Universidad de San Carlos de Guatemala

Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia

Escuela de Química Biológica

Microbiología General I

Ana Cristina Caballeros Vásquez

QB 201322156

Guía 2

Microscopia

1. Explique qué es el poder de resolución (P.R.) de un microscopio óptico. ¿Cómo se calcula el

P.R. de un microscopio óptico?
Es la capacidad del microscopio para mostrar en forma nítida y separada dos puntos
adyacentes

(Garcia, 2004)
2. Realice un esquema en donde pueda observarse la trayectoria de los rayos desde la fuente de
luz pasando a través del condensador, el portaobjetos y el lente objetivo 10X y señale lo
siguiente:

a. ¿Cuando los rayos de luz atraviesan el portaobjetos de vidrio: ¿que se forma y cómo se
aplica para el cálculo de la Apertura Numérica?
Se forma un cono de luz, este disminuye la apertura numérica del microscopio
b. Cuál es la función del condensador?
El condensador es el lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación.
c. Cuál es la función del diafragma de apertura?
El diafragma regula la cantidad de luz que entra en el condensador.
d. Qué aumentos pueden tener los lentes objetivos y los oculares?
Los objetivos pueden tener aumentación de 4X, 10X, 40X y 100X. Los oculares tienen un
aumento de 10X. (Martinez, 1998)
3. Dibuje un lente objetivo de inmersión y una lámina portaobjetos con aceite. Señale la
trayectoria de los rayos de luz a través de ellos y conteste lo siguiente:

a. ¿Cuál es el aumento de este objetivo?

100X
b. Indique el valor del índice de refracción (n) del aire, del vidrio (portaobjetos) y el aceite
de inmersión.
El ángulo de luz que penetra una lente va depender del índice de refracción del medio en
el que se encuentre el lente del objetivo. Por eso es importante saber que existe una gran
diferencia entre estos 3 medios.
c. Cuál es la función del aceite de inmersión.
Este evita la refracción de los rayos de luz permitiendo que entren al objetivo, por lo tanto
la resolución aumenta.
d. Explique que sucede con los rayos cuando atraviesan un portaobjeto sin aceite y cuando
traviesan un portaobjetos con aceite.
Los rayos de luz al atravesar el portaobjetos de vidrio, se desvían debido al cambio de
densidad entre el vidrio y el aire resultando en que algunos rayos de luz sean refractados
y por lo tanto no todos los rayos de luz llegan al objetivo. (Montoya, 2008)
4. Utilizando la siguiente ecuación, calcule el Poder de Resolución (P.R.) de un microscopio
óptico.
P.R. = 0.5λ / A.N objetivo DATOS: 0.5 = Constante, λ = Longitud de onda = 0.530 μm A.N.
objetivo (Inmersión) = 1.25
Calcule: el P.R. del microscopio en micras
P.R. = 0.5 (530nm)/ 1.25
P.R. = 0.212 um
5. ¿Cuáles son los factores que limitan el P.R. de los microscopios ópticos?
La apertura numérica del objetivo y condensador (Garcia, 2004)
6. Sobre el uso del lente de imersión, investigue
a. Porqué es importante emplear aceite de inmersión cuando observamos bacterias?
Es importante para así poder observar las bacterias mas claramente y poder destinguir
bien su morfología.
b. Qué le puede suceder al lente de inmersión si por un olvido no se elimina el aceite después
de su uso?
Esto puede provocar que parte de la muestra, en este caso bacterias, queden adheridas al
microscopio y contaminen otras muestras que sean observadas.
 c. Ponga 3 recomendaciones para el correcto uso del lente de inmersión (100X) que son
imprescindibles para su mejor conservación y evitar que se deteriore.
+ Asegurar que el objetivo de inmersión este limpio antes de usarlo.
+ El portaobjetos debe estar totalmente seco.
+Tener cuidado que al momento de subir la platina, no quebrar el objetivo de
inmersión.(Gini, 2007)
7. Sobre el uso correcto de la fuente de iluminación investigue:
a. Para observar una preparación en fresco: ¿cómo debe ser la intensidad de la luz? ¿A qué
altura debe estar el condensador? Con el diafragma de apertura y de campo conteste:
¿Cómo se debe manejar para obtener una buena iluminación?
La intensidad de la luz debe ser baja, a manera de no secar los microorganismos que se
deseen estudiar. El condensador debe estar abajo, de acuerdo al objetivo que se utilice y
el diafragma de apertura debe estar casi cerrado para dejar pasar solo la intensidad de luz
necesaria.
b. Para observar una preparación fija y teñida de bacterias, conteste ¿en qué posición debe
estar el condensador? Como debe usar el diafragma de apertura? Y si el microscopio que
está usando tiene diafragma de campo, como se usa?
Ya que esta lámina contendrá colorantes y parafina que proteja al microorganismos la luz,
el condensador y los diafragmas cambiaran dependiendo del objetivo a utilizar. (Gamazo,
2005)
8. Elabore un cuadro con los diferentes tipos de microscopios ópticos que se consideraron en
esta unidad: campo claro, campo oscuro, contraste de fases, fluorescencia y confocal de
barrido láser. Indique las características y sus principales aplicaciones. Incluya esquemas en
donde se aprecien los accesorios que contribuyen a mejorar el P.R de cada uno.

Microscopio Características Aplicación

Campo claro Objetos oscuros se pueden Identificación general de
identificar en fondo brillante. microorganismos según su
Microorganismos pueden ser morfología
teñidos para su mejor
observación.
Campo Oscuro Objetos con diferentes índices Morfología e identificación
de refracción. Imagen oscura general de microorganismos sin
de fondo brillante teñir. Hace posible la
Muestra con índices de observación en estado vivo de
refracción distintos partículas y células Torne más
La luz es refractada visibles los objetos más
transparentes
Contraste de fases El condensador presenta un Permite observar células sin
disco que proyecta un haz de colorear y resulta
luz con forma anular, y en la especialmente útil para células
lente de salida de los objetivos, vivas
se agregan unos “anillos de
fase”, que son discos
transparentes con un diseño en
relieve
 Fluorescencia Exposición a luz U.V. Tinción Locación de una proteína
con fluorocromos si no poseen específica dentro de la célula.
fluorescencia natural El rayo de Identificación de bacterias
luz monocromática se enfoca patógenas por
en el espécimen que contiene inmunofluorescencia . Procesos
en fluorocromo, que se excita y dinámicos en células vivas.
emite luz de longitud de onda
visible
Cofocal de barrido combina el microscopio de Brinda imágenes en 3D
fluorescencia con la imagen
electrónica y puntos de luz
suministrados
9. Explique como funciona el microscopio electrónico y diferencias con el óptico.
Un microscopio electrónico tiende a tener mayor resolución que un microscopio óptico. En
un microscopio óptico, se utiliza una fuente de luz para observar la muestra, mientras que
un microscopio electrónico utiliza un haz de electrones los cuales generan una imagen
digital. (Martinez, 1998)
10. Mencione los dos tipos de microscopios electrónicos que existen y su principales aplicaciones.
Ponga 2 ejemplos de las estructuras celulares y partículas que se pueden observar con
microscopía electrónica y sus dimensiones. Mencione la capacidad de aumento de este tipo
de microscopios.
a. Microscopio Electrónico de Transferencia (MET) - Un filamento de tungsteno calentado en
un generador de electrones libera un haz de electrones que es enfocado a continuación sobre
la muestra mediante el condensador. La muestra dispersa los electrones que pasan a través
de ella, y este haz se enfoca con lentes magnética para formar una imagen aumentada y visible
sobre una pantalla fluorescente. Se emplea para la observación e investigación de la estructura
bacteriana o viral en detalle, con el que pueden llegarse a estudiar hasta los orgánulos y
componentes celulares de los microorganismos. P.R.: 0.5nm
b. Microscopio Electrónico de Barrido (MEB) - Realiza un escáner con un estrecho haz de
electrones en forma de prisma, de adelante hacia atrás sobre la muestra, cuando el haz incide
sobre una zona concreta de la muestra, los átomos de la superficie emiten una nube tenue de
electrones denominados electrones secundarios, que son atrapados por un detector especial,
éstos inciden sobre un centellador, causando la emisión por éste de centellos de luz que un
fotomultiplicador transforma en una corriente eléctrica y la amplifica. La señal se envía a un
tubo de rayos catódicos y se
produce una imagen como en la pantalla de televisión. Se emplea específicamente cuando se
desea apreciar la superficie o una imagen tridimensional de los microorganismos sin un interés
particular en su interior, también para localización real de microorganismos in situ, en nichos
ecológicos.P.R.: 7.0nm. (Montoya, 2008)
11. Mencione cuales son las ventajas y desventajas de la microscopía electrónica.}
Ventajas: - Permite observar los microorganismos con mayor detalle, además permite
observar microorganismos de dimensiones muy reducidas y hasta sus componentes
intracelulares y extracelulares. Reduce la participación humana en los ajustes lo que repercute
en menos errores.
Desventajas: - Los procesos de preparación de las muestras pueden resultar más complicados,
el alcance de la tecnología y los costos es una limitante para su aplicación (Gini, 2007)
 12. Adjunte imágenes de microcospía óptica y electrónica en donde se aprecie la diferencia entre
ambas.

Referencias

Gamazo, C (2005) “Manual práctico de microbiología” 3er ed. España. Masson.

García, V (2004) “Introducción a la microbiología” 2nda ed. Costa Rica EUNED

Gini, G (2007) “Manual de procedimientos para la identificación de bacterias” 3er Ed. Guatemala,
USAC

Martinez, M (1998) “Instrumentos Opticos y Optometricos” 1er Ed. España Editorial universitaria
de Valencia

Montoya, H (2008) “Microbiologia básica para el área de salud y afines” 2nda Ed. Colombia.
Editorial universitaria de Antioquia