UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Curso de Graduação em Farmácia-Bioquímica

Clostridioses: patogenia, prevenção e vacinas

Caroline Marques dos Santos

Trabalho de Conclusão do Curso de

Farmácia-Bioquímica da Faculdade de
Ciências Farmacêuticas da
Universidade de São Paulo.

Orientador(a):
Prof.(a). Dr(a) Marco Antônio Stephano

São Paulo

2020
0
 SUMÁRIO

Pág.

LISTA DE ABREVIATURAS ...................................................................... 1

RESUMO .......................................................................................... 2

1. INTRODUÇÃO ................................................................................ 3

2. OBJETIVOS ................................................................................... 6

3. MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................... 6

4. RESULTADOS ................................................................................ 7

5. DISCUSSÃO ................................................................................... 7

6. CONCLUSÃO .................................................................................. 24

7. BIBLIOGRAFIA ................................................................................ 26

8. ANEXOS ....................................................................................... 32
 1

LISTA DE ABREVIATURAS

MAPA Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento

BoNT Neurotoxina botulínica

TeNT Neurotoxina Tetânica

SNC Sistema Nervoso Central

DNA Ácido desoxirribonucleico

CctA Toxina A de Clostridium chauvoei

PCR Reação em Cadeia de Polimerase

ATX Toxina alfa

CPA Toxina alfa de Clostridium perfringens

CPB Toxina beta de Clostridium perfringens

CPB2 Toxina beta-2 de Clostridium perfringens

CPE Enterotoxina de Clostridium perfringens

ETX Toxina épsilon de Clostridium perfringens

ITX Toxina iota de Clostridium perfringens

BEC Enterotoxina binária

NetB Toxina tipo beta de enterite necrótica

TpeL Toxina perfringens grande

HC High Chain (Cadeia pesada)

PLGA Poliácido glicólico-láctico

BPF Boas Práticas de Fabricação

 2

RESUMO
SANTOS, C.M. Clostridioses: patogenia, prevenção e vacinas. 2020. no. f.
Trabalho de Conclusão de Curso de Farmácia-Bioquímica – Faculdade de
Ciências Farmacêuticas – Universidade de São Paulo, São Paulo, ano.

Palavras-chave: Clostridioses, Clostridium, vacinas veterinárias, toxoides

INTRODUÇÃO: O gênero Clostridium é composto de bactérias obrigatoriamente

anaeróbicas, geralmente Gram-positivas, com mais de 200 espécies e
subespécies distribuídas na maior parte dos ambientes. Apesar da alta variedade,
apenas cerca de 20 delas têm importância como causadoras de doenças em
seres humanos e animais.O grupo de doenças causadas pelos clostrídios é
chamado de clostridioses. No campo da veterinária as manifestações mais
comuns dessas são as patogenias neurotrópicas, histotóxicas e enterotóxicas.
Todos os anos as clostridioses são motivo de grandes perdas econômicas na
pecuária, já que sua infecção pode acontecer por diversos meios de
contaminação. Devido a fatores de virulência resistentes às condições adversas, a
eliminação desses microrganismos do ambiente não é possível, sendo
fundamental a vacinação. OBJETIVO: Esta revisão da literatura aborda os
aspectos patogênicos relacionados aos clostrídios mais comuns na veterinária,
analisando suas características, prevenção e seu controle através das
vacinas. MATERIAIS E MÉTODOS: Os artigos serão selecionados pelas bases de
dados científicas mais atuais no assunto, publicados preferencialmente do período
de 2015 a 2020. A procura será realizada por palavras-chave, título e autor.
RESULTADOS: A partir da análise crítica da literatura selecionada, foi elaborado o
texto descritivo, o qual contém as informações mais atuais sobre as clostridioses.
CONCLUSÃO: A pecuária é uma das maiores áreas da economia do país,
portanto, é de interesse entender sobre as doenças que acometem os animais,
como as clostridioses, e discutir sobre as medidas profiláticas necessárias por
meio de vacinas. Espera-se assim apresentar informações mais atuais e
relevantes sobre essas questões.
 3

1. INTRODUÇÃO
Os Clostridium são pertencentes a um gênero de bactérias presentes nos
mais variados ambientes, como solos, sedimentos marinhos, produtos em
decomposição e até mesmo na microbiota animal e humana. 1 São caracterizados
como bacilos Gram-positivos, anaeróbios, formadores de esporos, incluídos no filo
dos Firmicutes, com uma variedade de aproximadamente 200 espécies
conhecidas. Apesar disso, limitam-se a 11 o número de clostrídios patogênicos
para animais.2
A descoberta das bactérias conhecidas como Clostridium aconteceu de
maneiras diversas. Em meados do século XIX um cientista germânico, chamado
Justinus Kerner (1786–1862) desejava compreender a causa de intoxicações
alimentares por salsichas e encontrou células em formato de bastão em suas
amostras. O biólogo belga Emile van Ermengem (1851–1932) encontrou estes
microrganismos formadores de esporos, que mais tarde foram classificados como
Bacillus. Somente no século XX os Clostridium foram diferenciados como
bactérias com esporos, em forma de bacilo e com metabolismo anaeróbico. 3
A definição de uma bactéria em aeróbica, anaeróbica ou facultativa
depende dos meios de reação que ela necessita para seu metabolismo. Os
organismos aeróbicos obtêm energia por carbono consumindo oxigênio e são
incapazes de sobreviver na ausência deste. Os anaeróbios, ao contrário, são
inibidos pelo oxigênio e utilizam outras substâncias para o metabolismo, pela
fermentação, por exemplo. Neste caso o oxigênio pode ser tóxico para o
crescimento, possivelmente reagindo com componentes celulares pelo potencial
de óxido-redução. 4
A patogenia depende de muitos fatores e um dos mais importantes é a
interação do Clostridium com o ambiente. Fatores ambientais determinam se a
bactéria ou seu esporo germinará e produzirá as toxinas, como um ambiente de
anaerobiose, meio nutritivo, entre outros. Por exemplo, em condições
 4

desfavoráveis a probabilidade de que o Clostridium produza esporos é maior,

podendo infectar os solos e alimentos por um período considerável de tempo. 5
Esporos são formas latentes da célula com maior resistência física. Estão
localizados no interior da célula, sendo também denominados de endosporos.
Uma vez favorável o meio para seu crescimento (no caso dos clostrídios a
ausência ou baixo teor de oxigênio e oferta ampla de nutrientes) o endósporo
germina e passa para forma vegetativa.6
Além dos endosporos, estes organismos geram as exotoxinas. Exotoxinas
são substâncias com atividade tóxica com ação longe do sítio de sua liberação.
Cada Clostridium produz uma ou mais toxinas, com diferentes potências.6
Conforme demonstrado, esses microrganismos possuem diferentes fatores
de virulência (as exotoxinas e endósporos são os fatores da patogenia).
"Clostridioses" é o nome dado ao grupo de enfermidades potencialmente fatais
causadas pelas bactérias do gênero Clostridium, as quais podem ser verificadas
em três formas: neurotrópica (botulismo e tétano), histotóxica (gangrena gasosa,
carbúnculo sintomático, hemoglobinúria bacilar) e enterotoxêmica. 7
A transmissão dos clostrídios acontece pelo contato dos esporos com
ferimentos, ingestão por alimentos e água contaminados, ou ainda em animais
com baixa imunidade (Ocasionada pelo uso de antibióticos, idade, cirurgias, outras
doenças, entre outros) os microrganismos da própria microbiota se tornam
patogênicos.8 No caso do C. botulinum ou do C. tetani o contágio acontece por
interação com as toxinas pré-formadas.7
Clostridioses neurotrópicas são divididas em Botulismo e Tétano. O
Botulismo é uma doença causada pelas neurotoxinas produzidas pelo agente
Clostridium botulinum, também conhecidas como BoNTs. Resulta em paralisia
muscular, sendo mais comuns os tipos C e D em animais. 9 O tétano é resultado da
neurotoxina tetanospasmina do C. tetani, a qual bloqueia a ação inibitória do SNC
(sistema nervoso central).10
 5

A clostridioses histotóxicas são o carbúnculo sintomático, gangrena gasosa

ou edema maligno, hemoglobinúria bacilar e hepatite necrótica. O carbúnculo
sintomático tem como agente principal o C. chauvoei, este produz cinco toxinas
diferentes e causa traumas musculares.11 A gangrena gasosa, também conhecida
como edema maligno ou mionecrose clostridial, é causada pelos agentes C.
sordellii, C. septicum, C. perfringens do tipo A e C. novyi do tipo A, sendo sua
principal característica a necrose de tecidos.12 13 A hemoglobinúria bacilar é uma
infecção que causa hemólise, cujo causador é o C. haemolyticum. O Clostridium
novyi do tipo B é responsável pela hepatite necrótica. 8
Entre as enterotoxemias, infecções do trato gastrointestinal, os principais
causadores são o Clostridium difficile, o C. perfringens dos tipos A, C. sordelli e C.
septicum.14 8 A forma clínica da doença é a diarreia, podendo ocasionar também
colite fulminante e colite pseudomembranosa.15
O diagnóstico nos casos de doenças causadas por clostrídios pode ser feito
pela análise de material biológico, como soro sanguíneo, amostra dos tecidos
lesados ou fezes. Devido à alta letalidade e a rápida incubação dos agentes,
muitas vezes o diagnóstico é feito apenas após a morte do animal, tornando
inviável o tratamento por antibióticos.7
O alto custo da morte dos animais doentes gera perdas econômicas
consideráveis. Estima-se que cerca de 500 mil animais ao ano são afetados, o que
significa uma perda de aproximadamente 1,1 bilhão de reais, 16 além da
possibilidade de um animal contaminado poder transmitir o agente aos seres
humanos, como o C. perfringens, que ocasiona em enterotoxemias graves. 8
Levando em consideração esses fatores, a profilaxia e a vacinação combinados
trariam melhor controle das doenças.
As vacinas disponíveis no mercado atual são composições bacterina-
toxoides ou somente toxoides, de diferentes espécies de Clostridium, geralmente
nas formas mono ou polivalentes, porém de métodos de produção tradicionais, os
quais podem ter inconvenientes como a infraestrutura de biossegurança, as
 6

diferenças de quantidade entre lotes, entre outros. Novos métodos têm surgido a
fim de superar essas questões, como o desenvolvimento de vacinas
recombinantes criadas por engenharia genética, ou métodos de liberação por
vetores.10 17
Para garantir a segurança e eficácia, as vacinas devem seguir, desde o seu
desenvolvimento até o produto final, uma série de leis e é vital que seu processo
seja bem controlado por testes de qualidade e siga as boas práticas de fabricação
18
(BPF) , a fim de minimizar respostas imunes indesejadas, como provocar a
doença e garantir a menor toxicidade possível.19
Dessa forma, considerando que o Brasil é o maior exportador mundial de
carnes e um dos maiores produtores agropecuários tanto de bovinos como de
outros animais, entender as doenças veterinárias é de suma importância. 20 As
clostridioses são muito comuns, sendo de notificação obrigatória 21 e de alta
letalidade. Como os tratamentos por antibióticos se tornam inviáveis, as vacinas
são a melhor alternativa como profilaxia.

2. OBJETIVO(S)
A proposta do trabalho é revisar e analisar os principais aspectos das
clostridioses veterinárias, demonstrando sua patogenia, suas formas de contágio e
de transmissão, além de seu diagnóstico.
O objetivo também é apresentar e discutir como as clostridioses podem ser
prevenidas pelo uso de vacinas, fabricadas por diversos métodos, destacando
técnicas de vacinas comerciais tradicionais e comparar com as novas tecnologias
que surgiram nos últimos dez anos.

3. MATERIAIS E MÉTODOS
Esta revisão da literatura foi feita escolhendo artigos e revisões por meio de
bases de dados científicas: PubMed, ScienceDirect, Scielo, CrossRef e por
ferramentas de busca como Google Acadêmico. O período de publicação foi
 7

priorizado de 2015 a 2020, exceto no caso de livros e artigos científicos

consolidados no tema.
A pesquisa realizada se deu por palavras-chave e termos: “Clostridial
diseases”; “Clostridium infections”; clostridioses veterinárias; “Clostridium toxoids”;
“vaccine production”, entre outras relacionadas. Primeiro o filtro utilizado foi por
título, autor e ano de publicação, seguido por análise do abstract ou resumo,
selecionando também por relevância e número de citações. Os idiomas são o
português e inglês, excluindo-se os demais.

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Levando em conta que as clostridioses são um dos principais grupos de
doenças que acometem os animais na pecuária e seu tratamento é difícil,
dependendo de ações profiláticas como a vacinação, é relevante que se pesquise
sobre seus mecanismos e manifestações. Neste trabalho serão apresentadas a
seguir as principais clostridioses que infectam animais da pecuária e suas
patogêneses, as quais passam pela classificação em neurotóxicas, histotóxicas e
enterotóxicas.

Figura 1: Clostridioses veterinárias, animais mais afetados e vacinas comerciais

Fonte: ZARAGOZA, Nicolas E. et al. Vaccine production to protect animals against pathogenic
clostridia. Toxins, v. 11, n. 9, p. 525, 2019.
 8

4.1. Clostridioses neurotrópicas

4.1.1. Botulismo
O Botulismo é uma doença causada pelas toxinas produzidas pelo agente
Clostridium botulinum, também conhecidas como neurotoxinas botulínicas ou
BoNTs.9 Elas são substâncias altamente letais e tóxicas aos humanos e animais,
causando inúmeras perdas e são potenciais armas biológicas do bioterrorismo. 8
As cepas de Clostridium botulinum e outras Clostridium que produzem
essas neurotoxinas são classificadas em quatro diferentes grupos (I a IV) de
acordo com seu metabolismo, genética e taxonomia. 22 No caso de infecções em
animais, o botulismo mais comum é causado pelo grupo III, enquanto os grupos I
e II estão mais relacionados com casos em humanos.23 9
As neurotoxinas botulínicas por sua vez, são divididas em sete tipos
diferentes de A a H, ordenadas segundo suas propriedades metabólicas e
proteolíticas ou não, nas quais os tipos C e D (não-proteolíticos) acometem
geralmente os animais e os demais em humanos, com algumas exceções. 24 25
As vias de contaminação são a exposição ambiental aos esporos que estão
presentes no solo, água e em carcaças de animais, sendo a ingestão a forma mais
comum, muitas vezes em casos de osteofagia, na qual a deficiência de fósforo faz
com que se alimentem dos ossos de animais mortos ou da própria carcaça. 26
Porém, existem episódios pontuais da entrada do microrganismo por ferimentos
expostos, no qual o esporo germina e produz as toxinas na lesão. 27
As toxinas botulínicas têm estruturas semelhantes, com duas cadeias
proteicas ligadas por ponte de dissulfeto, o que impede sua degradação pelo suco
gástrico do animal.28 29
Após colonização de Clostridium botulinum intestinal e
produção de toxinas, a BoNT realizará uma transcitose para mucosa do epitélio
intestinal. Uma vez absorvida, atinge a circulação sanguínea e tem afinidade pelos
neurônios motores da junção neuromuscular, onde impede a liberação de
 9

acetilcolina e por consequência inibe a transmissão excitatória, causando paralisia

muscular.28 30
Os sinais clínicos da doença variam de espécie para espécie, do período de
incubação e da quantidade de toxinas ingeridas. O principal sinal é a paralisia, em
aves nas asas e patas, em bovinos dificuldade para se movimentar, constipação,
fraqueza e em peixes a paralisia das barbatanas. 8
A prevalência do botulismo é maior nas aves e em ruminantes, ocorrendo
eventualmente em outros animais. 22

4.1.2. Tétano
O tétano é uma doença neurológica ocasionada pelo Clostridium tetani,
altamente fatal, ocorrendo em humanos e animais, incluindo ruminantes e
principalmente equinos, os quais são muito sensíveis a toxina tetânica. 8 A
enfermidade acontece quando feridas expostas, pós cirurgias e castrações dos
animais (ou feridas do cordão umbilical de potros) permitem o contato com
esporos do agente, que germinam em baixos potenciais de óxido-redução e
anaerobiose. 8 31
A toxina responsável pela patogênese é a tetanopasmina, ou neurotoxina
tetânica (TeNT), ainda que o C. tetani produza também a toxina tetanolisina
(formadora de poros). A TeNT é uma metaloprotease dependente de zinco, que
quando absorvida se liga aos neurônios motores inibidores do SNC e impede a
liberação dos neurotransmissores, consequentemente, provoca uma constante
contração dos músculos.30 32
Os primeiros músculos atingidos pela ação da toxina tetânica são os da
mandíbula e do pescoço (em inglês existe a expressão lockjaw), sendo um dos
sintomas mais característicos. Outros sinais clínicos são espasmos involuntários,
dificuldade de movimento, sinais neurológicos tais como agitação, ansiedade ou
depressão e convulsões.31 Curiosamente, o efeito da toxina é variável entre as
espécies, inclusive, répteis e animais de sangue frio são praticamente resistentes,
 10

enquanto que, em cavalos e pequenos ruminantes, pequenas doses já podem

resultar na rápida letalidade.8

4.2. Clostridioses Histotóxicas

4.2.1. Carbúnculo sintomático

Carbúnculo sintomático (manqueira, "mal-de-ano" ou em inglês blackleg) é
uma infecção aguda cujo agente etiológico é o Clostridium chauvoei caracterizada
pela mionecrose e alguns casos de morte súbita, acomete principalmente bovinos,
apesar de existirem casos reportados em humanos. 33 34 35
Os mecanismos da doença ainda não estão completamente elucidados,
porém o que se sabe é que o agente poderia estar como esporo alojado na
musculatura e, em uma ferida que ocasionasse um ambiente anaeróbio, haveria a
germinação e a ação necrosante das toxinas.10
O Clostridium chauvoei é uma bactéria Gram positiva formadora de esporos
e anaeróbica, muito semelhante geneticamente ao Clostridium septicum.10 Os
fatores de virulência incluem DNAse, hialuronidase, neuraminidase e flagelo. 11 35 A
toxina A de C. chauvoei (CctA), da família das leucocidinas, é apontada como
responsável pela atividade citotóxica e hemolítica, sendo seu modo de ação
formar poros na membrana celular e por consequência a lise. 33
Devido a rápida patogênese em muitos animais não há sinais clínicos
aparentes, encontrados apenas após a sua morte. Nos casos semi-agudos ainda
podem apresentar letargia, prostração e como já citado nos casos miocárdicos
ocorre a morte súbita. O principal diagnóstico é identificação do agente por PCR
em amostras de tecido muscular lesionado.36
Estudos analisaram o impacto econômico do carbúnculo sintomático para
pequenos fazendeiros nos países de Laos e Etiópia, demonstrando perdas
financeiras consideráveis, o que já se mostrava no mundo todo. 37 38 Além do fator
 11

econômico, por se alastrar rapidamente, não é viável o uso de antibióticos, então

medidas profiláticas são necessárias para mitigar e impedir a morte dos animais.
A melhor medida profilática é a vacinação, já que o manejo animal, como
trocar o ambiente e a silagem, isoladamente não demonstra resultados
suficientes.39 A produção da vacina contra o C. chauvoei é feita a partir de massa
bacteriana inativada, uma vez que os mecanismos das toxinas e quais atuam
exatamente não estão claros.30

4.2.2. Gangrena gasosa

A gangrena gasosa é infecção que causa necrose dos tecidos moles,
podendo ter como agentes bactérias anaeróbicas como C. septicum, C. novyi, C.
perfringens, C. sordelli, entre outras. Pode acometer ruminantes, cavalos e
humanos, com poucos casos em outros animais. Assim como no carbúnculo
sintomático pouco se sabe sobre a patogênese, mas acredita-se que seja
ocasionada pela presença da forma vegetativa ou de esporo que germina e entra
por meio de feridas expostas e pós cirúrgico de castração. 13
Mundialmente o agente mais comum é o Clostridium septicum,8 logo após o
C. perfringens do tipo A, que será discutido posteriormente. O C. septicum é uma
bactéria formadora de esporos, com motilidade e possui maior aero tolerância em
relação as demais espécies.13 Seu principal mecanismo de virulência é a toxina
alfa (ATX), da família das aerolisinas, cujo efeito é formar um poro na bicamada
lipídica; é hemolítica e altamente letal. 30 Além de gangrena gasosa este agente
pode causar a doença chamada "Braxy", caracterizada por necrose do abomaso
em ruminantes.40
Os sintomas da gangrena gasosa nos animais vivos são fraqueza,
prostração, cianose ocular, taquicardia, taquipneia. Porém, na maioria das vezes,
a infecção é aguda e rápida levando o animal a morte, sendo o diagnóstico pela
análise do tecido necrosado, com observações macroscópicas de edema e
enfisema e microscópicas evidenciando a presença de infiltrados com os bacilos. 13
 12

É a clostridiose com maior taxa de mortalidade, geralmente aguda e por

isso de difícil tratamento. O manejo dos animais pode auxiliar na profilaxia,
aumentando a higienização nas técnicas de castração ou nas cirurgias, ainda que
a vacinação seja o ideal.10

4.2.3 Hemoglobinúria bacilar

O Clostridium haemolyticum, ou C. novyi do tipo D, é o causador desta
clostridiose. A patogênese é mais comum em bovinos e poucos casos em ovinos,
sendo a distribuição geográfica variada com aumento de episódios em solos
próximos a rios ou úmidos.8 41 O modo de ação do agente se dá quando o animal
ingere o alimento contaminado com o esporo e há um intermédio da Fascíola
hepática, na qual as larvas deste verme causam danos ao tecido do fígado e um
ambiente de anaerobiose, favorecendo a germinação do C. haemolyticum.7
O C. haemolyticum é muito semelhante ao C. novyi do tipo B, este causador
da hepatite necrótica. É uma bactéria formadora de esporos e anaeróbia e sua
patogênese se deve a toxina hemolítica beta, conhecida como fosfolipase do tipo
C, cujo mecanismo é causar lise dos hepatócitos, levando a agregação plaquetária
e aumento da permeabilidade vascular.42 10
Os sintomas em estados subagudos são em consequência da anemia,
como fraqueza e febre, porém, na maioria dos casos o animal já é encontrado
morto, sendo o diagnóstico a análise de fragmentos hepáticos danificados. 8

4.2.4 Hepatite necrótica

A hepatite necrótica (black disease) é muito semelhante a hemoglobinúria
bacilar, já que o Clostridium novyi do tipo B é próximo do C. haemolyticum, sendo
diferenciada apenas pelos achados histológicos e a anemia hemolítica que não
ocorre na hepatite necrótica.41 É mais comum em ruminantes e altamente letal em
ovelhas.8
 13

Assim como na hemoglobinúria, a patogênese depende de agentes como a

Fascíola hepática ou ainda o Cysticercus tenuicollis, os quais facilitam a migração
dos esporos ingeridos para o fígado nas células de Kupffer. O principal fator de
virulência é a toxina alfa, da família das citotoxinas clostridiais, cuja ação é
interagir com as proteínas de actina do citoesqueleto afetando a conformação da
célula. Apesar da forma vegetativa de C. novyi do tipo B também produzir certa
quantidade de beta toxina.40 10
Os sintomas agudos da doença incluem isolamento e a não movimentação
do animal, com aumento de temperatura corporal. Ainda assim, na maioria dos
casos o curso da doença é a morte em algumas horas, em ruminantes de um a
dois dias, nos casos superagudos os animais não apresentam sintomas e são
encontrados já falecidos e com a necrose.40

4.3. Enterotoxemias
O Clostridium perfringens, entre os Clostridium, é o que produz maior
quantidade e variedade de toxinas, sendo um dos principais causadores de
enterotoxemias, assim como enterites hemorrágicas, além do Clostridium difficile.
Por mecanismos ainda não muito conhecidos, em condições ideias como
estresse, há uma predisposição para seu crescimento e produção de toxinas
letais. A doença é descrita como lesões necróticas com presença de hemorragia
no intestino do animal. A prevalência varia de espécie e de tipo de cepa. 44
O C. perfringens é uma bactéria anaeróbia, fermentadora, formadora de
esporos encontrada na microbiota natural de seres humanos e animais. A sua
classificação é feita de acordo com as toxinas produzidas, variando do tipo A ao E
(mais recentemente foram acrescentados os tipos F e G) 43, resumidos na Tabela
1, baseado na presença dos genes para toxina alfa, beta, épsilon e iota, existindo
ainda outras como perfringolisina O, enterotoxina (CPE), enterotoxina binária
(BEC), toxina tipo-beta de enterite necrótica (NetB), toxina perfringens grande
(TpeL) e toxina-beta2.44 45
 14

O C. perfringens do tipo A está relacionado com casos em mamíferos,

principalmente, porém nada foi comprovado que possa causar diretamente as
enterotoxemias, visto que é normalmente encontrado na microbiota de animais
saudáveis.8 A toxina que mais produz é CPA, porém estudos mais atuais
mostraram a produção de NetF em cães, que pode ser a responsável por casos
de gastroenterites.
O tipo B tem como maiores fatores de virulência as toxinas beta (CPB) e a
épsilon (ETX). Esta última também é secretada pelo C. perfringens do tipo D e é o
causador de enterotoxemias em ovinos e bovinos, sobretudo em recém
nascidos.43
A ETX é da família das aerolisinas, é ativada por proteases do trato
gastrointestinal do animal, onde realiza seu mecanismo de formação de poros,
promovendo lesões cerebrais e de outros tecidos, além de aumentar a
permeabilidade vascular.46
Infecções com C. perfringens do tipo C tem como responsável pelas lesões
nos tecidos a toxina CPB, seu maior fator de virulência. Além dela, algumas cepas
produzem a CPA, CPB2 e CPE.43 O mecanismo de ação consiste em formar poros
na membrana, acarretando em danos no epitélio intestinal e necrose. Possui
estrutura semelhante as toxinas alfa hemolisina e gamma hemolisina de
Staphilococcus e é tripsina sensível. Atinge principalmente recém-nascidos
causando enterite necrótica, em especial filhotes de porcos. 47 43
A toxina ETX é majoritariamente produzida pelo C. perfringens do tipo D, o
qual ainda produz as toxinas CPA, CPE e perfringolisina O. A pró-toxina ETX entra
no animal geralmente pela alimentação, no caso de ruminantes pela ingestão de
carboidratos não digeríveis, os quais fermentam e favorecem o crescimento do
perfringens. Este tipo de C. perfringens está muito associado a enterotoxemias em
gado, caprinos e ovinos.43
 15

Tabela 1: Tipos de Clostridium perfringens, toxinas e fatores de virulência

Fonte: Adaptado de ZARAGOZA, Nicolas E. et al. Vaccine production to protect animals against
pathogenic clostridia. Toxins, v. 11, n. 9, p. 525, 2019.

4.4. Vacinas
As vacinas têm sido utilizadas como prevenção por séculos. O seu
nascimento se deu a partir da observação de casos de varíola no século XVIII,
onde os achados em animais eram mais leves em relação ao de humanos. Um
cientista da época, chamado de Edward Jenner, resolveu então inocular parte dos
fragmentos de animais nos braços das pessoas, a chamada variolação. Ele
originou, dessa forma, o princípio da vacina, que nada mais é do que a inoculação
do agente infeccioso morto, atenuado ou um elemento deste, sem que cause a
doença, mas gere resposta imune.48
Anos mais tarde se iniciaram as primeiras formas de vacinas, porém, de
baixa potência e sem controle rígido de pureza. Conforme o desenvolvimento de
novas tecnologias e com as novas descobertas de agentes etiológicos tornou-se
mais viável a produção de vacinas seguras tanto para os seres humanos quanto
para os animais, domésticos e da pecuária.48
A principal função das vacinas é promover uma resposta imune de longo
prazo no organismo e, pela imunização de vários indivíduos, o bloqueio das
infecções e infestações na população. Na resposta imunológica, o ideal é que o
antígeno apresentado leve a um reconhecimento efetivo pelo sistema imune, com
 16

proliferação de células T e de células B ou plasmócitos (são células de memória

produtoras de anticorpos específicos contra aquele determinado patógeno),
responsáveis pela imunidade humoral.49
Uma vacina eficiente é aquela que gera resposta imune suficiente com o
mínimo de efeitos adversos. Para esse fim são discutidos cada vez mais sobre
quais componentes devem ser acrescentados e quais as melhores tecnologias e
meios para aumentar sua potência.49
Existem diferentes tipos de vacinas produzidas, utilizando um único agente
sendo monovalente ou mais de um, as vacinas polivalentes. Além disso, existe a
classificação das vacinas do mercado veterinário em inativadas, as quais
dependem de uma inativação do antígeno por agente químicos, como formaldeído
e geralmente precisam de adjuvantes; vivas atenuadas, que passam por processo
de atenuação com formalina, que apesar de gerar uma resposta celular e humoral
efetiva tem riscos quanto a reativação do agente; subunidades de membrana
celular; ou ainda, as recombinantes, estas, que utilizam de engenharia genética
para produzir apenas fragmentos que induzam uma imunidade. 50
O uso de antibióticos, como já visto, não é efetivo no tratamento das
infecções bacterianas em animais, porque comumente são doenças agudas, as
quais causam morte súbita ou pouco depois da incubação. Além desse fator,
pode-se considerar também a alta nos casos de bactérias resistentes aos
tratamentos, que se agrava não somente aos animais como humanos. Somando
esses fatores, a vacinação é a ação profilática mais adequada, principalmente
também, porque infecções bacterianas, como as clostridioses, provocam grandes
perdas financeiras na pecuária.51 52
As vacinas contra clostridioses no mercado brasileiro e internacional são,
em sua maioria, polivalentes, abrangendo todas as doenças já apresentadas.
Podem ser apenas por toxoides, ou ainda um conjunto toxoide e massa
bacteriana. A sua produção segue uma série de processos, começando pela
"semente" do organismo, armazenada em nitrogênio líquido e desta, uma amostra
 17

é utilizada para uma pré-cultura. Em escala industrial é feita a fermentação da

cultura em tanques. Os microrganismos em condições de anaerobiose vão gerar
as toxinas, que posteriormente serão inativadas e purificadas, para então se tornar
um toxoide. O antígeno é concentrado e acrescentado a um adjuvante. 18
Primeiramente, a criação e concepção das vacinas veterinárias passavam
por modificações dos meios de cultura com novas técnicas, aperfeiçoamento da
inativação e do uso de adjuvantes. Atualmente, as abordagens para o
desenvolvimento de novas vacinas são o uso de técnicas da biologia molecular
como mapeamento genômico e demais “ômicas” para descobrir novos antígenos,
além de tecnologias para melhor purificação e sistemas de liberação controlada. 50
Dessa forma, há sempre a relação entre o tradicional e o novo, que será discutido
com ênfase nas vacinas contra costridioses, resumidas na Tabela 2.
 18

Tabela 2: Resumo das clostridioses, agentes, toxinas, vacinas comerciais e

recombinantes.

Fonte: Adaptado de ZARAGOZA, Nicolas E. et al. Vaccine production to protect animals against
pathogenic clostridia. Toxins, v. 11, n. 9, p. 525, 2019.
 19

As vacinas comerciais de toxoide tetânico, por exemplo, ainda são

produzidas por métodos tradicionais, mas passaram e ainda passam por
pesquisas de melhorias na formulação, dosagem, adjuvantes e tecnologias de
produção.53 No que se refere ao seu adsorvente, o hidróxido de alumínio, há certa
tendência de substituição, já que existem efeitos adversos, como inflamação local,
granulomas e hipersensibilidade.54
Há indícios que o hidróxido de alumínio induza eosinófilos, os quais liberam
anticorpos IgE, a mesma resposta que ocorre em alergias. O hidróxido de alumínio
na sua forma cristalina tem como vantagens a alta resposta de células Th2 e
ativação do sistema complemento, o baixo custo e a boa adsorção, a qual se
mostrou mais efetiva do que o de fosfato. Porém, muitas desvantagens também
são apontadas, tais como os efeitos adversos já citados e principalmente, o fato
54 55
de não poder ser liofilizado ou congelado.
Contudo, os sais de alumínio têm sido utilizados como adjuvantes por mais
de 70 anos, nas suas diferentes formas. 56 O uso destes adjuvantes é necessário
para intensificar e modular a resposta imune que se deseja. O propósito é que
melhorem a resposta celular e humoral, aumentando o tempo de ação da vacina,
evitando o uso de mais doses; podem também aprimorar a resposta em indivíduos
imunocomprometidos e, finalmente, auxiliar no carreamento da forma nativa do
antígeno.54
Outra melhoria na vacina seria o encapsulamento do toxoide tetânico em
um sistema de liberação controlada. Em 1999, Maria Alonso 57 elaborou uma
vacina com a co-encapsulação da toxina tetânica por microesferas de poliácido
glicólico/láctico (PLGA), o qual facilitaria a diminuição de dosagens necessárias,
que só ficou comprometida pela instabilidade da toxina.57
Segundo Wenlei Jiang e Steven P. Schwendeman, 58 o toxoide encapsulado
por PLGA adicionado a excipientes (estabilizadores como a lisina) seria mais
estável. Eles demonstraram, a partir de uma série de experimentos, que a vacina
encapsulada com microesferas leva a liberação contínua do antígeno e aumenta a
 20

imunogenicidade. Além disso, sabe-se que a encapsulação do toxoide tetânico por

microesferas apresenta a vantagem da administração via nasal, a qual alcança
vias sistêmicas onde a toxina isolada não atinge. 53 54
A produção de toxoide botulínico segue os mesmos processos do tetânico,
com a inativação por formaldeído e o uso de adjuvantes. Seja na indústria de
cosméticos ou veterinária, existem desvantagens na forma tradicional de
produção, já que a toxina botulínica é um dos produtos biológicos mais perigosos
ao ser humano e muitas vezes a quantidade produzida é baixa, sem uma
consistência de quantidades exatas. Assim, as pesquisas por vacinas
recombinantes têm se difundido a fim de minimizar essas situações, ainda que a
metodologia tradicional seja efetiva.51
As vacinas recombinantes contra o botulismo podem ser realizadas por
diferentes estratégias de engenharia genética como por vetores de DNA
(plasmídeos ou virais, por exemplo), porém não existe nenhuma em estágio
comercial nem para humanos nem para animais. 59 O desenvolvimento destas
depende de fatores como a escolha da parte estrutural, como produzir em larga
escala, processos de purificação e controle da vacina. Com relação a estrutura, as
neurotoxinas têm um arranjo semelhante, são compostas pelas cadeias leve (L) e
pesada (H), ligadas por uma ponte de dissulfeto.
Apesar disso, existe certa heterogeneidade entre as neurotoxinas, o que faz
com que as vacinas sejam específicas para cada sorotipo. 60 Os protótipos de
vacinas de neurotoxinas do tipo C e D são baseados em H, que contém a porção
C-terminal (HC), o qual é responsável por se ligar ao receptor. 29
Webb et al.60, estudaram a resposta de camundongos as vacinas
recombinantes de rBoNT/C Hc e rBoNT/D HC, construídas por expressão em
Pichia pastoris tanto nas formulações monovalentes como bivalentes, a fim de
verificar as diferentes ações protetoras de cada uma. Com uma amostra de
camundongos, o experimento consistiu em vacinar um grupo com as
 21

recombinantes e outro com controle e algumas semanas depois ambos os grupos

foram desafiados com a inoculação das neurotoxinas puras.
Após o procedimento foram feitos testes de quantificação dos antígenos por
ELISA. No resultado obtiveram alguns problemas quanto a purificação da proteína
de BoNT/C1 Hc, que permaneceu com uma cadeia adicional de 22 aminoácidos e
BoNT/D Hc, a qual também continuou com uma parte truncada. Apesar disso,
concluíram que as vacinas monovalentes de rBoNT/C Hc e rBoNT/D Hc foram
efetivas contra as toxinas C e D, e, além disso, houve total proteção nos
camundongos vacinados pela combinação bivalente, validando a eficácia das
formulações.
Moreira61 discutiu possíveis opções de expressão de antígenos contra o
botulismo, pela análise de HC expresso por Escherichia coli e P. pastoris,
observando os critérios de cada um para determinar a viabilidade de uma
produção em larga escala.
Nos casos de expressão por E. coli, os produtos poderiam ser de dois
estados da proteína, na forma solúvel ou insolúvel. As solúveis teriam preferência
por serem mais imunogênicas, apesar de requererem uma purificação mais
intensa. A proteína recombinante então seria purificada por cromatografia de
afinidade e, como algumas espécies apresentaram baixa imunização pela dose de
antígeno, poderiam ser adicionados adjuvantes, preferencialmente hidróxido de
alumínio, já que vacinas com adjuvantes oleosos poderiam ter efeitos adversos
com resposta inflamatória.
Agora, comparando a expressão por P. pastoris, houve produção de
proteínas solúveis, com o porém da dificuldade na lise da célula, encarecendo
uma produção em larga escala. Portanto, a expressão por E. coli se mostrou mais
vantajosa pelo menor custo e porque ambas necessitam de etapas de purificação.
No Brasil, Cunha et al51 desenvolveram uma quimera recombinante com a
cadeia pesada Hc de BoNT combinada a porção termolábil de enterotoxina B de
E. coli, adicionada a hidróxido de alumínio como adjuvante. Uma amostra de 21
 22

bois Nelore foi dividida em três grupos, o primeiro imunizado com a vacina
recombinante, o segundo com a vacina comercial bivalente dos toxoides do tipo C
e D, e finalmente, o terceiro grupo com o controle de solução salina.
A prova de soro neutralização demonstrou que os títulos da vacina quimera
foram de 5 e 6 UI/mL contra os sorotipos C e D, respectivamente, pouco acima
dos títulos das vacinas comerciais (5 +-0 e 2.85 +- 1.35 UI/mL) e a quantidade de
anticorpos produzida foi semelhante entre os grupos vacinados com a
recombinante e a comercial. Concluindo-se que os exemplos de vacinas
recombinantes podem ser efetivas contra o botulismo (sorotipos C e D, no caso de
animais) e diminuir os riscos de biossegurança e outros problemas dos métodos
tradicionais.51
As vacinas comerciais contra o C. perfringens são uma combinação das
toxinas ETX, CPA e CPB na forma de toxoides ou toxoides e massa bacteriana,
polivalentes, apenas no campo veterinário, já que não existem vacinas aprovadas
para humanos. A imunização evita as doenças mais comuns ocasionadas por
este, como a gangrena gasosa e Enterotoxemias. 10 A produção da vacina começa
pelo crescimento dos diferentes microrganismos (C. perfringens do tipo B, C e D),
como os demais, as toxinas são inativadas por formaldeído e a imunização ocorre
geralmente em mais de uma dose. Os lotes passam então por teste de controle de
pureza, toxicidade e eficácia.62 10
Não existe ainda nenhum protótipo ou vacina comercial contra as toxinas
ITX, CPE ou A NetB, porém cresce a quantidade de pesquisas sobre possíveis
candidatos de vacinas recombinantes de uma ou mais toxinas, principalmente no
que se refere a ETX. Embora os métodos de produção das vacinas tradicionais
obtenham o nível de anticorpos desejado, há desvantagens como grandes
diferenças entre as potências dos lotes produzidos, riscos relacionados a
biossegurança e resíduos do processo que possam permanecer no produto final. 63
Em 2016, Moreira et al64 elaborou uma formulação trivalente de vacina
recombinante contra as toxinas alfa, beta e épsilon de C. perfringens. A expressão
 23

foi realizada em Escherichia coli BL21, onde os antígenos de rAlfa, rBeta e

rÉpsilon foram purificados e adicionados a hidróxido de alumínio como adjuvante.
As medidas de soro neutralização apresentaram resultados acima do esperado,
com títulos maiores em relação ao mínimo pretendido pela legislação e em relação
as vacinas comerciais, além da quantidade superior de anticorpos. A imunização
foi feita em esquema de duas doses em coelhos e posteriormente os
pesquisadores imunizaram outras espécies de bovinos, ovinos e caprinos, os
quais também reforçaram os resultados posteriores, com títulos de 1.19, 3.71 e
10.74 UI/mL para as toxinas alfa, beta e épsilon, respectivamente, no caso dos
bovinos.64
O uso de vacinas recombinantes a partir de E. coli tem como vantagens não
necessitar de um processo de produção tão trabalhoso em relação ao C.
perfringens, a não necessidade de inativação das toxinas por formaldeído, o qual
pode deixar resíduos no produto final, fora o menor risco com biossegurança
relacionado ao C. perfringens. Contudo, não significa que vacinas recombinantes
por E. coli possam ser implementadas na indústria veterinária, já que deve-se
analisar o custo benefício, por precisar de tecnologias muitas vezes específicas
para purificação dos antígenos, ainda, a produção se limita a alguns antígenos,
diferente da tradicional, que pode conter vários em uma formulação. 63
Na literatura mais recente em 2017 e 2019, o grupo de Alimolaei 65 e Wilde66
respectivamente, apresentaram dois diferentes estudos sobre vacinas contra C.
perfringens, particularmente contra enterite necrótica, por dois diferentes meios de
liberação, um por um probiótico Lactobacillus casei e o segundo por Salmonella.
No primeiro, criaram uma cepa recombinante de L. casei que expressava o
alfa toxoide e esta, então, foi inoculada em camundongos BALB/c por via oral,
estes depois colocados em contato com a toxina alfa. O resultado observado foi
maior taxa de sobrevivência entre os animais vacinados em comparação ao grupo
controle e a confirmação da resposta imune na mucosa. O uso de L. casei como
 24

vetor teria como vantagens sua segurança, ação adjuvante e a necessidade de

menos doses na imunização.
No experimento de Wilde, a estratégia foi utilizar uma vacina atenuada de
Salmonella que carreasse três antígenos, sendo a alfa toxina, a NetB (ambos
baseados em C. perfringens) e uma enzima metabólica, a frutose-1,6-bifosfato
aldolase (Fba), a qual demonstrou ter relação na virulência. A imunização foi em
frangos de um dia de idade, em grupos do tipo Cornish e Rock, livres de
Salmonella, separados entre os que foram inoculados por via oral com a vacina e
o grupo controle. O desafio foi induzir as aves a enterite necrótica por uma cepa
virulenta de C. perfringens na ração. Os resultados mostraram que o modelo de
lise de Salmonella para liberação dos antígenos gerou boa resposta imunológica,
com produção de anticorpos na mucosa e resposta celular. 65 66
Finalmente, o processo de produção das vacinas, sejam elas por métodos
convencionais ou não, deve ser regulamentado e licenciado pelas agências
responsáveis.18 No Brasil, a agência que regulamenta vacinas veterinárias é o
Ministério da Agricultura, de Pecuária e Abastecimento (MAPA), o qual determina
por instruções normativas todos os testes a serem realizados para cada tipo de
formulação, como os testes de título e anticorpos.
Ainda, as vacinas passam por um controle de qualidade rígido e devem seguir as
Boas Práticas de Fabricação (BPF).

6. CONCLUSÃO(ÕES)
No ramo das vacinas contra clostridioses, ainda há muito o que se
melhorar, principalmente referente a novos métodos de desenvolvimento e
produção, já que a maioria dos agentes têm riscos de biossegurança na
fabricação e grandes diferenças entre lotes, representando desvantagens do
processo tradicional.
Como demonstrado, as vacinas recombinantes e novos métodos de
liberação são possíveis oportunidades de transpor essas limitações. Ainda podem
 25

ter como vantagem requerer menos métodos de "downstream", ou seja, das fases
de purificação do antígeno, uma vez que a produção por recombinantes
conhecidas como E. coli ou P. pastoris conseguem um nível de antígeno
purificado melhor em relação ao tradicional e também têm uma quantidade de
produção estabelecida.
No entanto, os métodos tradicionais ainda são eficazes e de bom custo-
benefício, enquanto que as vacinas recombinantes podem encarecer o custo de
uma produção em larga escala, porque exigem tecnologias mais caras. Ainda
assim, inovações surgiram nas últimas décadas, como a proposta de vacinas de
liberação controlada por meio de probióticos, no protótipo de L. casei para
liberação de alfa toxina do C. perfringens, as quais podem ser interessantes pela
fácil administração (pela alimentação ou via nasal) e efetividade na produção de
anticorpos.
Na situação atual, o Brasil é um dos maiores produtores e exportadores
mundiais de carnes, dependendo da agropecuária para o crescimento da
economia. As clostridioses causam perdas financeiras consideráveis nessa área e
podem ser evitadas por medidas simples de manejo e vacinação. Por
consequência, é primordial entender a patogênese destas doenças e conhecer a
produção das vacinas comerciais, a fim de planejar melhorias no desenvolvimento
de vacinas mais efetivas, de custo acessível e que sigam os critérios de
legislação.
 26

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66. WILDE, Shyra et al. Salmonella-vectored vaccine delivering three Clostridium

perfringens antigens protects poultry against necrotic enteritis. PloS one, v. 14,
n. 2, p. e0197721, 2019.
67. WOUDSTRA, Cedric et al. Neurotoxin gene profiling of Clostridium botulinum
types C and D native to different countries within Europe. Applied and
environmental microbiology, v. 78, n. 9, p. 3120-3127, 2012.

8. ANEXOS

03/11/2020
____________________________ SP, 04/11/2020
____________________________
Data e assinatura do aluno(a) Data e assinatura do orientador(a)