Laboratorio de bioquímica abril 25 del 2020. Universidad Tecnológica de Pereira.

Extracción y purificación de la papaína

Universidad Tecnológica de Pereira
Correo-e: Ximena.fernandez@utp.edu.co

Resumen aunque en menor proporción. Su ingesta aporta al

Se procede a investigar acerca del proceso de como organismo 4 kilocalorías por cada gramo de proteína.
extraer la papaína, de donde y como se purifica para
que tenga diferentes usos en el comercio
Características sobre la proteína asignada que fue la
papaína
Se habla un poco del fruto donde se encuentra esta
INTRODUCCION proteína: la papaya
La papaya es la fruta del árbol del papayo (carica papaya
Normalmente cuando escuchamos proteínas lo L) originaria de centro-america, su crecimiento es rápido,
asociamos a que es algo que se consume para tener la fruta madura de unos 4 a 6 meses depende del clima
cierta condición física o para aumentar masa muscular donde se cultiva, las propiedades organolépticas dependen
entre otras cosas, las proteínas desde un punto de vista del tiempo de maduración del fruto.
químico se definen como lo principal y estas están La papaya es una fruta muy común, a veces se suele
presentes en casi todos los procesos que ocurren a comer en ensaladas, como se cita anteriormente las
nivel celular. propiedades organolépticas depende la maduración,
Las proteínas se encuentran en todos los organismos cuando esta verde de observa que desprende como un
vivos y desempeñan muchas funciones biológicas liquido blanco ( la apariencia de ser leche) de sabor
distintas, por ejemplo, la queratina en la piel y uñas, la amargo, no muy agradable para el consumo, cuando esta
fibroína en la tela de araña, las proteínas son un madura se observa la cascara de un color como amarillo,
conjunto de aminoácidos (moléculas bifuncionales la fruta es conocida por tratar problemas del estreñimiento,
contienen un grupo amino básico y un grupo carboxilo otro de los múltiples beneficios de la fruta como de la gran
acido) si tienen entre 2 y 10 aminoácidos se les mayoría son los siguientes:
conocen como oligopéptido, de 10 a 100 como Es un buen diurético
polipéptido y de mayor a 100 proteína. Aumenta las defensas naturales
Las proteínas cumplen ciertas funciones, una de ellas Mejora la salud de la piel
son las proteínas estructurales que como su nombre lo Función antioxidante
indica, da la estructura a la célula, y las otras que se Prevención de las enfermedades cardiovasculares
denominan enzimas que cumplen la función de extraer Restaura el equilibrio acido base
alimento de los alimentos, es decir una función Mejora el estreñimiento
metabólica y está también los anticuerpos, que nos Ayuda a la digestión de las proteínas
protegen de cualquier antígeno, Asimismo, ayudan a El aporte de proteínas es bajo -como suele ser común en
transportar determinados gases a través de la sangre, como las frutas- y su contenido en grasas es escaso. Se
el oxígeno y el dióxido de carbono, y funcionan a modo de diferencia así de las frutas oleaginosas, que aportan
amortiguadores para mantener el equilibrio ácido-base y la principalmente grasas.
presión oncótica del plasma. El sabor de la fruta varia un poco, a veces la papaya es un
Los alimentos donde están presentes sobre todo en los poco dura a pesar de tener un aspecto maduro, otras veces
alimentos de origen animal como la carne, el pescado, los es dulce y suave.
huevos y la leche. Pero también lo están en alimentos El cultivo de la fruta tiene unas principales funciones que
vegetales, como la soja, las legumbres y los cereales, son
Vender la fruta para consumo y extracción de enzimas
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Pero ¿Qué es una proteasa? Son enzimas proteolíticas,

Generalidades de la papaína es decir, actúan rompiendo los enlaces que unen los
Tiene una acción metabólica catabólica aminoácidos de las proteínas facilitando su digestión,
La papaína es una enzima proteolitica natural que se estas enzimas hidrolizan la unión acido y el grupo alfa
extrae del latex de las hojas del tallo y los frutos amino del siguiente aminoácido dentro de la proteína.
inmaduros de la papaya, usualmente se agrupa con la La papaína puede ser un polvo granulado o unas
quimipapaina, glicilendopeptidasa y endopeptidasa lll hojuelas según haya sido la cantidad del latex secado,
debido a su similitud de su peso molecular, su su color esta entre el blanco, el crema y el amarillo
especificidad es baja por lo tanto es capaz de hidrolizar también depende del tipo de secado al que se somete
diferentes tipos de moléculas como aminoácidos básicos : el latex o su grado de oxidación, es prácticamente
leucina glicina arginina y lisina entre otros, se compone de soluble en agua salvo a que se trate de un extracto
212 aminoácidos, Residuos de 212 aminoácidos altamente purificado e insoluble en cloroformo, éteres
(metionina ausente; p I 8.75) con cuatro puentes y alcoholes, su densidad data de un valor de 1,2 g/
disulfuro y catalizador, su punto isoeléctrico esta entre cm^3
8,75 y 9,55
Cisteína iónicamente importante (posición 25) y
residuos de histidina (posición 158), La papaína tiene
un peso molecular de 23.350 Da, la Papaina presenta
propiedades antiinflamatorias, antibacterianas y
antioxidantes y se pueden usar en el tratamiento de
lesiones cutáneas grandes, en la industria farmacéutica
su principal uso es la fabricación de heparina, vacunas
y enzimas digestivas En la industria alimentaria, la
papaína se usa para ablandar la carne y otros
productos relacionados, en la Panadería se usa para
evitar la formación de grietas en las galletas, para los (imagen de la papaína)
quesos se involucra en acelerar el añejamiento, La estructura secundaria de la papaína esta compuesta
también sirve para la producción de alimentos por el 21% de hojas beta, el 25% de hélices alga, el
especiales para bebes . para producir hidrolizado de resto es una secuencia de aminoácidos no repetitivas,
proteínas, para clarificar jugo y oso en la industria su estructura secundaria se mantiene estable por
cervecera la papaína se emplea para evitar que interacciones de puentes de hidrogeno e interacciones
proteínas y taninos que se van agregando a la mezcla hidrófobas
se coagulen y formen coloides, en la industria de la
panificación, y para la extracción de sabor y
compuestos de color de plantas La papaína se ha
utilizado en el aislamiento celular y en la separación
de biomoléculas en procesos industriales a gran
escala. Además, la papaína es ampliamente utilizada
en el cuero para retirar el tejido graso del cuero y
luego para disimular las protuberancias, desengrasar y
estirar el cuero, en la industria cosmética se usa para Experimento donde se demuestra una de las tantas
limpiar prótesis dentales y están presentes en algunas funciones de esta enzima y a su vez comprobándose
cremas para la piel que cumple con el principio de Michaelis-Menten
La papaína entra en la clasificación de ser una Reactivos
proteasa Tiras de carne
Papaya
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Agua destilada A los 3 trozos de carne se les comparo con un blanco

Materiales es decir con un pedazo que no fue sometido a la
Licuadora, 3 beaker de 100 ml, agua destilada solución
Procedimiento Para el trozo de carne que interactuó con los 15 ml del
Se procede a recolectar la cascara de la papaya ( esta concentrado en masa 2,5 % se data que el pedazo
debe estar inmadura), con el fin de observar la seguía duro, al tratar de estirarlo para ver si se rompía,
actividad enzimática, se procede a pesar diferentes había que ejercer cierta fuerza, pero a comparación del
masas de la cascara de la papaya, primero se recolectar blanco, este pedazo estaba mas blando.
2,5 gramos, se depositan en la licuadora y se agregan Con la segunda tira de carne que interactuó con la
100 ml de agua, se licua para tener la solucion, se solucion de 10 % en masa, la textura era mas blanda, a
procede de igual manera con el paso de 10 gramos y comparación del blanco y la tira 1, y con el pedazo
40 gramos que interactuó con la solución del 40% en masa,
Para así tener 3 soluciones del mismo componente estaba completamente blanda
pero a diferentes concentraciones en masa, 2,5%-
10%- y 40% como se muestra en la imagen 1

(imagen 1)

En 3 cajas Petri, cada una tiene una tira de carne, se

adiciona 15 ml a la carne que esta previamente
rotulada con la concentración correspondiente

Se deja que la solución y la carne actúen durante una

hora para observar los resultados, a una temperatura
Con estos experimentos se observa que la enzima
de 30 grados celcius y las observaciones fueron las
cumple con el comportamiento de michaelis menten
siguientes organolépticas fueron las siguientes
Nota : acá se hizo una comprobación del material
donde se encuentra la enzima, no estaba purificada ni
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nada, solo se quiso estudiar sus propiedades Luz solar: las muestras se depositan en unas bandejas
directamente del látex de la papaya que es donde se al aire libre donde reciben la luz solar uniformemente,
concentra esta enzima cundo se utiliza este método se obtiene un polvo de
color Marrón, pero esto hace que se oxide y se pierda
un poco la actividad enzimática, por eso no es tan
utilizado
Secador: es una operación de secado directa cuyo
equipo consta de una cámara provista de bandejas
removibles en donde se deposita la muestra. Estás
bandejas reciben un flujo de aire proveniente de un
ventilador o compresor a una temperatura mayor a la
de ambiente para retirar la humedad presente por
convección
¿Por qué cumple con el principio? Pues el principio Horno: este método consiste en una cámara cerrada
básicamente expresa que, a una mayor concentración con bandejas, la diferencia con el secador con
de la enzima, más rápido es la velocidad de reacción, bandejas radica en que en esta cámara no existe un
entonces se pudo apreciar que entre más concentrado flujo de aire, sino que se imparte calor al aire presente
de le adicionaba al trozo de carne, este ablandaba más. dentro de la cámara el cual puede tener o no una salida
al exterior graduable, el uso de este método da una
La papaína tiene un rango de ph donde es activa (3-10) coloración Marrón lo que indica que hubo oxidación,
se puede emplear diferentes sustratos que estén en el entonces este método no es muy utilizado
rango de este ph, también una temperatura buena para Secador al vacío: consiste en una cámara hermética
la papaína es entre 30 y 60, soporta altas temperaturas, con bandeja donde una bomba en encarga de generar
pero si esta es muy alta comienza el proceso de vacío en la misma. No existe un flujo de aire, sino que
desnaturalización de la enzima reduciendo su se produce un cambio en el punto de ebullición del
actividad , punto isoeléctrico esta entre 8,75 y 9,55, el agua y gracias a que las bandejas pueden tener una
número de recambio de la enzima es 10, el número de temperatura ajustable, este se evapora
recambio es el máximo número de moléculas de un Secador por liofilización: se utiliza cuando la muestra
sustrato que una molécula de enzima puede convertir no puede ser calentada para evitar la pérdida de
en producto por unidad de tiempo. algunas características no termostables
EXTRACCIÓN DE LA PAPAÍNA La extracción de la papaína no es un trabajo tedioso,
Se procede a seleccionar una papaya verde de 3 a 4 se tiene que elegir un periodo donde la fruta no haya
meses, se le realizan cortes uniformes por toda la madurado, se puede disolver en agua o en un buffer
fruta, con una profundidad de aproximadamente 5 previamente seleccionado con un ph en los rango 3-
mm, esta operación se repite con intervalos de hasta 2 11, por ejemplo solventes como el agua ya que su ph
semanas hasta que se observe que el flujo lechoso es 7, bicarbonato de sodio ( 9) y solución amonio ( 10
disminuya, la recolección se recomienda durante )
temporadas de lluvias ya que el flujo del latex Para eliminar impurezas se puede agregar alcohol ya
disminuye en temporadas con humedades bajas, el que la enzima no es soluble en estos componentes,
latex se recolecta, se le agrega el buffer fosfato de después de que se haya hecho el respectivo lavado se
amonio, acido citrico a pH de 7 y se lleva a un tanque elige el proceso de secado mas optimo, donde se
de agitación permita tener un líquido homogéneo para pueda regular la temperatura, si bien la temperatura
proceder a una filtración que ayude a eliminar el optima de esta enzima es de 30-60 grados, y soporta
material ceroso y las impurezas. altas temperaturas, no es recomendable subirla a mas
El segundo paso de la extracción es el secado del latex de 65 ya que esto puede afectar la actividad
Hay 3 métodos de hacer el secado enzimática, por ende basado en la teoría, el mas
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optimo seria el secador y el secador al vacío, ya que se

puede regular una temperatura. Para elegir un óptimo proceso de purificación hay que
tener en cuenta las propiedades que se encuentran en
la imagen 2
Para la precipitación de la proteína se usan algunos
métodos que son:
Precipitación por el cambio de ph o precipitación
isoeléctrica: consiste en ajustar el ph al punto
isoeléctrico de la proteína
Imagen Precipitación por incremento en la fuerza iónica o
Acá se muestra la recolección del respectivo latex, salting out: es un método muy utilizado en consiste en
la adición de sales que no desnaturalicen la proteína y
previenen la contaminación por bacterias
Para la purificación el método mas utilizado fue
Cromatografía de intercambio iónico
La mayoría de las proteínas tienen cargas en su
superficie por lo cual puede tener una interacción entre
ellas.
Para la activación
La actividad de la papaína se midió a temperatura
ambiente y luego se emplea un método colorimétrico
que usa caseína como sustrato

PURIFICACION DE LA PAPAINA Se construye una curva de calibración de tirosina en el

Hay varios métodos de purificación, pero el mas espectrofotómetro a 600 nM a partir de una solución
común es por precipitación isoeléctrica, que consiste
1,1 mM de tirosina con una sln a 500 nMde Na2CO3
en ajustar el pH al punto isoeléctrico de la proteína
y agua desionizada y reactivo de folin- ciocalteu ( este
reactivo es un ensay bioquímico para la determinación
total de proteínas en una solución

Después de la extracción, el látex se usó

inmediatamente.
para la precipitación de papaína en su estado nativo o
Entonces 1 ml de látex fue mezclado con 10 ml de
tampón fosfato 50 mM, pH 7,5 que contiene EDTA 38
mM cloruro de cisteína La mezcla se incubó a 4 ° C
durante 1 h. Después de centrifugar durante 10 min.
se bombearon 6 ml de sobrenadante a través del
Reactive Green 5-inmobilized columna de criogel a un
caudal de 0,5 ml / min durante 2 h. La elución de
papaína del criogel se realizó con 10 ml de solución de
NaCl 1,0 M.

el tampón de fosfato es muy utilizado normalmente en

(imagen 2) ya que no desnaturaliza esta proteína, una posibilidad
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de que utilicen el EDTA es que este es un agente

quelato de metales pesados y este reacciona con
ligandos que contiene O, S Y N y como la teoría
tabula de que esta enzima (papaína) contiene puentes
disulfuro, entonces el edta interacciona con estas
moléculas y da estabilidad, se centrifuga para que
haya una mejor separación del sobrenadante, al final
de usa una solución de NACL para realizar la
purificación por cromatografía de intercambio iónico.

Bibliografía
https://www.researchgate.net/publication/327142290_
Purificacion_de_la_papaina_del_latex_de_la_lechosa_
y_cuantificacion_de_la_actividad_enzimatica
K
Mcmurry 8 edición capítulo de proteínas
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https://es.wikipedia.org/wiki/Ensayo_de_prote%C
3%ADnas_de_Lowry