UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA

Facultad de Medicina y Psicología

Microbiología Básica
Práctica #8: Pruebas bioquímicas bacterianas. Identificación preliminar
de bacterias Gram positivas aerobias y anaerobias facultativas.

Dra. Idanya Rubí Serafín Higuera

Grupo: 333
Equipo #1:
Delgado Zamora Andrea Belén 1289372
Galindo Cervantes José Guadalupe 1175704
Gonzalez Verduzco Ingrid Magali 0273883
Hernandez Diaz Alison Naomi - 1289072
Sebastian Justiniani 1297516
Reza Flores Paul Alexis 1288616

Tijuana, Baja California, México Martes 18 de Abril del 2023

Competencia a desarrollar en la sesión
- Los alumnos realizarán pruebas de laboratorio para identificar procesos metabólicos
bacterianos, en los diferentes medios de cultivo y con sustratos específicos.
- Correlacionaran las pruebas con los fundamentos bioquímicos involucrados en la
identificación de las bacterias. Este conocimiento podrá aplicarlo en la evaluación del
diagnóstico por el laboratorio en el ejercicio profesional.

Materiales
Recursos materiales
Set de 3 cepas de Staphylococcus aureus (1 por equipo) ATCC en medio TSA
Set de 3 cepas de Staphylococcus saprophyticcus en medio TSA o Agar nutritivo

Cepas bacterianas por equipo:

Set de Tinción de Gram
4 Medio de agar sangre
4 Medio de agar sal manitol
4 Peróxido de hidrógeno 3% (catalasa)
4 Plasma citratado (coagulasa) tubos ependor.
20 Portaobjetos
Pipetas transfer
Para 4 equipos Discos diferenciales de Novobiocina 5U
Aplicadores
Portaobjetos

Instrucciones
1. Tinción de Gram
2. Prueba de la catalasa
3. Prueba de la coagulasa
4. Inocular gelosa sangre y aplicar disco de Novobiocina sobre el área de la
estriación masiva.
5. Inocular los medios de Manitol sal agar.
6. Describir la morfología colonial de crecimiento en gelosa sangre y manitol sal
agar, así como la susceptibilidad a la Novobiocina.
7. Realizar las anotaciones de los resultados obtenidos por el equipo.
8. Identifique presuntamente las cepas proporcionadas.
9. Anexe al reporte la referencia bibliográfica que utilizó.
Resultados
Staphylococcus aureus
Catalasa + Coagulasa – (debía salir +)

Antibiótico Susceptibilidad Distancia

Cloranfenicol Sencible 10mm

Novobiocina Sencible 5mm

Tetraciclina Sencible 8mm

Penicilina Sencible 10mm

Eritromicina Sencible 10mm

Estreptomicina Sencible 8mm

Discusión
Morfología de Staphylococcus aureus
El género Staphylococcus son células esféricas de 0.5 milimicras de diámetro, no móviles, no
esporulados, anaerobios facultativos, catalasa positivos, capaces de crecer en un medio con
10% de cloruro de sodio y a temperaturas de 10 a 40°C, con temperaturas óptimas es de 30 –
37 °C. Son saprófitos de vida libre, su presencia como flora endógena en ciertas
circunstancias proporciona a muchas especies, la oportunidad de causar infecciones. S. aureus
es la única especie hallada en humanos que produce la enzima coagulasa; así pues todas las
demás especies son conocidas habitualmente como “estafilococos coagulasa negativos”.La
estructura de los estafilococos consta de cápsula, peptidoglicano, proteína A, ácido
teicoico, factor de agrupamiento y membrana citoplasmática; produce un gran número
de factores de virulencia, que incluyen toxinas citolíticas, enterotoxinas y enzimas.
Staphylococcus causan infecciones de la piel y de tejidos blandos (como forúnculos, abscesos
y fascitis necrosante), neumonía, intoxicaciones alimentarias y enfermedades
inducidas por toxinas (síndrome del choque tóxico y dermatitis exfoliativa estafilocócica (piel
escaldada)). Si estos microorganismos penetran en el torrente sanguíneo, pueden causar
osteomielitis, abscesos renales o endocarditis.
Las especies asociadas más frecuentemente con infecciones humanas son:
S. aureus, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. lugdunensis, S. saprophyticus y S.chleiferi.
Diagnóstico
Microscopia: Con la tinción de Gram, se observan cocos Gram positivos aislados o en
grupos (racimos de uva).
Cultivo: Crecen con rapidez en medios de cultivo no selectivos o medios enriquecidos con
nutrientes y o suplementados con sangre de oveja. S. aureus puede ser aislado en medio
suplementado con cloruro de sodio al 7.5% y manitol; al cabo de 24 hrs en ambiente aerobio
o anaerobio se observan grandes colonias lisas. La coloración amarilla causada por
carotenoides es común en el caso de S. aureus. En agar sangre puede observarse hemólisis.
Identificación: Además de la morfología microscópica y de las colonias, se pueden
identificar estos microorganismos por la utilización de carbohidratos (pruebas
bioquímicas), susceptibilidad a los antibióticos y serología.
Prueba de la coagulasa: Detecta la coagulasa ligada (factor de agregación) o la
coagulasa libre. Esta prueba se puede realizar siguiendo dos métodos: técnica en
portaobjetos y en tubo de ensayo. Uno de los posibles mecanismos de acción de la
coagulasa libre se basa en la reacción de una enzima extracelular bacteriana, la
procoagulasa que actúa, con un activador presente en el plasma de conejo similar a la
protrombina. Esta reacción da lugar a un complejo análogo a la trombina, la coagulasa
propiamente dicha, que a su vez reacciona con el fibrinógeno dando lugar a un
coágulo de fibrina en ausencia de Ca ++. La coagulasa ligada o factor de agregación
actúa directamente sobre el fibrinógeno y lo convierte en fibrina. No requiere de
activadores plasmáticos.

Conclusión
Encontramos que la bacteria utilizada en la práctica formó colonias, la bacteria es
Gram (+) por lo que si se utiliza esta tinción, se espera que tenga un color púrpura, y
la morfología es de cocos en racimos. Otra manera de identificarlos es con una prueba
de coagulasa, pues esta forma parte de sus factores de virulencia.
Esta bacteria es de gran importancia a nivel médico, pues es bastante común que
ocasiona infecciones en seres humanos, y puede ocasionar enfermedades del sistema
respiratorio como lo son la sinusitis, otitis, faringitis, entre otros y en otros sistemas
del organismo como los son el digestivo, nervioso, urinario, músculo esquelético,
corazón, de tejidos blandos, ojos y así mismo septicemia o choques sépticos.

Cuestionario
I.- Investigar el fundamento y el método de la prueba de la catalasa, así como la
interpretación.
Fundamento
La catalasa es una enzima que cataliza la descomposición del peróxido de hidrógeno
en agua y oxígeno. La prueba se utiliza para comprobar la presencia de la enzima
catalasa que se encuentra en la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias
facultativas que contienen el citocromo oxidasa. La principal excepción son los
Streptococcus.

Método de prueba
En un portaobjetos se depositan una o dos gotas de agua oxigenada al 30% y se pone
en contacto con ella una colonia de los microorganismos a estudiar.
Si se invierte el orden del método (extender la colonia sobre el agua oxigenada)
pueden producirse falsos positivos.
Interpretación
Observar la formación inmediata de una efervescencia rápida con desprendimiento de
burbujas (resultado positivo). En el caso de que no se lograra observar ver este cambio
significa que la bacteria no produce la enzima catalasa (resultado negativo).

II.- ¿Cuál género de bacteria es positiva para esta prueba?

Micrococcus, Staphylococcus, Bacillus, Corynebacterium (con las excepciones de las
especies C. pyogenes y C. haemolyticum).
Referencias bibliográficas
● Universidad de Las Palmas de Gran Canaria. (s.f.). Pruebas bioquímicas de
identificación de bacterias.
https://www2.ulpgc.es/hege/almacen/download/35/35729/pruebas_bioquimicas_de_i
dentificacion_de_bacterias.pdf
● Cabello, R. (1999). Microbiología y parasitología humana. México, D.F.: Editorial
Médica Panamericana.
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA
Facultad de Medicina y Psicología

Microbiología Básica
Práctica #9: Bacilos Gram Negativos Anaerobios Facultativos.
FAMILIA: Enterobacteriaceae

Dra. Idanya Rubí Serafín Higuera

Grupo: 333
Equipo #1:
Delgado Zamora Andrea Belén 1289372
Galindo Cervantes José Guadalupe 1175704
Gonzalez Verduzco Ingrid Magali 0273883
Hernandez Diaz Alison Naomi - 1289072
Sebastian Justiniani 1297516
Reza Flores Paul Alexis 1288616

Tijuana, Baja California, México Martes 18 de Abril del 2023

Competencia a desarrollar en la sesión
- Los alumnos realizarán pruebas de laboratorio para identificar procesos metabólicos
bacterianos.
- Correlacionaran las pruebas con los fundamentos bioquímicos involucrados en la
identificación de las bacterias.

Materiales
Recursos materiales por equipo de trabajo
2 medios de Hugh – Leifson/ glucosa (O/F ) ( 2 tubos por equipo)
1 Medio de SIM (Por equipo)
1 Medio de TSI
1 Medio de Citrato de Simmons
1 Medio de Caldo Urea
1 Medio de LIA
2 Medio de RM/ VP (2 Tubos por prueba)
Aceite mineral.
Lápiz diamante
Tinción para Gram
I caja de medio agar nutritivo por equipo 4 equipos

Reactivos
1) Peróxido de hidrógeno 3% ( catalasa)
2) Tetrametil – p – fenilendiamina (oxidasa)
3) Reactivo de Kovacs ( Indol ,p – dimetilaminobenzaldehido)
4) Reactivos de Voges Proskawer A y B ( alfa Naftol, KOH )

Cepas
Escherichia coli. ( o Enterobacterias disponibles)en medio TSA
Pseudomonas ssp. En medio TSA

Otros
set de medios de cultivo para ser utilizadas como testigos.

Instrucciones
1. Comprobar mediante tinción de Gram las muestras de prueba y verificar que no
sean un cultivo mixto.
2. A partir de las cepas de Escherichia coli (o Enterobacterias) y Pseudomonas
spp. Inocular la batería de pruebas bioquímicas como a continuación se
describe.
 Batería de Pruebas Bioquímicas por cada una de las cepas bacterianas.
2 Tubos de medio O/F (picadura)
I Medio SIM (picadura)
1 medio TSI (picadura y estriación)
1 medio caldo Urea (inoculación)
1 tubo Citrato de Simmons (picadura y estriación)
1 tubo medio LIA (estriación en la superficie).
2 tubos medio RM/ VP (inoculación)
1 Caja de medio Agar MacConkey
1 Caja de medio Agar EMB
1 Caja de Agar nutritivo

3. Cubrir con unas gotas de aceite mineral uno de los tubos del medio O/ F
4. Identifique adecuadamente cada una de las pruebas.
5. Incubar a 37°C por 24 horas en ambiente aerobio.
6. Realice la prueba de catalasa a cada uno de los microorganismos de prueba
7. Realice la prueba de oxidasa a cada uno de los microorganismos de prueba.

Resultados

1. Tinción de Gram de las cepas proporcionadas en el laboratorio

2. Prueba de la catalasa y oxidasa

Prueba Microorganismo Resultado

Catalasa Enterobacteria +

Pseudomonas ssp. +

Oxidasa Enterobacteria -

Pseudomonas ssp. -

3. PRUEBAS BIOQUÍMICAS
Observación en tubos testigo (medios sin inocular)
Observaciones en tubos inoculados
Interpretación de la prueba.
Base bioquímica de la prueba
Discusión
Las pruebas bioquímicas son una herramienta importante utilizada en microbiología para
identificar diferentes tipos de bacterias en el laboratorio. Estas pruebas se basan en la
capacidad de las bacterias para utilizar ciertos sustratos y producir ciertos productos
metabólicos, lo que permite distinguirlas de otras especies bacterianas.
A continuación, se describen algunos fundamentos teóricos de las pruebas bioquímicas más
comúnmente utilizadas en el laboratorio:
1. Prueba de oxidasa: Esta prueba se utiliza para identificar bacterias que tienen la
capacidad de producir la enzima oxidasa. La enzima oxidasa cataliza la transferencia
de electrones del sustrato al oxígeno, y produce agua y peróxido de hidrógeno como
subproductos. Las bacterias que son oxidasa positivas, como Pseudomonas
aeruginosa, producen un cambio de color característico cuando se les expone a una
solución que contiene un compuesto de oxidorreducción y la enzima oxidasa.
2. Prueba de catalasa: La prueba de catalasa se utiliza para identificar bacterias que
producen la enzima catalasa, que cataliza la conversión del peróxido de hidrógeno en
agua y oxígeno. Las bacterias que son catalasa positivas, como Staphylococcus
aureus, producen burbujas de oxígeno cuando se les expone a peróxido de hidrógeno.
3. Prueba de fermentación de carbohidratos: La prueba de fermentación de
carbohidratos se utiliza para identificar bacterias que tienen la capacidad de fermentar
ciertos tipos de azúcares
4. La prueba de coagulasa es una prueba bioquímica utilizada para distinguir entre
bacterias estafilococos coagulasa-positivos y coagulasa-negativos. Esta prueba se basa
en la capacidad de la coagulasa para convertir el fibrinógeno en fibrina, lo que resulta
en la formación de un coágulo visible. Esta prueba es útil en la identificación de
estafilococos y es una herramienta importante en el diagnóstico de infecciones
estafilocócicas.

Conclusión
La práctica de microbiología de bacilos gram negativos anaerobios facultativos es
esencial para la identificación y el estudio de microorganismos que pueden causar
infecciones en humanos y animales. Durante la práctica, se utilizan diversas técnicas
para el aislamiento, la identificación y la caracterización de estos microorganismos,
incluyendo pruebas bioquímicas y de sensibilidad a los antimicrobianos.

La identificación precisa de los bacilos gram negativos anaerobios facultativos es

fundamental para seleccionar el tratamiento adecuado para una infección. Además, la
práctica de microbiología de estos microorganismos también ayuda a comprender su
fisiología y su papel en la ecología microbiana.

Es importante destacar que la práctica de microbiología de bacilos gram negativos

anaerobios facultativos requiere un alto nivel de habilidad técnica y conocimiento en
microbiología clínica. Por lo tanto, es crucial que los profesionales de la salud
involucrados en el diagnóstico y tratamiento de las infecciones causadas por estos
microorganismos reciban una formación adecuada en microbiología.

En conclusión, la práctica de microbiología de bacilos gram negativos anaerobios

facultativos es un componente esencial de la microbiología clínica y la investigación
microbiológica, y su importancia radica en la identificación precisa de estos
microorganismos, el estudio de su fisiología y ecología, y la selección adecuada del
tratamiento antimicrobiano para las infecciones que causan.

Cuestionario:
I.- Investigar el fundamento y el método de la prueba de fermentación de
carbohidratos, así como la interpretación.
El agar TSI o agar hierro triple azúcar es un medio de cultivo sólido que sirve como
prueba bioquímica para orientar la identificación inicial de los bacilos Gram
negativos. Se fundamenta en evidenciar la fermentación de los azúcares presentes, y la
producción de sulfuro de hidrógeno y gas.
Fundamento
Cada uno de los compuestos cumple una función dentro del medio.
Cloruro de sodio y agar: El cloruro de sodio es necesario para mantener el equilibrio
osmótico del medio. En tanto que el agar le da la consistencia sólida.
Indicador de pH (rojo de fenol): El pH del medio preparado está equilibrado a 7,3 y
el indicador de pH (rojo de fenol) vira a amarillo por debajo de 6,8. Esto quiere decir
que pequeñas cantidades de ácidos producidos por la fermentación de los azúcares
harán virar el medio de color rojo-naranja a amarillo.
Derivados proteicos (extracto de levadura, extracto de carne, peptona y proteosa
peptona): Cuando las bacterias metabolizan las proteínas presentes en el agar TSI, se
producen aminas que alcalinizan el medio (principalmente a nivel del bisel), debido a
que la reacción necesita oxígeno. Las aminas hacen virar el bisel a rojo fuerte.
Fermentación de carbohidratos (glucosa, lactosa y sacarosa): El estudio de la
fermentación de azúcares puede dar varias imágenes y cada una se interpreta de
manera diferente. La interpretación de la prueba divide a los microorganismos en 3
categorías: no fermentadores de glucosa, no fermentadores de lactosa y fermentadores
de lactosa/sacarosa.
Metodología
Pese 62,5 gr del medio agar hierro triple azúcar (TSI) deshidratado y disuelva en un
litro de agua destilada.
Caliente hasta disolver completamente el agar. Hervir por un minuto agitando
frecuentemente. Distribuir 4 ml del medio en tubos de ensayo 13/100 con tapa de
algodón.
Esterilizar en autoclave a 121°C por 15 minutos. Sacar del autoclave y dejar reposar
de forma inclinada. Se debe cuidar que tanto la base como el bisel tengan la misma
distancia.
Almacenar en nevera 2-8°C. Dejar atemperar antes de sembrar la cepa bacteriana.
El color del medio deshidratado es beige claro y el medio preparado es de color
rojo-naranja
El pH final del medio preparado es 7,3 ± 0,2.

II.-Citrato de Simmons
El agar citrato de Simmons es un medio sólido utilizado como prueba bioquímica de
identificación de microorganismos, especialmente de bacilos gramnegativos. El medio
original fue creado por Koser en 1923.
Fundamento
Algunas bacterias tienen la capacidad de sobrevivir en ausencia de fermentación o
producción de ácido láctico, necesitando conseguir energía a través de la utilización de
otros sustratos. En esta prueba la única fuente de carbono ofrecida es el citrato.
Las bacterias capaces de sobrevivir bajo estas condiciones metabolizan el citrato de
forma rápida por una vía alterna a la tradicional, utilizando el ciclo del ácido
tricarboxílico, o el ciclo de fermentación del citrato.
El catabolismo del citrato por parte de las bacterias comprende un mecanismo
enzimático sin la intervención de la coenzima A. Esta enzima se conoce con el
nombre de citricasa (citrato oxalacetato-liasa) o citrato desmolasa. La reacción
requiere la presencia de un catión bivalente, que en ese caso es suministrado por el
magnesio.
La reacción genera oxaloacetato y piruvato, que luego dan origen a ácidos orgánicos
en medio de un pH alcalino formado por la utilización de la fuente de nitrógeno. Estos
ácidos orgánicos son usados como fuente de carbono generando carbonatos y
bicarbonatos, alcalinizando aún más el medio.
Interpretación
Si el medio queda del color original (verde) y no hay crecimiento visible, la prueba es
negativa, pero si el medio cambia a color azul, indica la presencia de productos
alcalinos, que es detectado por el indicador de pH. En este caso, la prueba es positiva.
Esto sucede porque si la bacteria utiliza el carbono del citrato, también es capaz de
tomar el nitrógeno del fosfato de amonio con el cual libera amoníaco, alcalinizando el
medio.
Por otra parte, si se observa crecimiento de la bacteria en el medio, pero no hay
cambio de color, también la prueba debe considerarse positiva, ya que si hay
crecimiento quiere decir que la bacteria fue capaz de utilizar el citrato como fuente de
carbono, aunque no haya un cambio del pH en el momento (en ocasiones puede
tardar).
Si existe duda en la interpretación del color final, se puede comparar con un tubo de
citrato no inoculado.
Metodología
Pesar 24,2 gr del medio deshidratado para un litro de agua. Mezclar y dejar en reposo
durante 5 minutos aproximadamente. Terminar de disolver el medio calentando
durante 1 o dos minutos, agitando frecuentemente.
Servir 4 ml en tubos de ensayo y autoclavar a 121 °C durante 15 minutos. Al salir del
autoclave, inclinar con ayuda de un soporte, de tal manera que el agar se solidifique en
forma de pico de flauta con poco taco o fondo y más bisel.
El pH final del medio citrato es de 6,9 (color verde). Este medio es muy sensible al
cambio de pH.
A pH 6 o por debajo, el medio se torna color amarillo. Este color no es observado en
la prueba con bacterias.
Y a pH 7,6 o por encima, el medio cambia a color azul de prusia intenso.

III.- LIA
El agar LIA (Lisina Hierro) es una prueba bioquímica utilizada para la identificación
de bacterias de la familia Enterobacteriaceae. Este medio fue creado por Edwards y
Fife, basados en la fórmula de Falkow.
Fundamento
Peptonas y extracto de levadura
Como la mayoría de los medios de cultivos, el agar hierro lisina contiene componentes
que proporcionan la fuente de nutrientes necesarias para el crecimiento bacteriano.
Estos componentes están representados por las peptonas y el extracto de levadura.
Glucosa
Así mismo, este agar contiene como carbohidrato fermentable la glucosa. Se sabe que
todas las bacterias de la familia Enterobacteriaceae fermentan la glucosa.
Este paso es crucial, porque se encargará de acidificar el medio, condición
indispensable para que la enzima lisina descarboxilasa -si está presente- actúe sobre su
sustrato.
En algunos géneros bacterianos se puede observar la producción de gas debido a la
fermentación de la glucosa.
El gas se evidencia cuando ocurre un desplazamiento del agar en el tubo, quedando un
espacio vacío en el fondo del mismo, o por fractura del medio en dos o más porciones.
L-lisina
Una vez descarboxilada la lisina, se forma una diamina (cadaverina) y anhídrido
carbónico.
La descarboxilación se da en presencia de la coenzima fosfato de piridoxal. Esta
reacción es irreversible.
Indicador de pH (púrpura de bromocresol)
Todos los cambios de pH ocurridos en el medio por las diversas reacciones, son
detectados por el indicador de pH púrpura de bromocresol.
En este sentido, cuando hay acidificación el medio se torna amarillo, y cuando hay
alcalinización el medio regresa al color morado o púrpura original.
Cuando ocurre desaminación de la lisina por la presencia de la enzima lisina
desaminasa, se forma un color rojizo en la superficie, típico en los géneros Proteus,
Providencia y algunas especies de Morganella.
Esto se debe a que durante el proceso de desaminación se forma el ácido
alfa-ceto-carbónico, que reacciona con el citrato de amonio en presencia de oxígeno,
lo que origina el color mencionado.
Citrato férrico de amonio y tiosulfato sódico
Por otra parte, las bacterias que producen sulfuro de hidrógeno quedarán en evidencia
por la presencia del tiosulfato sódico (fuente de sulfuro) y del citrato férrico de
amonio, que es el revelador del H2S.
Las bacterias que posean la enzima tiosulfato reductasa tienen la capacidad de actuar
reduciendo el tiosulfato de sodio presente, formando sulfito y sulfuro de hidrógeno
(H2S).
Este último es un gas incoloro, pero al reaccionar con la sal de hierro forma sulfuro
ferroso metálico, que es un compuesto insoluble (precipitado negro visible).
Sin embargo, la capacidad de formación de H2S con este medio no es muy confiable,
debido a que algunas bacterias lisina descarboxilasa negativas capaces de producir
H2S no formarán el precipitado negro, pues la acidez del medio interfiere. Por ello se
recomienda corroborar con otros medios que contengan hierro.
Interpretación de la prueba
Descarboxilación de la lisina
Los tubos deben leerse después de culminadas las 24 horas de incubación, de lo
contrario se corre el riesgo de malinterpretar la reacción, reportando falsos negativos.
Hay que recordar que la primera reacción que ocurrirá será la fermentación de la
glucosa, por tanto todos los tubos al cabo de 10 a 12 horas virarán a color amarillo.
Si al finalizar el tiempo de incubación (24 horas) se observa un fondo amarillo con
una superficie morada o púrpura, la reacción es negativa. El color púrpura de la
superficie corresponde a la alcalinización del medio por el uso de peptonas.
Una reacción positiva es aquella en donde el fondo y la superficie del tubo son
completamente púrpuras, es decir, vuelve al color original.
Por tanto, quien determina la positividad de la prueba es la base o fondo del medio. Si
se tiene duda sobre el color se puede comparar con un tubo de LIA no inoculado.
Desaminación de la lisina
Un tubo que evidencia la desaminación de la lisina tendrá una superficie color rojiza
granate y un fondo amarillo (ácido), o todo el tubo color rojizo granate.
Esta reacción se interpreta como negativa para la descarboxilación de la lisina, pero
positiva para la desaminación de la lisina.
Esta reacción se define e interpreta en el bisel.
Producción de sulfuro de hidrógeno (H2S)
Una reacción positiva se observa por la aparición de un precipitado negro en todo el
medio o parte de él. Generalmente entre el límite del bisel y la base.
Metodología
Pese 35 gr del medio lisina agar hierro deshidratado y disuelva en un litro de agua
destilada.
Caliente hasta disolver completamente el agar, para ello deje hervir por un minuto
agitando frecuentemente. Distribuir 4 ml del medio en tubos de ensayo 13/100 con
tapa de algodón.
Esterilizar en autoclave a 121°C por 15 minutos. Sacar del autoclave y dejar reposar
de forma inclinada, de tal manera que quede una base profunda y un bisel corto.
Almacenar en nevera 2-8°C. Dejar atemperar antes de sembrar la cepa bacteriana.
El color del medio deshidratado es beige y del medio preparado color púrpura rojizo.
El pH final del medio preparado es 6,7 ± 0.2
El medio se torna amarillo con pH igual o menor a 5,2, y es morado a pH 6,5 para
arriba.

IV.- Nitratos
Metodología
1. Inocular los caldos de nitrato con suspensión bacteriana.
2. Incube los tubos a la temperatura óptima de 30 ° C o 37 ° C durante 24 horas.
 3. Después de la incubación, busque primero el gas N2 antes de agregar los
reactivos.
4. Agregue 6-8 gotas de reactivo de nitrito A y agregue las 6-8 gotas de reactivo
de nitrito B.
5. Observe la reacción (desarrollo de color) en un minuto o menos.
6. Si no se desarrolla color, agregue zinc en polvo.
7. Observe durante al menos 3 minutos para que se desarrolle un color rojo
después de la adición de zinc.

Interpretación
Reacción Gas Color después de la Color después de la Interpretación
adición de la solución adición de zinc.
AyB

NO3 → NO2 Ninguno rojo – NO3 +, sin gas

NO3 → NO2, gas Ninguno rojo – NO3 +, sin gas

parcial

final no gaseoso

productos

NO3 → NO2, sí rojo – NO3 +, gas +

final gaseoso

productos
 NO3 → gaseoso sí Ninguno Ninguno NO3 +, NO2 +,

Producto final gas +

NO3 → Ninguno Ninguno Ninguno NO3 +, NO2 +,

final no gaseoso no gas

productos

NO3 → sin reacción Ninguno Ninguno rojo Negativo

V.- SIM
El medio SIM es un agar semisólido y diferencial, especialmente diseñado para
ayudar a la identificación de algunas bacterias, principalmente de la familia
Enterobacteriaceae. Está compuesto por tripteína, peptona, sulfato de hierro, sulfato de
amonio, tiosulfato de sodio y agar.
Fundamento
Es un medio de cultivo que se considera diferencial, debido a que su uso logra
distinguir entre los microorganismos capaces de producir sulfuro de hidrógeno de los
que no lo hacen; también destaca aquellas que forman indol a partir del triptófano de
las que no lo forman, y finalmente diferencia las bacterias mótiles de las inmóviles.
Metodología
Medio SIM
Pesar 30 gr del medio deshidratado y disolver en un litro de agua destilada. La mezcla
se deja en reposo por 5 minutos y luego se calienta hasta hervir, agitando
frecuentemente hasta su completa disolución.
Distribuir la mezcla en tubos de ensayo con tapa de algodón y autoclavar a 121°C por
15 minutos. Sacar la gradilla de tubos del autoclave y dejar solidificar en posición
vertical, para que el medio quede en forma de taco.
Para su conservación se guarda en nevera hasta su uso. El medio preparado debe tener
un pH final de 7,3 ± 0,2.
Al momento de inocular el medio este debe estar a temperatura ambiente. El color del
medio es beige.
Reactivo de Kovac´s
Medir 150 ml de alcohol amílico o isoamílico o butílico. (Usar uno de los tres
mencionados).
Disolver 10 gr de p-dimetilaminobenzaldehído. Luego, agregar lentamente 50 ml de
ácido clorhídrico concentrado.
El reactivo listo para su uso es incoloro o amarillo claro. Debe conservarse en frasco
ámbar y guardarse en nevera. No usar si toma un color castaño oscuro; eso indica que
está dañado. Este reactivo se prefiere cuando se trata de enterobacterias.
Reactivo de Erlich
Pesar 2 gr de p-dimetilaminobenzaldehido y disolver en 190 ml de alcohol etílico
absoluto y mezclar lentamente con 40 ml de ácido clorhídrico concentrado. Conservar
de igual manera al reactivo de Kovac´s. El reactivo de Ehrlich se usa mas para
bacterias no fermentadoras y anaerobios.
Usos
El medio SIM es altamente utilizado en los laboratorios de bacteriología. Tiene como
ventaja que en un mismo tubo pueden observarse tres características esenciales en la
identificación de las enterobacterias.

VI.- MIO
El medio MIO es una prueba bioquímica que se utiliza para ayudar en la identificación
de especies de bacterias pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae. Es bastante
nutritivo y está compuesto por glucosa, extracto de levadura, peptona, tripteína,
clorhidrato de L-ornitina, púrpura de bromocresol y agar.
Fundamento
Peptona, extracto de levadura y tripteína
Estos elementos contribuyen al poder nutritivo de este medio. Sirven como fuente de
nutrientes y aminoácidos esenciales para el desarrollo bacteriano.
Además, la tripteína es una fuente de triptófano para evidenciar la presencia de la
enzima triptofanasa, que degrada el triptófano por una desaminación reductiva,
liberando indol, ácido pirúvico, amoníaco y energía.
El indol es incoloro, por tanto, su presencia se revela al agregar cinco gotas del
reactivo de Ehrlich o de Kovacs, ambos con p-dimetilaminobenzaldehído.
El grupo aldehído de este compuesto reacciona con el indol, generando un producto de
color rojo fucsia en forma de anillo en la superficie del agar.
Cualquier vestigio de color se debe considerar como una prueba positiva. La prueba
debe leerse inmediatamente, pues pasado el tiempo el color se degrada.
Interpretación
Prueba positiva: formación de un anillo de color rojo fucsia al agregar las gotas del
reactivo de Kovacs.
Metodología
Medio MIO
Pesar 31 gr del medio MIO y disolver en un litro de agua destilada. Calentar hasta que
hierva la mezcla durante un minuto, agitando frecuentemente hasta disolver
completamente el agar. Distribuir 4 ml del medio en tubos de ensayo 13/100 con tapa
de algodón.
Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Sacar del autoclave y dejar
reposar de forma recta en una gradilla, de tal manera que se forme un taco semisólido.
Almacenar en nevera 2-8 °C. Dejar atemperar antes de sembrar la cepa bacteriana.
El color del medio deshidratado es beige y el del medio preparado de color púrpura
levemente opalescente. El pH final del medio preparado es 6,5 ± 0.2. El medio se
torna amarillo con pH ácido y morado a pH alcalino.
Reactivo de Kovacs (revelador de la prueba de indol)
Este reactivo se prepara de la siguiente manera:
Se miden 150 ml de alcohol amílico, isoamílico o butílico (cualquiera de los tres). En
él se disuelven 10 gr de p-dimetilaminobenzaldehído. Posteriormente, se agregan
lentamente 50 ml de ácido clorhídrico concentrado.
El reactivo preparado es incoloro o amarillo claro. Debe guardarse en frasco ámbar y
conservarse en nevera. Un color castaño oscuro evidencia su deterioro.
También el reactivo de Kovacs se puede sustituir por el reactivo de Ehrlich. Este
último, por ser más sensible, se prefiere para revelar el indol en bacterias que la
producen en mínimas cantidades, como en algunos bacilos gramnegativos no
fermentadores y ciertos anaerobios.
VII.- Urea
El caldo urea es un medio de cultivo líquido, utilizado para evidenciar la presencia de
la enzima ureasa en ciertos microorganismos. La ureasa es una enzima microbiana que
se produce de manera constitutiva, es decir, es sintetizada independientemente de estar
o no presente el sustrato sobre el que actúa.
La función de la ureasa está relacionada con la descomposición de los compuestos
orgánicos. No todos los microorganismos son capaces de sintetizar esta enzima, por
tanto su determinación en el laboratorio permite identificar ciertas cepas bacterianas e
inclusive diferenciar entre especies de un mismo género.
Existen dos tipos de prueba de la urea: Stuart y Christensen. Se diferencian en su
composición y en la sensibilidad. La primera es especial para evidenciar gran cantidad
de ureasa producida por especies del género Proteus.
La segunda es más sensible y puede detectar pequeñas cantidades de ureasa
generadas tardíamente por otros géneros bacterianos, tales como Klebsiella,
Enterobacter, Staphylococcus, Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus,
Helicobacter y Mycobacterium.
Fundamento
La enzima ureasa hidroliza la urea para formar anhídrido carbónico, agua y dos
moléculas de amoníaco. Estos compuestos reaccionan para formar el producto final
llamado carbonato de amonio.
Caldo urea de Stuart
El caldo urea de Stuart es más tamponado con un pH de 6,8. Por tanto, el
microorganismo debe ser capaz de formar grandes cantidades de amonio para hacer
virar al rojo de fenol. El pH debe elevarse por encima de 8.
Por ello el caldo urea de Stuart es selectivo para especies de Proteus, dando resultados
positivos en 24 a 48 horas de incubación, y no es efectivo para bacterias que producen
pocas cantidades de ureasa o que hidrolizan lentamente la urea.
Caldo o agar urea de Christensen
El caldo o agar urea de Christensen es menos tamponado, siendo capaz de detectar
pequeñas cantidades de amonio. Además, este medio está enriquecido con peptonas y
glucosa. Estos compuestos hacen que se desarrollen otros microorganismos
productores de ureasa que no crecen en el caldo Stuart.
Así mismo, la prueba de urea de Christensen ofrece resultados más rápidos, sobre todo
para Proteus, pudiendo dar fuertemente positiva en tan solo 30 minutos como tiempo
mínimo y hasta 6 horas como tiempo máximo.
El resto de los microorganismos productores de ureasa logran virar el color del medio
levemente después de 6 horas, y fuertemente al cabo de 24, 48, 72 horas o más, e
incluso algunas cepas pueden dar reacciones débiles después de 5 o 6 días.
Interpretación de ambos medios (Stuart y Christensen)
El medio originalmente es de color amarillo-anaranjado y una reacción positiva hará
virar el color del medio a rosado-fucsia. La intensidad del color es directamente
proporcional a la cantidad de amonio producido.
Una reacción negativa dejará el medio del color original a excepción de las levaduras,
que pueden dar un rosado pálido con el medio agar urea de Christensen.
Metodología
Caldo urea de Stuart
Pesar los gramos necesarios según las indicaciones de la casa comercial. Disolver en
agua destilada preferiblemente estéril. No usar calor para disolver, pues la urea es
sensible al calor.
Para esterilizar se utiliza el método de filtración con membranas. Para ello se usa un
filtro Millipore con poros de 0,45 µ de diámetro. No usar autoclave. Una vez filtrada
la solución, se distribuye en tubos estériles. Para obtener resultados confiables se debe
trasvasar entre 1,5 ml como cantidad mínima a 3 ml como cantidad máxima por tubo.
Conservar en nevera y atemperar antes de usar.
Si no se dispone del método de filtración, el medio debe utilizarse de forma inmediata
para obtener resultados confiables.
Otra forma de preparar el caldo urea de Stuart es de la siguiente manera:
Algunas casas comerciales venden el medio base para la prueba de la urea, sin incluir
la urea.
Se pesa la cantidad indicada por la casa comercial. Se disuelve en agua destilada y se
esteriliza en el autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Se deja reposar un poco y
cuando el medio esté tibio se agrega 100 ml de una solución de urea preparada al 20%
y esterilizada por filtración.
Se distribuye en tubos estériles, como fue descrito anteriormente.
Caldo o agar urea de Christensen
-Preparación de la solución de urea
Pesar 29 gr de urea deshidratada y disolver en 100 ml de agua destilada. Utilizar el
método de filtración para esterilizar.
-Agar base de urea
Disolver 24 gr del agar base deshidratado en 950 ml de agua destilada. Esterilizar en
el autoclave a 121°C por 15 minutos. Dejar reposar hasta que alcance una temperatura
de 50°C y agregar la urea anteriormente preparada de forma aséptica.
Verter 4 a 5 ml en tubos estériles e inclinar hasta que solidifiquen. Debe quedar un
pico de flauta largo.
Este medio también se puede preparar de forma líquida.

VIII.- O/F ( Hugh- Leifson)

El medio OF o de fermentación de glucosa es un agar semi-sólido especialmente
diseñado para el estudio del metabolismo oxidativo y fermentativo de los
carbohidratos en un grupo importante de microorganismos diferente a las
enterobacterias, denominados bacilos Gram negativos no entéricos.
Fundamento
Como todo medio de cultivo, el medio OF debe contener sustancias nutritivas que
garanticen el crecimiento bacteriano; estas sustancias son las peptonas.
Por su parte, el carbohidrato proporciona energía y a la vez sirve para estudiar el
comportamiento del microorganismo frente a él, es decir, permite clasificar a la
bacteria como un organismo oxidativo, fermentativo o no sacarolítico.
El medio OF contiene una relación de peptona/carbohidrato de 1:5 a diferencia de los
medios convencionales de 2:1. Esto garantiza que la cantidad de aminas alcalinas
formadas a partir de la degradación de las peptonas no neutralice la formación de
ácidos débiles.
Por otra parte, el medio contiene cloruro de sodio y fosfato dipotásico. Estos
compuestos estabilizan osmóticamente al medio y regulan el pH respectivamente. El
azul de bromotimol es el indicador de pH, el cual hace virar el color del medio de
verde a amarillo con la producción de ácido.
Algunos microorganismos pueden utilizar los carbohidratos por la vía oxidativa o por
la vía fermentativa, mientras que otros no toman ninguna de las dos vías.
Esto depende de la característica de cada microorganismo. Por ejemplo, algunos
microorganismos aerobios estrictos pueden oxidar determinados carbohidratos, y los
anaerobios facultativos pueden oxidar y fermentar dependiendo del ambiente que los
rodee, mientras que otros no oxidan ni fermentan los carbohidratos (asacarolíticos).
Finalmente, existe una modificación del medio OF recomendada por la CDC que
contiene una base especial OF con rojo fenol como indicador.
Preparación
Pesar:
2 gr de peptona
5 gr de cloruro de sodio
10 gr de D-glucosa (o del carbohidrato que se vaya a preparar)
0,03 gr de azul de bromotimol
3 gr de agar
0,30 gr de fosfato dipotásico
1 litro de agua destilada.
Mezclar todos los compuestos menos el hidrato de carbono y disolver en 1 litro de
agua destilada. Calentar y agitar hasta disolver en su totalidad.
Al enfriar a 50°C se agrega 100 ml de glucosa al 10% (filtrada).
Distribuir asépticamente 5 ml del medio OF en tubos de ensayos con tapa de algodón
y autoclavar a 121 °C, a 15 libras de presión por 15 minutos.
Dejar solidificar en posición vertical.
El pH del medio debe quedar en 7, 1. El color del medio preparado es verde.
Conservar en nevera.
Referencias bibliográficas
● Cabello, R. (1999). Microbiología y parasitología humana. México, D.F.: Editorial
Médica Panamericana.