UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

ALIMENTACION Y NUTRICION HUMANA

TEMA:
DETERMINACIN DE LA DIGESTIN IN VITRO DEL ALMIDN
PROFESORA:
Dra. RITVA REPO DE CARRASCO
ALUMNOS:
Mera Oyola, lizbeth
Jimnez Mercedes
Nez Campos, Benjamn.
Quispe Manrique, Carlos
Vereau Lezcano, Jean Paul
2013-I
PRACTICA 2
Determinacin de la digestibilidad in vitro del almidn.


OBJETIVOS

- Conocer el mtodo estndar para la hidrolisis del almidn con -amilasa y su
aplicacin en productos alimenticios con el fin de conocer su grado de digestibilidad in
vitro.

I. INTRODUCCIN

El almidn es uno de los componentes principales de la dieta humana y hasta hace
algunos aos era considerado como un carbohidrato disponible que era
completamente digerido y absorbido en el intestino delgado de los humanos. Sin
embargo, se observ que una fraccin del almidn resiste la hidrlisis por las enzimas
digestivas. Esta fraccin se denomina almidn resistente (AR) y fue definida por la
EURESTA (European Research Project on Resistant Starch) como la suma del almidn y
productos de la degradacin del almidn que no pueden ser absorbidos en el intestino
delgado de individuos sanos. El almidn resistente puede ser considerado como un
ingrediente que aumenta la calidad de los alimentos. Se lo llama as porque resiste a la
digestin por parte de las enzimas amilolticas y llega integro al intestino donde es
fermentado por las bacterias duodenales, esta resistencia a la hidrlisis puede ser
explicada por varios factores como grado y tipo de cristalinidad del grano de almidn,
contenido de amilosa, morfologa del grnulo, la presencia de complejos almidn-
lipdico y almidn-protena, etc. Pero que en la prctica mediante el uso del mtodo
que simula de forma elemental el proceso de digestin in vitro, se puede lograr
cuantificar el porcentaje de almidn hidrolizado como parte del almidn disponible.
El estudio de la hidrlisis enzimtica del almidn in vitro de esta prctica permite
obtener una informacin relativa de la biodisponibilidad del almidn in vivo.

Es por ello que en la presente prctica se realiz la determinacin de la tasa de
hidrolisis del almidn de tres muestras alimenticias: galleta de soda, pur de papa y
harina siete semillas, Y para ello se hidroliz con -amilasa hasta reducirlo a azucares
ms simples y reportarlos como equivalentes de maltosa mediante cuantificacin por
un mtodo espectrofotomtrico con DNS.







II. MARCO TERICO
2.1. Estructura de los grnulos de almidn
El tamao y forma del granulo de almidn vara entre especies e incluso entre variedades. En
general los grnulos de tubrculos (papa) son grandes y esfricos mientras en los cereales son
pequeos y polidricos, y los de las leguminosas en forma de rin (Gallant, 1992).
Los almidones de cereales presentan un patrn tipo A, mientras que los almidones de tubrculos
presentan un patrn tipo B, y las leguminosas un patrn intermedio tipo C, que es producto de
una mezcla de patrones tipo A y B (Gernat, 1990). Los almidones con patrn tipo B o C son ms
resistentes a la digestin que los almidones tipo A (Topping y Clifton, 2001). El factor que ms
influye en el tipo de patrn es la longitud de las cadenas de amilopectina, siendo ms cortas en los
almidones tipo A (que presentan de 23-29 unidades de glucosa) que en los del tipo B (30-40
unidades de glucosa).
Cuando los grnulos de almidn son tratados por calor, se desorganiza irreversiblemente su
estructura cristalina, incrementando la susceptibilidad al ataque enzimtico por -amilasas y en
consecuencia incrementando su digestibilidad (Prez y Oliva-Telles, 2002).
Cuando el almidn es calentado con un exceso de humedad se produce la gelatinizacin, que
consta de dos etapas. En la primera la disgregacin de los grnulos 60-70 C y la segunda a los 90
C aproximadamente el almidn pierde su estructura granular permaneciendo nicamente
fragmentos de amilopectina en una solucin amilosa (Jing Ming y Sen Lin, 1990). Sin embargo, la
respuesta de los almidones a diferentes condiciones de temperatura y humedad varan.

2.2. Digestin del almidn en el intestino delgado
El almidn debe ser completamente despolimerizado a glucosa para que pueda ser absorbido en
el intestino delgado. La despolimerizacin es llevada a cabo por diferentes enzimas que rompen
enlaces glucosidicos (1-4) y (1-6). Las enzimas que actan en especies monogstricas son las
- amilasas que rompen enlaces (1-4), liberando maltosa y dextrinas. En la digestin de
almidones la saliva que contiene enzimas que no actan sobre el enlace (1-6) por que tiene
poca afinidad por los enlaces terminales (Low y Longland, 1990).

2.2.1. Tamao de partcula.
El tamao de partcula afecta la digestin del almidn debido a que las partculas ms pequeas
(con mayor superficie especfica) facilitan la accin de las amilasas y se digieren ms rpidamente
(que las partculas con mayor volumen). De esta forma un mayor grado de molido o masticacin
pueden facilitar la digestin de los almidones. Liljeberg et al, 1992 estudiaron la digestibilidad in
vivo del almidn de cereales molidos o enteros a partir del ndice glicmico, comprobaron que los
granos enteros disminuyen el ritmo de digestin del almidn y por lo tanto reducen la
digestibilidad de la dieta. En consecuencia, tambin reducen o retrasan la glicemia e insulinemia
postprandial.
2.2.2. Matriz proteica
Los grnulos de almidn estn acompaados por otras materias vegetales que pueden inhibir el
acceso de las amilasas al granulo. En algunos casos los grnulos de almidn pueden estar
encapsulados en una matriz proteica y en otros casos con lpidos los cuales dificultan el accionar
de la enzima restringiendo su actividad hidroltica.
2.3. Almidn disponible (AD) en el haba (Vicia faba L.)
El valor nutritivo del haba se ha determinado mediante la digestibilidad de sus protenas o por su
aporte energtico, y su contenido de factores antinutricionales como los inhibidores de tripsina,
lectinas o taninos. Hay pocos estudios acerca de la digestibilidad del almidn del haba y mucho
menos como Parte de frmulas de mezclas de harinas y se han enfocado a la nutricin animal.
Debido a que las habas se almacenan por tiempos largos cuando estn secas (Silva y Osorio, 2007)
reportaron valores de almidn disponible 32. 9 %. (Tovar y Melito, 1996). Reportaron otros valores
para leguminosas 33.4% de almidn disponible en frijol.
2.4. Digestibilidad en productos trmicamente tratados.
Segn (Garca, 2007) el anlisis de la hidrlisis enzimtica in vitro del almidn de productos
horneados: se realiz por el mtodo de Holm et al. (1985), el cual permiti determinar la tasa de
digestin del almidn trabaj con -amilasa pancretica porcina, reducindose este en azucares
sealados como equivalentes de maltosa, determinados por espectrofotometra.
Afirman que produce una parcial o completa destruccin de la estructura cristalina de los grnulos
de almidn en el horneado lo que facilita el accionar de las enzimas. Adems al evaluar se observa
la velocidad de hidrlisis dela enzima - amilasa en las harinas horneadas aumenta a medida que
la temperatura de horneado de la harina se incrementa en un mismo tiempo.
Recomiendan tambin el uso de las harinas horneadas por conveccin, previamente gelatinizadas
en ese experimento para incrementar la disponibilidad enzimtica del almidn.

III. MATERIALES Y MTODOS

3.1. Muestra alimenticia
Se trabaj con tres muestras de alimentos ricos en almidn: Harina de 7 semillas, pur de papa y
galleta de soda.

3.2. Materiales
Material de vidrio: Erlenmeyer, pipetas, tubos de ensayo, etc.
Micropipeta de 20-200 uL
Micropipeta de 100-1000 uL

3.3. Reactivos
Amilasa SIGMA TIPO IA 1200 U/mg (27 mg/ml). Diluir 56 uL de enzima con 16 ml de
tampn fosfato (preparar dentro de los 30 minutos previos al comienzo de la hidrlisis).
Tampn fosfato. Disolver en aproximadamente 700 mL de agua destilada 3.03 g de
KH
2
PO
4
, 3.96 g de Na
2
HPO
4
y 0.40 g de NaCl. Llevar a pH 6.9 y aforar a 1000 ml.
Solucin de DNS. Disolver 11 g de NaOH, 10 g de cido dinitrosaliclico (DNS), 2 g de fenol
y 0.5 g de bisulfito de sodio en agua destilada; enrasar en una fiola de 1000 ml.
Sal de Rochelle. Preparar una solucin al 40% (pv) de tartrato de sodio y potasio en agua
destilada.
3.4. Equipos
Balanza analtica
Bao mara
Cocina
Espectrofotmetro
Vortex
3.5 Procedimiento
Pesar 500 mg de almidn o su equivalente en un Erlenmeyer de 150 ml.
Aadir 55 ml de tampn fosfato mximo 30 minutos antes de iniciar la hidrlisis. Parael
caso de harinas, la muestra debe ser cocinada antes del anlisis. Para ello, aadir 30 ml de
tampn y hervir con agitacin constante durante toda la coccin. Esto puede hacerse 1
1.5 h antes de iniciar la incubacin.
Colocar el Erlenmeyer en bao de agua a 47C con agitacin. Dejar que se estabilice la
temperatura.
En los primeros 5 minutos, y antes de adicionar la encima, tomar dos alcuotas de 200 uL
de muestra y marcar como tiempo cero (0 min).
Aadir 1.25 mL de al Erlenmeyer y luego incubar a 37C durante 1 hora con agitacin
continua.
Dentro de ese tiempo de incubacin de una hora, tomar muestra a los 5, 15, 30 y 60
minutos, las alcuotas de 200 uL sern aadidas a una galera de tubos de ensayo
codificados y conteniendo las cantidades de reactivos que se muestran en el cuadro 1.
Preparar un blanco de muestra (BM).
Preparar un blanco-tampn (BT) para calibrar el equipo como se muestra en el cuadro 1.
Hervir los tubos en un bao de agua durante 5 min. Agregar 1 ml de sal de Rochelle.
Aadir 10 ml de agua destilada. Mezclar.
Leer las absorbancias a 550 nm ajustando el cero de absorbancia en el espectrofotmetro
con el blanco tampn.
Cuadro 1: Procedimiento de la batera de trabajo
MUESTRA DNS (ml) MUESTRA (ul) AGUA (uL) ESTANDAR (uL)
BM
0 min
5 min
15 min
30 min
60 min
BT
3.0
3.0
3.0
3.0
3.0
3.0
3.0
0.0
200
200
200
200
200
200 tampn
500
300
800
800
800
800
800
500
500
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0


IV. RESULTADOS Y DISCUSIN

RESULTADOS
Cuadro 2: mg de almidn provenientes de cada muestra
Muestra Peso (g) % de almidn mg de almidn
Harina 7 semillas 1.3 69% 897
Pur de papa 2.5 80.64% 2016
Galleta de soda 0.6 77.5% 465


Cuadro 3: Absorbancia de las diferentes muestras a diferentes tiempos
Tiempo
(min)
Harina 7 semillas Pur de Papa Galleta de soda
R1 R2 Prom R1 R2 Prom R1 R2 Prom
0 0.029 - 0.029 0.016 0.021 0.019 0.15 0.16 0.16
5 0.040 0.038 0.039 2.896 2.792 2.844 0.317 0.2744 0.2907
15 0.040 0.045 0.043 3 3 3 1.19 1.237 1.2135
30 0.096 0.091 0.094 3 3 3 1.544 1.536 1.54
60 0.119 0.117 0.118 3 3 3 1.586 1.683 1.6345

Absorbancia del blanco de la muestra: 0.024
Se utiliz la siguiente ecuacin para calcular los mg de maltosa/ml en cada muestra:
Y = 0.7245X 0.0768
Dnde: Y = mg de maltosa/ ml
X = Absorbancia
Luego se us la siguiente ecuacin para calcular el % de hidrlisis
% hidrlisis = (mg maltosa tiempo X mg de maltosa tiempo 0 )*0.95*100/mg muestra
Con los valores obtenidos de ambas ecuaciones se construy el siguiente cuadro:
Cuadro 4: % de hidrlisis de las diferentes muestras a diferentes tiempos
Tiempo
(min)
Harina 7 semillas Pur de papa Galleta de Soda
mg de maltosa %hidrlisis mg de maltosa %hidrlisis mg de maltosa %hidrlisis
0 0.1460 0.0005 0.132229124 0 0.3268 0.0297
5 0.1598 0.0010 4.031469979 0.1482 0.5072 0.0286
15 0.1654 0.0014 - - 1.7810 0.2302
30 0.2357 0.0066 - - 2.2316 0.3016
60 0.2689 0.0090 - - 2.3620 0.3222

(*) Los valores de los tiempos 15 min en adelante del pur de papa fueron descartados por
salirse de la escala del espectrofotmetro y se les consider como outsiders.

Figura 1: Digestibilidad del almidn de la harina de 7 semillas en el tiempo


En la figura 1 se observa una clara tendencia de subida en el % de hidrlisis a travs del tiempo lo
que nos hace suponer que si se hubieran tomado ms muestras en tiempos superiores el
porcentaje de hidrlisis hubiera sido superior. As mismo se observa que el porcentaje de hidrlisis
en la harina de 7 semillas va aumentando linealmente a travs del tiempo con un valor de
correlacin de 0.9238, muy cercano al valor de 1, lo cual nos indica lo cercano que estn los
puntos experimentales a la tendencia lineal que se mencion anteriormente. En la prctica el
porcentaje de hidrolisis se realiz como una medida indirecta de la digestibilidad del almidn
mediante la concentracin de la maltosa.
Las siete semillas (son generalmente cereales), y los almidones que presentan son de patrn
tipo A, que son ms digestibles que los de la patrn B y C segn (Topping y Clifton, 2001) El factor
que ms influye en el tipo de patrn es la longitud de las cadenas de amilopectina, siendo ms
cortas en los almidones tipo A (que presentan de 23-29 unidades de glucosa). En la figura 1, se
observa que conforme pasa el tiempo el porcentaje de hidrlisis aumenta debido al tratamiento
del calor que desorganiza irreversiblemente los grnulos de almidn , incrementando la
susceptibilidad al ataque enzimtico por -amilasas y en consecuencia incrementando su
digestibilidad segn (Prez y Oliva-Telles, 2002).
Los tamaos de partculas de los grnulos de almidn, tambin influyen a la digestibilidad, segn
(Liljeberg et al, 1992) estudiaron la digestibilidad in vivo del almidn de cereales molidos y
enteros, manifestndose que la digestibilidad en los molidos es ms digerible que los enteros. En
la prctica se realiz digestibilidad de la harina de siete semillas con un porcentaje de almidn
y = 0.0002x + 0.0003
R = 0.9238
0.0000
0.0010
0.0020
0.0030
0.0040
0.0050
0.0060
0.0070
0.0080
0.0090
0.0100
0 10 20 30 40 50 60 70
%

d
e

h
i
d
r

l
i
s
i
s

Tiempo (min)
Digestivilidad del Almidn de la harina de
7 semillas en el tiempo

disponible de 69% (cuadro 2), sin embargo, en la mezcla de la harina de la siete semillas no se
conoce la proporcin de la cantidad de harinas de cada unidades(haba, maz, trigo, cebada,
Kiwicha, quinua) lo que esto dificulta saber el almidn disponible de cada elemento.
Figura 2: Digestibilidad del almidn del pur de papa en el tiempo



Segn la ISSN 0716-8756 (1995) indica que el pur de papa posee 14.4 g de almidn/ 100gr de
pur mientras que nuestro valor prctico result 32.26 g de almidn/ 100gr de pur segn su tabla
de composicin del producto.
The History Channel Latin America (2013) nos menciona que para obtener el polvo del pur de
papas instantneo hace falta hervir las papas a 70C y posteriormente enfriarlo a 20C. De esta
manera se rompe la estructura de la papa, para luego poder mezclarla fcilmente con los aditivos
necesarios. Luego se calienta a 150C y, por ltimo, la masa resultante se la hace polvo para
finalmente ser envasada. Por lo que podemos decir que nuestro pur ha sido pre-cocido.
Muoz (1990) citado por Tarazona (1995) nos menciona que el cocimiento produce la
gelatinizacin del almidn hacindose ms susceptible al ataque enzimtico durante el
metabolismo ya mencionamos que para la elaboracin del pur se ha pre-cocido lo que ha
facilitado su digestin con las enzimas.
y = 0.0296x
R = 1
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
0.16
0 1 2 3 4 5 6
%

d
e

h
i
d
r

l
i
s
i
s

Tiempo (min)
Digestivilidad del Almidn del pur de
papa en el tiempo

Tarazona (1995) nos menciona que la mayor o menor porcentaje de digestibilidad puede estar
asociado al grado de gelatinizacin de los almidones durante el proceso de coccin, es deseable
que este sea superior a 90% para que haya una eficiente digestin y asimilacin. Nos menciona
que la digestibilidad del pur de papa es de 95.08%.
Podemos observar en la figura 2 que conforme aumenta el tiempo el porcentaje de hidrlisis
aumenta, a pesar que son dos puntos como se mencion anteriormente. Segn Araya (s.f) el pur
de papas posee una rpida absorcin. Tambin nos menciona que el pur de papa es digerido
rpidamente y su efecto glicmico es similar al de una carga equivalente de glucosa. Se podra
decir que estos dos puntos tratan de interpretar esta lo que nos mencionan todos los autores, la
facilidad de digestin del almidn por la enzima.
Adems de los datos obtenidos al momento de realizar la prueba experimental de la digestibilidad
in vitro del pur de papa se apreci el cambio a color oscuro que sufri la muestra por su reaccin
con el DNS. Lo que nos indicaba la presencia de glucosa por la hidrolisis del almidn.

Figura 3: Digestibilidad del almidn de la galleta de soda en el tiempo

En el grfico se observa una clara tendencia de subida en el % de hidrlisis a travs del tiempo sin
embargo a medida que la curva avanza, la pendiente de la misma disminuye. As mismo se observa
que el porcentaje de hidrlisis en la galleta de soda va aumentando cuadrticamente con un valor
y = -0.0002x
2
+ 0.0152x + 0.0054
R = 0.9489
0.0000
0.0500
0.1000
0.1500
0.2000
0.2500
0.3000
0.3500
0.4000
0 10 20 30 40 50 60 70
%

d
e

h
i
d
r

l
i
s
i
s

Tiempo (min)
Digestivilidad del Almidn de galleta de
soda en el tiempo

de correlacin de 0.9489. Como este valor es cercano a 1, se entiende que la ecuacin propuesta
es la ms cercana al comportamiento real de la digestibilidad del almidn de galleta de soda en el
tiempo hasta llegar a un % de hidrlisis mximo donde terminar la digestin.
La galleta de Soda, est compuesta por una masa cracker se caracteriza por su bajo porcentaje
de azcar y grasa respecto al agua y la harina (Champ, 2003).
Garca, 2007 Afirma que produce una parcial o completa destruccin de la estructura cristalina de
los grnulos de almidn en el horneado lo que facilita el accionar de las enzimas. Adems al
evaluar se observa la velocidad de hidrlisis de la enzima - amilasa en las harinas horneadas
aumenta a medida que la temperatura de horneado de la harina se incrementa en un mismo
tiempo.
Lo mencionado por Garca (2007) se puede comprobar en la prctica, al observar la lnea de
tendencia de la hidrlisis del almidn de la galleta de soda. Presenta una lnea de tendencia
cuadrtica, que implica que debido a su composicin del almidn la mayor cantidad de hidrlisis
del almidn sucede en los primeros 20 minutos, despus la hidrlisis es lenta a casi estable en el
tiempo.
Se puede explicar debido a las estructura de capas que presenta la galleta de soda, facilitando la
digestin del almidn.
Segn Fandila (2010) nos dice que el almidn es hidrolizado y absorbido en el intestino delgado,
estn en funcin de su hidrlisis y absorcin en el intestino delgado. Proponiendo una
clasificacin del almidn en: almidn de digestin rpida (ADR), almidn de digestin lenta (ADL) y
almidn resistente (AR).
ADR es aquella fraccin en que la cantidad de glucosa es liberada despus de los 20
minutos de hidrlisis.
ADL es la fraccin de almidn que no es hidrolizado despus de entre 20 y 120 minutos
despus de la hidrlisis.
AR es la cantidad de almidn que no es hidrolizado despus de los 120 minutos de
hidrolisis
Segn la explicacin que nos ofrece Fandila, la galleta de soda presenta almidn de digestin
rpida, como se puede observar en la figura 3, donde la mayor parte de la hidrlisis ocurre en los
primero 20 minutos, teniendo su mximo a los 40 minutos. Se pude deducir que la galleta
presenta almidn de fcil digestin, as como almidn de digestin lenta.


V. CONCLUSIONES
-
-
-
-
-


VI. CUESTIONARIO
1. Qu factores afectan la digestibilidad de los almidones?
Existen factores intrnsecos y extrnsecos que pueden influir en los valores de digestin
obtenidos (Annison y Topping, 1994). Uno de ellos es la relacin amilosa/amilopectina
presente (Annison y Topping, 1994, Bjorck, 1996), almidones con niveles elevados de
amilosa presentan velocidades de digestin ms bajas, sugirindose que los almidones con
alto contenido de amilosa incluyen una gelatinizacin incompleta de sta durante
condiciones normales de cocinado, la retrogradacin de la amilosa es otra causa que
influye en las bajas velocidades de hidrlisis (Bjorck, 1996), el tamao de grnulo del
almidn que algunos casos es producto del origen botnico, variedad o ecotipo y el tipo de
procesamiento del alimento.

2. Qu relacin existe entre la digestibilidad in vitro del almidn y porcentaje de
gelatinizacin?
La gelatinizacin produce una pasta de almidn. Tambin induce un drstico aumento de
la susceptibilidad del almidn a la hidrlisis de las enzimas especficas, las amilasas. Por
eso un almidn gelatinizado se digiere ms rpidamente. Estas transformaciones del
almidn y la modificacin de la velocidad de digestin de los carbohidratos que resulta de
ellas han sido estudiadas en diversos procesos de fabricacin.

VII. BIBLIOGRAFA

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VIII. Anexos