 ppm,
provoca perda de olfato em até 1 hora, e problemas nos olhos e
garganta a seguir: entre 100 e 150 ppm de H2S na atmosfera provoca
perda de olfato em até 15 min., podendo causar a morte a partir de 8
horas de exposição: 200 ppm podem causar a morte do indivíduo a
partir de 4 horas de exposição. A concentração letal é de 600 ppm:
neste teor, o H2S mata em instantes.

C.4.6 O H2S age da seguinte forma sobre o organismo: quando se

respira, o H2S, através dos pulmões, entra na corrente sangüínea. Para
se proteger, o organismo oxida (queima) o H2S o mais rápido possível,
formando um composto não prejudicial. Quando a concentração aumenta,
o organismo não consegue oxidá-lo totalmente e o excesso de H2S age no
centro nervoso do cérebro que comanda a respiração, resultando na
paralisação total do sistema respiratório. Como conseqüência, os
pulmões param de funcionar, e a pessoa se asfixia.

C.4.7 O H2S queima com uma chama de coloração azulada, produzindo o

SO2, que também é venenoso, apresentando como concentração letal 1000
ppm. Entretanto, sua presença na atmosfera é mais facilmente
perceptível do que no caso do H2S, na medida em que o SO2 não atua
inibindo o olfato, mas sim provocando sufocação do homem, obrigando
ao abandono imediato do local de trabalho.

C.4.8 Consultar os procedimentos de segurança estabelecidos no ANEXO

A da norma PETROBRAS N-2282.

/ANEXO D

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ANEXO D - PROCEDIMENTO PARA DESCARTE DOS MEIOSDE CULTURA UTILIZADOS

D.1 Esterilizar a 121oC/1,1 atm, por 30 min., os frascos contendo

meios de cultura utilizados.

D.2 Injetar em cada frasco, com auxílio de uma seringa, uma

quantidade suficiente de solução de hidróxido de sódio 1N, para
precipitar todo o sulfeto.

D.3 Abrir os frascos e descartar o material, em capela, devido ao

desprendimento de gás sulfídrico (H2S) residual.

D.4 Imergir os frascos em solução detergente e, em seguida,

enxagüar. Os frascos amarelados, devido à aderência do ferro, devem
ser colocados em solução de ácido nítrico (HNO3) a 10% (v/v), e
novamente lavados com solução detergente e enxagüados. Secar em
estufa a 110oC.

/ANEXO E

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ANEXO E - PREPARAÇÃO DE CORPOS DE PROVA

E.1 REAGENTES

E.1.1 Éter etílico.

E.1.2 Bicarbonato de sódio p.a.

E.1.3 Cloreto estanoso (SnCl2) p.a.

E.1.4 Óxido de antimônio (Sb203) p.a.

E.1.5 Ácido clorídrico (HCl) p.a.

E.2 PROCEDIMENTO

E.2.1 Preparação do fluido de limpeza (solução de Clarke)

Preparar, adicionando 20 g de Sb203 e 50 g de SnCl2 em 1L de ácido

clorídrico.

E.2.2 Preparação do corpo de prova

E.2.2.1 Para corpo de prova novo

a) jatear com areia, formando uma superfície de rugosidade

uniforme;
b) limpar com éter e secar;
c) medir as dimensões do CP;
d) determinar a massa, com precisão de 0,1 mg.

E.2.2.2 Para corpo de prova usado

a) decapar com solução de Clarke;

b) neutralizar com solução de bicarbonato de sódio;
c) lavar com água destilada e com éter. Secar;
d) proceder conforme item E.2.2.1.

Nota 1: Se os CP’s estiverem armazenados em óleo lubrificante ou

“NUJOL”, antes de inserí-los no dispositivo, devem ser
lavados com éter e secados.

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