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Microscopia Optica

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MICROSCOPÍA ÓPTICA

El microscopio se inventó, hacia 1610, por Galileo, según los italianos, o por Jansen, según los
holandeses. Las primeras publicaciones importantes en el campo de la microscopia aparecen en 1660 y 1665
cuando Malpighi observa al microscopio los capilares sanguíneos. A mediados del siglo XVII, Leenwenhoek,
utilizando microscopios simples de fabricación propia, describió por primera vez protozoos, bacterias,
espermatozoides y glóbulos rojos. Durante el siglo XVIII el microscopio sufrió diversos adelantos mecánicos que
aumentaron su estabilidad y su facilidad de uso, aunque no se desarrollaron mejoras ópticas. Las mejoras más
importantes de la óptica surgieron en 1877 cuando Abbe publica su teoría del microscopio y por encargo de Carl
Zeiss mejora la microscopía de inmersión sustituyendo el agua por aceite de cedro lo que permite obtener
aumentos de 2000 Aº. A principios de los años 30 se había alcanzado el limite teórico para los microscopios
ópticos, sin conseguir aumentos superiores a 500X o 1000X. Actualmente, el desarrollo de la óptica ha permitido
mejorar la definición de los microscopios de luz, contando con una amplia gama de microscopios de este tipo. Sin
embargo, el límite de resolución de estos microscopios no permite observar estructuras que estén a una distancia
menor a 0,2 µm, por lo que se han desarrollado otros tipos de este instrumento tales como el microscopio
electrónico. Esta guía resume las partes y características del microscopio óptico compuesto, que será la principal
herramienta utilizada durante todo el semestre para los laboratorios de Biología Celular.

MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO COMPUESTO

El microscopio óptico ha sido por más de dos siglos la principal herramienta de trabajo de los científicos.
Una célula animal típica mide de 10 a 20 m de diámetro, lo que es unas 5 veces más pequeño que la partícula
más pequeña visible al ojo humano desnudo. Las células animales no-solo son pequeñas, sino que también son
incoloras y transparentes. La descripción de sus detalles internos se debe en gran parte, a que durante la última
parte del siglo XIX, se desarrollaron variadas tinciones que permitieron aumentar el contraste lo suficiente como
para hacer evidentes las diferentes estructuras intracelulares.
Aunque existen diferentes tipos de microscopios, todos están formados esencialmente por los mismos
componentes. A modo de repaso, recordaremos que sus componentes se han agrupado en tres sistemas
principales:

A. Sistema Mecánico:

Pie: Corresponde a la base de sustentación del aparato.


Columna: sostiene el espejo o el sistema de iluminación, el condensador, platina y el tubo con el sistema óptico
de amplificación.
Platina: plataforma horizontal con un orificio central que permite el paso de los rayos luminosos que atravesarán
la preparación. Consta de pinzas para sujetar la preparación, la que es desplazada por un carro móvil.
Tubo o Cañón: en su extremo superior lleva la lente ocular y en el inferior la lente objetiva. Se denomina tubo
binocular si posee dos lentes oculares.
Revólver o Tambor: Corresponde a una pieza giratoria en el extremo inferior del tubo. Moviliza por rotación los
diferentes objetivos de que dispone el microscopio.
Tornillos de Focalización: los microscopios tienen dos tornillos: macrométrico el que se utiliza para un enfoque
grueso, y el micrométrico que completa el enfoque de precisión. El tornillo micrométrico trae una escala
graduada y cada marca indica un avance de dos micrómetros ( m).
B. Sistema de Iluminación:

Fuente luminosa: Puede ser natural o artificial (luz blanca, ultravioleta, monocromática, etc.).
Espejo: tiene por función recibir la luz de la fuente luminosa y reflejarla sobre el condensador. Cuando se usa la
luz natural (difusa) se emplea la cara plana del espejo y si la luz proviene de una fuente cercana (concentrada) se
usa la cara cóncava. Los microscopios modernos no usan espejos pues su fuente de luz se ubica bajo el
condensador.
Condensador: Está formado por un sistema de lentes que enfoca la luz en el plano superior de la preparación.
Existen condensadores de Abbe compuestos de dos lentes (A.N.=1,20), condensadores de tres lentes (A.N.=1,40)
y condensadores acromáticos corregidos de sus aberraciones esféricas y cromáticas.
Diafragma Iris: Por debajo del condensador se dispone un diafragma regulable que gradúa la cantidad de luz que
llega a la preparación.
Anillo porta filtro: Corresponde a un anillo de metal situado bajo el condensador en el cual puede colocarse un
filtro de color. Al usar luz artificial rica en radiaciones rojas y amarillas de mayor longitud de onda, es
recomendable el uso de filtros azules o verdes que absorban las radiaciones de mayor longitud de onda
aumentando así el poder de resolución del aparato.

C. Sistema de Amplificación:

Lentes oculares. Son sistemas ópticos ubicados en la parte superior del tubo del microscopio. Consistentes en un
cilindro hueco que lleva dos lentes (simples o compuestos). La lente superior se denomina ocular y la inferior, de
campo o colectora. A veces se usan también los oculares de compensación, que en combinación con los objetivos
apocromáticos corrigen la aberración cromática restante de los objetivos. Así el objetivo apocromático corregido
concentra más los rayos azules, en tanto que los oculares compensadores concentran más los rojos. Como
resultado de la interacción la imagen aparece incolora. Los oculares se designan por su aumento (6X, 8X, 10X,
15X, 20X). Esto es importante por cuanto el aumento del microscopio es igual al producto del aumento del ocular
por el del objetivo. En resumen, la función de los oculares es aumentar la imagen real e invertida dada por el
objetivo y corregir algunos defectos de la misma, de manera que el ocular actúa como una lupa formando una
imagen virtual, aumentada y derecha de la imagen real dada por el objetivo.
Lentes Objetivas: Corresponden a sistemas de lentes ubicados inmediatamente encima del objeto o preparación.
Estas lentes dan una imagen aumentada, real e invertida. Existen diversos tipos de objetivos, los que se clasifican
según el medio interpuesto entre la lente y el objeto:
- Objetivos a seco: En estas lentes el medio interpuesto entre la lente y el objeto (preparación) es aire. Pueden
ser apocromáticos o corrientemente acromáticos.
- Objetivos de inmersión: El medio interpuesto es un líquido viscoso transparente con un índice de refracción
mayor que el del aire. Existen lentes de inmersión en agua o aceite (comúnmente aceite de cedro; n = 1,515). En
general este aceite tiene un n semejante al del vidrio que cubre la preparación (cubreobjetos) (n = 1,52). Su
función es concentrar los rayos que se habrían perdido por refracción en el portaobjetos.

Además, el microscopio tal como lo conocemos hoy tiene tres características fundamentales:
Poder de aumento: capacidad del microscopio de entregar imágenes aumentadas.
Poder de definición: capacidad del microscopio de dar imágenes nítidas de contornos precisos.
Poder de resolución: capacidad del microscopio de mostrar separados dos puntos, que a ojo desnudo
parecen como juntos.
Poder de penetración: capacidad del microscopio de mostrar a foco dos puntos que están en distintos
planos.

Poder de aumento: el aumento de un microscopio óptico está dado por el producto entre el aumento de la lente
objetiva que se está usando y el aumento de la (o las) lente(s) ocular(es):

Aumento Total = aumento lente objetiva X aumento lente ocular


Poder de resolución: Al definir esta capacidad del microscopio, obligadamente debe mencionarse el concepto de
Límite de resolución (LR), el que se define como la mínima distancia que debe haber entre dos puntos para que
éstos sean vistos como entidades separados.

Poder resolución = 1 / LR

El LR de un microscopio puede calcularse usando la fórmula de Abbe:

L.R = K _ __
AN

Esta ecuación es valida incluso para el ojo. El símbolo es la longitud de onda de la luz usada para iluminar el
objeto (0,5 μm para luz blanca), K es una constante que depende del índice de refracción del medio que hay entre
el objeto y la lente objetiva (0,61 para microscopio óptico), y AN es la apertura numérica.

Apertura Numérica (AN): Los objetos dispersan la luz. De esta manera, los rayos de luz que chocan con un punto
son dispersados, formando un cono de luz.
El ángulo de apertura , se forma entre el rayo que pasa exactamente por el centro de la lente y el último rayo
que entra por la periferia de la lente objetiva. Este ángulo permite medir la cantidad de luz que puede ingresar en
el objetivo.
Si se observan los valores de AN de las diferentes lentes objetivas de un microscopio dado, podrá apreciarse que
la AN aumenta con el aumento de cada lente, es así que en la tabla siguiente se muestran los aumentos de las
diferentes lentes objetivas y sus respectivas AN.

TABLA I
Aumento Objetivo AN
4X 0,1
10X 0,25
40X 0,65
100X 1,25

La fórmula de Abbe muestra que para aumentar la resolución, es decir disminuir el límite de resolución, se
pueden manipular sólo un pequeño número de variables: la longitud de onda de la luz que se usa ( ) y la apertura
numérica (AN) del objetivo con que se está realizando la observación Y es principalmente respecto a la
manipulación de la longitud de onda donde se han hecho la mayoría de las mejoras, creándose diferentes tipos de
microscopía que serán analizados más adelante en los laboratorios.

OBJETIVOS

Conocer la estructura y el funcionamiento del microscopio de luz.


Aplicar las normas de uso y cuidado del microscopio óptico.
Observar distintos tipos de muestras para comprender su funcionamiento.

PALABRAS CLAVES

Difracción y refracción de la luz, límite y poder de resolución, poder de penetración, poder de aumento y
poder de definición.
ACTIVIDAD PRÁCTICA

A. Evaluación del conocimiento previo que cada alumno posea respecto a las partes del microscopio y de su
utilización.

B. Cada alumno, observará una muestra de papel milimetrado con una letra impresa.
Enfocar la letra con la lupa (4,5x u otro según el caso). Realice las siguientes actividades.

Con un papel milimetrado mida la distancia entre el lente objetivo y la preparación en el portaobjeto.
Usando las líneas del papel milimetrado determine el diámetro del campo observado, luego el radio y a partir
de éste calcule el área del campo.
Usando las líneas del papel milimetrado determine el tamaño de la letra.

C. Enfocar la letra con el objetivo de 10x. Realice las siguientes actividades:

Mida la distancia entre el lente objetivo y la preparación con un papel milimetrado.


Describa como se ve la letra (derecha, invertida, difusa, etc.)
Desplace la platina a la derecha y a la izquierda ¿en qué dirección se mueve la letra?
Usando las líneas del papel milimetrado calcule el área del campo observado y compárelo con el observado a
través de la lupa.

D. Pasar al objetivo de 40x y responder lo siguiente:

¿La iluminación experimenta cambio?


Mida la distancia entre el lente objetivo y la preparación y compárela con las distancias obtenidas con la lupa
y el objetivo de 10x.

E. Se entregará a cada alumno una preparación de hilos de colores para evaluar la correcta colocación en la
platina y el correcto enfoque 10x.

Describa como varia la profundidad en la observación de hilos de colores cuando se cambia de objetivo 10x al
de 40x.
Determinar con cual de los dos aumentos se obtiene:

Mayor amplitud de campo


Menor distancia de trabajo
Mayor poder de resolución

BIBLIOGRAFÍA

 Abbas AK, Lichtman AH, Pober J. 2002. Inmunología Celular y Molecular. 4º Edición. Ed. McGraw-Hill-
Interamericana, Madrid, España.
 Alberts B, Bray D, Lewis J. 2002. Biología Molecular de la Célula. Ediciones Omega S. A. Barcelona.
 Darnell JH, Baltimore. 1994. Molecular Celll Biology. Scientific American Books, N.Y.
 De Robertis E, Hib J, Ponzio R. 2000. Biología Celular y Molecular. Ed. El Ateneo. Bs. Aires.
 Lodish, H. et al. 2002. Molecular Cell Biology. 5º Ed.
 Mathews, van Holde. 1999. Bioquímica. Mac Graw Hill-Interamericana. Madrid.
 Spotorno A, Hoecker G. 1993. Elementos de Biología Celular y Genética. Editado por el Departamento de
Biología Celular y Genética. Facultad de Medicina. Universidad de Chile.

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