R. Ruiz; J.

Vsquez

Revista Amaznica de Investigacin Alimentaria, v.1, n 1, p. 22 - 29 (2001)

Facultad de Ingeniera en IndustriasAlimentarias UNAP, Iquitos-Per ISSN: 000000

HIDRLISIS ENZIMTICA DE DESECHOS DEL UMAR (Poraqueiba sericea Tulasne) Y DE LA YUCA (Manihot esculenta Crantz)
Roger Ruiz Paredes
MSc. en Ingeniera de Alimentos por la UNICAMP (Brasil). Ingeniero. Docente de la Facultad de Ingeniera en Industrias Alimentarias de la Universidad Nacional de la Amazona Peruana. Iquitos. Per. ingalim@terra.com.pe

Jessy Patricia Vsquez Chumbe

Biloga. Docente de la Facultad de Ingeniera en Industrias Alimentarias de la Universidad Nacional de la Amazona Peruana, Iquitos, Per.

RESUMEN Se estudi la hidrlisis de la torta de yuca (Manihot esculenta Crantz) y umar (Poraqueiba sericea Tulasne) con las enzimas comerciales alfa-amilasa Fungamyl 5000 BG, de Aspergillus oryzae, amiloglucosidasa AMG 300 L de Aspergillus niger, y celulasa Celluclast 1.5L de Trichoderma reesei. En la hidrlisis del almidn de la torta se obtuvo productos de mayor valor Equivalente de Dextrosa (ED) y ms estables en concentracin de torta al 6% (p/p), tratamiento trmico a 75C por 5 minutos, hidrlisis con alfa amilasa en una concentracin de 0.1% p/p de la torta. La combinacin de alfa-amilasa con amiloglucosidasa demostr un aumento del valor de ED, teniendo para la yuca un valor de 38.7 y para el umar 37.7, a una concentracin para ambas enzimas de 0.1% p/p de la torta por 60 minutos. La combinacin de alfa-amilasa, amiloglucosidasa y celulasas, mostr un incremento del valor de ED, teniendo para la yuca 48.95 y para el umar 48.76, a una concentracin de enzimas de 0.1% para alfa-amilasa y amiloglucosidasa y 1% para la celulasa. Palabras Claves: Umar, Poraqueiba sericea, Yuca, Manihot esculenta, Hidrlisis Enzimtica, Alfa-amilasa, Amiloglugosidasa, Celulasa

1. INTRODUCCIN La hidrlisis enzimtica es importante en la industria alimentaria por los efectos fisicoqumicos u organolpticos que produce, tales como la disminucin de la viscosidad, mejora de la filtrabilidad, disminucin de la tendencia a la cristalizacin, clarificacin y estabilizacin de los lquidos con vistas a su conservacin, insolubilizacin de macromolculas por formacin de cogulos, mejora en la fermentabilidad, mejora de la estabilidad bacteriolgica, correccin de las

deficiencias enzimticas de origen natural, mejora de la textura y las caractersticas organolpticas, aumento del poder edulcorante y otros (Wiseman, 1991). Segn Montaldo (1972), la yuca fresca tiene alrededor de 61% de humedad, 1.2% de protenas, 0.4% de grasas, 34.9% de carbohidratos, 1.2% de fibras y 1.3% de cenizas; mientras que al secarse las protenas suben a 3.1%, grasa a 1.1%, carbohidratos a 89.4%, fibra a 3.1% y cenizas a 3.3%. Por su parte, el almidn de yuca tiene 14.5% de humedad, 0.85% de sustancias nitrogenadas,

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0.35% de grasa, 84.0% de almidn, 0.20% de cenizas y trazos de celulosa. El umar (Poraqueiba sericea Tulasne) descrita por Tulasne en 1849, es una especie propia de la selva baja que crece preferentemente en suelos prximos al ro Amazonas y algunos de sus tributarios con suelos aluviales, frtiles y de textura arenosa (Gutirrez, 1969). Generalmente se consume en forma directa como fruta, desechndose la semilla que constituye aproximadamente el 74% del fruto. Esta semilla posee un significativo porcentaje de almidn que puede ser extrado y utilizado. Este almidn seco posee 0.47% de protena, 0.014% de grasa, 0.54% de ceniza, 0.03 de fibra y 98.95% de carbohidratos. La torta residual de la extraccin del almidn es una mezcla de celulosa, protenas, hemicelulosa y almidn remanente que no debe ser mayor al 5% (Aguirre, 1987). La alfa-amilasa (Alfa 1,4-D- Glucan Glucano-hidrolasa) hidroliza los enlaces glucosdicos alfa-1,4 de los polisacridos que poseen 3 o ms unidades de D-glucosa en unin alfa-1,4. El ataque se hace en forma no selectiva (tipo endoenzima) sobre varios puntos de la cadena simultneamente, aunque los primeros productos de la hidrlisis son siempre oligosacridos de 5-7 unidades de glucosa, o un nmero mltiplo (Braverman, 1980). La amiloglucosidasa (Alfa-1,4- D-Glucan glucohidrolasa) es una exohidrolasa tambin conocida como glucoamilasa, que hidroliza los enlaces glucosdicos alfa-1,4 y alfa-1,6 de la amilosa y la amilopectina separando unidades de glucosa a partir del extremo no reductor de la cadena (Braverman, 1980). Puesto que la glucoamilasa es la nica entre
1

todas las amilasas que libera glucosa a partir del almidn en un tiempo relativamente corto, se lo puede valorar determinando la glucosa formada tras un corto tiempo de reaccin, para ello se emplean glucosaoxidasa y peroxidasa o mejor hexoquinasa y glucosa6-p-deshidrogenasa (Benavides et al., 1985). La celulasa forma parte de las paredes celulares de las plantas e hidroliza los enlaces beta-1,4 glucano de las cadenas de celulosa y de sus productos de degradacin formando, glucosa, celobiosa y polmeros de la glucosa ms grandes, adems de ocasionar disminucin en la viscosidad (Novo Nordisk, 1999). El pH ptimo de los sistemas celulolticos suele estar entre 4-6. Son termoestables y la temperatura ptima para algunos de ellos se encuentra alrededor de 60C. Se trata por lo tanto de dos parmetros favorables para la aplicacin tcnica siempre que se consiga aumentar la actividad celuloltica y hacer a la celulosa atacable por los sistemas enzimticos mediante un tratamiento previo sencillo (Benavides et al., 1985). 2. MATERIALES Y MTODOS 2.1 Materia prima e insumos Materia prima: se utilizaron los residuos (torta) que resultan de la extraccin del almidn de la yuca y de la semilla del umar Enzimas: i) Fungamyl 5000 BG de Novo Nordisk, producido a partir de una cepa de Aspergillus oryzae, con actividad1 declarada de 5000 FAU/g ; ii) Celluclast 1.5 L de Novo Nordisk con actividad2 declarada de 700 EGU/ g ; iii) AMG 300 L de Novo Nordisk, amiloglucosidasa obtenida de Aspergillus

Una unidad de Alfa-Amilasa Fngica (1 FAU) corresponde a la cantidad de enzima que descompone 5.26 g de almidn soluble por hora, bajo condiciones estndar: Tiempo de reaccin: (7-20 min),, Temperatura (37C), pH: 4.7. En la ficha tcnica se observa que las mejores condiciones de trabajo son 45-50C y pH 4.0-5.0. NOVO NORDISK (1999). Una unidad Endo-Glucanasa (1 EGU) es la cantidad de enzima que bajo condiciones estndar, degrada el CMC. Para las aplicaciones prcticas las mejores condiciones de trabajo son: Temperatura (50-60C), pH (4.5-6.0), densidad (1.2g/mL), sustrato (CMC), tiempo de reaccin (20 min).

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niger con actividad3 declarada de 300 AGU/ mL. 2.2 Equipos

- Determinacin de carbohidratos (Mtodo de Diferencia). - Determinacin de acidez titulable 2.5 Procedimiento experimental

Agitador magntico, balanza analtica Sartorius, bao termosttico, potencimetro, viscosmetro, estufa, mufla, extractor Soxhlet, refractmetro, equipo Kjeldahl, refrigeradoracongeladora marca Friolux. 2.3 Materiales y reactivos Micropipeta de 100 1000 L, micropipeta de 5-50 L, bureta graduada, erlenmeyers de 50, 100, 250 y 500 mL, papel filtro, pipetas volumtricas de 5, 10, 25 mL, soportes, balones volumtricos, vasos de precipitado, cpsulas de porcelana, campana de desecacin, mortero y piln, tips para micropipeta otros. Solucin de yodo diluida (1:5), solucin de CMC al 1%, NaOH al 1% y 40%, HCl al 1%, solucin de Fehling A, reactivo de Fehling B, indicador de azul de metileno al 1%, cido sulfrico 0.25N, NaOH 0.25N, ter de petrleo, indicador rojo de metilo, soluciones buffer de 4 y 7, papel indicador universal, almidn soluble, maltosa, tampn acetato 0.1M, buffer tris-maleato, CaCl2 , NaCl, fosfato disdico, fosfato monosdico. 2.4 Mtodos de anlisis - Determinacin de humedad (Mtodo segn la A.O.A.C - Modificado). - Determinacin de ceniza (Mtodo segn la A.O.A.C - Modificado). - Determinacin de grasa (Mtodo segn la A.O.A.C - Modificado). - Determinacin de protenas totales (Mtodo Kjedhal segn la A.O.A.C - Modificado).

2.5.1 Hidrlisis de la torta del umar y la yuca con alfa-amilasa. Se estudi la cintica de la hidrlisis con Fungamyl 5000 BG de suspensiones de la torta al 6%, previamente sometida a tratamiento trmico, pH de 4.7 y 50C. La hidrlisis se evalu a 0, 30, 60, 90 y 120 minutos, utilizando tres concentraciones para la enzima: 0.01, 0.05, 0.1% (p/p almidn). Despus de cada hidrlisis la enzima se inactiv a 95C por 5 minutos. Los resultados se midieron como tiempo y concentracin ptima. 2.5.2 Efecto de la combinacin de la alfaamilasa y la amiloglucosidasa en la hidrlisis de la suspensin de la torta de yuca y de umar. Con el fin de incrementar el porcentaje de recuperacin de slidos, se estudi la influencia de una enzima que adems de actuar sobre los enlaces alfa 1,4, tenga actividad sobre las ramificaciones alfa 1,6. Con tal finalidad se estudi los mejores tratamientos obtenidos en la hidrlisis con la alfa-amilasa Fungamyl 5000 BG, combinados con la amiloglucosidasa AMG 300 L, en dos diferentes concentraciones: 0.05 y 0.1% (p/p de la torta), pH de 4.5 y 55C. La hidrlisis se realiz en 100g de suspensin de torta de yuca y umar, con 0.10% de alfa amilasa, combinada con 0.05 y 0.10% de amiloglucosidasa. La hidrlisis se realiz por 60 minutos.

Una unidad de Amiloglucosidasa (1 AGU) se define como la cantidad que hidroliza 1 micromol de maltosa por minuto bajo condiciones estndar: Temperatura (60C), pH (4.5, tampn acetato 0.1M), tiempo de reaccin (30 min).

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Torta
Agua Suspensin de la torta (6%) Acondicionamiento pH Tratamiento trmico 75C/5' Enzima Hidrlisis enzimtica

amilasa y amiloglucosidasa que corresponde a la concentracin 0.1% para ambas enzimas, mientras que las concentraciones de la celulasa fueron 0.5 y 1% p/p. 3. RESULTADOS Y DISCUSIN 3.1 Composicin de las tortas de yuca y de umar La Tabla 1 presenta la composicin proximal, en porcentaje msico, y las caractersticas fisicoqumicas de las tortas de yuca y de umar, utilizados como materia prima en la presente investigacin.
Tabla 1: Composicin porcentual y caractersticas fisicoqumicas
Componente Torta de yuca Torta de umar 13.55 1.05 0.70 2.05 0.50 84.20 86.45 347.30 0.12 4,82 18.9 12.66 9.45 14.17 12.71 0.92 62.80 87.34 416.53 0.06 5.21 12.8

Inactivacin 95C/5'

Centrifugacin 5000 rpm/5'

Sobrenadante

Torta

Humedad Protena Grasa Fibra Ceniza Carbohidratos Materia seca Caloras (Kcal) Acidez pH a 20C Almidn

Figura 1: Diagrama de flujo para la hidrlisis enzimtica de la torta del umar y de la yuca.

3.2 Hidrlisis por accin de las diversas enzimas Como se observa en la Tabla 2, los valores de Equivalente de Dextrosa (ED) fueron superiores en la concentracin 0.10% y 60 minutos: 24.00 para la yuca y 23.52 para el umar. El aumento en el tiempo despus de los 60 minutos es insignificante, por lo que sera un desperdicio de recursos aumentar ms all de 60 minutos el tiempo de hidrlisis. Las Figuras 2 y 3, por su vez, muestran tres etapas en la cintica del ED: en la primera la velocidad de produccin de azcares reductores es proporcional respecto al tiempo, tambin se puede decir que hay elevada concentracin del sustrato, el cual estara

2.5.3 Efecto de la combinacin de la alfaamilasa, la amiloglucosidasa y la celulasa en la hidrlisis de la suspensin de la torta de yuca y de umar Con este tratamiento se busc intensificar la hidrlisis de la torta, mediante la adicin de la celulasa, adems de la alfa-amilasa y la amiloglucosidasa, con la finalidad de degradar las paredes celulares que se encuentran compuestas de celulosa y de esta manera incrementar la concentracin de glucosa en el hidrolizado. Los ensayos se realizaron en 100g de suspensin al 6% de torta. Se eligi el mejor tratamiento de la combinacin alfa-

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Tabla 2: Hidrlisis del almidn en una suspensin al 6%(p/p) de las tortas de yuca y umar con Fungamyl 5000 a pH 4.7 y 50C

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Porcentaje 2 de Fungamyl 5000 BG / minutos Blanco1 0.01 30 ALMIDN DE TORTA DE YUCA 9.95 0.74 1.30 1.32 0.045 + 48.00 + ALMIDN DE TORTA DE UMAR 9.75 0.73 1.27 1.30 0.044 + 47.00 + 20.38 + 19.40 + 19.89 18.83 + + 20.89 + 34.79 1.86 4.90 4.85 0.00 + 34.39 6.35 5.14 5.00 0.00 + 33.93 33.54 10.53 12.66 5.15 5.39 5.20 5.85 0.069 0.00 34.37 11.04 4.90 4.99 0.09 35.67 19.74 4.66 4.66 0.00 21.29 + 31.88 30.52 21.34 21.55 4.90 5.39 4.89 5.09 0.00 0.00 22.92 21.54 + + 32.48 18.40 5.15 5.00 0.00 21.11 + 35.80 23.52 4.59 4.73 0.16 21.63 + 31.48 31.19 23.88 24.03 5.34 5.39 5.11 5.21 0.00 0.00 20.92 20.94 + + 20.90 + 19.80 + 20.30 19.21 + + 21.32 + 21.72 + 23.39 21.98 + + 35.50 1.90 5.00 4.95 0.00 + 35.10 6.48 5.25 5.10 0.00 + 34.62 34.22 10.74 12.92 5.25 5.50 5.31 5.97 0.07 0.00 35.07 11.27 5.00 5.08 0.09 36.40 20.14 4.75 4.76 0.00 32.53 31.14 21.78 21.99 5.00 5.50 4.99 5.19 0.00 0.00 33.14 18.78 5.11 5.11 0.00 21.54 + 36.53 24.00 4.83 4.83 0.17 22.07 + 32.14 31.83 24.37 24.52 5.21 5.31 5.21 5.31 0.00 0.00 21.35 21.37 + + 60 90 120 30 60 90 120 30 60 0.05 0.10 90 120

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Caracterstica

Sobrenadante Peso (%)3 Equivalente de dextrosa Slidos solubles (%) Slidos totales (%) Slidos insolubles (%) Reaccin con Yodo Torta residual Retencin de slidos (%BS) Reaccin con Yodo

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Sobrenadante Peso (%)3 Equivalente de dextrosa Slidos solubles (%) Slidos totales (%) Slidos insolubles (%) Reaccin con Yodo Torta residual Retencin de slidos (%BS) Reaccin con Yodo

Sin hidrlisis enzimtica Concentracin en porcentaje (p/p) referido a la torta Porcentaje (p/p) referido a la suspensin

Hidrlisis Enzimtica de Desechos del Umar y de la Yuca

30 Equivalente de Dextrosa 25 20 15 10 5 0 30 50 70 90 110

0.05% 0.10%

130

Tiempo (min)
0.01% 0.05%

Figura 2: Cintica del ED en el hidrolizado de la torta de yuca

30 25 Equivalente de Dextrosa 20 15 10 5 0 30 50 70 90 110

0.05% 0.10%

130

Tiempo (min)
0.01% 0.05%

Figura 3: Cintica del ED en el hidrolizado de la torta de umar

saturando a la enzima. En la segunda etapa la formacin de producto es menos dependiente del tiempo, la concentracin del producto ha aumentado y la velocidad de reaccin ha disminuido con respecto a la primera etapa. La ltima etapa muestra independencia entre la formacin de producto y el tiempo, y la velocidad de reaccin tiende a ser constante.

En la Tabla 3 se observa que la amiloglucosidasa no tiene influencia sobre la cantidad de sobrenadante recuperado. Tambin se puede observar que los valores de ED aumentan entre 10 a 14 unidades. Teniendo los mximos valores de ED para la torta de yuca 38.7 y para la torta de umar 37.7, para la concentracin de 0.1% de alfaamilasa y 0.1% de amiloglucosidasa, en un

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Tabla 3: Hidrlisis del almidn en una suspensin al 6%(p/p) de las tortas de yuca y umar con una combinacin de alfa amilasa y amiloglucosidasa a pH 4.5 y 55C
Concentracin de Enzimas (p/p)1 Caracterstica Alfa amilasa + Amiloglucosidasa 0.10 0.10 + 0.05 ALMIDN DE TORTA DE YUCA 36.53 24.00 4.68 4.83 0.17 33.63 34.02 4.90 5.00 0.10 Alfa amilasa Alfa-amilasa + Amiloglucosidasa 0.10 + 0.10 38.20 38.70 4.95 5.20 0.30 19.73 38.10 37.70 4.85 5.10 0.29 17.99

Sobrenadante Peso (%)2 Equivalente de dextrosa Slidos solubles (%) Slidos totales (%) Slidos insolubles (%) Torta residual Retencin de slidos (%BS) Sobrenadante Peso (%)2 Equivalente de dextrosa Slidos solubles (%) Slidos totales (%) Slidos insolubles (%) Torta residual Retencin de slidos (%BS)
1 2

22.07 23.74 ALMIDN DE TORTA DE UMAR 35.80 23.52 4.59 4.73 0.16 21.63 34.63 33.02 4.79 4.90 0.19 22.95

Porcentaje (p/p) referido a la torta Porcentaje (p/p) referido a la suspensin

Tabla 4: Hidrlisis del almidn en una suspensin al 6%(p/p) de las tortas de yuca y umar con una combinacin de las 3 enzimas pH 4.5 y 60C

Concentracin de Enzimas (p/p)2

Caracterstica Blanco Alfa amilasa Alfa-amilasa + + Amiloglucosidasa Amiloglucosidasa 0.10 0.10 + 0.05 0.10 + 0.10 ALMIDN DE TORTA DE YUCA 38.20 38.70 4.95 5.20 0.30 37.50 44.00 4.95 4.78 0.49 37.95 48.95 4.85 5.37 0.42 20.75 37.85 48.76 4.75 5.35 0.40 18.75
1

Alfa amilasa

Sobrenadante 3 Peso (%) Equivalente de dextrosa Slidos solubles (%) Slidos totales (%) Slidos insolubles (%) Torta residual Retencin de slidos (%BS) Sobrenadante 2 Peso (%) Equivalente de dextrosa Slidos solubles (%) Slidos totales (%) Slidos insolubles (%) Torta residual Retencin de slidos (%BS)
1 2

9.95 0.74 1.30 1.32 0.045

48.00 19.73 20.99 ALMIDN DE TORTA DE UMAR 9.95 0.74 1.30 1.32 0.045 48.00 38.10 37.70 4.85 5.10 0.29 17.99 37.25 43.90 4.85 4.73 0.45 18.95

Sin hidrlisis Porcentaje (p/p) referido a la torta 3 Porcentaje (p/p) referido a la suspensin

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tiempo de hidrlisis de 60 minutos. Esto indica que existe tambin una fraccin de almidn que es retenida en la torta, que no es degradada por la alfa-amilasa y la amiloglucosidasa. Este almidn resistente al ataque enzimtico puede tener su origen en la naturaleza misma del almidn de la yuca y umar, ya que autores como Fennema (1982), sealan la existencia de un almidn resistente al ataque enzimtico in vitro e in vivo que se origina debido a la retrogradacin de la amilosa y a la formacin de complejos de amilosa-lpidos. En la Tabla 4 se observa que en la combinacin de las 3 enzimas, los mayores valores de ED corresponden a 48.95 para la torta de yuca y 48.76 para la torta de umar, en una concentracin de 1% de celulasa. El incremento de ED por accin de las celulasa de debe a la hidrlisis de la celulosa en glucosa y/o celobiosa, y tambin por disminucin de la viscosidad, permitiendo que ocurra una mayor interaccin entre el almidn y la alfaalfa-amilasa y amiloglucosidasa. 4. CONCLUSIONES Para la obtencin de mejores resultados al ataque enzimtico, se someti a la suspensin de la torta al 6% a un tratamiento trmico de 75C por 5 minutos: Los mejores resultados en cuanto al mayor valor de ED obtenido para el tratamiento con la alfa-amilasa Fungamyl 5000, fueron 24.00 para la yuca y 23.52 para el umar, con una concentracin de enzima del 0.1% por 60 minutos. Los mejores resultados en cuanto al mayor valor de ED obtenido para el tratamiento con la mezcla de la alfa-amilasa Fungamyl 5000 y la amiloglucosidasa AMG 300 L, fueron 38.7 para la yuca y 37.7 para el umar, con

una concentracin de enzima del 0.1% para ambas enzimas por 60 minutos. Los mejores resultados en cuanto al mayor valor de ED obtenido para el tratamiento con la mezcla de la alfa-amilasa Fungamyl 5000, la amiloglucosidasa AMG 300 L y la celulasa Celluclast 1.5 L, fueron 48.95 para la yuca y 48.76 para el umar, con una concentracin de enzima del 0.1% para la alfa-amilasa, 0.1% para la amiloglucosidasa y 1% para la celulasa, durante 60 minutos. Queda demostrado que se puede utilizar los desechos del umar y de la yuca, para obtener productos que pueden ser utilizados en las industrias alimentarias, ya sea como jarabes, sustratos para obtener otros productos fermentables, etc. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS Aguirre Vargas E. B. Extraccin de almidn a partir de la semilla de umar. Disertacin de Ingeniero, Facultad de Ingeniera en Industrias Alimentarias, UNAP, Iquitos, Per (1987) Benavides M.; et al. Estudio sobre la obtencin de glucosa a partir de harina de arroz mediante hidrlisis enzimtica. Tecnologa, n153, Colombia (1985) Braverman J.B.S. Bioqumica de los alimentos. Editorial Manual Moderno, S.A. de C.V, Mxico (1980) Gutirrez R.A. Especies de frutales nativos de la selva del Per: Estudio botnico y propagacin por semillas (1969) Montaldo A. La yuca: origen, mejoramiento e industria. IICA. (1972) Novo Nordisk. Ficha Tcnica de Enzimas (1999) Wiseman A. Manual de biotecnologa de los enzimas. Editorial Acribia S.A., Zaragoza, Espaa (1991)

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