Universidad Catlica Santa Maria

Facultad de Ciencias Farmaceticas, Bioqumicas y Biotecnolgicas

Arequipa

Extraccin y Purificacion de Flavonoides a

partir de ptalos de Rosa
Lenny Orana Sarmiento Snchez
Resumen
Se realiz una extraccin por Soxhlet de los ptalos de
rosas rojas, primero se hace un desengrasado con ter
que fue desechada, luego la extraccin con etanol, la
que se concentro y filtro, se hizo un reextraccin con
Acetato de Etilo por tres veces, se desecha la fase
eterea y se conserva la fase acetica. Se agreg
cloroformo para formar un precipitado, se filtra y a la
fase precipitada se le resuspende en solucion
etanolica. Procedemos a hacer las pruebas de
identificacin y determinacin, como lo es la reaccin
de Shinoda y la reaccin con el Tricloruro de Aluminio.

Summary
Extraction by Soxhlet of red rose petals you made, first
degreasing with ether which was discarded is, after extraction
with ethanol, which was concentrated and filter, made a reextraction with ethyl acetate three times, discarded the ether
phase and the acetic phase is preserved. Chloroform was
added to form a precipitate, is filtered and the precipitated
phase was resuspended in ethanol solution. We proceed to
make identification tests and determination, as is the reaction
of Shinoda and reaction with aluminum trichloride.

Introduccin
Los flavonoides lato sensu son pigmentos casi universales en los vegetales. Casi
siempre hidrosolubles, son responsables de la coloracin de las flores, frutos y a veces
de las hojas. Asi ocurre con los flavonoides amarillos (chalconas, auronas, flavonoles
amarillos), con los antociansidos rojos, azules o violetas. Si no son directamente
visibles, contribuyen a la coloracin por su papel de copigmentos: asi ocurre con las

flavonas y flavonoles incoloros que copigmentan y protegen a los antociansidos. En

algunos casos, la zona de absorcin de la molecula se situa en el ultravioleta prximo:
la coloracin se percibe nicamente por los insectos que se sienten asi eficazmente
atrados y guiados hacia el nctar y obligados por lo tanto a asegurar el transporte del
polen que condiciona la supervivencia de la especie vegetal. Los flavonoides se
encuentran tambin en la cutcula foliar y en las clulas epidrmicas de las hojas,
asegurando asi la proteccin de los tejidos contra los efectos nocivos de las radiaciones
ultravioletas.

Distribucin y localizacin
Distribucin
La presencia de flavonoides en las Algas no se ha demostrado hasta el momento.
Aunque son frecuentes en Bryophytas (Musgos y Hepticas), se trata de flavonoides
stricto sensu, mayoritariamente de O- y C-hetersidos de flavonas y de derivados Ournicos. En Pteridophytas no es mayor la variedad estructural de flavonoides, las
Psylotales y Selaginellales se caracterizan por la presencia de biflavonoides, las
Equisetales por la proantocianidoles. Los O-heterosidos de flavonoles dominan en los
Helechos que, segn algunos autores, elaboran asimismo chalconas o
proantocianidoles. En Gymnospermas, los proantocianidoles son bastante constantes y
se observa la presencia, en Cycadales y Coniferales (a excepcin de Pinaceae) de
biflavonides, ausentes en Gnetales; la distribucin de estos compuestos y de
heterosidos de flavonas y flavonoles que los acompaan vara netamente, en este caso,
en funcin del rgano(leo, corteza, hojas). La diversidad estructural de flavonas es
mxima en Angiospermas: as una treitena de tipos de flavonoides se han podido
identificar en las Asteraceae. Numerosos autores se han encargado de relacionar la
distribucin de estas molculas con los distintos sistemas taxonmicos propuestos por
los sistemticos contemporneos: en lneas generales no estn en desacuerdo con las
tendencias evolutivas establecidas para estos sitemas. Esto permite incluso, sobre todo
en el caso de las Dicotiledoneas, la construccin de un filograna bastante coherente
entre grupos que han conservado gran cantidad de caracteres ancestrales y otros mas
evolucionados.

Localizacin
Los hetersidos de flavonoides, hidrosolubles, se acumulan en las vacuolas y, segn las
especies, se concentran en la epidermis de las hojas o se reparten entre la epidermis y
el mesofilo (aunque estos dos tejidos pueden acumular de manera especifica
estructuras diferentes, como se ha podido demostrar en algunos cereales). En el caso
de las flores, se concentran en las clulas epidrmicas. Cuando los flavonoides se
encuentran en la cuticula foliar, se trata casi siempre de geninas libres cuya lipofilia se
incrementa por la metilacin, parcial o total, de los grupos hidroxilo. Esto se refiere
sobretodo a plantas de regiones aridas o semiridas, generalmente provistas de
estructuras secretoras.

Estructura Qumica
Quimicamente, estas sustancias son de naturaleza fenlica y se caracterizan por poseer
dos anillos aromticos bencnicos unidos por un ouente de tres atomos de carbono, con
la estructura general

C6 C3 C6 '

los cuales pueden formar o no un tercer anillo. Los

anillos son denominados A, B y C; los atomos de carbono individuales son referidos por

un sistema numrico, el cual utiliza nmeros

ordinarios para los anillos A y C y nmeros primos
para el anillo B.
Los flavonoides naturales suelen presentar al
menos tres hidroxilos fenlicos y se encuentran
generalmente combinados con azucares en forma
de glucosidos, aunque tambin se presentan con
relativa frecuencia como agliconas libres (1,2).
Varios subgrupos de flavonoides son clasificados
de acuerdo con la sustitucin del anillo C. En esta
clasificacin son de suma importancia el estado de oxidacin del anillo heterocclico y la
posicin del anillo B(2,3).

Los tipos de flavonoides estn relacionados por una ruta biosintetica comn, la que
incorpora precursores de las rutas del shiquimato y la acetato-malonato (4,5).
Posteriores modificaciones ocurren en varios estados, lo que resulta en la extensin de
la hidroxilacion, metilacin, isoprenilacion, dimerizacin y glicosilacion, produciendo Oglicosidos y C-glicosidos.

Flavonas y flavonoles
Presentes en vegetales y son los flavonoides mas comunes, distribuidos en todos los
pigmentos amarillos de las plantas a pesar de los carotenoides

Flavanonas y flavanonoles
Son incoloros o solo ligeramente amarillos, son compuestos que existen en muy
pequeas cantidades por eso son los flavonoides menos conocidos.Sus glicsidos son
bien conocidos hesperidina y naringina- extraidos de la corteza de los frutos ctricos.

Antocianinas
Siempre se encuentran como glicsidos; despus de la clorofila, son el grupo mas
importante de pigmentos en las plantas visibles al ojo humano y proporcionan el
color malva, rosa, violeta y azulado a numerosas flores y frutos, como la fresa, la
rosa, las manzanas y la uva constituyen hasta aproximadamente 30% de su masa
seca.

Propiedades fsico-qumicas, extraccin

Solubilidades y extraccin
Aunque por regla general, los hetersidos son hidrosolubles y solubles en alcoholes,
muchos de ellos poseen una escasa hidrosolubilidad (rutsido, hespersido). Las
geninas son, en su mayora, solubles en disolventes orgnicos apolares; cuando
contienen al menos un grupo fenlico libre, se disuelven en disoluciones de hidrxidos
alcalinos.
Los flavonoides lipfilos de los tejidos superficiales de hojas (o de frondes) se pueden
extraer directamente con disolventes de polaridad media (diclorometano);
seguidamente habr que separar las ceras y grasas que se extraen simultneamente
(se puede lavar en principio con hexano pero la selectividad de este disolvente no es
absoluta).
Los heterosidos pueden extraerse, normalmente en caliente, con acetona o alcohol
(etanol, metanol) a los que se adiciona agua(20 a 50% segn que la droga sea fresca o
seca). Se puede seguidamente realizar una evaporizacicon al vacio y, cuando el medio
contenga solo agua, proceder a una serie de extracciones liquido-liquido con
disolventes no miscibles con el agua: con ter de petrleo que elimina clorofila y lpidos;
con dietileter que extrae las geninas libres; con acetato de etilo que arrastra la mayora
de los hetersidos. Los azucares libres permanecen en la fase acuosa junto con, en caso
de fracaso, los hetersidos mas polares.
La separacin y purificacin de los diferentes flavonoides se funda en las tcnicas
cromatogrficas habituales (sobre poliamida, celulosa, gel de Sephadex, etc.). Al igual
que para la mayora de metabolitos secundarios de los vegetales, la CLAR constituye en
estos ltimos aos el mtodo de eleccin en el arsenal de las tcnicas de aislamiento de
heterosidos flavonicos (fases reversas C8 o C18 con disolventes se tipo agua -o
acetonitrilo, o THF- + metanol + acido actico).

Propiedades biolgicas
La principal actividad atribuida a los flavonoides es la de ser venoactivos, es decir,
ser capaces de disminuir la permeabilidad de los capilares sanguneos y aumentar su
resistencia. En animal, pueden reducir la sintomatologa de una hipovitaminosis C
esperimental. Esta propiedad le ha valido, durante un tiempo, el nombre de vitamina
P. Al no ser vitaminas (una carencia en flavonoides no ocasiona ningn sndrome
especial), se habla de factores vitamnicos P o, mejor aun, de factores P. Estos
trminos, ambiguos, tienden a no utilizarse: en la actualidad, a estod productos
naturales y a sus derivados que los diccionarios especializados incluyen bajo la
denominacin general de vasculoprotectores y
venotonicos se les denomina
venotropos. Este inters de los flavonoides en controvertido: as, la FDA (Food & Drug
Administration)no les reconoce ninguna actividad; adems la lectura de tratados
clsicos de farmacologa no permite durar sobre la escasa importancia que, por regla
general, se atribuye a su valor teraputico. No obstante los flavonoides y las
preparaciones a base de flavonoides son objeto en Francia y en muchos pases como
Alemania, Espaa o Italia- de amplia prescripcin, de frecuente recomendacin
farmacutica y de una importante automedicacin, en el terreno de patologas
ciculatorias menores. Ademas algunas molculas de estos grupos, al menos en
posologas elevadas, han podido mostrar una cierta eficacia clnica. Actualmente,
interesa sobre todo la interaccion de los flavonoides con radicales y sus posibles
consecuencias en trminos preventivos. Muchos trabajos experimentales se esfuerzan
asimismo en demostrar, in vitro, la actividad celular de estas molculas y los sitemas
implicados en la respuesta inmunitaria y en la inflamacin.
Por regla general los flavonoides son in vitro inhibidores enzimticos:

Inhibicin de la histidina descarboxilasa por el quercetol o la naringenina;

Inhibicin de la elastasa;
Inhibicin de la hialuronidasa, por las flavonas y sobre todo por los
proantocianidoles, lo que permite conservar la integridad de la sustancia
fundamental de la pared vascular;
Inhibicin no especifica de la catecol-O-metiltranferasa, lo que aumenta la
cantidad de catecolaminas disponibles y provoca por tanto un aumento de la
resistencia vascular;
Inhibicin de la fosfodiesterasa del AMPc que explicara, entre otras y pro parte,
su actividad antiagregante plaquetaria;
Inhibicin de la aldosa reductasa- de la que se sabe que se encuentra implicada
en la patogenia de la catarata
Inhibicin in vitro de la protein-kinasa sobre todo por la luteolina;
Numerosos flavonoides hipolaetina, cirsiriol, etc.- son potentes inhibidores de la
5-lipooxigenasa y por tanto de la produccin de los leucotrienos mediadores de la
inflamacin y de las manifestaciones alrgicas.

Otras propiedades de los flavonoides, a menudo presentados como antiinflamatorios lo

que es compatible con lo que se conoce como sus interacciones (in vitro) con los
polinucleares y los trombocitos o tambin con el metabolismo del acido araquidnico,

los flavonoides pueden ser antialrgicos, hepatoprotectores (isobutrina, hipidulina,

flavanolignanos), antiespaspodicos sobre ileon de cobaya estimulado por diversos
agonistas (flavonoides de tomillo y de otras Lamiaceae), hipocolesterolemiantes,
diurticos, antibacterianos, antivirales in vitro, etc.
Un pequeo numero de flavonoides son anticancergenos e inhibidores del crecimiento
de clulas tumorales in vitro: pueden interaccionar con los enzimas del metabolismo
xenobiotico, poseer efectos anti-iniciadores y/o antipromotores o incluso ser
citostticos, es decir, citotxicos. La mayora de los flavonoides son, in vitro,
antimutagenicos; a contrario, algunos flavonoles son, sobre los mismos modelos,
mutagenicos. Las variaciones de actividad en funcin de las caractersticas
estructurales no permiten ninguna generalizacin.

Utilizacin de Flavonoides en Terapeutica

Pese a los resultados parciales proporcionados por test bioqumicos o por estudios de
farmacologa animal, la realidad de la eficacia clnica de la mayora de los flavonoides
y, a forfitiori, de la de las drogas que los contienen- casi nunca ha sido correctamente
establecida. Los ensayos en el hombre que no son normalmente mas que meras
observaciones-, no se realizan siempre de acuerdo con las normas actualmente en
vigor para este tipo de pruebas. Unicamente un pequeo numero de molculas puras o
de extractos estandarizados ha podido demostrar una eficacia sintomtica moderada a
pesar de la subjetividad de los sntomas y de la importancia del efecto placebo en el
principal tipo de patologa involucrada. Los flavonoides se utilizan sobre todo en el
terreno capilar-venoso: solos o asociados, son constituyentes habituales de
vasculoprotectores y venotonicos y de tpicos utilizados en flobologia. En general las
especialidades que se disponen en la actualidad en el mercado poseen las indicaciones
o propuestas de empleo siguiente:

Tratamiento de sntomas relacionados con la insuficiencia venolinftica (pesadez

y dolores de pierna)
Tratamiento de los signos funcionales debidos a la crisis hemorroidal.
Mejora de los transtornos de fragilidad capilar a nivel de la piel (petequias);
tratamiento de apoyo de transtornos funcionales de la fragilidad capilar.
Tratamiento de metrorragias debidas a la contracepcin por microprogestagenos
y de metrorragias debidas a la utilizacin de dispositivos intrauterinos, despus
de su exploracin clnica o paraclinica.
Propuesto en transtornos ligados a la circulacin retiniana y/o coroidiana.
Tratamiento del linfoedema de miembro superios consecuente al tratamiento
radioquirurgico del cncer de mama.

Los expertos se ponen de acuerdo para subrayar que los venotropos carecn de inters
demostrado en la prevencin de transtornos trficos en pacientes que poseen varices
en los miembros inferiores y en la cicatrizacin de ulceras de las piernas. En la
insuficiencia venosa, no poseen indicacin en ausencia de sintomatologa funcional; no
eximen de una teraputica etiolgica y patognica.

Pigmentos involucrados en la Rosa Roja (Rosa

Gallica sp.)
Las Antocianinas son los pigmentos mas importantes responsables del color rojo de las
rosas. Estos pigmentos pueden causar que los petalos se observen rosados, rojos,
violeta o azules, dependiendo de la copigmentacion que se presente. La
copigmentacion es la interaccion de antocianinas con flavonoides y otros compuestos
como metales, alcaloides, taninnos y polisacridos. La pigmentacin de los tejidos
vegetales tambin se afecta por el pH y la temperatura (Jungmin et al., 2008).
Compuestos como las antocianinas y los fenoles son sintetizados con base a
informacin gentica y estadio de desarrollo de la planta, e influenciado por factores
ambientales como disponibilidad de nutrientes, temperatura y radicacin lumnica. La
mayora de los flavonoides protegen a las clulas de los daos ocasionados por la luz
UV y tambin estn involucradas en la defensa de la planta en otras situaciones de
estrs, como heridas o ataque de patgenos (Grotewold, 2006).
Cuando algunas flores inician el proceso de senescencia, sus petalos cambian de color.
Este cambio de color puede disminuir el valor esttico de la flor y puede ser utilizado
como parmetro de senecencia. La modificacin del color puede ser causada por
cambios bioqumicos de los pigmentos, por el grado de copigmentacion y por cambios
en el pH de los petalos. Entre una de las manifestaciones de estos fenmenos
bioqumicos se puede mencionar el ennegrecimiento de los petalos de la rosa roja, lo
cual ocurre debido a la oxidacin ade flavonas, antocianinas y otros fenoles (Halevy y
Mayak, 1979).

Mtodos Experimentales de extraccin

Los flavonoides en general se extraen de muestras secas y molidas. La muestra se
desengrasa inicialmente con ter de petrleo n-hexano, y el marco se extrae con
etanol puro o del 70%. Este ltimo es recomendado para garantizar la extraccin
de los ms polares. El extracto obtenido se evapora con calentamiento no superior a
los 50C y se le hacen particiones sucesivas con ter etlico, acetato de etilo y nbutanol. Los flavonoides apolares quedan en la fase etrea, los medianamente
polares en la fase acetato de etilo y los ms polares en el nbutanol. Cada una de
estas tres fracciones se puede analizar por cromatografa en capa fina (CCF) y
HPLC en fase reversa.
Se pesaron 5g de ptalos de rosas, se somete a una extraccin con ter por
Soxhlet, por 3 ciclos para el desengrasado y luego continuamos la extraccin
con Etanol por 5 ciclos.

 El extracto etanolico es evaporado a sequedad y suspendido en agua

destilada hirviendo a 100ml con agitacin.
La suspensin acuosa es filtrada por papel y el filtrado se lleva a una re
extraccin con Acetato de Etilo, por tres veces cada una con 20ml.
La fase Actica contiene los flavonoides los cuales precipitan al agregarle
Cloroformo.
Filtrar el precipitado, y el residuo re disolverlo en Etanol para las pruebas de
identificacin.

Reaccin de Shinoda o Cianidina

Caracteriza compuestos de estructura benzopirona. Si la alcuota del extracto se

encuentra en alcohol como es el caso- se diluye con 1ml de HCl concentrado y un
pedacito de cinta de Magnesio. Despues de la reaccin se espera 5minutos, se aade
1ml de alcohol amlico, se mezclan fases y se deja reposar hasta que se separen.

Si la alcuota del extracto se encuentra en agua, se procede de la misma manera,

a partir de la adicion del HCl concentrado.
El ensayo se considera positivo, cuando el alcohol amlico se colorea de amarillo,
naranja, carmelita o rojo. Intensos en todos los casos.

Reaccion con el FeCl3 5%

Utilizar una solucin acuosa de rutina, aadirle gotas del reactivo de FeCl3 5%.
Observar a la luz UV con y sin vapores de amoniaco en un cromatograma.

Resultados y discusiones
Discusin de resultados
Las antocianinas son mas estables en un medio acido que en un medio neutron o
alcalino. En medio acido a pH 1, la forma predominante es la del ion flavilio, el cual da el
color rojo, cuando esta es sometida a pH basico o alcalino, el ion flavilio es susceptible
al ataque nucleofilio por parte del agua, produciendose la pseudobase carbinol, esto es
a pH 4.5 y seguido se forma la chalcona, las dos formas son incoloras. A un pH 7 se
produce la base quinoidal, el cual da una coloracion azul debido a cambios
conformacionales y a la estabilizacion de los electrons de Valencia del cation flavilio y la
resonancia del anillo aromatico

B3 .

En el caso de la reaccion de Shinoda, el extracto de Rosas en contacto con el acido

clorhidrico con las Cintas de Magnesio metalico se genera hidrogeno, este ultimo reduce
al flavonoide lo cual se reconoce por la coloracion rosada.
En la reaccion de coloracion con FeCl3, la muestra de extracto de Rosas cambio a una
coloracion roja rosada. Esto se debe a que la naturaleza polifenlica de los flavonoides,
especificamente compuestos con orto-difenoles, lleva a la formacion de coloraciones
variadas en presencia de FeCl3, que en este caso por presentar antocianinas produce
una coloracion roja rosada.

Conclusiones
1. Las diferentes especies vegetales estudiadas, en especial las drogas de estas,
como: los petalos de rosas; presentan diferentes tipos de flavonoids, utilizados
hoy en las industrias con fines terapeuticos, alimentarios, etc.
2. Mediante los metodos de extraccion y las reaccion de identificacion, las rosas
presentan heterosido flanonico antocianina.
3. La muestra problema de flavonoides, presenta una relacion de flujo determinado,
cercano a los estandares empleado en UV.

Bibliografa

BRUNETON JEAN, Farmacognosia, Editorial Acribia S.A. 2da Edicion ZARAGOZA,

Espaa
CLAUDIA KUKLISKI, Farmacognosia, Ediciones Omega, S.A, 2000, primera
impresin 2003
DOMINGUEZ XORGE, Mtodos de investigacin de fitoquimica
HARBONE J.B, Biochemistry of phenolic compounds, 1964
Catedra de Farmacognosia y medicina Tradicional, guia de practicasFarmacognosia, 2012
LOCK, O. Investigacion Fitoquimica, Metodo en el Estudio de Productos Naturales.
Fondo Editorial PUCP. Lima. 1994, pp.114-130