La revista farmacéutica y química, 2015, 2 (2): 30-40

Disponible en linea www.tpcj.org

ISSN: 2349-7092
Artículo de revisión CODEN (EE. UU.): PCJHBA

Una descripción general del proceso de desarrollo, optimización y validación del método HPLC para el análisis de fármacos

Vikram Kumar *, Rabijit Bharadwaj, Gaurav Gupta, Shailesh Kumar

Amity Institute of Biotechnology, Amity University Rajasthan, Jaipur 303002, Rajasthan, India

Abstracto Actualmente se utilizan muchas estrategias diferentes de desarrollo de métodos de cromatografía líquida de alta resolución. Esta
descripción general describe una estrategia para el desarrollo sistemático de métodos de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Es una
herramienta analítica que puede separar, detectar y cuantificar el fármaco, sus diversas impurezas y degradantes relacionados con el fármaco que
pueden formarse en la síntesis o el almacenamiento. La HPLC implica la comprensión de la química de la sustancia farmacéutica y facilita el
desarrollo del método analítico. Se evaluaron muchos parámetros cromatográficos para optimizar el método. Se debe encontrar la fase móvil, la
fase estacionaria, la columna, el tamaño de la columna, la temperatura, la longitud de onda y el gradiente apropiados que proporcionen una
compatibilidad y estabilidad adecuadas del fármaco, así como de impurezas y degradantes.

Palabras clave HPLC, cromatografía, fármaco, optimización, validación

Introducción
La cromatografía es un procedimiento que se utiliza para resolver una mezcla compleja en sus fracciones o componentes particulares individuales. Es una
técnica de separación y las unidades separadas se pueden identificar utilizando cualquier técnica analítica como UV-visible, Infrarrojos, Espectroscopía de
masas, RMN, etc. Para realizar análisis cuantitativos se realiza la medición del área bajo la curva en el cromatograma.

"Chromato" "graphy" deriva su nombre de dos palabras, ya que chromo significa color y graphy significa escritura. es decir, se forman bandas de color en el
procedimiento que se miden o analizan. Estas bandas de color se forman debido a la separación de compuestos individuales en diferentes longitudes en la
columna como se ve en la cromatografía en columna y en papel en la cromatografía en papel.

Pero en los métodos modernos como las bandas de color HPLC no se pueden ver y se utilizan detectores.

Principio de cromatografía
La cromatografía se puede definir simplemente como el proceso de separación de los componentes individuales de una mezcla en función de sus afinidades

relativas hacia las fases móviles y estacionarias.

Principio: Las muestras se someten al flujo de una fase líquida móvil a través de la fase estacionaria estable. Los compuestos de la muestra se
separan en componentes individuales en función de su afinidad relativa hacia las dos fases durante su recorrido.

La revista farmacéutica y química

30
Kumar V et al The Pharmaceutical and Chemical Journal, 2015, 2 (2): 30-40

El compuesto de muestra con la mayor afinidad por la capa estacionaria viajará más lento y por una distancia más corta en comparación con los compuestos con

menos afinidad que viajan más rápido y por una distancia más larga [1].

Tipos de cromatografía:
Según la técnica empleada en la separación de componentes individuales, la cromatografía se clasifica en términos generales como:

1. Basado en adsorción: Aquí la capa estacionaria es una superficie sólida mientras que la fase móvil es líquida. Los compuestos viajan a la superficie
sólida bajo la influencia del líquido móvil. La separación depende del grado de adsorción física de los compuestos a la superficie sólida.

2. Basado en particiones: En este método, tanto la fase estacionaria como la móvil son líquidas. Entonces, los compuestos se separan debido a la afinidad
basada en sus coeficientes de partición en las capas líquidas individuales. El compuesto con mayor coeficiente de partición al líquido móvil tiene mayor
afinidad con él, por lo que viaja más rápido y viceversa.

Según el tipo de material estacionario utilizado para la separación, es de dos tipos:

1) Fase normal: El material estacionario en fase normal es de naturaleza polar y, por lo tanto, los compuestos con mayor polaridad eluyen en último lugar, mientras

que los no polares salen primero.

2) Fase inversa: El material estacionario en fase inversa es de naturaleza no polar y, por lo tanto, los compuestos con menor polaridad eluyen en último
lugar y viceversa.
Principalmente en el análisis de HPLC, el tipo que se utiliza hoy en día es el de fase inversa, ya que muchos de los compuestos biológicos, fitoquímicos y

fármacos que se analizan mediante HPLC son de naturaleza polar [1].

¿Qué es HPLC?
Cromatografía líquida de alta presión es la forma completa para HPLC y, como se indica en el nombre, se utiliza alta presión en principio de su
funcionamiento. También debido a su eficacia en el análisis de compuestos, se considera Cromatografía líquida de alta resolución. Algunos incluso han
llegado al extremo de llamarlo como Cromatografía líquida de alta paciencia basado en el largo tiempo humano requerido y la paciencia necesaria en su
funcionamiento.
HPLC es uno de los sistemas de cromatografía modernos que se utilizan ampliamente en los campos de la investigación clínica, investigación bioquímica,
control de calidad industrial, etc. Las aplicaciones de HPLC incluyen detección, análisis, determinación, cuantificación, derivación de moléculas a partir de
mezclas biológicas, vegetales y médicas. importancia. La cromatografía líquida de alta resolución es básicamente una forma muy mejorada de cromatografía
en columna. En lugar de permitir que el solvente gotee a través de una columna solo bajo la fuerza de la gravedad, es forzado externamente a través de la
columna bajo altas presiones de hasta 400 atm. Esto hace que el proceso cromatográfico sea mucho más rápido.

También permite el uso de un tamaño de partícula muy pequeño para el material de relleno de la columna, lo que proporciona una superficie mucho mayor para las

interacciones entre la fase estacionaria y las moléculas que fluyen a través de ella. Así, permite una separación mucho mejor de los componentes de la mezcla.

La cromatografía líquida de alta resolución es ahora una de las herramientas más poderosas de la química analítica, ya que tiene la capacidad de identificar, separar

y cuantificar los compuestos que están presentes en cualquier muestra que se pueda disolver en cualquier líquido. Hoy, trazas de concentraciones de compuestos

tan bajas como partes por billón [ ppt] pueden identificarse fácilmente. La HPLC se puede aplicar y se ha aplicado a casi cualquier muestra, como alimentos,

productos farmacéuticos, muestras forenses, nutracéuticos, cosméticos, productos químicos industriales y matrices ambientales [2-3].

En HPLC se utilizan dos variantes basadas en la polaridad relativa del disolvente y la fase estacionaria.

HPLC en fase normal

Esto es esencialmente lo mismo que ya habrá leído en cromatografía de capa fina o cromatografía en columna. Aunque se describe como
"normal", no es la forma más común de HPLC.
La columna está llena de diminutas partículas de sílice y el disolvente no es polar, por ejemplo, hexano. Una columna típica tiene un diámetro interno de
alrededor de 4,6 mm y una longitud en el rango de 150 a 250 mm.

La revista farmacéutica y química

31
Kumar V et al The Pharmaceutical and Chemical Journal, 2015, 2 (2): 30-40

Los compuestos polares de la mezcla que pasan a través de la columna se adhieren más a la sílice polar que los compuestos no polares. Por
tanto, los no polares pasarán más rápidamente por la columna.

HPLC de fase inversa

En la fase inversa, el tamaño de la columna es el mismo, pero la sílice se modifica y se vuelve no polar uniendo largas cadenas de hidrocarburos a su
superficie, por lo general con 8 o 18 átomos de carbono en ellas. Se utiliza un disolvente polar, por ejemplo, una mezcla de un alcohol como metanol y
agua [3].
Habrá una fuerte atracción entre el solvente polar y las moléculas polares en la mezcla que pasa a través de la columna. La atracción entre las
cadenas de hidrocarburos unidas a la sílice (la fase estacionaria) y las moléculas polares en la solución no será tanta. Por lo tanto, las moléculas
polares en la mezcla pasarán la mayor parte de su tiempo moviéndose con el solvente.

Los compuestos no polares de la mezcla tenderán a formar atracciones con los grupos hidrocarbonados debido a las fuerzas de van-der Waals. Serán
menos solubles en el disolvente debido a la necesidad de romper los enlaces de hidrógeno cuando se aprieten entre las moléculas de agua o metanol.
Pasan menos tiempo en solución en el solvente y esto los ralentizará en su camino a través de la columna. Esto significa que ahora son las moléculas
polares las que viajarán a través de la columna más rápidamente. La HPLC de fase inversa es la forma de HPLC más utilizada [2-3].

Principios del desarrollo de métodos en HPLC

Para comprender los principios del desarrollo de métodos en HPLC, es necesario conocer el funcionamiento básico, los procesos de elución y los
parámetros físicos y químicos de la técnica y la selección de detectores para detectar el analito. En este artículo de revisión, discutiremos los principios
mencionados anteriormente y sugeriremos las modificaciones más óptimas para el desarrollo de métodos en HPLC.

Operación
La muestra a analizar se inyecta en un pequeño volumen en la corriente de la fase móvil. El movimiento del analito a través de la columna se ralentiza por

interacciones químicas o físicas específicas con las fases estacionarias a medida que atraviesa la longitud de la columna. La cantidad de analito que se ralentiza

depende de la naturaleza del analito y de las composiciones de las fases estacionaria y móvil. El tiempo que tarda un analito específico en eluir se denomina tiempo de

retención; el tiempo de retención en condiciones particulares se considera una característica de identificación razonablemente única de un analito dado. El

empaquetamiento de la columna de tamaño de partícula más pequeño (que crea una contrapresión más alta) aumenta la velocidad lineal, lo que da a los componentes

menos tiempo para difundirse dentro de la columna, lo que conduce a una resolución mejorada en el cromatograma resultante. Los disolventes comúnmente utilizados

incluyen cualquier combinación miscible de agua o varios líquidos orgánicos (los más comunes son el metanol y el acetonitrilo). El agua puede contener tampones o

sales para ayudar en la separación de los componentes analitos o compuestos tales como ácido trifluoroacético que actúa como un agente de apareamiento de iones.

Un perfeccionamiento adicional de la HPLC ha sido cambiar la composición de la fase móvil durante el análisis. Esto se conoce como elución en
gradiente. Un gradiente general para la cromatografía de fase inversa puede comenzar con metanol al 5% y progresar gradualmente hasta
metanol al 50% durante 25 minutos; el gradiente elegido depende de la hidrofobicidad del analito. Las mezclas de analitos se separan en función
de la afinidad del analito por la composición de la fase móvil actual con respecto a la fase estacionaria. Este proceso de partición es similar al que
ocurre durante una extracción líquido-líquido, pero es continuo y no escalonado. Por ejemplo, cuando se usa un gradiente bajo en agua / alto en
metanol, los componentes más hidrófobos eluirán de la columna debido a una fase móvil relativamente hidrófoba.

La elección de disolventes, aditivos y gradiente depende de la naturaleza del analito y de la fase estacionaria. Por lo general, se realizan una serie de
pruebas en el analito y se pueden procesar varias series de prueba para encontrar el método de HPLC óptimo que proporcione la mejor separación de
picos.

La revista farmacéutica y química

32
Kumar V et al The Pharmaceutical and Chemical Journal, 2015, 2 (2): 30-40

Figura 1: Instrumentación básica de HPLC

Figura 2: Un esquema de flujo para HPLC

Flujo isocrático y elución en gradiente

La separación que mantiene constante la composición de la fase móvil durante todo el procedimiento se denomina isocrática, que significa
composición constante.
La composición de la fase móvil no tiene que permanecer necesariamente constante. Cuando la composición de la fase móvil cambia durante el proceso
de separación, se describe como una elución en gradiente. Los dos componentes de la fase móvil se denominan típicamente "A" y "B"; el componente A
es el solvente débil que permite que el soluto eluya lentamente y B es el solvente fuerte que eluye rápidamente los solutos de la columna. El disolvente A
suele ser agua, mientras que el B es un disolvente orgánico miscible con agua, como metanol, isopropanol, THF o acetonitrilo.

En la elución isocrática, el ancho del pico aumenta linealmente con el tiempo de retención de acuerdo con la ecuación para N, el número de platos teóricos. Esto

tiene la desventaja de que los picos de elución tardía se vuelven muy planos y anchos. La forma y el ancho pueden evitar que se reconozcan como picos.

El gradiente de elución reduce la retención de los componentes que se eluyen más tarde para que eluyan más rápido y den picos estrechos y más altos para la

mayoría de los componentes. Esta elución también mejora la forma del pico de los picos con cola porque la concentración creciente del eluyente orgánico empuja

hacia adelante la parte de la cola de un pico. La altura del pico aumenta, lo que hace que se vea más nítido y esto es importante en el análisis de trazas. El

programa de gradiente puede incluir incrementos repentinos en el porcentaje de componente orgánico de acuerdo con el deseo de una separación óptima en el

mínimo tiempo posible. En la elución isocrática, los solutos eluyen en el mismo orden en que la selectividad no cambia incluso si se cambian las dimensiones de la

columna (longitud y diámetro interno), mientras que en la elución en gradiente, el orden de elución puede cambiar a medida que cambian las dimensiones o el

caudal.

La revista farmacéutica y química

33
Kumar V et al The Pharmaceutical and Chemical Journal, 2015, 2 (2): 30-40

El papel del componente orgánico de la fase móvil es reducir el orden superior de la estructura del agua y así reducir la resistencia retardadora del
componente acuoso.

Parámetros
Diámetro interno
El diámetro interno (DI) de una columna de HPLC es un parámetro importante que influye en la sensibilidad de detección y la selectividad de separación en elución en

gradiente. También determina la cantidad de analito que se puede cargar en una columna. Las columnas más grandes se ven generalmente en aplicaciones industriales

como la purificación de un medicamento para su uso posterior. Las columnas de bajo DI tienen una sensibilidad mejorada y un menor consumo de solvente a expensas

de la capacidad de carga. Las columnas de mayor diámetro interno (más de 10 mm) se utilizan para purificar cantidades utilizables de material debido a su gran

capacidad de carga. Las columnas de escala analítica (4,6 mm) han sido el tipo más común de columnas, aunque las columnas más pequeñas están creciendo

rápidamente en popularidad. Las columnas de escala analítica se utilizan en el análisis cuantitativo tradicional de muestras y, a menudo, utilizan un detector de

absorbancia UV-Vis.

Las columnas de calibre estrecho (1-2 mm) se utilizan para aplicaciones en las que se desea una mayor sensibilidad, ya sea con detección de fluorescencia, detectores

UV-Vis o con otros métodos de detección como cromatografía líquida-espectrometría de masas. Las columnas capilares que tienen un tamaño inferior a 0,3 mm se

utilizan más exclusivamente con medios de detección alternativos como la espectrometría de masas. Estas columnas suelen estar hechas de capilares de sílice fundida,

en lugar de los tubos de acero inoxidable que se emplean en las columnas más grandes [4].

Tamaño de partícula

La mayoría de las HPLC tradicionales se realizan con la fase estacionaria unida al exterior de pequeñas partículas de sílice esféricas. Estas partículas de sílice

vienen en muchos tamaños, siendo las perlas de 5 μm las más utilizadas. Las partículas más pequeñas normalmente proporcionan más área superficial y mejores

separaciones, pero la presión requerida para la velocidad lineal óptima aumenta en la inversa del diámetro de la partícula al cuadrado. Esto implica que cambiar a

partículas que son la mitad de grandes mientras se mantiene el mismo tamaño de la columna definitivamente duplicará el rendimiento, pero también aumentará la

presión requerida en un factor de cuatro. Las partículas más grandes se utilizan en HPLC preparativa donde los diámetros de columna están en el rango de 5 cm a>

30 cm y para aplicaciones que no son de HPLC, como la extracción en fase sólida [5-6].

Tamaño de poro

Muchas fases estacionarias son porosas para proporcionar una mayor superficie para el disolvente. Un poro pequeño proporcionará una mayor área de superficie, mientras que un

tamaño de poro más grande tiene una mejor cinética, especialmente se utilizan analitos grandes. Por ejemplo, una proteína que es sólo un poco más pequeña que un poro puede entrar

en el poro pero no sale fácilmente una vez dentro [7-8].

Presión de la bomba

Las bombas varían en capacidad de presión, pero su rendimiento se mide en función de su capacidad para producir un caudal constante y reproducible. La

presión puede alcanzar hasta 40 MPa (6000 lbf / in 2 o alrededor de 400 atm). Los sistemas de HPLC modernos se han mejorado para trabajar a una presión

mucho más alta y, por lo tanto, pueden utilizar tamaños de partículas mucho más pequeños en las columnas (<2 μm). Estos sistemas de "cromatografía líquida de

ultra alto rendimiento" o RSLC / UHPLC pueden trabajar hasta 100 MPa (15000 lbf / in 2 o 1000 atm) [9].

Selectividad de solvente

La fuerza de elución de un disolvente dado está determinada por su hidrofobicidad, pero la selectividad de un disolvente está determinada por sus características

polares. El heptano y el hexano tienen la misma fuerza de elución pero diferente selectividad. Por ejemplo, el metanol es un fuerte donante de protones y un fuerte

aceptor de protones en los enlaces de hidrógeno. El acetonitrilo tiene un momento dipolar, pero es solo un aceptor de protones muy débil en los enlaces de hidrógeno.

El tetrahidrofurano acepta un protón en el enlace de hidrógeno pero no puede donar un protón [10].

La revista farmacéutica y química

34
Kumar V et al The Pharmaceutical and Chemical Journal, 2015, 2 (2): 30-40

Efecto del pH sobre la ionización del analito

El mecanismo principal de retención en la cromatografía RP es la interacción hidrofóbica. Los compuestos ionizantes harán que se comporten como
especies más polares y reducirán su interacción hidrófoba con la fase estacionaria, lo que conducirá a una menor retención.

Ácidos Bases
H
O OH O O H H
H H
-H
C C norte
norte H

• Más hidrofóbico, retenido con más fuerza Menos

• hidrofóbico, retenido con menos fuerza

El estado de ionización de una molécula estará determinado por el pH de la fase móvil y, por tanto, el pH de la pnasa móvil dictará el comportamiento de
retención de los analitos con grupos funcionales ionizables.

Efecto de la temperatura

Las condiciones de temperatura en el desarrollo del método de HPLC presentan un desafío porque pueden tener efectos impredecibles sobre la selectividad. El uso

de temperaturas elevadas:

1. Reducir la viscosidad de la fase móvil y contrapresión. Esto puede permitirle operar a velocidades de flujo más altas o usar columnas más largas / tamaños de partículas más

pequeños.

2. Reducir el tiempo de elución.

3. Mejorar el método reproducibilidad en lugar de operar a temperatura ambiente). Sin embargo, es

imposible determinar si el uso de temperaturas elevadas ayudará o impedir un específico

separación porque para las separaciones complejas, las mejoras en una parte del cromatograma casi siempre van acompañadas de una mejora
en otra parte del mismo cromatograma [12].

Tiempo de retención

El tiempo que tarda un compuesto en particular en viajar a través de la columna hasta el detector se conoce como tiempo de retención. El tiempo de retención
se mide desde el momento en que se inyecta la muestra en el sistema hasta el punto en el que la pantalla muestra una altura de pico máxima para ese
compuesto.
Los diferentes compuestos tienen diferentes tiempos de retención. El tiempo de retención de un compuesto en particular variará según:

• la presión utilizada (porque afecta el caudal del disolvente) la naturaleza de la fase

• estacionaria (material y tamaño de partícula) la composición exacta del disolvente
•
• la temperatura de la columna
Si utiliza tiempos de retención como una forma de identificar compuestos, las condiciones deben controlarse cuidadosamente.

Selección de búfer

La elección del tampón se rige por el pH que se desee. El rango de pH típico para la fase reversa en empaquetamiento a base de sílice es de 2 a 8. Es

importante que el tampón tenga un pKa cercano al pH deseado ya que el tampón controla mejor el pH en su pKa. Una regla es elegir un tampón con un valor de

pKa <2 unidades del pH deseado de la fase móvil.

La revista farmacéutica y química

35
Kumar V et al The Pharmaceutical and Chemical Journal, 2015, 2 (2): 30-40

Consideraciones generales durante la selección del búfer:

• El fosfato es más soluble en metanol / agua que en acetonitrilo / agua o THF / agua.
• Algunos tampones de sal son higroscópicos y esto puede dar lugar a cambios en la cromatografía como un aumento de las colas de compuestos básicos y

posiblemente diferencias de selectividad.

• Las sales de amonio son generalmente más solubles en fases móviles orgánicas / agua.

• El ácido trifluoroacético puede degradarse con el tiempo. Es volátil y se absorbe a bajas longitudes de onda de UV.

• El crecimiento microbiano puede ocurrir rápidamente en fases móviles tamponadas que contienen poco o ningún modificador orgánico. El crecimiento se

acumula en las entradas de la columna y puede dañar el rendimiento cromatográfico.

• A un pH superior a 7, el tampón fosfato acelera la disolución de la sílice y acorta considerablemente la vida útil de las columnas de HPLC basadas en

sílice. Si es posible, los tampones orgánicos deben usarse a un pH superior a 7. Los tampones de bicarbonato de amonio suelen ser propensos a

• cambios de pH y suelen ser estables solo durante 24 a 48 horas. El pH de esta fase móvil tiende a volverse más básico debido a la liberación de

dióxido de carbono. Una vez preparados los tampones, deben filtrarse a través de un filtro de 0,2 μm.

•
• Las fases móviles deben desgasificarse.

Concentración de tampón

Generalmente, una concentración de tampón de 10-50 mM es adecuada para moléculas pequeñas. Generalmente, no se debe usar más del 50% orgánico con
un tampón. Esto dependerá de el tampón específico así como su concentración.
El ácido fosfórico y sus sales de sodio o potasio son los sistemas tampón más comunes para HPLC de fase inversa. Los tampones de sulfonato pueden reemplazar a

los tampones de fosfonato cuando se analizan compuestos organofosforados [13].

Selección de detectores

Detectores de HPLC son importantes accesorios de la HPLC instrumento.

Esta parte de HPLC ayuda en la detección e identificación de compuestos en la muestra inyectada. Los detectores están

diseñados para tener ciertas propiedades como

• deben ser inertes (no reactivos) a las muestras inyectadas y las fases móviles que las atraviesan.
• deben ser preferiblemente no destructivos para la muestra.

• debe poder producir una respuesta rápida y cuantitativa.

• detección y datos analíticos fiables, uniformes y reproducibles.
• compatible con todo tipo de compuestos bajo prueba.
• debe tener una buena sensibilidad (capacidad para detectar compuestos en concentraciones muy bajas en los rangos por debajo de μg, ng, etc.) ya que la cantidad

de muestra puede ser menor en muchos casos.

Todos los tipos de Detectores de HPLC cumplen la mayoría de las propiedades anteriores [13].

Tipos de detectores de HPLC

Basándose en el principio utilizado en la detección, los detectores disponibles son detectores UV, detectores fluorescentes, detectores electroquímicos y
detectores de matriz de fotodiodos (PDA) y detectores de índice de refracción.

Detectores UV
La detección de la muestra depende de la absorción de la energía de los rayos UV por el analito. El detector consta de accesorios en orden como fuente de UV,

rejilla (para defracción de luz), paso de muestra a través de un tubo expuesto a rayos, fotocélula, conductor de carga, etc.

Cuando los rayos ultravioleta emitidos por la lámpara pasan a través de las rejillas, los rayos se dividen en diferentes longitudes de onda. Los rayos de una longitud de onda

específica pasan a través de la muestra. Cierta cantidad de luz es absorbida por la muestra y los rayos no absorbidos que caen sobre la fotocélula.

Estos rayos al chocar con las fotocélulas producen electrones cuya corriente se registra. Esto es indicativo de la naturaleza y cantidad de muestra. Este rango de

absorción de longitud de onda UV es específico para la muestra.

La revista farmacéutica y química

36
Kumar V et al The Pharmaceutical and Chemical Journal, 2015, 2 (2): 30-40

Estos son los detectores de HPLC utilizados en general, a menos que exista un requisito para el análisis de compuestos especiales. Son capaces de detectar una

amplia gama de compuestos. La sensibilidad varía hasta la cantidad de microgramos de estimación.

Detectores de PDA

Estos son detectores que siguen un principio similar a los detectores UV pero el rango de detección se extiende desde la región UV, visible y hasta cierto punto

hasta la región IR. Por lo tanto, las ventajas son una mayor sensibilidad y mide todo el rango de absorción, es decir, proporciona la exploración de todo el

espectro.

Detector de fluorescencia

En este detector, los rayos de fluorescencia emitidos por la muestra después de absorber la luz incidente se miden en función de la calidad y cantidad de la
muestra.
El equipo consta de accesorios en orden como fuente de luz, paso de muestra por un tubo expuesto a rayos, rejilla (para defracción de luz),
fotocélula, conductor de carga, etc.
La lámpara de arco de xenón se utiliza para producir luz para la excitación de moléculas de muestra. Estos rayos de luz excitan las moléculas de muestra. Estas

moléculas excitadas emiten florescencia, que pasan a través de rejillas. Estas rejillas pasan la fluorescencia a una longitud de onda específica a la fotocélula que

se registra. El detector es adecuado para compuestos que pueden producir florescencia.

Algunos compuestos se alteran químicamente para producir fluorescencia mediante derivatización química para estimar mediante este detector. Estos detectores tienen

alta precisión y sensibilidad (con menos ruido en los datos). Los compuestos se pueden medir hasta cantidades de nanogramos.

Detectores electroquímicos
Este detector es especialmente adecuado para estimar compuestos oxidables y reducibles. El principio es que cuando el compuesto se oxida o se
reduce, la reacción química produce un flujo de electrones. Este flujo se mide como corriente, que es función del tipo y cantidad de compuesto.

El sistema cuenta con electrodos como electrodo de trabajo donde se produce la oxidación o reducción y electrodo de referencia que actúa para restar la

conductividad de la fase móvil a la de la muestra. Este electrodo es adecuado para compuestos que no pueden ser analizados por un detector UV, especialmente

debido a sus similitudes en las propiedades de absorción de luz, por ejemplo, monoaminas. Este detector tiene una súper sensibilidad que varía hasta la medición

de picogramos. Por lo tanto, se pueden medir cantidades muy pequeñas de compuestos que están presentes en la muestra.

Este detector electroquímico produce un ruido severo o fluctuaciones en los picos. Por eso es difícil trabajar con él en comparación con otros detectores. Como tal,

todos los tipos de detectores de HPLC se utilizan según los requisitos de los laboratorios.

Detectores de índice de refracción

Se trata de detectores que miden el cambio de índice de refracción del eluyente de la columna con respecto a la fase móvil pura. Tienen varias
desventajas como la falta de alta sensibilidad, la no idoneidad para la elución en gradiente y también requieren un estricto control de temperatura ± 0.001 o C
para operar a su máxima sensibilidad.

Optimización del método

Las condiciones experimentales deben optimizarse para obtener las separaciones y la sensibilidad deseadas después de obtener las separaciones adecuadas. Las condiciones

experimentales del ensayo indicadoras de estabilidad se lograrán mediante un examen planificado / sistémico de parámetros que incluyen el pH (si es iónico), los componentes y

la proporción de la fase móvil, el gradiente, el caudal, la temperatura, las cantidades de muestra, el volumen de inyección y el tipo de disolvente de los diluyentes.

Validación de método
La validación de un procedimiento analítico es el proceso mediante el cual se establece, mediante estudios de laboratorio, que las características de desempeño

del procedimiento cumplen con los requisitos para su uso previsto. El proceso de validación de métodos para procedimientos analíticos comienza con la

recopilación planificada y sistemática por parte del solicitante de la validación.

La revista farmacéutica y química

37
Kumar V et al The Pharmaceutical and Chemical Journal, 2015, 2 (2): 30-40

datos para respaldar el procedimiento analítico [14-15]. Todos los métodos analíticos destinados a ser utilizados para analizar cualquier muestra clínica deberán ser

validados. La validación de los métodos analíticos se realiza según las directrices de la ICH.

Componentes de la validación de métodos

Las siguientes son características típicas de desempeño analítico que pueden probarse durante la validación de métodos:

• Exactitud
• Precisión
• Repetibilidad
• Precisión intermedia
• Linealidad

• Límite de detección

• Límite de cuantificación

• Especificidad

• Rango

• Robustez
• Determinación de la idoneidad del sistema

• Estudios de degradación forzada

• Estudios de estabilidad de la solución

Exactitud es la proximidad de un valor medido al valor verdadero o aceptado. La precisión indica la desviación entre el valor medio encontrado y el valor
real. Se determina aplicando el método a muestras a las que se han añadido cantidades conocidas de analito. Estos deben analizarse contra soluciones
estándar y en blanco para asegurarse de que no exista interferencia. Luego, la precisión se calcula a partir de los resultados de la prueba como un
porcentaje del analito recuperado por el ensayo. A menudo se puede expresar como la recuperación mediante el ensayo de cantidades añadidas conocidas
de analito [16].

los precisión de un método analítico es el grado de concordancia entre los resultados de las pruebas individuales obtenidos cuando el método se aplica a
un muestreo múltiple de una muestra homogénea. La precisión es una medida de la reproducibilidad de todo el método analítico [17]. Consta de dos
componentes: repetibilidad y precisión intermedia.
La precisión intermedia es la variación dentro de un laboratorio, como diferentes días, con diferentes instrumentos y por diferentes analistas [18-19]. La
precisión se expresa entonces como la desviación estándar relativa.
Exactitud y precisión no son lo mismo. Un método puede tener una buena precisión y, sin embargo, no serlo.
Repetibilidad es la variación experimentada por un solo analista en un solo instrumento. No distingue entre la variación del instrumento o sistema
solo y del proceso de preparación de la muestra. Durante la validación, la repetibilidad se realiza analizando múltiples réplicas de una muestra
compuesta de ensayo utilizando el método analítico. Se calcula el valor de recuperación.

Linealidad es la capacidad del procedimiento analítico para obtener una respuesta que es directamente proporcional a la concentración (cantidad) de analito en la

muestra. Si el método es lineal, los resultados de la prueba son directamente o mediante una transformación matemática bien definida proporcionales a la concentración

de analito en muestras dentro de un rango dado. La linealidad generalmente se expresa como el límite de confianza alrededor de la pendiente de la línea de regresión.

Límite de detección

El límite de detección (DL) o límite de detección (LOD) de un procedimiento individual es la cantidad más baja de analito en una muestra que puede detectarse

pero no necesariamente cuantificarse como un valor exacto. En los procedimientos analíticos que exhiben ruido de línea de base, el LOD puede basarse en una

relación señal / ruido (S / N) (3: 1), que generalmente se expresa como la concentración de analito en la muestra. (Libro) La señal La relación entre ruido y ruido

viene determinada por: s = H / h Donde H = altura del pico correspondiente al componente. h = valor absoluto de la mayor fluctuación de ruido desde la línea de

base del cromatograma de una solución en blanco.

La revista farmacéutica y química

38
Kumar V et al The Pharmaceutical and Chemical Journal, 2015, 2 (2): 30-40

Límite de cuantificación

El límite de cuantificación (LOQ) o límite de cuantificación de un procedimiento analítico individual es la cantidad más baja de analito en una muestra que se
puede determinar cuantitativamente con precisión y exactitud adecuadas. Para procedimientos analíticos como HPLC que exhiben ruido de línea base, el LOQ
generalmente se estima a partir de una determinación de la relación S / N (10: 1) y generalmente se confirma inyectando estándares que dan esta relación S /
N y tienen un estándar relativo porcentual aceptable. desviación también.

Especificidad es la capacidad de evaluar de manera inequívoca el analito en presencia de componentes que se puede esperar que estén presentes, como
impurezas, productos de degradación y excipientes. La especificidad mide solo el componente deseado sin interferencia de otras especies que puedan estar
presentes; la separación no es necesariamente necesaria.
Rango se define como el intervalo entre las concentraciones superior e inferior de analito en la muestra para el que se ha demostrado que el
procedimiento analítico tiene un nivel adecuado de precisión, exactitud y linealidad.
Robustez se define como la medida de la capacidad de un método analítico para no verse afectado por variaciones pequeñas pero deliberadas en los
parámetros del método (por ejemplo, pH, composición de la fase móvil, temperatura y ajustes instrumentales) y proporciona una indicación de su fiabilidad
durante el uso normal.
La determinación de la robustez es un proceso sistemático de variación de un parámetro y medición del efecto sobre el método mediante el seguimiento de la idoneidad

del sistema y / o el análisis de muestras.

Determinación de la idoneidad del sistema es la evaluación de los componentes de un sistema analítico para demostrar que el rendimiento de un sistema
cumple los estándares requeridos por un método [19]. Estos parámetros se pueden calcular experimentalmente para proporcionar un informe de prueba de
idoneidad del sistema cuantitativo: número de platos teóricos (eficiencia), factor de capacidad, separación (retención relativa), resolución, factor de cola,
desviación estándar relativa (precisión). Estos se miden en un pico o picos de tiempo de retención y ancho de pico conocidos [20].

Estudios de degradación forzada

Se considera que los estudios de estrés o degradación forzada degradan deliberadamente la muestra. Estos estudios se han utilizado para evaluar la capacidad de

un método analítico para medir un ingrediente activo y sus productos de degradación, sin interferencia, generando productos de degradación potenciales. Durante la

validación del método, el fármaco se ha expuesto a ácido, base, calor, luz y agente oxidante para producir aproximadamente entre un 10% y un 30% de degradación

del principio activo. Los estudios también pueden proporcionar información sobre las vías de degradación y los productos de degradación que podrían formarse

durante el almacenamiento. Estos estudios también pueden ayudar en el desarrollo, la fabricación y el envasado de la formulación para mejorar la estabilidad del

medicamento. Las razones para llevar a cabo estudios de degradación forzada incluyen: desarrollo y validación de una metodología indicadora de estabilidad,

determinación de las vías de degradación de las sustancias farmacéuticas y productos farmacéuticos, discernimiento de los productos de degradación en

formulaciones que están relacionadas con sustancias farmacéuticas frente a aquellas relacionadas con sustancias no farmacológicas en la formulación (por ejemplo,

excipientes). [18,19]

Estudios de estabilidad de la solución

Durante la validación, la estabilidad de los patrones y las muestras se establece en condiciones normales, condiciones normales de almacenamiento y, a veces, en el

instrumento para determinar si son necesarias condiciones especiales de almacenamiento, por ejemplo, refrigeración o protección contra la luz [21-22].

Conclusión
Esta revisión describe la técnica general de desarrollo del método HPLC y la validación del método optimizado. Se discutió un enfoque general y
simple para el desarrollo de métodos para la separación de compuestos. El conocimiento del pH, pKa y solubilidad del compuesto primario es de
suma importancia antes del desarrollo del método HPLC. Tener conocimiento del pH puede ayudar a discernir la naturaleza ionizable de las otras
impurezas (es decir, productos de degradación, subproductos sintéticos, metabolitos, etc.) en la mezcla. La selección de la composición de la fase
móvil y del tampón (orgánico y pH) juega un papel importante en la selectividad de la separación. La optimización final se puede realizar
cambiando la pendiente del gradiente, la temperatura y el caudal, así como el tipo y concentración de

La revista farmacéutica y química

39
Kumar V et al The Pharmaceutical and Chemical Journal, 2015, 2 (2): 30-40

modificadores de fase móvil. El método optimizado se valida con varios parámetros (por ejemplo, especificidad, precisión, exactitud, límite de detección, linealidad,

etc.) según las directrices de la ICH.

Referencias
1. ¿Qué es la cromatografía? Principios, tipos y técnicas. www.bheem.hubpages.com
2. Joseph C. Arsenault, Patrick D. McDonald, Guía para principiantes de cromatografía líquida. Marzo de 2008.
3. HPLC - Chemiguide. 2 de mayo de 2007. www.chemguide.co.uk
4. Snyder, LR, Kirkland, JJ y Dolan, JW (2011). Introducción a la cromatografía líquida moderna. John Wiley & Sons., John Wiley & Sons,
Nueva York.
5. Xiang, Y., Liu, Y. y Lee, ML (2006). Cromatografía líquida de ultra alta presión utilizando temperatura elevada. Revista de cromatografía
A, 1104 ( 1), 198-202.
6. Horvath, CG, Preiss, BA y Lipsky, SR (1967). Cromatografía líquida rápida. Investigación de parámetros operativos y separación de
nucleótidos en intercambiadores de iones peliculares. Química analítica, 39 ( 12), 1422-1428.

7. Dong, MW (2006). HPLC moderno para científicos en ejercicio. John Wiley & Sons. Snyder, LR, Kirkland, JJ y Glajch, JL (2012). Desarrollo
8. de métodos prácticos de HPLC. John Wiley & Sons.

9. Ahuja, S. y Rasmussen, H. (Eds.). (2011). Desarrollo de métodos de HPLC para productos farmacéuticos ( Vol. 8). Prensa académica.

10. Ahuja, S. y Dong, M. (Eds.). (2005). Manual de análisis farmacéutico por HPLC ( Vol. 6). Elsevier. Kazakevich, YV y Lobrutto, R.
11. (2007). HPLC para científicos farmacéuticos. John Wiley & Sons. Neue, UD (1997). Columnas de HPLC: teoría, tecnología y práctica.
12. Wiley-VcH. McMaster, M. (2007). HPLC: una práctica guía del usuario. John Wiley & Sons. Castilo, J. (2014). Principios generales
13. del desarrollo del método HPLC.
14.
15. Bliesner, DM (2006). Validación de métodos cromatográficos: una guía práctica. John Wiley & Sons, págs. 88-92.

dieciséis.Una guía para la validación en HPLC basada en el trabajo de GM Hearn Perkin Elmer. RA van Iterson Drenthe College Emmen
Holland para www.standardbase.com.
17. Weston, A., Brown, PR (1997). Principios y práctica de HPLC y CE, Prensa académica, California. Ngwa, G. (2010). Degradación forzada
18. como parte integral del desarrollo del método indicador de estabilidad de HPLC. Tecnología de administración de fármacos, 10 ( 5), 56-59.

19. Reynolds, DW, Facchine, KL, Mullaney, JF, Alsante, KM, Hatajik, TD, Mott, MG (2002). Orientaciones y mejores prácticas disponibles
para realizar estudios de degradación forzada. Tecnología farmacéutica, 48-56.

20. ICH, Q2A, Texto sobre validación de procedimientos analíticos, Conferencia internacional sobre armonización, octubre de 1994, Ginebra.

21. ICH, Q2B, Validación de Procedimientos Analíticos, Metodología, Conferencia Internacional sobre Armonización, noviembre de 1996, Ginebra.

22. ICH, Conferencia internacional sobre armonización de pruebas de estabilidad de nuevas sustancias y productos farmacéuticos (QIAR) IFPMA,
2000, Ginebra.

La revista farmacéutica y química

40