Extraccion de Acidos Nucleicos

Extracción de Ácidos
Nucleícos.
Blgo. Félix J. Alvarez A.

(e) Maestría en Genética Humana – UPCH
Clase 05
Genética de los Virus
2
Genética de las Bacterias.
3
Genética de los Hongos.
• Organismo
Eucariota.
• Haploides (n) o
diploides (2n).
• Incluso pueden
tener
Heterocariosis.
• Cromosomas
lineales.
4
¿Qué es Biología Molecular?
DOGMA DE LA
BIOLOGIA
MOLECULAR
ADN
ARN
Expresión del gen. GENES (información)
5
Extracción de Ácidos Nucleicos.
¿De dónde podemos extraer el ADN/ARN?
Sangre Periférica Tejido fresco

Suero/Plasma
Bloque Para finas Otros…
6
Técnicas de Extracción de Ácidos Nucleicos
1. Tipo de microorganismo de estudio.
2. Tipo de ácido nucleíco.
3. Cantidad y calidad del ácido nucleíco.
4. Prueba molecular a realizar posterior a la extracción.
5. Disponibilidad de los reactivos.
6. Equipamiento del laboratorio.
7
Esquema general de una Técnica de
Extracción de Ácidos Nucleícos.
8
Técnicas de Extracción de
Ácidos Nucleicos
1. Salting Out.
2. Fenol / Cloroformo / Alcohol Isoamílico.
3. Kits comerciales (Columnas de gel de silice).
9
Estandarizar y elegir técnica
de Extracción.
10
Estandarizar y elegir técnica.
11
Amplificación del ADN - PCR
¿Qué componentes se necesitan para una Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR)?
Primers Forward / Reverse
Buffer con Mg2Cl

Enzima
Nucleótidos (A,C,G, T)
ADN extraído
12
Esquema de la PCR
13
Amplificación del ADN:
Etapas del PCR
25 – 30 ciclos
14
Tipos de Reacción en Cadena de Polimerasa
• PCR punto final:
1. Nested PCR: Amplificas 2 veces.
2. Multiplex PCR Se usan 2 juegos de primers.
3. Touchdown PCR T° disminuye ciclo a ciclo.
• PCR en Tiempo Real.
15
Assembly (Polymerase Cycling Assembly or PCA) PCR
Asymmetric PCR
Co-Amplification at Lower Denaturation Temperature (COLD) –PCR
Colony PCR
Digital PCR (dPCR)
High Fidelity PCR
Hot Start/cold finish PCR TECNICA
InterSequence-Specific (ISSR) – PCR MOLECULAR
Inverse PCR
Linear-After-The-Exponential (LATE) – PCR
Long-PCR
Methylation-specific PCR (MSP)
Multiplex-PCR
Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)
TEST DE
Nested PCR
Semi Nested PCR DIAGNOSTICO
Quantitative/Real-Time (q) PCR
HRM Real-Time (q) PCR
Round A/Round B (R) – PCR
Splicing by overlap/overhang extension (SOE) PCR
Thermal Asymmetric InterLaced (TAIL) – PCR
Touchdown PCR
Whole genome amplification
Visualización del ADN amplificado.
17
Evaluar la PCR realizada.
18
Aplicaciones Diagnósticas.
1. Detectar mutaciones genéticas.
2. Detección de patógenos en muestras biológicas.
3. Presencia, expresión y seguimiento de oncogenes.
4. Análisis de parentesco (paternidad).
5. Pruebas criminalísticas.
6. Estudios arqueológicos.
19
Detección de patógenos en muestras
biológicas.
20
Secuenciamiento de genes (SNP)
• Polimorfismo de un solo nucleótido (SNP)
21
Secuenciamiento Masivo.
22
Estudios realizados (1)
Materiales clínicos: sangre 2 a 3 mL

Extracción artesanal.
PCR anidada diseñados por Bialek et al
Cebadores HcI y HcII (391pb)
Cebadores HcIII y HcIV (210pb)
Proteína 100kDa involucrada en infección y supervivencia.
23
PCR + 87%
Hemocultivo 37%
25
Estudios publicados (4)
26
Extracción de RNA
Consideraciones especiales:
RNAsas
(uso de inhibidores de
RNAsas)
pH
(pH 5-6 para RNA, pH 8 para
DNA)
Tipos principales de RNA
en la célula
RNA mensajero (mRNA):  1-5%

(sirve como molde para la síntesis de proteinas)
RNA ribosomal (rRNA):  80%

(componente estructural de los ribosomas)
RNA de transferencia (tRNA):  10-15%

(participa en la síntesis de proteínas)
¿Para qué extraer RNA?
➢Tamaño (estudiar distintas formas de splicing)
➢Secuencia (predecir un producto proteico)
➢Abundancia (medir los niveles de expresión)
➢Dinámica de expresión (temporal, tejido-

específica, etc).
Protocolos de extracción
de RNA
Extracción orgánica Extracción por afinidad
(solventes orgánicos) (columnas)
Extracción con oligo(dT)

(para mRNA)
Visualización de RNA en gel
➢ Geles desnaturalizantes ➢ Condiciones libres de RNAsas
Gracias por su atención.
Felix.alvarez.a@upch.pe
32

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Extracción de Ácidos

Blgo. Félix J. Alvarez A.

Expresión del gen. GENES (información)

Sangre Periférica Tejido fresco

Bloque Para finas Otros…

2. Fenol / Cloroformo / Alcohol Isoamílico.

3. Kits comerciales (Columnas de gel de silice).

Primers Forward / Reverse

Buffer con Mg2Cl

• PCR en Tiempo Real.

Materiales clínicos: sangre 2 a 3 mL

RNA mensajero (mRNA):  1-5%

RNA ribosomal (rRNA):  80%

RNA de transferencia (tRNA):  10-15%

➢Tamaño (estudiar distintas formas de splicing)

➢Secuencia (predecir un producto proteico)

➢Abundancia (medir los niveles de expresión)

➢Dinámica de expresión (temporal, tejido-

Extracción con oligo(dT)

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