Sesion 07 Electroforesis 2S2018

Bioquímica Clínica Básica.
Tecnología Médica.
Universidad Santo Tomás.
Sede Viña del Mar.
Sesión 07:
Electroforesis
Profesor: BQ. Carlos Cárcamo D.

2º Semestre 2018
Purificación de proteínas
El objetivo es obtener una proteína pura o con mínimas trazas
de contaminantes.
Precipitación con sales.

BAJA RESOLUCIÓN Precipitación con temperatura.
Precipitación con pH.
Métodos cromatográficos:
filtración en gel, intercambio iónico, afinidad
ALTA RESOLUCIÓN
Métodos electroforéticos:
electroforesis no desnaturalizante,
desnaturalizante, isoelectroenfoque
Electroforesis
Técnica que se basa en la separación de moléculas
según la movilidad de estas en un campo eléctrico.
Tipos:
De frente móvil (en solución)
De zona (sobre un medio soporte)
En papel Sílice Geles (a través de una matríz porosa)
Agarosa Poliacrilamida
(DNA) (DNA y proteínas)
Electroforesis
ELECTROFORESIS DE ZONA
MATRIZ ≈ que retiene las moléculas.
Moléc. (+)  cátodo (-)

Moléc. (-)  ánodo (+)
cátodo ánodo
SOPORTE
+-
Electroforesis
Factores que afectan la movilidad
a) Campo eléctrico:
• Voltaje (V-voltios):
 bajo voltaje (10-500 V)

 alto voltaje (500-10000 V)
• Resistencia (Ω-Ohm): determinada por el soporte.
• Intensidad (A-amperios): flujo de carga eléctrica,

depende de V y de R.
• Temperatura: efecto joule (uso de refrigerantes).

Electroforesis
b) Muestra:
• Carga o densidad de carga: carga eléctrica/masa de la

molécula.
• Tamaño: debido al poro de la matriz.
• Forma: forma globular v/s lineal (globular avanza más).

Electroforesis
c) Amortigudor:
• pH: determina el grado de solvatación y

la carga de las moléculas. Generalmente es ligeramente
básico (moléculas toman carga negativa)
• Fuerza iónica: generalmente 0.05 o 0.1 M

para que no interfiera.
d) Soporte:
• Adsorción.
• Porosidad molecular.
Electroforesis
Matrices
Características:
• Gel poroso (tridimensional interno).

• Tiene que permitir el paso de moléculas.
• NO puede estar cargado.
Electroforesis
Matrices
no restrictivo (grupo I): papel, almidón, agar, acetato de celulosa.
* poro >>> proteínas.

* separación sólo por CARGA
Electroforesis
de proteínas
restrictivo (grupo II): acrilamida
* poros = proteínas
* separación por CARGA y TAMAÑO
Electroforesis restrictivo (grupo II): acrilamida, agarosa

de DNA/RNA * poros = moléculas de DNA/RNA
* separación sólo por TAMAÑO
Electroforesis
Gel de Agarosa
• Soporte restrictivo: Agarosa
• Permite separa moléculas grandes (0.1-60 kpb).

Electroforesis
Gel de Agarosa
• Separación por TAMAÑO.
• Electroforesis horizontal (agarosa).

Electroforesis
Gel de Agarosa
APLICACIONES
• Separar, identificar y purificar

Geles de
fragmentos de DNA o RNA. Agarosa
• Determinar tamaño de un fragmento de DNA.
• Identificación de regiones de unión

a proteínas. Southern
• Detectar la presencia de un gen Blot
(o secuencia específica de DNA).
• Determinar si se expresa un gen específico Northern

Blot
Electroforesis
Geles de Agarosa
• Separar, identificar y purificar fragmentos de DNA o RNA.
Electroforesis horizontal
muestra (-)
+ -
Campo eléctrico (DV)

1- Preparar el gel.
2- Aplicación de la muestra.
3- Electroforesis.
4- Detección por tinción con
Bromuro de Etidio (BrEt),
se intercala en el DNA y al
irradiarlo con luz UV emite
fluorescencia.
Electroforesis
Geles de Agarosa: Southern Blot
• Interacción RNA-DNA (hibridación).
• Detectar en una mezcla una secuencia de RNA
específica (muy sensible).
• Expresión génica.
DNA 4. Revelado
1. Electroforesis en geles de agarosa interés
32P e-
2. Transferencia a membrana
moléculas
moléculas de DNA
de DNA
5. Resultado
Gel Agarosa Southern BLOT
3. Hibridación con la sonda radioactiva
Sonda
de DNA 32P
…TAACGT…
DNA
…ATTGCA… interés
Todas los DNA

DNA de interés
Electroforesis
Geles de Agarosa: Northern Blot
• Interacción DNA-DNA (complementación).
• Detectar en una mezcla una secuencia de DNA
específica (muy sensible).
• Detectar la presencia de un gen, etc.
1. Electroforesis en geles de agarosa RNA 4. Revelado
interés
2. Transferencia a membrana 32P e-
moléculas
moléculas de RNA
de RNA
Resultado
Gel Agarosa Northern BLOT
3. Hibridación con la sonda radioactiva
Sonda
de DNA 32P
…TAACGT…
RNA
…AUUGCA… interés
Todas los RNA

DNA de interés
Electroforesis
Geles de Agarosa
Determinación de Peso Molecular
Marcadores de peso
molecular
• Mezcla de diferentes
proteínas pre-teñidas de
las que conocemos el peso
molecular.
• Por comparación y
extrapolación podemos
averiguar el PM de nuestra
proteína.
Electroforesis
Gel de Poliacrilamida
• Soporte restrictivo: Poliacrilamida.
• Permite separar moléculas pequeñas (6-2000 pb).
• Polimerización: Acrilamida + Bisacrilamida

Electroforesis
• La variación de la concentración de la mezcla provoca

variación del tamaño de poro.
• Electroforesis de tipo vertical.

Electroforesis
VENTAJAS
• Gran poder de separación (resolución) por CARGA y

por TAMAÑO.
• Químicamente inerte.
• Transparentes (densitograma).
• Estable (pH, fuerza iónica, temperatura).
• Versatilidad en cuanto al tamaño de poro.

Electroforesis
APLICACIONES
• Separar proteínas.
• Determinar peso molecular de una proteína. SDS-PAGE
• Separar proteínas oligoméricas.
• Separar proteínas en función de su pI. Electroenfoque
• Separar proteínas de mezclas

Electroforesis 2D
muy complejas.
• Ver si hay una proteína en concreto. Western Blot

Electroforesis
Gel de Poliacrilamida: SDS-PAGE
sodium dodecyl sulphate-
polyacrylamide gel electrophoresis
Electroforesis
SDS : dodecil sulfato de sodio

DETERGENTE ANIÓNICO
En la electroforesis SDS-PAGE el
SDS se agrega en TODO!!!!
1. En el gel.
2. En el buffer de muestra.
3. En el buffer de corrida.
Electroforesis
APLICACIONES
• Grado de pureza de una proteína.
• Determinación de masa molecular.
• Verificación de la concentración de proteínas.
• Detección de proteólisis.
• Identificación de proteínas inmunoprecipitadas.
• Separación de proteínas marcadas con isótopos

radioactivos.
Electroforesis
REACTIVOS UTILIZADOS
Para hacer la matriz (gel)
N,Nʼ-metilen-bis- Tetrametiletilendiamino
Acrilamida
acrilamida (TEMED)
Persulfato de
amonio
Electroforesis
REACTIVOS UTILIZADOS
Para hacer la matriz (gel)
•Acrilamida (C3H5NO): formación de polímeros

•Bisacrilamida: (N,N’- methylenebisacrylamide (C7H10N2O2):
entrecruzamiento de las cadenas de polímeros.
•SDS: saturación con cargas negativas.
•APS y TEMED: catalizadores de la reacción de polimerización.
•DTT o βME: agentes denaturantes.
•Azul de Bromofenol: permite la visualización de la corrida
electroforética. Carga negativa por encima de pH 4.6.
Electroforesis
FORMACION DE LA MATRIZ
Electroforesis
En esta técnica es posible modificar los porcentajes de
acrilamida para obtener una mayor resolución
% de Acrilamida Rango de
separación
(tamaño)
15% 15 – 45 kDa
12.5% 15 – 60 kDa
10% 18 – 75 kDa
7.5 % 30 – 120 kDa
5% 60 – 212 kDa
Electroforesis
Electroforesis
Se utilizan dos amortiguadores:
El buffer de corrida y el buffer de muestra
El buffer de corrida contiene
1. SDS
2. Tris-HCl
3. Glicina
Electroforesis
Se utilizan dos amortiguadores:
El buffer de corrida y el buffer de muestra
El buffer de muestra contiene
1. Beta mercaptoetanol
2. Azul de bromofenol
3. Glicerol
Electroforesis
EFECTO CONCENTRADOR
Electroforesis
VISUALIZACION DE LAS PROTEINAS
TIPOS DE TINCCION
La tinción con Azul de Coomassie

(Coomassie Brilliant Blue) puede
detectar una banda de hasta
50 ng.
La tinción con plata incrementa

la sensibilidad de detección
(50 veces aprox.)
Electroforesis
DETERMINACION DEL TAMAÑO APROXIMADO
DE LAS BANDAS OBTENIDAS
Con los estándares de peso molecular se obteinen RF
Electroforesis
DETERMINACION DEL TAMAÑO APROXIMADO
DE LAS BANDAS OBTENIDAS
Con los estándares de peso molecular se obteinen RF
RF = distancia recorrida por la banda

distancia total al frente de la corrida (RF)
Electroforesis
ELABORACION DE UNA GRÁFICA CON LOS DATOS
OBTENIDOS DE LOS ESTÁNDARES DE PESO MOLECULAR

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Bioquímica Clínica Básica.

Profesor: BQ. Carlos Cárcamo D.

Precipitación con sales.

En papel Sílice Geles (a través de una matríz porosa)

MATRIZ ≈ que retiene las moléculas.

Moléc. (+)  cátodo (-)

 bajo voltaje (10-500 V)

• Resistencia (Ω-Ohm): determinada por el soporte.

• Intensidad (A-amperios): flujo de carga eléctrica,

• Temperatura: efecto joule (uso de refrigerantes).

• Carga o densidad de carga: carga eléctrica/masa de la

• Tamaño: debido al poro de la matriz.

• Forma: forma globular v/s lineal (globular avanza más).

• pH: determina el grado de solvatación y

• Fuerza iónica: generalmente 0.05 o 0.1 M

• Gel poroso (tridimensional interno).

no restrictivo (grupo I): papel, almidón, agar, acetato de celulosa.

* poro >>> proteínas.

Electroforesis restrictivo (grupo II): acrilamida, agarosa

• Soporte restrictivo: Agarosa

• Permite separa moléculas grandes (0.1-60 kpb).

• Separación por TAMAÑO.

• Electroforesis horizontal (agarosa).

• Separar, identificar y purificar

• Identificación de regiones de unión

• Determinar si se expresa un gen específico Northern

Campo eléctrico (DV)

Todas los DNA

Todas los RNA

• Soporte restrictivo: Poliacrilamida.

• Permite separar moléculas pequeñas (6-2000 pb).

• Polimerización: Acrilamida + Bisacrilamida

• La variación de la concentración de la mezcla provoca

• Electroforesis de tipo vertical.

• Gran poder de separación (resolución) por CARGA y

• Estable (pH, fuerza iónica, temperatura).

• Versatilidad en cuanto al tamaño de poro.

• Separar proteínas en función de su pI. Electroenfoque

• Separar proteínas de mezclas

• Ver si hay una proteína en concreto. Western Blot

SDS : dodecil sulfato de sodio

• Grado de pureza de una proteína.

• Determinación de masa molecular.

• Verificación de la concentración de proteínas.

• Identificación de proteínas inmunoprecipitadas.

• Separación de proteínas marcadas con isótopos

•Acrilamida (C3H5NO): formación de polímeros

La tinción con Azul de Coomassie

La tinción con plata incrementa

RF = distancia recorrida por la banda

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