Resumo PL Bioquímica

1. Colorimetria: observação da lei de Lambert-Beer

Método que permite detetar e As moléculas

quantificar substâncias que existem em É possível porque: possuem um espectro
pequenas quantidades numa mistura de absorção
complexa característico

Lei de Lambert-Beer: A   dC ,
 A-absorvância da solução a um determinado comprimento de onda
  -coeficiente de extinção molar (parâmetro característico da
substância a um comprimento de onda definido)  M-1.cm-1
 d-percurso ótico (distância percorrida pela luz quando atravessa a
amostra, normalmente 1 cm (largura da cuvette))  cm
I  C-concentração da substância  M
Transmitância=
I0
1
Absorvância= log
T A lei não é aplicável quando:
I0-radiação incidente  Se aumenta a concentração da substância (as moléculas começam
I-radiação a reagir entre si)  desvios à linearidade
transmitida  O valor da absorvância são muito grandes, a radiação emitida é
muito pequena  os valores de A registados são inferiores aos previstos
a essas concentrações.
 A molécula que está a absorver sofre alterações das suas
propriedades (pode sofrer agregação, degradação ou alterar o seu estado
de ionização)  há uma alteração do 

Objetivo: Determinar o intervalo de concentrações do azul de bromofenol e

correspondentes valores de absorvância nos quais se observa a lei de Lambert-Beer. Observar a
variação do coeficiente de extinção molar quando as características da substância variam.

Nota: O comprimento de onda utilizado foi de 590 nm pois é onde ocorre o pico de
absorvância do azul de bromofenol (absorve no vermelho  surge como azul)

Figura 1 - Espetros de absorção de soluções de azul bromofenol

 Procedimento:
1. Fazer as seguintes soluções: Tampão fosfato 0,01 M + Azul de bromofenol 2,0x10-4
M, 1,0x10-4 M, 3,0x10-5 M, 8,0x10-6 M, 6,0x10-6 M, 4,0x10-6 M e 2,0x10-6 M.
2. Determinar a absorvância do solvente (tampão fosfato 0,01 M, pH 7), ao
comprimento de onda escolhido (590 nm).
3. Determinar a absorvância das várias soluções ao mesmo comprimento de onda,
começando pela mais diluída.
4. Selecionar uma das soluções com uma absorvância próxima de 1 e colocá-la numa
cuvette. Adicionar uma gota de ácido clorídrico 1 M e misturar bem. Ler a absorvância e
seguidamente medir o pH da solução com papel indicador de pH.

Resultados:

4,5
4 y = 16740x + 0,4809
3,5 R² = 0,7908

3
2,5
Abs

2
1,5
1
0,5
0
0 0,00005 0,0001 0,00015 0,0002 0,00025
[Brom]/M

Nota: r2=0,7908  Houve erros  Erro na autoverificação do

espetrofotómetro.
 O tampão fosfato não absorve a 590
nm, mas pode ter havido absorção residual.
 A cuvette podia estar suja.
 A lei de Lambert-Beer só é válida no
intervalo em que a variação de absorvância
com a concentração é linear. Ajustar uma reta
a todos os pontos está errado.

Conclusão:
Sendo que A=εdC e A=16740 C + 0,4809, tem-se que declive=εd, logo ε=16740 M-1.cm-1
Quanto ao ponto 4 do procedimento (adição de HCl), verifica-se que a absorvância da
solução diminui (A=0,016) e o pH diminui (torna-se ácido). Além disso, passa a absorver
comprimentos de onda mais curtos, o que se verificou pela mudança da cor da solução (passa a
ser amarela).
 2. Quantificação de proteína pelo método do Biureto

Baseia-se no facto de cada ião Cu2+ formar um

complexo com 4 grupos amina da cadeia
polipeptídica da proteína. O composto que se forma Método
é azul (tem máximo de absorção a 540 nm). colorimétrico, com
recurso ao
espetrofotómetro

Vai permitir quantificar a concentração

da solução de proteína, desde que a Lei
de Lambert-Beer seja aplicável

Objetivo: Determinar a concentração de proteína numa solução de BSA (albumina de

soro bovino) de concentração desconhecida, pelo método do Biureto.

Procedimento:
1. Preparar 9 tubos de ensaio com as seguintes composições:

Solução de albumina
Tubo de ensaio Solução A (ml) Água desionizada (ml)
10mg/ml (ml)
1 - - 1,0
2 0,2 - 0,8
3 0,4 - 0,6
4 0,6 - 0,4
5 0,8 - 0,2
6 1,0 - -
7 - 1,0 -
8 - 0,5 0,5
9 - 0,1 0,9

2. Adicionar a cada tubo 4 ml de reagente de biureto.

3. Colocar os tubos de ensaio num banho de água a 37ºC durante 10 minutos.
4. Ler a absorvância das soluções a 540 nm, utilizando o tubo 1 como branco (zero).
 Resultados:

Nota: Como o volume final em cada tubo é o mesmo (1 ml), a concentração de

Nota:
Albumina (BSA) será:

Tubo [BSA]/M Abs 0,45

1 0 0 0,4
2 2 0,127 0,35
0,3 y = 0,0374x + 0,0226
3 4 0,182 0,25 R² = 0,9822

Abs
4 6 0,234 0,2
5 8 0,312 0,15
0,1
6 10 0,402 0,05
7 0 0,126 0
8 0 0,063 0 2 4 6 8 10 12
9 0 0,01 [BSA]/M

Através da equação da reta é possível calcular a concentração de proteína na solução de

concentração desconhecida:
 Para A=0,126 vem que: [proteína]=2,8 M
 Para A=0,063 vem que: [proteína]=1,08M  Como se trata de uma diluição, tem
de se multiplicar pelo fator de diluição (2)  [proteína]=2,16M
 Para A=0,010 não tem significado calcular a [proteína], pois está no limite de
valores viáveis de absorvância medidos pelo espetrofotómetro.

Conclusão:
A concentração de proteína na solução A será a média dos valores viáveis encontrados.
Neste caso, [proteína]=2,5mg/ml. Na realidade, a concentração de proteína na solução A era de
3mg/ml.

Nota: Deve-se ter em conta que a lei de Lambert-Beer nem sempre é válida, por exemplo,
se a concentração de proteína fosse muito elevada, a absorvância seria muito grande e,
provavelmente, não estaria incluída no intervalo de valores utilizados para a obtenção da
equação da reta, sendo que assim não seria válida a sua utilização.
 3. Determinação dos parâmetros cinéticos de um enzima – fosfatase ácida

Biocatalisador que acelera as reações químicas que

ocorrem nos organismos vivos.

vmax e Km avaliam a competência catalítica do enzima

Segue a cinética descrita pela equação
vmax  S  vmax – velocidade de conversão de substrato a produto
de Michaelis-Menton, v  em condições de saturação do enzima com o substrato
Km   S 
Km – constante de Michaelis-Menton, afinidade do
enzima para o substrato (maior afinidade  menor Km)

Equação de Lineweaver-Burk:

1 Km 1 1
 
v vmáx  S  vmáx

Fosfatase ácida (atividade ótima em meio acídico): possui uma especificidade alargada para
monoésteres de fosfato, hidrolisando a sua ligação éster:

Monoéster de fosfato + H2O  álcool + fosfato

p-nitrofenilfosfato (p-NPP): é hidrolisado e liberta fosfato inorgânico (Pi) e p-nitrofenol:

p-nitrofenilfosfato + H2O  p-nitrofenol + Pi

Em condições alcalinas, o p-nitrofenol absorve fortemente a 400-410 nm, enquanto que o

p-nitrofenilfosfato é incolor em toda a gama de pH. Esta alteração de cor do p-nitrofenol
permite detetar o progresso de uma reação catalisada pelo enzima por espetrofotometria.

Serão conduzidas reações de hidrólise de tempo fixo para várias concentrações

iniciais de p-nitrofenilfosfato (p-NPP). Após um tempo em condições próximas das
condições ótimas de funcionamento do enzima, é adicionada uma base forte
(NaOH). Isto faz aumentar o pH para valores alcalinos extremos, o que inativa o
enzima (a proteína desnatura), fazendo parar a reação, e permite detetar o p-
nitrofenol, devido à sua transição de incolor para amarelo.

Objetivo: Determinar os parâmetros cinéticos Vmax e KM da fosfatase ácida de gérmen

de trigo.
 Procedimento:
1. Preparar 14 tubos de ensaio com as seguintes composições:

Solução de p-NPP em tampão Solução de tampão citrato

Tubo
citrato 0,1M, pH=5,0 (ml) 0,1M, pH=5,0 (ml)
0 - 1,0
EC - 0,9
0,25A 0,9 (0,25mM) 0,1
0,25 0,9 (0,25mM)
0,50A 0,9 (0,50mM) 0,1
0,50 0,9 (0,50mM)
1,0A 0,9 (1,0mM) 0,1
1,0 0,9 (1,0mM)
1,5A 0,9 (1,5mM) 0,1
1,5 0,9 (1,5mM)
2,0A 0,9 (2,0mM) 0,1
2,0 0,9 (2,0mM)
2,5A 0,9 (2,5mM) 0,1
2,5 0,9 (2,5mM)

2. Adicionar 0,1ml da solução de fosfatase ácida aos tubos EC, 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2 e 2,5.
Após cada adição, agitar e colocar o tubo num banho de gelo para impedir a atividade do enzima.
3. Colocar todos os tubos num banho a 30ºC durante 10 minutos. Retirar os tubos e
colocá-los imediatamente num banho de gelo.
4. Adicionar 5ml de NaOH 0,2M a cada tubo. Manter os tubos à temperatura ambiente.
5. Ler as absorvâncias a 405nm, usando como branco o tubo 0.
6. Subtrair às leituras dos tubos 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2 e 2,5 a leitura obtida para o tubo EC
e a leitura obtida no tubo A de igual numeração.

Nota: O tubo EC, que contém enzima sem substrato, permite descontar a absorvância devida
à presença de enzima e o tubo A (sem enzima) desconta a absorvância devida à libertação
de p-nitrofenol que não resulta da ação catalítica do enzima (hidrólise espontânea do
substrato). O valor de absorvância obtido após estas deduções corresponde à libertação de
p-nitrofenol devida exclusivamente à catálise enzimática.
 Abs 1
  Pi  / min  1000  6 
 10 min
Resultados:

Tubo Abs Abs corr v (Abs)   Pi  [NPP]

0 0
EC 0
0,25A 0
0,25 0,198 0,198 0,0198 0,0066 0,25
0,5A 0 0 0
0,5 0,252 0,252 0,0252 0,0084 0,5
1,0A 0 0 0
1 0,331 0,331 0,0331 0,011033333 1
1,5A 0 0 0
1,5 0,375 0,375 0,0375 0,0125 1,5
2,0A 0,001 0 0
2 0,377 0,376 0,0376 0,012533333 2
2,5A 0,009 0 0
2,5 0,394 0,385 0,0385 0,012833333 2,5

Abs
V=
10 min

0,014 Gráfico de Lineweaver-Burk

60
0,012
50
Δ[Pi]/mM.min-1

0,01
1/v (min.mM-1)

0,008 40 y = 7,0691x + 23,18

R² = 0,9836
0,006 30
0,004 20
0,002 10
0 0
0 1 2 3 0 1 2 3 4 5
[S]/mM 1/[NPP]/mM-1

Pela equação de Lineweaver-Burk e pela observação do gráfico:

1 1
 b  23,18   vmáx  0, 043141mM / min
vmáx vmáx
Km Km
 m  7, 0691   K m  0,305mM
vmáx 0, 043141

Nota: Não é possível calcular a constante catalítica (kcat) pois não é conhecida a concentração
total do substrato.
 4. Deteção e quantificação de açúcares redutores com o reagente de DNS

Os monossacarídeos, (CH2O)n, são aldeídos Açúcares que possuem o grupo funcional

ou cetonas que possuem vários grupos carbonilo (C=O) livre, em meio alcalino
hidroxilo. Em reação com um álcool, um
aldeído forma um hemiacetal, e uma
cetona forma um hemicetal. Devido a
estas reações, as formas lineares dos
monossacarídeos com cinco ou mais O método de determinação de açúcares
átomos de carbono existem em equilíbrio redutores mais usado é o do DNS (ácido
com as formas cíclicas (reações 3,5-dinitrosalicílico). Em condições
intramoleculares), predominando as alcalinas, açúcares redutores podem
formas cíclicas. reduzir o DNS a ácido 3-amino-5-
nitrosalicílico.

A hidrólise de um dissacárido, oligossacárido

As ligações glicosídicas que unem os ou polissacárido que não tenha propriedades
monossacáridos podem sofrer hidrólise, redutoras (grupos carbonilo não disponíveis
sendo catalisadas por enzimas altamente por estarem envolvidos na ligação glicosídica),
específicas (ex: α-amilase) no que diz pode ser detetada pelo aparecimento no meio
respeito à configuração isomérica do de reação de açúcares redutores.
substrato.

Objetivo: Classificar monossacáridos e dissacáridos quanto à sua capacidade de reduzir

o reagente de DNS: quantificar os açúcares redutores presentes. Observar a ação do enzima α-
amilase sobre o amido.

Procedimento:
1. Preparar 12 tubos de ensaio com as seguintes composições:
Solução de tampão fosfato Solução de α-amilase
Solução (0,5mL)
20mM, pH=7,0 (ml) 0,05mg/mL
Glucose 1g/L 0,5
Frutose 1g/L 0,5
Sacarose 1g/L 0,5
Sacarose 1g/L 0,5
Lactose 1g/L 0,5
Lactose 1g/L 0,5
Maltose 1g/L 0,5
Maltose 1g/L 0,5
Galactose 1g/L 0,5
Amido 1g/L 0,5
Amido 1g/L 0,5
Água 0,5
 2. Incubar todos os tubos num banho de água a 37 ºC durante 15 minutos.
3. Preparar uma segunda série de tubos com 1,0mL de cada solução de glucose (g/L): 0,
0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0, 1,2.
4. Adicionar 1mL do reagente de DNS a todos os tubos (20 no total) e colocá-los num
banho de água a 100 ºC durante 15 minutos.
5. Retirar os tubos do banho e aguardar alguns minutos para baixar a temperatura.
Adicionar 10mL de água destilada a cada tubo. Misturar bem.
6. Ordenar os tubos por cor e ler as absorvâncias a 540 nm, usando como “branco” o
tubo da série dos padrões que não contém glucose (0).

Resultados:

0,3

0,25 Com os tubos da

y = 0,25x - 0,017
segunda série
R² = 0,9906
0,2
Abs

0,15

0,1

0,05

0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4
[Glc](g/L)

Ponto importante:

 Os tubos são ordenados por cor (mais claro  mais escuro) pois quanto mais
forte for o castanho da solução (Nota: O DNS muda de amarelo para castanho.) maior era a
concentração de açúcar redutor na solução, e assim não vai haver contaminação das
soluções mais concentradas.

Conclusão: Os açúcares redutores são: glucose, frutose, galactose, lactose (glc+gal) e

maltose (glc+fru). Estes possuem o grupo carbonilo livre, sendo por isso capazes de se oxidarem
na presença do DNS. Observou-se a formação de um precipitado vermelho (Cu+).
Os açúcares não redutores não são capazes de se oxidar sem sofrer hidrólise da ligação
glicosídica, e são: sacarose (glu+fru) e amido (glc+glc+…). O amido apenas tem um carbono livre
no final da cadeia, considerando-se que a sua percentagem redutora é mínima/não existente.
 7. Separação de lípidos por cromatografia de adsorção em camada fina (TLC)

Utiliza uma fase estacionária de sílica gel, distribuída uniformemente sobre um suporte
plano, formando uma película de espessura com cerca de algumas décimas de milímetro, e
uma fase móvel (eluente) constituída por um solvente ou mistura de solventes orgânicos,
que, ao difundir-se através da fina camada sólida, arrasta consigo os compostos
adsorvidos à fase estacionária consoante as suas solubilidades relativas no eluente e a
afinidade para a fase estacionária.

Quanto maior a solubilidade do composto adsorvido à fase estacionária no

eluente, maior será a velocidade de migração (eluição) na fase estacionária.

Objetivo: Separar as várias classes de lípidos existentes numa gordura vegetal e numa
gordura animal por cromatografia de adsorção em camada fina de sílica gel.

Procedimento:
1. Preparar uma tina para cromatografia: papel de filtro numa das paredes da tina e
100mL de eluente (Éter de petróleo-éter dietílico-ácido acético em 80:20:1). Aguardar 30
minutos.
2. Traçar a lápis uma linha horizontal na placa de sílica a 1,5cm da extremidade inferior.
3. Aplicar as seguintes amostras a 1,5cm de distância entre cada uma: 15μl de ácido
esteárico, ácido oleico, colesterol, oleato de colesterol e trioleína; 10μl de banha; 5μl de azeite.
4. Colocar a placa na tina e tapar. Esperar cerca de 30 minutos.
5. Retirar a placa da tina e traçar a lápis a linha da frente do solvente. Seca a placa com
o secador.
6. Colocar a placa numa tina saturada com vapores de iodo e aguardar alguns segundos
até estar revelada – os lípidos surgirão como manchas castanhas.
7. Retirar a placa e delinear a lápis cada uma das manchas

Resultados:

2,3
Rf (ácido oleico)=  0,16
14
0, 7
Rf (colesterol)=  0, 05
14
14cm 9, 2
Rf (oleato de colesterol)=  0, 66
14
6, 7
Rf (trioleína)=  0, 48
14
0,8
Rf (azeite1)=  0, 06
14
5,9
Rf (azeite2)=  0, 42
14
6, 7
Rf (banha)=  0, 48
Ácido
esteárico
Ácido Colesterol Oleato de
oleico colesterol
Trioleína Azeite Banha 14
 𝑑𝑖𝑠𝑡â𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑝𝑒𝑟𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑒𝑙𝑜 𝑐𝑜𝑚𝑝𝑜𝑠𝑡𝑜
Nota: Fator de retenção: 𝑅𝑓 = 𝑑𝑖𝑠𝑡â𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑝𝑒𝑟𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑒𝑙𝑜 𝑒𝑙𝑢𝑒𝑛𝑡𝑒

Quanto mais apolar/hidrofóbico for o lípido, mais migra na sílica, tendo maior afinidade ao
eluente (que é hidrofóbico e sobe por capilaridade). Quanto mais hidrofílico menos migra.

Conclusão: O oleato de colesterol é o que migra mais, sendo o mais hidrofóbico, seguido
da trioleína e do ácido oleico. O colesterol é o que migra menos, sendo o mais hidrofílico, pois
possui um grupo hidroxilo que lhe confere um caráter polar.
Quanto aos componentes do azeite, verifica-se pela cromatografia que é a trioleína.
(Nota: O azeite não contém colesterol, pelo que a semelhança nas migrações é coincidência e a
do azeite neste ponto corresponderá a um outro lípido não testado. O mesmo acontece com a
banha e a trioleína, não sendo este lípido um componente da banha.)

Nota: A função do iodo é interagir com as ligações duplas dos lípidos, formando as manchas
castanhas observadas. Não foi possível observar nenhuma mancha no ácido esteárico pois
este lípido não possui nenhuma ligação dupla.