INTRODUCCIÓN

Son cadenas cortas de ribo o desoxirribonucleotidos de cadena simple o doble esto quiere decir
que puede ser mono o bicatenarios, tiene la capacidad de unirse al ADN cromosómico, mARN o
ARN no codificante a través de Watson-Crick y Hoogsteen emparejamiento de base, esto oferce la
posibilidad para una intervención altamente especifica en la edición del genoma, transcripción
génica, traducción de ARNm, y vías reguladoras del ARN para aplicaciones terapéuticas.

En teoría, una secuencia específica de 15-17 bases ocurre sólo una vez en el genoma humano, lo
que permitiría la manipulación específica de genes individuales para oligonucleótidos con una
secuencia complementaria en este rango de tamaño.

El efecto terapéutico de los oligonucleótidos se obtiene mediante la unión específica de factores

de transcripción y el plegamiento intramolecular en estructuras que puede unirse e interferir con
la función de varias biomoleculas.

Finalmente, las células muestran receptores específicos para oligonucleótidos. Estos receptores
pueden activar una variedad de respuestas inmunológicas que pueden ser de valor terapéutico.

Los oligonucleótidos pueden ser moléculas muy potentes. Sin embargo, la interpretación del
mecanismo de acción terapéutica de una secuencia oligonucleótida específica no es sencilla.
Aparate de la actividad deseada los oligonucleótidos pueden efectos específicos de secuencias no
deseados por ejemplo efectos adversos.

Hay algo que se conoce como complementariedad de secuencias parciales que puede afectar la
unión de ácidos nucleótidos distintos a la especie objeto (conocido como efecto fuera del objetivo)
La estimulación de respuestas inmunes también puede ocurrir y la unión a proteínas y péptidos
puede alterar su actividad.

Otras características de los oligonucleótidos también impiden una aplicación clara como
terapéutico. Son sensibles a la degradación por las nucleasas y sus características fisicoquímicas
conducen a una rápida excreción por los riñones e inducen la absorción por los macrófagos
dificultando la acumulación de tejido diana (Geary et al. 2015). Además, el paso espontáneo sobre
las membranas celulares para estas moléculas grandes y cargadas para aplicaciones intracelulares
es difícil.

UNIÓN DIRECTA A ÁCIDOS NO NUCLEICOS

Algunos oligonucleótidos terapéuticos tienen aplicaciones que no se basan en el emparejamiento

de bases con ácidos nucleicos endógenos. Esto puede ser el resultado de la unión a receptores
inmunes específicos que reconocen ácidos nucleicos en lugares inesperados (por ejemplo, ADN
extracelular) o cualidades estructurales específicas (por ejemplo, motivos CpG).

Los ácidos nucleótidos cuentan con la capacidad de plegarse o unirse a estructuras

tridimensionales complejas atreves de regiones interna de complementariedad (parcial) lo que le
permite unirse prácticamente a cualquier biomolecula.
IMPORTANCIA DE MOTIVOS CpG EN EL DISEÑO DE OLIGONUCLEÓTIDOS

Son moléculas cortas de ADN sintético monocatenario que contienen un desoxinucleótido de

citosina trifosfato ("C") seguido de un desoxinucleótido de guanina trifosfato ("G"). La "p" se
refiere al enlace fosfodiéster entre nucleótidos consecutivos, aunque algunos ODN tienen un
esqueleto de fosforotioato (PS) modificado en su lugar.

Se evidencian que los oligonucleótidos con motivos CpG tienen un gran

potencial de aplicación en el desarrollo de vacunas y en el tratamiento de
trastornos alérgicos.

Cuando estos motivos CpG no están metilados, actúan como inmunoestimulantes.

Principalmente el uso de los motivos CpG como adyuvante

para vacunas, el tratamiento de los trastornos alérgicos y
de tumores.
En varios estudios se demostró que algunas secuencias de
ADN ricas en CpG no metiladas y ubicadas en un contexto
de bases determinadas, eran la responsable del potencial
inmunoestimulador.

Estas secuencias aparecen 20 veces mas frecuentes en el

ADN de bacteria que en el ADN de mamíferos y parece
constituir una estructura que genera una señal de peligro
para el sistema inmunitario Estos oligonucleótidos
provocaban proliferación y estimulación en células B,
macrófagos, células NK y células presentadoras de
antígenos. Sin embargo, cuando se metilaba la C se perdía
totalmente la capacidad inmunoestimuladora del
compuesto. De esta forma, quedó establecido que lo que
hace diferente al ADN bacteriano del ADN de mamíferos era
la abundancia de motivos CpG en su secuencia. Los
oligonucleótidos sintéticos que contienen este motivo de
CpG pueden funcionar con fuertes inmunoestimuladores con
amplias potencialidades de aplicación.

Características estructurales

Los CpG ODN sintéticos se diferencian del ADN microbiano en que tienen un esqueleto parcial o
completamente fosforotioado (PS) en lugar del esqueleto típico de fosfodiéster y una cola de poli
G en el extremo 3 ', extremo 5' o ambos. La modificación de PS protege al ODN de ser degradado
por nucleasas como la DNasa en el cuerpo y la cola de poli G mejora la captación celular. [7] Las
colas de poli G forman tétradas intermoleculares que dan como resultado agregados de alto peso
molecular. Estos agregados son responsables del aumento de actividad que imparte la secuencia
poli G; no la secuencia en sí. [8] Se ha demostrado que numerosas secuencias estimulan TLR9con
variaciones en el número y ubicación de los dímeros CpG, así como las secuencias de bases
precisas que flanquean los dímeros CpG. Esto condujo a la creación de cinco clases o categorías no
oficiales de CpG ODN basadas en su secuencia, estructuras secundarias y efecto sobre las células
mononucleares de sangre periférica humana ( PBMC ). Las cinco clases son Clase A (Tipo D), Clase
B (Tipo K), Clase C, Clase P y Clase S. [9]Es importante señalar que durante el proceso de
descubrimiento, las "Clases" no se definieron hasta mucho más tarde cuando se hizo evidente que
los ODN con ciertas características provocaban respuestas específicas. Debido a esto, la mayoría
de los ODN mencionados en la literatura usan números (es decir, ODN 2006, ODN 2007, ODN
2216, ODN D35, ODN K3, etc.). Los números son arbitrarios y provienen de probar un gran número
de ODN con ligeras variaciones en los intentos de encontrar la secuencia óptima. Además, algunos
artículos darán nombres diferentes a las ODN descritas anteriormente, lo que complicará aún más
la convención de nomenclatura.

Los aptámeros

Como receptores de afinidad Los aptámeros son oligonucleótidos sintéticos de ARN o ADN de
cadena sencilla (normalmente 20-80 nucleótidos con pesos moleculares de entre 6 y 30 kDa),
capaces de adoptar conformaciones tridimensionales únicas que les permiten reconocer y, por lo
tanto, enlazarse con gran afinidad y especificad a casi cualquier tipo de diana, desde iones hasta
células13 . La propiedad más importante de un aptámero (del latín aptus, adaptar) es su elevada
selectividad. A diferencia de otras sondas moleculares basadas en ácidos nucleicos, los aptámeros
interaccionan y se unen a sus correspondientes dianas mediante un proceso de reconocimiento
estructural, similar a la reacción antígeno-anticuerpo (Figura 1). Es por ello que a los aptámeros
también se les conoce por el nombre de “anticuerpos químicos”. Estos puede unirse al la molecula
objetivo por interraciones de carga e hidrofobicas y puestes de hidrógenos y el objetivo son
moléculas pequeñas o macromoléculas. Los aptameros se aíslan artificialmente, mientras que los
riboswitches ocurren naturalmente.

Se ha demostrado que varios virus codifican ARN pequeños y estructurados que se unen a
proteínas virales o celulares con alta afinidad y especificidad. Se demostró que estos ARN podían
modular la actividad de proteínas esenciales para la replicación viral o inhibir la actividad de
proteínas implicadas en respuestas antivirales celulares. Además, se ha demostrado que los
genomas de los procariotas contienen ribosbrujos sensibles a los nutrientes para regular la
expresión génica. Sintéticamente, tales compuestos pueden ser identificados sometiendo una gran
biblioteca diversa de moléculas de ácido nucleico a un procedimiento de panoramización (Fig.
15.2). Este proceso de selección ha sido denominado SELEX (evolución sistemática de ligandos por
enriquecimiento exponencial) (Stoltenburg et al. 2007).

Método para la generación de aptámeros denominado SELEX

Este método utiliza la química combinatoria para la selección de ácidos

nucleicos sintéticos con alta afinidad por su molécula diana. La química
combinatoria consiste en la síntesis de un número significativo de moléculas de
estructura similar que forman colecciones (bibliotecas) consiguiendo una gran
diversidad química, y en la cual se puede tamizar una molécula diana para
encontrar miembros (es decir, secuencias) de dicha biblioteca que presenten
afinidad (3).

El método SELEX (figura 1) consiste en la selección de los miembros de una

biblioteca (aproximadamente 1015 secuencias diferentes) que se unen a la
molécula diana. Se puede dividir este método en tres pasos principales: 1) la
interacción entre los miembros de la biblioteca y la molécula diana; 2) la
selección de los miembros que poseen afinidad por la molécula diana y 3) el
enriquecimiento de la biblioteca mediante amplificación usando PCR (por la
sigla en inglés de polymerase chain reaction). La composición natural de los
aptámeros incluye ADN y ARN. Sin embargo, se han incorporado
satisfactoriamente al proceso enzimático o de síntesis secuencias con ácidos
nucleicos modificados. Estos últimos han sido evaluados exitosamente
mediante ensayos in vitro o modelos in vivo (4). En el caso de ADN-SELEX (5),
la doble cadena se separa y una de sus cadenas sencillas es la forma funcional
de la biblioteca. En ARN-SELEX (6) se requieren la transcripción para hacer
funcional la biblioteca partiendo de ADN y la transcripción reversa para
enriquecerla posteriormente mediante PCR (7).

Al aplicar la evolución dirigida de las polimerasas naturales para ampliar su espectro de sustratos,
la síntesis y la transcripción inversa de ácidos nucleicos completamente sintéticos, también
llamados ácidos nucleicos xeno (XNAs), se ha hecho posible (Pinheiro et al. 2012). Un aptamer
dirigido al VEGF, el pegaptanib (Macugen), se comercializa para la degeneración macular
relacionada con la edad húmeda (Nimjee et al. 2017).
El aptamer PEGylado (para la PEGylación véase también Cap. 27) se inyecta en el vítreo a una dosis
de 1,65 mg (0,3 mg de los cuales es aptamer)/ojo en 90 μl cada 6 semanas. Los efectos adversos
incluyeron endoftalmitis y eventos hemorrágicos en el ojo, relacionados con el procedimiento de
inyección. El compuesto también parecía exhibir efectos en la retinopatía diabética. Para
aumentar la estabilidad varios nucleótidos son 2 -O-metil y 2 -O-fluoro modificados y el aptamer se
conjuga con polietilenglicol, que estabiliza el aptamer en solución y facilita la administración
clínica.

El producto pegaptanib ya fue aprobado en 2004. Dada la experiencia con este pionero clínico y el
hecho de que la identificación de los aptameros que unen una proteína de interés asociada a una
enfermedad es relativamente sencilla, se puede esperar una avalancha de terapias basadas en
aptameros. En realidad, el pegaptanib sigue siendo el único aptamer terapéutico aprobado. Varios
aptamers están en desarrollo clínico (tabla 15.1). Sin embargo, el desarrollo clínico se ha detenido
para algunos, incluida la pegnivacogina, que estaba en estudios avanzados de Fase II (Povsic et al.
2016). La pegnivacogina es un aptamer de ARN de 31 nucleótidos modificado que se une e inhibe
el factor IXa. Se conjuga con metoxi-polietilenglicol ramificado de 40 kDa. Se produjeron
reacciones alérgicas graves en un subconjunto de pacientes (24 de 1605 tratados) con anticuerpos
PEG preexistentes. Esto indica que el entorno inmunoprivilegiado del ojo puede haber sido clave
para el éxito clínico del pegaptanib y requiere una cuidadosa consideración de las estrategias de
PEGylación para los aptameros que se utilizan sistémicamente.

Estimulando las respuestas inmunes

Tabla 15.1 Aptamers aprobados o en estudios clínicos avanzados

Las diferencias en la estructura química entre la información genética de microorganismos
patógenos y mamíferos pueden formar una señal de reconocimiento para la activación inmune.
Existen receptores específicos que reconocen el ADN patógeno o el ARN y posteriormente activan
una serie de programas genéticos. Por ejemplo, la familia de receptores tipo Toll (TLR), de los
cuales TLR3 reconoce ARN de doble cadena y TLR9 reconoce fragmentos de ADN CpG, lo que
podría indicar la presencia de patógenos bacterianos. La amplia activación proinflamatoria que
resulta de esta unión, puede dificultar la aplicación de oligonucleótidos como terapéuticos, pero
también puede ser girada para tener aplicaciones en aplicaciones antivirales, inmunoactivas,
adyuvantes de vacunas y antitumorales.

El ADN procariótico contiene muchas secuencias de dinucleótidos CpG, mientras que el ADN de los
mamíferos tiene muy pocos, que por lo general están metilados. Los oligonucleótidos sintéticos
que contienen motivos CpG pueden imitar el ADN procariótico e inducir respuestas inmunes
(Shirota et al. 2015). La secuencia CpG es una fuerte señal de reconocimiento para las células de
mamíferos a través de la interacción con el receptor Toll en los endosomas que conduce a la
proliferación de células B y la activación de células de linaje mieloide. CpG1018 es un adyuvante
aprobado en la vacuna contra la hepatitis B comercializada Heplisav[ .

Varios otros oligonucleótidos basados en CpG se prueban actualmente en ensayos clínicos para
una variedad de aplicaciones (Tabla 15.2), p. ej., junto con antígenos del ántrax como vacuna,
junto con antígenos del melanoma para aumentar la vigilancia inmune del cáncer, y para limitar
las respuestas alérgicas con el alérgeno del ácaro del polvo doméstico. En la colitis ulcerosa, el
enfoque un tanto contraintuitivo para estimular el sistema inmune con el agonista TLR9,
Kappaproct[, en realidad parece apoyar la regeneración al romper la inflamación crónica ardiente
característica de la enfermedad.

En un enfoque similar, el ARN ssRNA y el ARN dsRNA pueden ser un predictor de infección viral y
los receptores tipo Toll reconocen el ARN ss7 (TLR7/8) y el ARN dsRNA (TLR3) en los endosomas,
respectivamente. En particular, el dsRNA sintético compuesto de ácidos poliinosinicos y
policitoidilicos (poli-IC) es un activador fuerte (Martins et al. 2015). Es clínicamente probado como
poli-ICLC (Hiltonolķ) por Oncovir Inc., como una formulación polilisina-compleja de poli-IC, para
proteger el dsRNA de la degradación mediada por nucleasa. El sistema se está desarrollando en
cáncer de ovario avanzado recidivante junto con el anticuerpo oregovomab.
Cuadro 15.2 Oligonucleótidos inmunoestimuladores aprobados o en estudios clínicos avanzados