Protein Mühendisliği ve Rekombinant Enzim Üretimi

Arş. Gör. Rizvan İMAMOĞLU Bartın Üniversitesi Hidrogen Biyoteknoloji, CEO rizvanimamoglu@gmail.com Protein Mühendisliği ve Rekombinant Enzim Üretimi İçindekiler • • • • • • • • • • • • • Giriş Protein Mühendisliği Protein Mühendisliği Kullanım Alanları Rekombinant Protein Üretimi Ön Bilgi Protein Üretim Sistemleri Rekombinant Protein Üretimi Bakteriyel Ekspresyon Sistemi Maya Ekspresyon Sistemi Memeli Ekspresyon Sistemi Cell-free Ekspresyon Sistemleri Füzyon Etiketler Inclusion bodies Laboratuvarımızda Üretilen Proteinler GİRİŞ ✓ Proteinler ✓ Amino asitlerin belirli türde, belirli sayıda ve belirli diziliş sırasında birbirlerine kovalent polipeptitlerdir. düz zincirde bağlanmasıyla oluşmuş karakteristik Giriş • İnsanda yaklaşık 20-25 bin arası gen bulunmaktadır. • İnsan vücudunun 80.000 ila 400.000 protein içerdiği tahmin edilmektedir. Giriş • Terapötik proteinler • Endüstriyel proteinler • Moleküler enzimler Protein Mühendisliği Nedir • Protein mühendisliği, yararlı veya değerli proteinler geliştirme sürecidir. Bu alan multidisiplindir bir alandır ve protein katlanması ve protein tasarım ilkelerinin tanınması yapılmıştır. konusunda birçok araştırma Protein Mühendisliği ✓ Protein Mühendisliğinin Hedefleri ✓ Proteinlerin katalitik özelliklerini iyileştirmek (substrat -aktif bölge ilişkisini daha özel kılmak, birden çok aktif bölgeyi aynı protein üstünde sunabilmek vb.) Protein Mühendisliği ✓ Protein Mühendisliğinin Hedefleri ✓ Proteinlerin yapısal özelliklerini değiştirerek istenilen fizikokimyasal özelliklere sahip, daha dayanıklı, daha verimli çalışan proteinler üretmek Protein Mühendisliği Kullanım Alanları ➢ Klinik Uygulamalarda ❑ Aşı üretimi ❑ Diagnostik kitlerin geliştirilmesi Protein Mühendisliği Kullanım Alanları ✓ Biyoteknoloji ✓ Büyük çapta mg-gr miktarlarda protein üretimi ❑Büyüme faktörleri ❑ İnsülin gibi hormonların üretimi Protein Mühendisliği Kullanım Alanları ➢ Eczacılık-İlaç geliştirilmesi Endüstrisinde Yeni için, mekanizmalarını etki ilaçların gösterdikleri proteinler üzerinde yapılan çalışmalar Protein Mühendisliği Kullanım Alanları ✓Biyokimyasal çalışmalarda ❑Enzimatik özelliklerin araştırılması ❑ Biyokimyasal olayların düzenlenmesi ❑ Protein-Protein yada Protein DNA etkileşimlerinin incelenmesi ve ITC (izotermal titrasyon mikrokalorimetresi) Protein Mühendisliği Kullanım Alanları ✓ Yapı Çalışmalarında ❑3D X RAY KRİSTAL VE NMR ANALİZLERİ • Eski zamanlarda… Neden rekombinant proteinler? • Miyoglobinin ilk yapısı (Kendrew & Perutz, Nobel 1962) balina etinden elde edilen protein kristallerinden belirlendi. Miyoglobin ette bol miktarda bulunur !! • Bugün… • Çok düşük ekspresyonlu, ancak önemli hücresel fonksiyonlara (enzimler! Düzenleyici proteinler! Zar proteinleri!) sahip proteinlere artan ilgi. Doğal kaynaklar, yapısal çalışmalar için yeterli protein sağlayamaz durumda. • Bazı proteinlerin kristalizasyonu için, stabilizasyon, saflaştırma, mutasyon çalışmaları için mühendislik gereklidir ... Neden rekombinant proteinler? Rekombinant Ön bilgi http://www.expasy.org/ • Proteinin işlevi. http://www.uniprot.org/ Prokaryotik mi? Ökaryotik mi? Lokalizasyon: sitoplazma, zar, periplazma? In vivo ifade seviyeleri Diğer proteinlerle etkileşimler Rekombinant Ön bilgi http://www.expasy.org/ http://www.uniprot.org/ • Proteinin fiziksel ve kimyasal özellikleri. sekans Aminoasit sayısı ve MW pl ve hidrofobiklik Post-translasyonel modifikasyonlar (glikosilasyon ...) Rekombinant Ön bilgi http://www.expasy.org/ • Yapı. http://www.uniprot.org/ Yapısı bilinen homolog proteinler Alanlar ve oligomerizasyon durumu Yapı tahmini (α-sarmalları, β-sarmalları, yapılandırılmamış alanlar) esnek döngüler, Rekombinant Proteinlerin Ekspresyonu Sekanslama İfade sisteminin seçimi Host ve vektör seçimi Klonlama ve vektör ligasyonu Koloni seçimi Yapı tasarımı Kristalizasyon Protein saflaştırma Sekans ve Aktivite Kontrolü Ekspresyon protokolü optimizasyonu Protein Üretim Sistemleri ✓ Prokaryotlarda ❖ Bakteriyel ( E. coli, B. subtulis ) ✓ Eukaryotlarda ❖ Yeast ( Mayalar: S. cereviciae ve P. Pastoris ) ❖ Insect cells (böcek hücreleri - baculo virusler) ❖ Mammalian cells (Cell lines: hücre kültürleri, adeno- ve retroviruslerle infection) ✓ Bitki ve Cell Free (hücre kullanmaksızın) EUKARYOTIC HOSTS PROKARYOTİK HOST (E.Coli straini) - posttranslational modifications • Küçük proteinler • Ucuz • İyi ekspresyon Ekspresyon Sistemleri CELL-FREE SYSTEMS • Çeşitli hücre özütleri (ticari olarak E.Coli'den İnsana!) • Post-translasyonel modifikasyonlar • İzotopik etiketleme için kolay • Hızlı ama pahalı Maya (S. Cerevisiae, P.Pastoris): Bazı post-translasyonel modifikasyonlara sahip ökaryotik proteinler Ucuz ve kolay Bakulovirüs-Böcek hücreler (Sf9, Sf21, Drosophila S2): Post-translasyonel modifikasyonlar Seçim yok antibiyotikler Pahalı! Memeli (CHO, 293, HeLa): Tüm postalar translasyon modifikasyonlar Seçim antibiyotik yok Pahalı ve zaman alıcı Rekombinant Protein Üretimi Ekspresyon Vektörü Protein üretmek için genetik bilgi içerir, konakçının kromozomal DNA'sından bağımsız olarak çoğalır Promoter: RNA polimerazın bağlanmasını ve transkripsiyon faktörlerini kontrol eder Marker Antibiyotik Direnç Geni: plazmit içeren hücreleri seçmek ve diğer organizmalarla rekabet etmelerine yardımcı olmak için Başlama Kodonu Optimal Ekspresyon için konakçı genomuna göre optimizasyon Stop Kodonu 5’ Primer Site Restriction Site Çoklu Klonlama Sitesinde (MCS) 3’ Primer Site Replikasyon orijini (ori): plazmid replikasyonunu ve kopya sayısını kontrol eder E.Coli strains /1 E. Coli suşları, genellikle klonlama ve plazmit replikasyonu için kullanılan konakçıdır. Strain Natural resistance Galaktoz metabolizması Streptomycin DH10B yolundaki mutasyonlar: hücreler sadece DH5agalaktozla büyüyemez Top10 Streptomycin Plazmid XL1 Tetracycline Blue rekombinasyonunu azaltan mutasyonlar: stabilitesinin XL10plazmid Tetracycline and artması Chloramphenicol Gold Primary use Genotype Endonükleaz mutasyonu: Genel klonlama ve saklama plazmid verimini mavi-beyaz tarama. artırır F- endA1 recA1 galE15 galK16 nupG rpsL DlacX74 F80lacZDM15 araD139 D(ara,leu)7697 mcrA D(mrr-hsdRMS-mcrBC) l- Genel klonlama ve saklama, F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG F80dlacZDM15 D(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK-mK+), l- Lac operon Genel klonlama ve saklama, mutasyonları mavi-beyaz tarama. F- mrcA D(mrr-hsdRMS-mcrBC) j80lacZDM15 DlacX74 nupG recA1 araD139 D(ara,leu)7697 galE15 galK16 rpsL(StrR) endA1 l- Mavi-beyaz tarama, rutin klonlama. endA1 gyrA96(nalR) thi-1 recA1 relA1 lac glnV44 F’[::Tn10 proAB+ laclq D(lacZ)M15] hsdR17(rKmK+) Büyük plazmitlerin klonlanması ve çoğaltılması, yüksek verimlilik. endA1 glnV44 recA1 thi-1 gyrA96 relA1 lac Hte D(mcrA)183 D(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 tetR F’[proAB laclq ZDM15 Tn10(TetR Amy CmR)] E. Coli hosts ➢ Seçime yardımcı olmak ve rekabeti azaltmak için antibiyotik direnci olan suşlar ➢ Azaltılmış proteolitik kaynaklara sahip suşlar ➢ Hücreler canlı ve sağlıklı olduğunda üstel büyüme evresinde ifade ➢ Özellikle toksik proteinler için bazal ekspresyonu azaltmak için sıkı ekspresyon kontrolüne sahip promotorlar ➢ Şaperonların veya katlanmaya yardımcı olan diğer faktörlerin birlikte ifadesi ➢ Nadir kodonlara yardımcı olan tRNA ifadesine sahip suşlar E.Coli strains /2 PDB'deki yapıların% 70'i, E.Coli'de ifade edilen rekombinant proteinlerdendir Strain Natural resistance Primary use Genotype BL21(DE3) - Genel protein ifadesi. F- ompT Ion hsdSB(rB- mB-) gal dcm (DE3) BL21(DE3) pLysS Chloramphenic ol Toksik proteinlerin ifadesi. F- ompT Ion hsdSB(rB- mB-) gal dcm (DE3) pLysS(CamR) BL21(DE3) pLysE Chloramphenic ol Toksik proteinlerin ifadesi. F- ompT Ion hsdSB(rB- mB-) gal dcm (DE3) pLysE(CamR) BL21 star (DE3) - Genel ekspresyon, toksik proteinler için önerilmez. F- ompT Ion hsdSB(rB- mB-) gal dcm rne131 (DE3) Rosetta2 (DE3) Chloramphenic Ökaryotik proteinlerin ifadesi. ol F- ompT hsdSB(rB- mB-) gal dcm (DE3) pRARE (CamR) Lemo21 (DE3) Chloramphenic ol Toksik, çözünmez veya zar proteinlerinin ifadesi. fhuA2 [Ion] ompT gal (l DE3) [dcm] DhsdS/ pLemo (CamR) Origami2 (DE3) Streptomycin and tetracyclin Çözünmeyen proteinlerin ifadesi. D(ara,leu)7697 DlacX74 DphoA Pvull phoR ara D139 ahpC galE galK rpsL F’[lac+ laclq pro] (DE3) gor52::Tn10 trxB (StrR, TetR) Maya Ekspresyon Sistemi En basit ökaryotik sistem: Ökaryotik protein ekspresyonunun avantajlarını kullanım kolaylığı ve düşük prokaryot maliyeti ile birleştirir Avantajlar: Hızlı büyüme Bilinen genetik Çok yönlü DNA dönüştürme sistemi Etkili homolog rekombinasyon sistemi Klonlama sırasında maya ve E.Coli arasında gidip gelme kolaylığı Oksotrofik seçim (veya antibiyotik seçimi) Galaktoz indüklenebilir vektörler mevcuttur Homolog rekombinasyon Oksotrofik seçim Önemli bir bileşiğin sentezi için eksik olan bir suş (His, Ura, Leu, Lys, Trp, Met), konakçının oksotrofisini tamamlayan bir gen içeren bir plazmid ile dönüştürülür ve bileşik için eksik olan ortamda büyütülür. Maya Ekspresyon Sistemi Sık kullanılan maya türleri: Saccharomices cerevisiae, Pichia pastoris, Saccharomices pombe,… - S. cerevisiae: - Tomurcuklanan maya veya fırıncı mayası olarak bilinir - Büyümesi kolay sistem; düşük maliyetli; iyi bilinen genom - Birçok mutant veya tasarlanmış suş mevcuttur - Gal promoteri: inhibitör olarak glikoz kullanan galaktoz Pichia pastoris: - yüksek hücre yoğunluklarına büyüyebilir - Kolay kontrol oluk oksotrofik seçim (yüksek kopya - - - Ökaryotik proteinlerin kısmi işlenmesine izin veren ökaryotik birlikte ve translasyon sonrası sistemlere sahiptir - Daha yüksek ökaryotlara benzer bir lipit bileşimine sahiptir, özellikle membran proteinleri için yararlıdır Ökaryotik post-translasyonel modifikasyonlar kısmen mevcut AOX1 promotörü: güçlü, metanol ile indüklenebilir ve glukoz / gliserol tarafından bastırılır sayısına izin veren oksotrofi geninden önce zayıf hızlandırıcılar ile) Metilotrofik: diğer mikro organizmaları öldürecek koşullarda büyür - daha az kontaminasyon indüklenebilir sistem - 1 L ortam tarafından üretilebilen protein miktarını artırarak çok - Kararlı klonlar üretmek için ekzojen DNA'nın genoma entegrasyonuna izin verir Baculovirus/ Böcek Hücresi Ekspresyon Sistemi Tn7 rekombinaz aracılı transpozisyon Bacmid DNA Pozitif klonların seçimi ve genişletilmesi Viral genlere sahip plazmid Bakulovirüs: böcek hücrelerinin çekirdeklerinde çoğalan çubuk şeklindeki DNA virüsleri, doğal ve spesifik böcek patojenleri Çift sarmallı dairesel genom ≈80180 kbp Böcek hücreleri veya böcek larvaları: böcek hücrelerinin çekirdeklerinde çoğalan çubuk şeklindeki DNA virüsleri, doğal ve spesifik böcek patojenleri Çoğunlukla kullanılan: sf9, sf21 ve High-Five E.Coli host (DH10b) Böcek hücreleri Birlikte enfeksiyon Yüksek titreli rekombinant virüs stoğu üretimi Böcek hücrelerinin enfeksiyonu ve hedef protein üretimi İfade vektörünün izolasyonu Memeli Ekspresyon Sistemi E.Coli host HeLa Bakterilerde hedef genin replikasyonu Pozitif klonların seçimi ve genişletilmesi CHO Hedef gen ile plazmid / ekspresyon vektörünün izolasyonu Memeli Hücreleri Transfeksiyon HEK293 Klonların taranması ve genişletilmesi Geçici expression (≈ 1 hafta) Stabil expression (≈ 2/3 ay) Transfeksiyon Tipleri Transient Transfeksiyon Stabil Transfeksiyon Transient Transfeksiyon • DNA ökaryot hücre içerisine aktarıldıktan sonra geçici olarak ekspre olur. • Hücre içerisine aktarılan DNA hücre genomuna entegre olmaksızın sitoplazmada serbest olarak kalır. Stabil Transfeksiyon Transfekte edilen DNA kromozomal DNA’ya integre olur. Doğrusal plazmit kullanılması kararlı transfeksiyonun etkisinin maksimum olmasını sağlar. Cell-free Ekspresyon Sistemleri Kullanım Amacı: Konakçı hücrenin fizyolojisini etkileyen proteinler İzotopik zenginleştirme ile NMR çalışmaları (ve saflaştırmaya gerek yoktur!) Se-Met ile MAD aşamalandırma Template: mRNA or DNA Hücre EXTRACT transkripsiyon ve çeviri moleküler makineler ✓ Ribozomlar ✓ Başlatma / uzama / sonlandırma faktörleri ✓ tRNA'lar ✓ Amino asitler ✓ Aminoasil-tRNA sentazları ✓ ATP, GTP ve diğer enerji kaynakları ✓ Enzimatik kofaktörler ✓ Protein katlanması için gerekli olan hücresel bileşenler (şaperonlar vb.) ✓ RNA polimeraz Klonlama Teknikleri • Restriksiyon enzimleri ve ligaz kullanımı • Homolog rekombinasyon kullanımı • Ligaz-free teknikler • Restriksiyon-free teknikler Füzyon Etiketler Yaygın kullanılan füzyonlar Kullanımı ✓ Saflaştırma ✓ Stabilite ve proteazlar ✓ Çözünürlük ve katlama ✓ Etiketleme (Western Blot ve floresan proteinler) His etiketi: Ni2+ veya Co2+ 'ya bağlanan 6-10 histidin kuyruğu; katlamayı genellikle etkilemez, afinite saflaştırma için kullanılır MBP etiketi: Maltoz Bağlayıcı Protein, proteinlerin çözünürlüğünü arttırır ve katlamayı iyileştirir, afinite saflaştırması için kullanılır SUMO etiketi: Ubiquitin ile ilgili Küçük Değiştirici, katlamayı ve kararlılığı destekler Strep etiketi: Afinite saflaştırması için kullanılan, biotin için yüksek afiniteye sahip bir protein olan streptavidin GST etiketi: Afinite saflaştırması için kullanılan, glutatyonu yüksek afinite ile bağlayan ve proteazlara karşı protein stabilitesini artıran Glutatyon S-Transferaz FLAG etiketi: Piyasada bulunan antikorlara güçlü bir şekilde bağlanan oktapeptid GFP etiketi: Yeşil Floresan Protein etiketi, ifadenin test edilmesini sağlar Proteazlar Etiketler saflaştırma için kullanışlıdır, ancak esneklik ve konformasyonların heterojenliği nedeniyle kristalleşmeyi engelleyebilir. Proteazlar, etiketin protein yapısını ve saflığını etkilemeden ayırmak için kullanılır. İdeal proteaz, konakçı organizmada mevcut değildir, spesifik bir tanıma sekansına sahiptir ve bu sekans, protein sekansında mevcut değildir. Entrokinase Kesim bölgesi: Asp-Asp-Asp-AspLys-↓-X Thrombin Kesim bölgesi: LVPR/GS TEV-protease Kesim bölgesi : ENLYFQ/G PreScission protease Bir proteaz enzimi tarafından tanınacak özel protein dizisi Rhinovirus 3C Protease, Kesim bölgesi : LEVLFQ/GP Ekspresyon Protokolü Plazmid tasarımı ve hazırlanması Hücre lizizi (Sonikasyon veya French press) Büyük miktarlarda protein ekspresyonu için ekspresyon koşullarının dikkatlice optimize edilmesi gerekir. Ölçek büyütmeden önce test et! Transformasyon Koloni Seçimi Ekspresyon indükleme Kültür yetiştirme ➢ Sıcaklık ➢ İndükleyici ajan konsantrasyonu ➢ İndüksiyon süresi ➢ ➢ ➢ ➢ ➢ Medium Sıcaklık İndüksiyon OD Antibiyotikler Katkı maddeleri Protein ekspresyon maliyetini planla Inclusion bodies INCLUSION BODIES: sitoplazmada bulunan, protein çözünmez olduğunda veya konakçı hücre içinde katlama mekanizmasının bulunmamasından dolayı oluşan yoğun yanlış katlanmış protein agregaları. Genellikle E. coli’de oluşmaktadır, nadirde olsa maya, böcek hücreleri veya memeli hücrelerinde oluşur. Avantajlar: • Çok miktarda protein • Daha düşük kontaminasyon ve daha yüksek protein saflığı 1. Inclusion bodies izolasyonu: hücrenin mekanik olarak bozulması ve çözünür fraksiyonların uzaklaştırılması (santrifüjleme, filtreleme veya sükroz gradyan ayırma) 4. Yeniden katlama ve diyaliz • Dezavantajları • Yeniden katlanma her zaman mümkün değildir • Ek maliyet 2. Kontaminantların kaldırılması: yeniden katlamayı geliştirir ve proteazları uzaklaştırır; deterjan, sukroz veya üre (<4M) yıkama 3. Çözünürülük: kaotropik ajanlar (üre veya guanidinyum klorür, 4-8 M) kullanarak. Yanlış disülfür bağı oluşumunu önlemek için genellikle indirgeyici ajanlar eklenir Rekombinant Protein Saflaştırma TEŞEKKÜRLER Sorular rizvanimamoglu@gmail.com Referanslar • Expression systems and vectors: Addgene, “Plasmids 101: A Desktop Resource”, October 2015 (2nd Edition), www.addgene.org • Yeast expression systems: Drew D. et al., “GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae”, Nat. Protoc. 2008, 3(5):784–798; Parker J.L. & Newstead S., “Method to increase the yield of eukaryotic membrane protein expression in Saccharomyces cerevisiae for structural and functional studies.”, Protein Sci. 2014, 23:1309-14; Byrne B., “Pichia pastoris as an expression host for membrane protein structural biology.”, Curr. Opin. Struct. Biol. 2015, 32:9-17. • Baculovirus expression systems: van Oers M.M., “Opportunities and challenges for the baculovirus expression system”, J. Invertebr. Pathol. 2011, 107:S3-15; Barford D. et al., “Baculovirus expression: tackling the complexity challenge”, Curr. Opin. Struct. Biol. 2013, 23(3):357-64. • • Mammalian expression systems: Andréll J. & Tate C.G., “Overexpression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies”, Mol. Membr. Biol. 2013, 30(1):52-63. Cell-free expression systems: Thermofisher website https://www.thermofisher.com/it/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biologyresource-library/pierce-protein-methods/cell-free-protein-expression.html; Endo Y. & Sawasaki T., “Cell-free expression systems for eukaryotic protein production”, Curr. Opin. Biotech. 2006, 17:373-380. • GFP crystal structure: Ormö M. et al., “Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein”, Science 1996, 273(5280):1392-5. • Thermostabilization: Serrano-Vega M.J. et al., “Conformational thermostabilization of the beta1-adrenergic receptor in a detergent-resistant form.” PNAS 2008, 105(3):877-82. • Refolding: Middelberg A.P.J., “Preparative protein refolding”, Trends in Biotech. 2002, 20(10):437-443; Palmer I. & Wingfield P.T., “Preparation and Extraction of Insoluble (InclusionBody) Proteins from Escherichia coli”, Curr. Protoc. Protein Sci. 2012, Chapter 6, Unit 6.3