TEMA 3.

- NUTRICIÓN MICROBIANA

Proceso por el cual los seres vivos adquieren del medio donde habitan, sustancias
químicas y orgánicas que requieren para crecer. Dichas sustancias se denominan
nutrientes, y son necesarias para obtener energía (reacciones de mantenimiento) y
para biosintesis (anabolismo) de nuevos componentes celulares.

3.1 REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES

1.-Clasificación de acuerdo a la fuente de energía:

a) litotrofas: aquellas que sólo requieren sustancias inorgánicas sencillas (SH2,

NH3, NO2-, Fe, etc.).
b) organotrofas: requieren compuestos orgánicos (hidratos de carbono,
hidrocarburos, lípidos, proteínas, alcoholes...).

2.-Clasificación de acuerdo a requerimientos:

a) autotrofas: crecen sintetizando sus materiales a partir de sustancias inorgánicas

sencillas. Tienen la capacidad de utilizar como fuente inorgánica de carbono
CO2.
b) heterotrofas: su fuente de carbono es orgánica, como glucosa.
c) autotrofas estrictas: son aquellas bacterias incapaces de crecer usando materia
orgánica como fuente de carbono.
d) Mixotrofas son aquellas bacterias con metabolismo energético litotrofo
(obtienen energía de compuestos inorgánicos), pero requieren sustancias
orgánicas como nutrientes para su metabolismo biosintético.

Todas las bacterias necesitan captar una serie de elementos químicos como
macronutrientes (C, H, O, N, P, S, K, Mg), y micronutrientes o elementos traza
(Co, Cu, Zn, Mo...)

En la naturaleza, estos elementos se encuentran combinados formando parte de

sustancias orgánicas o inorgánicas. Algunos nutrientes serán incorporados para construir
macromoléculas y estructuras celulares; otros se usarán para producción de energía y no
se incorporarán como material celular; finalmente, otros pueden ejercer ambos papeles.
Aunque dentro de los procariotas se encuentre variedad de nutriciones, las bacterias que
pueden nutrirse solamente de sustancias inorgánicas sencillas (H2O, CO2, N2, NO3-,
NH3, SO4=, fosfatos, etc.) son minoría, pero sus procesos metabólicos son interesantes.
De hecho, existen tipos metabólicos que sólo han evolucionado en procariotas
(fijación de Nitrógeno).

Los microorganismos quimioautotrofos (o quimiolitoautotrofos): obtienen su energía

de la oxidación de sustancias inorgánicas sencillas, como carbono del CO2, y el resto de

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elementos a partir de sales inorgánicas, por lo que pueden vivir en soluciones de sales
minerales en ausencia de luz.

CLASES DE NUTRIENTES

1.-UNIVERSALES: (aquellos que son requeridos por todos los procariotas): agua,
CO2, fosfatos y sales minerales.

AGUA: es el principal constituyente del protoplasto bacteriano; medio universal donde

ocurren las reacciones biológicas; reactante en exceso (es decir, un producto resultante
de algunas reacciones bioquímicas). Las fuentes de agua pueden ser.- endógena:
procedente de procesos de oxido-reducción; exógena (la más importante): procedente
del medio, y que difunde a través de las membranas. Por su disponibilidad: bacterias
xerófilas, son capaces de vivir con poca disponibilidad de agua. procariotas halófilos
extremos, como la arquea Halobacterium: habitan en lagunas hipersalinas; bacterias (y
sobre todo, ciertos microrganismos eucarióticos como levaduras) sacarófilos: viven en
jugos y zumos con altas concentraciones de azúcares.

CO2 : El anhidrido carbónico es requerido por todo tipo de bacterias: Las autotrofas lo
requieren como fuente de carbono, y lo reducen usando como fuente de energía la luz
(en el caso de las fotoautotrofas) u oxidaciones de determinadas sustancias inorgánicas
(los quimioautolitotrofos). El origen del CO2 puede ser: endógeno: procedente de
descarboxilaciones que ocurren al degradar la fuente orgánica de carbono. Y exógeno: el
CO2 de la atmósfera o disuelto en las soluciones acuosas.

Normalmente, las bacterias crecen a la concentración de CO2 atmosférico (0.03%), pero

algunas bacterias (Neisseria, Brucella), cuando se aislan por primera vez, requieren
atmósferas enriquecidas, con 5-10% de CO2. Esto parece deberse a que poseen alguna
enzima con baja afinidad hacia el carbónico; sin embargo, tras varios subcultivos,
suelen adaptarse a crecer a tensiones normales.

FÓSFORO: Suele requerirse en forma de fosfatos, orgánicos o inorgánicos. Las

bacterias que pueden usar los fosfatos orgánicos (debido a la posesión de fosfatasas) no
dependen absolutamente de ellos, ya que pueden recurrir igualmente a los fosfatos
inorgánicos. Los fosfatos orgánicos son hidrolizados por fosfatasas extracelulares o (en
las Gram-negativas) periplásmicas (p.ej., la fosfatasa alcalina). El fósforo se usa
principalmente para la síntesis de ácidos nucleicos y fosfolípidos, pero aparece también
en coenzimas y en proteínas.

SALES MINERALES: Son la fuente de aniones (Cl-) y de cationes para la célula. Los
cationes (K+, Mg++, Ca++, Fe++.) se necesitan en cantidades relativamente grandes.

El ión potasio (K+): interviene en la activación de una variedad de enzimas, incluyendo

las que participan en la síntesis de proteínas. En Gram-positivas está asociado con los
ácidos teicoicos de la pared.

El ión magnesio (Mg++): estabiliza ribosomas, membranas y ácidos nucleicos, como

cofactor en muchas reacciones, especialmente las que implican transferencia de grupos
fosfato.En las reacciones que requieren ATP, el Mg++ puede unir la enzima al sustrato

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durante el mecanismo de acción de la primera. Participa de las clorofilas y
bacterioclorofilas de bacterias fotosintéticas

El ión calcio (Ca++): es un cofactor de ciertas enzimas, como proteinasas.

El hierro (principalmente como ión ferroso, Fe++) suele estar acomplejado en la

naturaleza, formando sales insolubles. Las bacterias disponen de una serie de moléculas,
denominadas sideróforos, capaces de captar ese hierro. El hierro participa en muchas
moléculas implicadas en procesos de respiración, como citocromos y ferroproteínas no
hémicas (proteínas con Fe-S); interviene como cofactor en ciertas enzimas.

Aparte de estos iones , las bacterias necesitan pequeñas cantidades de otros elementos
(oligoelementos), a los que también se denomina como micronutrientes o elementos
traza: El manganeso (Mn++) es un cofactor de ciertas enzimas, y a veces puede sustituir
al Mg++. El cobalto (Co++) se requiere casi exclusivamente para la vitamina B12 . El zinc
interviene en la estabilización de complejos enzimáticos como las ADN- y ARN-
polimerasas. El molibdeno participa en las llamadas molibdoflavoproteínas, implicadas
en la asimilación de nitratos. También participa como cofactor junto con el Fe, en el
complejo nitrogenasa de las bacterias fijadoras de N2 atmosférico. El níquel participa en
hidrogenasas, enzimas que captan o liberan H2.

2.- NUTRIENTES PARTICULARES: elementos que pueden ser cubiertos de modo

muy distinto, dependiendo del tipo de bacteria que consideremos. Los elementos N y S
(que requieren todos los seres vivos) pueden ser captados por las bacterias de modo
diferente, dependiendo de sus capacidades biosintéticas. Tanto el N como el S se
encuentran en la célula en estado reducido: el radical -NH2 forma parte de los
aminoácidos (que a su vez son los sillares de las proteínas) y de las bases nitrogenadas
(que participan en los ácidos nucleicos y en algunas coenzimas); el radical -SH
interviene en determinados aminoácidos y en coenzimas como la CoA. La mayoría de
bacterias fotosintéticas y muchas heterotrofas asimilan estos elementos en forma
combinada inorgánica oxidada: como NO3--, debido a la actuación secuencial de
nitrato-reductasas y nitrito-reductasas asimilatorias. El SO42-. Este sulfato se activa con
ATP, y luego se reduce hasta sulfito y finalmente sulfhídrico, que ya tiene el estado de
reducción adecuado para la incorporación del S. Muchas bacterias heterotrofas pueden
usar alguna forma reducida de N inorgánico: amonio (NH4+); de S inorgánico: sulfuros
(S2-, SH-); de N orgánico: aminoácidos, y péptidos de S orgánico:cisteína

Nitrógeno.- La atmósfera contiene enormes cantidades de nitrógeno no combinado

(libre) en estado gaseoso: el nitrógeno molecular o dinitrógeno (N2), que procede de
microorganismos desnitrificantes Sin embargo, esta gran reserva sólo puede servir de
fuente de nitrógeno a ciertos procariotas, las llamadas bacterias fijadoras de nitrógeno
o diazotrofos. Esta notable capacidad bioquímica no ha evolucionado en eucariotas.

La fijación del N2 es un proceso de reducción que convierte el nitrógeno molecular en

amoniaco, según la siguiente ecuación:

N2 + 8H+ + 8e + 18 ATP ---------> 2NH3 + H2 + 18 (ADP + Pi)

Esta reacción está catalizada por un complejo enzimático denominado nitrogenasa o

dinitrogenasa

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Factores de crecimiento: son moléculas orgánicas específicas que, en muy pequeña
cantidad, algunas bacterias necesitan para crecer. Salvo excepciones no tienen función
plástica (no son sillares de macromoléculas) ni sirven como fuente de energía. Suelen
ser coenzimas o sus precursores, vitaminas, aminoácidos, purinas y pirimidinas;
que determinadas bacterias no pueden sintetizar por sí mismas, al carecer de una ruta
biosintética. Ejemplos: las bacterias del género Brucella requieren como factores de
crecimiento en sus medios de cultivo la biotina, niacina, tiamina y ácido pantoténico.
Haemophilus necesita suplementos de grupos hemo y piridín-nucleótidos.

VITAMINAS Y COFACTORES DE CRECIMIENTO REQUERIDOS POR

ALGUNAS BACTERIAS:

Factor o vitamina funciones principales

p-aminobenzoico (PABA) precursor del ácido fólico
Acido fólico metabolismo de compuestos C1, transferencia de grupos
metilo
Biotina biosíntesis de ácidos grasos; fijación de CO2
Cobalamina (vitamina B12) reducción y transferencia de compuestos C1; síntesis de
desoxirribosa
Niacina (ácido nicotínico) precursor del NAD; transferencia de electrones en
reacciones redox
Riboflavina precursor de FAD y FMN
ácido pantoténico precursor de la CoA
Tiamina (vitamina B1) descarboxilaciones; transcetolasas.
Complejo B6 (piridoxal, piridoxamina) transformaciones de aminoácidos y cetoácidos
Grupo Vitamina K, quinonas transportadores de electrones (ubiquinonas,
menaquinonas, etc.)

3.4 MEDIOS DE CULTIVO:

El conocimiento de la nutrición microbiana permite el cultivo de los microorganismos
en el laboratorio. En general, todos los microorganismos tienen requerimientos de
macro- y micronutrientes.
Un medio de cultivo es una solución acuosa, coloide o gel, en la que están presentes
todas las sustancias necesarias para el crecimiento de un determinado microorganismo.
Los medios de cultivo se pueden clasificar, en tres grandes tipos:

1) Medios complejos o indefinidos: su composición química exacta se desconoce, ya

que son el producto de realizar infusiones y extractos de materiales naturales complejos:
como digeridos crudos de extracto de carne, de extracto de levadura, de peptona de
carne o de soya, o de caseína (de la leche). Con ellos se logra un tipo de medio rico
nutricionalmente, aunque indefinido químicamente. Estos medios contienen fuentes
variadas de C y N orgánicos, sales minerales y micronutrientes. Sin embargo, no
podemos tener un control nutricional preciso.

2) Medios sintéticos o definidos: se obtienen disolviendo en agua destilada cantidades

concretas de distintas sustancias químicas puras, orgánicas y/o inorgánicas. La
composición concreta dependerá de la bacteria que queramos cultivar.

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Medio sintético para Escherichia coli Medio sintético para Leuconostoc mesenteroides

K2HPO4 7.0 g K2HPO4 0.6 g

KH2PO4 2.0 g KH2PO4 0.6 g

(NH4)2SO4 1.0 g NH4Cl 3.0 g

MgSO4 0.1 g MgSO4 0.1 g

CaCl2 0.02 g Glucosa 25 g

Glucosa 10 g acetato sódico 20 g

microelementos:

(Fe, Co, Mn, Zn, Cu, Ni, Mo) 2-10 mg cada uno

agua destilada 1000 ml aminoácidos (los 20) 100-200 mg cada

uno

purinas (adenina, guanina) 10 mg cada una

pirimidinas (uracilo, xantina), 10 mg cada una

vitaminas: biotina, fólico,

nicotínico, piridoxal, piridoxamina,
piridoxina, riboflavina,
tiamina, pantoténico, PABA)...... 0.01-1 mg cada una

elementos traza 2-10 mg cada uno

agua destilada 1000 ml

______________________________________________________________________
___Como se deduce de la tabla anterior, Escherichia coli posee muchísimas capacidades biosintéticas, ya que puede
crecer en un medio confeccionado exclusivamente a base de glucosa y sales minerales. (Aún más impresionantes son
las bacterias autotrofas, que ni siquiera requieren fuente orgánica de carbono, y sobreviven con medios a base de sales
solamente). En cambio, Leuconostoc, además de fuente orgánica de C y sales similares a las necesitadas por E.
coli, precisa una enorme diversidad de sustancias adicionales, incluyendo todos los aminoácidos proteinogenéticos,
bases nitrogenadas y vitaminas.

3) Medio semisintético: “mezcla” de los anteriores, lleva algunas sustancias químicas

cuya naturaleza y cantidad conocemos, junto con sustancias de naturaleza y
composición indefinidas.

De acuerdo a los requerimientos y características necesarias para aislar un

microorganismo, los medios se clasifican en:

Medios selectivos: son aquellos que permiten seleccionar un tipo (o tipos) de

microorganismos. En el laboratorio se emplean los medios selectivos sólidos a los que
se incorporan sustancias que inhiben el crecimiento de ciertas bacterias, pero permiten
el crecimiento de otras. (P. ej. medios que llevan cristal violeta inhiben el crecimiento de
bacterias Gram-positivas.

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Medios diferenciales: son aquellos que permiten distinguir a simple vista dos o más
tipos de bacterias en función de su distinto comportamiento respecto de algún nutriente
del medio. Ese comportamiento diferencial se traduce normalmente en un viraje de
color de una sustancia indicadora presente en el medio. Por ejemplo en el medio EMB
(eosina-azul de metileno) ciertos tipos metabólicos de bacterias producen cambios de
color y precipitación de sales cuando producen ácidos por fermentación de ciertas
fuentes de carbono, el medio agar-sangre lleva 5% de sangre de caballo o carnero, lo
cual revela la capacidad y el tipode hemolisis de ciertas bacterias.

Algunos medios son simultáneamente selectivos y diferenciales: el agar MacConkey,

que es un medio de color rosa y transparente, que posee, entre otras sustancias, lactosa
peptonas, rojo neutro, sales biliares y violeta cristal. Este medio es selectivo contra
muchas bacterias Gram-positivas debido al violeta cristal, y también contraselecciona
muchas Gram-negativas debido a las sales biliares (que son agentes tensioactivos que
desorganizan membranas externas). Las Enterobacterias están evolutivamente adaptadas
a soportar sales biliares en su hábitat natural (el intestino de vertebrados superiores), y
pueden crecer en este medio. Como medio diferencial, el agar MacConkey permite
visualizar dos tipos de Enterobacterias según puedan o no fermentar la lactosa, con
producción de ácidos. Las bacterias fermentadoras de lactosa (Lac+), excretan al medio
gran cantidad de ácidos orgánicos, lo que provoca que sus colonias, y sus alrededores
aparezcan de color rojo intenso, debido al viraje del rojo neutro; además, se forma un
halo turbio a cierta distancia de estas colonias, fenómeno ocasionado por la
precipitación de las sales biliares inducida por la acidez. En cambio, las bacterias Lac-,
al no poder usar la lactosa, recurren como fuente de C a las peptonas, a las que
desaminan: incorporan el esqueleto carbonado, excretando iones NH4+, que alcalinizan
el medio de cultivo, lo cual se traduce en que el indicador rojo neutro vira a amarillo.

Los distintos tipos de medios de cultivo varían según las necesidades de los
microorganismos en estudio pero todos han de cumplir los siguientes
requisitos:
Han de contener las sustancias necesarias para el crecimiento del
microorganismo que se siembra.
Han de mantenerse estériles hasta el momento de la siembra.

Los requerimientos para el crecimiento microbiano se pueden agrupar en dos

categorías:
Físicos .- temperatura, pH y presión osmótica
Químicos.- agua, fuentes de carbono y nitrógeno, sustancias minerales,
oxígeno y determinados factores orgánicos de crecimiento.
Finalmente, una vez sembrados, deben ser incubados a la temperatura y
condiciones adecuadas.

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 Los medios de cultivo pueden clasificarse:
A) Por el estado físico en que se encuentran.-
1.-Medios líquidos o caldos: aquellos que contienen, disueltos en agua,
nutrientes necesarios para el crecimiento de los microorganismos.
2.-Medios sólidos: Contienen nutrientes disueltos en agua pero se les añade un
agente solidificante.
3.-Medios semisólidos: similares a los medios sólidos, pero la concentración del
agente solidificante es menor, generalmente del 0,4% con lo que una vez
solidificados mantienen una consistencia gelatinosa.

B) Por su composición:
1.-Medios complejos.-
Contienen nutrientes necesarios para el crecimiento de muchos tipos de
microorganismos, pero no se conocen todos los componentes que forman parte
de ellos. Muchos componentes proceden de la degradación parcial de tejidos o
productos animales, de plantas o de microorganismos como fuente de
aminoácidos, azúcares, lípidos, vitaminas y minerales.Ejemplos son las
peptonas o triptonas (proteínas animales digeridas enzimáticamente), el
extracto de carne y el extracto de levadura. Son suplementados con glucosa.

2.-Medios definidos:
Son aquellos que contienen los distintos nutrientes en forma de productos
químicos puros (pero no extrapuros) y en concentraciones conocidas.
Así, un medio definido que permita el desarrollo de un microorganismo
heterótrofo y “poco exigente”, como E. coli, debería contener sales inorgánicas
y fuentes de carbono y nitrógeno: MgSO4, KPO4H2, PO4HNa2, glucosa y
NH4Cl.

C) Por su utilización:
1.-Medios selectivos.-
Son aquellos que permiten el crecimiento de un tipo determinado de
microorganismos, inhibiendo el desarrollo de otros. Algunos contienen un
agente selectivo como antibióticos,productos químicos, colorantes, etc. Entre
los agentes selectivos podemos citar el cloruro sódico, que en concentración
elevada inhibe la mayoría de los microorganismos excepto los halotolerantes,
como los estafilococos, o la azida de sodio, que inhibe el crecimiento de
bacterias Gram
negativas
La bilis y sales biliares convierten los medios de cultivo en selectivos para
Salmonella ya que, además de inhibir microorganismos Gram positivos, en
concentraciones elevadas inhiben también a bacterias Gram negativas
fermentadoras de lactosa.

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Colorantes como el verde brillante, inhiben selectivamente bacterias Gram
positivas, siendo también inhibidor para la mayoría de las bacterias intestinales
excepto para Salmonella.
Este colorante es la base del Agar Verde Brillante, utilizado para el aislamiento
de Salmonella a partir de muestras fecales.

2.-Medios diferenciales: Son aquellos diseñados para distinguir unos

microorganismos de otros, a partir de una población mixta, por la apariencia
distinta que toman sus colonias.
Por ejemplo, el agar sangre es un medio nutritivo enriquecido y es a la vez un
medio diferencial, que permite reconocer aquellos microorganismos capaces de
producir hemólisis.
Otros medios diferenciales llevan incluido un indicador de pH, que pone de
manifiesto la degradación de un nutriente específico (generalmente un azúcar)
por el cambio de color que se origina cuando éste es metabolizado.

El agar MacConkey es otro ejemplo de medio selectivo y diferencial. La

presencia de sales biliares y cristal violeta inhiben el crecimiento de bacterias
no entéricas; la fermentación de lactosa con liberación de productos ácidos
hace virar un indicador de pH incorporado en el medio.

Medios de Cultivo con base en los diferentes inhibidores para el aislamiento de

Enterobacterias patógenas para el hombre:

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Medio Tipo Inhibición/indicador Propósito

Agares entericos Selectivo para Enterobacteriaceae y

otros bacilos Gram negativos, inhibe la
mayoría de Gram positivos

MAC S, D Sales biliares, cristal violeta, Ayuda en la detección de E.coli

lactosa, rojo neutro 0157:H7

EMB S, D Eosina y azul de metilleno, lactosa Enterobacterias

y sucrosa

Agares selectivos Aislamiento de Salmonella spp, de

para entéricos Shigella spp
patógenos

Agar verde S, D Verde brillante, lactosa, sucrosa y Aislamiento de Salmonella spp, inhibe
brillante rojo de fenol la mayoría de otras
Enterobacteriaceae, se usa después de
un enruquecimiento inicial en caldo

Agar entérico S, D Sales biliares, amonio Enterobacteriaceae, diferencia a los

Hektoen férrico,citrato, tiosulfato de sodio, fermentadores de lactosa/sucrosa,
lactosa, sucrosa, azul de productores o no de H2S
bromotimol salicina
GN (caldo para E Citrato, deoxicolato Enriquecimiento para Salmonella spp y
Gram negativos) Shigella spp

Agar S Anfotericina, cefalotina, Aislamiento de Campylobacter spp

Campylobacter trimetoprim, vancomicina,
polimixina B

FACTORES AMBIENTALES:

Para el desarrollo de un M.O. ademas de requerimientos nutricionales

influyen factores ambientales sobre el crecimiento, supervivencia y actividad
metabólica:

 pH .- adecuado, invariable * fermentación de C-H libera ac. Orgánicos al

medio (acidificación),utilización de proteínas libera NH4+ (alcalinización):
detención de crecimiento

 Temperatura.- determina velocidad de crecimiento (optima):

hipertermófilos (t>75º C), termófilos (t>55º C), mesófilos (t 20-45º
C)psicrófilos o criófilos (t<10º C)

 Oxígeno.- respuesta frente al O2

*aerobias: dependen de oxígeno, microaerofílicas: concentraciones bajas (2%)

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 *anaerobias facultativas: utilizan oxigeno si esta presente, pero pueden crecer
en su ausencia

*anaerobias: no utilizan oxígeno; estrictas:el oxígeno es tóxico

aerotolerantes: toleran oxígeno

Otros factores
Potencial redox
Radiación electromagnética
Presión atmosférica, hidrostática y osmótica

AGENTES ANTIMICROBIANOS FÍSCOS

 Calor: principal agente de esterilización.
Alta temperatura combinada con humedad. Formas vegetativas mueren en 5-
10 min a 60-70º C. Esporas requieren >100º C
* Calor húmedo.- vapor a presión (autoclave: 1 atm de presión (1.1 Kg/cm2 ,
15 lb/pulg2 = 121º C)
*Calor seco.- horno > 160º C (vidrio elimina pirógenos)

 Radiaciones (esterilización en frío)

* Luz ultravioleta (superficies)
* Radiaciones ionizantes.-rayos X y Gamma (penetrantes y letales)

 Filtración: aplicable a materiales termolábiles (vitaminas, antibióticos).

Filtros Millipore con poro de 0.22 mm

ESTERILIZACIÓN

 Todo material utilizado para aislar y cultivar M.O. debe encontrarse

estéril (libre de todo organismo)

 Esterilización : destrucción completa de toda forma de vida microbiana

 Muerte: pérdida irreversible de su capacidad de reproducirse

 Bactericida: agente que mata a las bacteias

 Bacteriostático: agente que inhibe el desarrollo de M.O.

AGENTES ANTIMICROBIANOS QUIMICOS

 Alcoholes y fenoles.- Et-OH al 70% efectivo vs céls vegetativas, ineficaz
vs esporas
 Halógenos .- yodo (piel), cloro, hipocloritos (purificación de agua)
germicidas oxidantes

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 Peróxido de hidrógeno.- agente oxidante, antiséptico-limpieza heridas-
anaerobios
 Metales pesados.- modifican grupos funcionales. Hg, Ag y Cu tóxicos
para M.O., forman mercáptidos con grupos –SH de residuos de cysteína
 Gases.- agentes alquilantes. Para esterilizar plásticos. Óxido de etileno y
gas de formaldehído
 Detergentes.- depresores de tensión superficial. Alteran la relación
energética a nivel de interfases

AISLAMIENTO
 Cultivo : poblaciones bacterianas con millones de individuos

 Cultivo puro o axénico: contiene una sola clase de M.O.

 Cultivo mixto: varias clases de M.O. creciendo juntos

 En condiciones definidas se procede al aislamiento para separar al

gérmen en estudio del resto de las poblaciones con las que coexiste

CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS:

 Recuento viable: se utilizan diluciones seriadas y siembra en placa

UFC/ml

 Recuento de totales: medida del número presente

 *directo mediante microscopio (Cámara de Newbauer)

 contador electrónico de partículas (Coulter)

 Medida de masa celular: turbidimetría (densidad óptica),

espectrofotometría (absorbancia-transmitancia)

2.7 ESTUDIO MICROSCOPICO DE LOS Micro-Organismos (M.O.)

Microscopio.- permite ampliar el tamaño de la imagen aparente, hace

posible ver detalles estructurales de los M.O.
Observaciones:
* “in vivo” - en gota para M.O. no tan pequeños (protozoarios, hongos,
células), para observar movimiento, morfología, inclusiones

*Con tinción (no-vivos).-aumenta el contraste

1.-Tinción simple: un solo colorante. Se basa en la carga negativa asociada
a la capa externa del M.O.
2.-Tinción diferencial: ciertos M.O. y/o estructuras celulares con diferente
afinidad por determinados colorantes. Gram, Ziehl-Nelsen (ac-alcohol-
resistentes), Giemsa
Otra forma de observación sin ser tinción: Tinta china (cápsula)

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 AUMENTO Y RESOLUCIÓN

Aumento total de microscopio compuesto: Producto del aumento debido a la

lente del objetivo por el aumento del ocular

Poder de resolución: función de la longitud de onda de la luz utilizada y de

la característica propia de las lentes denominada apertura numérica
(medida de la capacidad de captación de luz por la lente)
Hay correlación entre la capacidad de aumento de una lente y su apertura
numérica (lentes de>aumento >apertura numérica

Tinción de Gram:
Gram+: absorben y conservan el Cristal Violeta (cocos, Staphylococcus,
Bacillus subtilis, Clostridium botulinum)

Gram-: no conservan el colorante (Escherichia coli, Salmonella spp)

Diferencias estructurales en la pared: Gram + pared gruesa de

peptidoglucano, Gram- capa fina de peptidoglucano revestida de capa
gruesa de lipoproteínas y lipopolisacáridos que impiden la llegada del
colorante
Gram + mas susceptibles a antibióticos

FORMA DE LAS BACTERIAS:

Las tinciones nos permiten diferenciar la forma clasificando de acuerdo a la

agrupación observada.

Bacilos: forma recta en bastón, solos o en largas cadenas

Cocos: forma esférica, si se unen en pares forman diplococos, cadenas-

estreptococos, racimos-estafilococos

Espirilos: largos filamentos helicoidales

Otras Microscopías ópticas:

• Contraste de fases.-se basa en que las células tienen un índice de

refracción más elevado que el medio, lo que implica un retardo en la
longitud de onda que las atraviesa y una alteración en la fase de la luz.
Observación de contorno celular con nitidez

• De interferencia: Nomarski. Imágenes de alto contraste y relieve

topográfico

• De campo obscuro: reemplazo del condensador normal por condensador

de campo negro (no permite transmitir la luz directamente a través del

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 espécimen hacia el objetivo). La luz es dispersada x la muestra y los
M.O. se observan brillantes en un fondo obscuro. Para movilidad y M.O.
que no se tiñen. Espiroquetas, leptospiras
• Luz Ultravioleta: con poder de resolución mayor (longitud de onda de UV
es menor que la luz visible

• De Epifluorescencia: utiliza luz de una longitud de onda capaz de excitar

alguna substancia a fluorescer. Para M.O. con fluorescencia natural
(metanobacterias).
Inmunofluorescencia con el uso de anticuerpos unidos a fluorocromos
(isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina)

• Microscopía de laser-confocal (CSLM Confocal Scaning Laser

Microscopy): utiliza luz láser (argón, neón) que incide sobre un único
punto del espécimen y hace un barrido haciendo cortes en diferentes
planos. La imagen se reconstruye tridimensionalmente. Las muestras a
estudiar se tiñen con sondas fluorescentes
• FISH (“Hibridación in situ con sondas fluorescentes)

• Microscopía Electrónica
De transmisión: fuente luminosa electrónica, de tungsteno, el haz se enfoca
medante lente electromagnética
De Barrido: utiliza un haz de e- que barre la superficie del espécimen.

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