Tema 2 Replicación y Reparación Del DNA

BIOLOGÍA MOLECULAR DE LA CÉLULA
José Pedro Vaqué, vaquej@unican.es

BMC_PARTE 1:EXPRESIÓN GENÉTICA Y ORGANIZACIÓN
Capítulo 1: Secuencia del DNA y organización del genoma.
Estructura del DNA structure. Genoma y cromosomas. Organización del genoma de eucariotas: intrones,
exones y DNA repetitivo. Empaquetamiento del DNA. EL nucleosoma. Condensación de la cromatina,
centrómeros y telómeros.
C. 1: Estructura del material

genético.
BMC_PARTE 1:EXPRESIÓN GENÉTICA Y ORGANIZACIÓN
Capítulo 2: Replicación y reparación del DNA.
Principios generales de la replicación. DNA polimerasas. Otras enzimas y factores implicados.
Replicación del DNA en Procariotas y en Eucariotas. Activaciópn dela replicación. Telómeros.
Reparación del DNA: Agentes, tipos de lesiones y mecanismos.
C. 1: Estructura del material

genético.
C. 2: Cómo la información genética

se transmite y repara,
LA TRANSMISION GENÉTICA DEL DNA
Capítulo 2: Transmisión y reparación del DNA.

LA TRANSMISION GENÉTICA DEL DNA
REPLICACIÓN
NUCLEOTIDE
NUCLEOTIDE SEQUENCE
(DNA)
NUCLEOTIDE TRANSCRIPCIÓN
NUCLEOTIDE SEQUENCE
(mRNA)
AMINO-ACID
TRADUCCIÓN
AMINO-ACID-SEQUENCE
(PROTEIN)

C.2: CÓMO LA INFORMACIÓN GENÉTICA SE TRANSMITE Y SE REPARA
CLASE 2.1
2.1- Replicación del DNA.
2.2- Orígenes de replicación.
2.3- Replicación de los telomeros.
2.4- Daño y repración del DNA.

LA NECESIDAD DE TRANSMITOR LA INFORMACIÓN GENÉTICA
EUCROMATINA COMPACTACIÓN HETEROCROMATINA

LA NECESIDAD DE TRANSMITIR LA INFORMACIÓN GENÉTICA
• PARA MANTENER INFORMACIÓN GENÉTICA VITAL.
• PARA MANTENER ACTIVIDADES VITALES
• REDUCIR POTENTIALES ERRORES DE LA ACTIVIDAD DE LA POLIMERASA
• MINIMIZAR OTRAS ALTERACIONES GENÉTICAS POTENTCIALMENTE PELIGROSAS
• GARANTIZAR LA VIABILIDAD DEL ORGANISMO EN EL CONTEXTO DE LA EVOLUCIÓN
COMPACTED
REPLICACIÓN DEL DNA Y EL CICLO CELULAR
Una cromatida de cada cromosoma
S: Fase de síntesis de DNA
Dos cromátidas hermanas = cromosoma

COMPACTED
Adèle L. Marston & Angelika Amon Nature Reviews Molecular Cell Biology 6, 818 (October 2005)

DNA POLIMERASAS

DNA POLIMERASAS
• La replicación del DNA es la copia de todo el genoma de un organismo.
• Ocurre una sola vez por cada ciclo celular de forma que todas las bases se copian
una sola vez.
• Las enzimas que sintetizan DNA se denominan DNA polimerasas:
 Polimerizan una hebra complementaria de DNA
 Sólo sintetizan DNA en dirección 5' → 3’ de la hebra molde.
 IMPORTANTE: Sólo pueden extender oligonucleotidos que ya se encuentran

alineados de forma complementaria a la cadena de DNA molde, NO pueden
generar una molécula de DNA de novo; Necesitan una cadena corta de RNA o
cebador.
• La replicación del DNA no es perfecta, se introducen errores: 1 / 107 nucleotidos se
introducen erróneamente (hay solución!)
• La replicació del DNA es semiconservativa y bidireccional desde un origen
REPLICACION SEMI-CONSERVATIVA DEL DNA

REACCION CATALIZADA POR LAS DNA POLIMERASAS
Se añade un nucleósido tri-fosfato al extremo 3’-OH de la cadena sintetizada, de
forma complementaria a la cadena molde. La reacción genera un pirofosfato.
LAS DNA POLIMERASAS SÓLO SINTETIZAN DNA EN DIRECCIÓN 5' → 3'

TIPOS DE DNA POLIMERASAS

POLIMERIZACION EN SENTIDO 5ï TO 3ïDIRECTION
Se añade un nucleósido tri-fosfato al extremo 3’-OH de la cadena sintetizada, de
forma complementaria a la cadena molde. La reacción genera un pirofosfato.
Molecular Biology of the Cell. e5. Garlan Science 2008
-LA HEBRA LÍDER (LEADING STRAND), SE SINTETIZA POR LA DNA POLIMERASA ε
-LA HEBRA RETRASADA (LAGGING STRAND) SE SINTETIZA DE LA FORMA SIGUIENTE:

-RNA; POR UNA PRIMASA + DNA POLIMERASA 𝜶𝜶
-DNA; POR LA DNA POLIMERASA δ
LAS DNA POLIMERASAS SÓLO SINTETIZAN DNA EN DIRECCIÓN 5' → 3'
INICIACION DE LOS FRAGMENTOS DE OKAZAKI CON CEBADORES DE RNA
Las DNA polimerasas requieren un cebador para iniciar la síntesis de DNA, NO lo
pueden hacer De Novo
LA PRIMASA SINTETIZA PEQUEÑOS POLÍMEROS DE RNA EN LA HEBRA

RETRASADA (LAGGING STRAND), QUE SIRVE DE CEBADORES PARA LA
REPLICACIÓN
Capítulo 2: Transmisión y reparación del DNA. Molecular Biology of the Cell. e5. Garlan Science 2008
ELIMINACIÓN DE LOS CEBADORES DE RNA Y
UNIÓN DE LOS FRAGMENTOS DE OKAZAKI
Las DNA polimerasas requieren un cebador para iniciar la síntesis de DNA, NO lo
pueden hacer De Novo
-LA RNAsa H Y LAS EXONUCLEASAS

(5´TO 3´), DEGRADAN EL RNA DE LOS
HÍBRIDOS DNA/RNA
LOS HUECOS SE RELLENAN GRACIAS A LA

POLYMERASE δ
UNA LIGASA DE DNA UNE LOS

FRAGMENTOS DE DNA
Molecular Biology of the Cell. e5. Garlan Science 2008

TIPOS DE DNA POLIMERASAS

FIDELIDAD DE LA REPLICATION. DNA PROOF-READING (COMPROBACIÓN)
La replicación del DNA es muy precisa, aunque las

polimerasas pueden cometer errores:
Habitualmente: 1 error cada 107 -108 nucleótidos.
Este error tan bajo se debe a que la mayoría de las

polimerasas tienen actividad exonuclease 3‘5'.
En general las exonucleasas digieren el DNA desde los

extremos y no suelen ser muy específicas. Existen
otras enzimas, las endonucleasas que rompen los
enlaces de fosfo-diester por el medio de secuencias
de nucleótidos específicas..
FIDELIDAD DE LA REPLICATION. DNA PROOF-READING (COMPROBACIÓN)
La replicación del DNA es muy precisa, aunque las

polimerasas pueden cometer errores:
Habitualmente: 1 error cada 107 -108 nucleótidos.

1 ERROR CADA 105 NT O CADA 107 NT EN DNA RECIÉN SINTETIZADO
PROOF-READING DNA-REPAIR MECHANISMS
Este error tan bajo se debe a que la mayoría de las

polimerasas tienen actividad exonuclease 3‘5'.
Mechanism
https://www.youtube.com/watch?v=ldXXGt8Ihss
En general las exonucleasas digieren el DNA desde los

extremos y no suelen ser muy específicas. Existen
otras enzimas, las endonucleasas que rompen los
enlaces de fosfo-diester por el medio de secuencias
de nucleótidos específicas..
Weinberg Figure 12.6 The Biology of Cancer (Garland Science 2007)

REPLICACIÓN DEL DNA: OTRAS PROTEINAS I
1. DNA polimerasa α /Primasa sintetiza el
cebador de RNA que se extiende inicialmente
por la DNA polimerasa α.
También genera un cebador (una vez) en la
hebra líder (leading strand).
2. DNA polimerasa δ sintetiza un fragmento
nuevo de DNA (parte del fragmento de Okazaki)
3. RNAsa H degrada el cebador de RNA y la

DNA polimerase δ rellena el “hueco”.
4. La DNA Ligasa Une

los dos fragmentos
adyacentes de DNA
recién sintetizados
Mark's Basic Biomedical Chemistry.

A Clinical Approach. McGraw-Hill 2006
Capítulo 2: Transmisión y reparación del DNA. Moodle: https://www.youtube.com/watch?v=-mtLXpgjHL0

REPLICACIÓN DEL DNA: OTRAS PROTEINAS II
Clamp o abrazadera (PCNA) y Clamp loader (RPC or RFC)
RPC or RFC en eukariotas reconoce la unión

cebador-hebra molde, se une y recluta a PCNA
usando ATP
PCNA forma un anillo alrededor de la hélice de

DNA helix y previene la disociación de la
polimerasa. Ayuda a la polimerasa a mantener su
función.
PCNA

REPLICACIÓN DEL DNA: OTRAS PROTEINAS II
DNA helicasas
-Las DNA helicasas Son enzimas que

abren las hebras de DNA utilizando ATP.
-Se localizan al frente de la horquilla de

replicación.

REPLICACIÓN DEL DNA: OTRAS PROTEINAS IV
Single Strand DNA binding proteins (SSB) ó RPA in eukaryotes
-Las proteínas SSB o RPA interaccionan con moléculas de DNA de cadena simple
(ssDNA) con el fin de impedir la Formación de estructuras secundarias de DNA
REPLICACIÓN DEL DNA: OTRAS PROTEINAS IV
Single Strand DNA binding proteins (SSB) ó RPA in eukaryotes
-Las proteínas SSB o RPA interaccionan con moléculas de DNA de cadena simple
(ssDNA) con el fin de impedir la Formación de estructuras secundarias de DNA
REPLICACIÓN DEL DNA: OTRAS PROTEINAS V
Topoisomerasas
El desenrollamiento del DNA genera problemas de

super-enrollamiento en la estructura del DNA.
Recordad los cordones de los teléfonos de casa no

hace tanto tiempo…..
http://chemistry.umeche.maine.edu/CHY431/Nucleic5.html
Las DNA topoisomerasas son proteínas que descargan

la tension producida por el desenrollamiento en el
DNA.

REPLICACIÓN DEL DNA: OTRAS PROTEINAS V
Topoisomerasas tipo I : Rompen 1 cadena de DNA y permite que la otra pueda
recolocarse antes de que se produzca la re-ligazón. NO utilizan ATP.
Topoisomerasas tipe II : Rompen las 2 cadenas de DNA y permite que otra doble
hélice se recoloque antes de la religación. Requiere ATP.
https://www.youtube.com/watch?v=EYGrElVyHnU

RESUMEN: PROTEINAS QUE PARTICIPAN EN LA REPLICACIÓN DEL DNA

RESUMEN: EL COMPLEJO DE REPLICACIÓN DEL DNA
Cooper and Hausman, The Cell, A Molecular Approach. 5ed.
Polimerasas en bacterias
DNA HELICASA
DNA POLIMERASA α
RPA
RNAsa H
RPC
DNA POLIMERASA ε
PCNA DNA POLIMERASA δ
DNA POLIMERASA δ
DNA LIGASA
NOMBRES EN HUMANOS
…Y LAS HISTONAS?
Durante la replicación, la mitad del

octámero (H3-H4) se conserva en el DNA y
se distribuye de forma dispersa entre las dos
nuevas moléculas.
Posteriormente, las histonas se completan y

las enzimas modificadoras de histonas
“reading-writing” copian los patrones
epigenéticos.
Esto permite cierto grado de herencia

epigenetica de las nuevas moléculas de DNA
sintetizadas.
EJEMPLOS DE EXPERIMENTOS PRECLÍNICOS Y REPLICACIÓN DEL DNA
Curiel-Olmo t al. Oncotarget 2015
N Engl J Med ,2011

J Clin Oncol 29:3085-3096.
2011

EJEMPLOS DE CLÍNICA Y REPLICACIÓN DEL DNA: IHC & DIAGNOSTICO
EPITELIO NORMAL EPITELIO DISPLASICO
EPITELIO DISPLÁSICO Y CANCER

UNA CEL. MITÓTICA
EL NÚCLEO MARRÓN INDICA SÍNTESIS DE DNA (REPLICATION) ACTIVA
APLICACIONES IMPORTANTE EN LA CLÍNICA I: PCR
Secuencia y homología.
-DNA desnaturaliza con calor

(completamente sobre los 90ºC)
-DNA re-naturaliza (hibridida) a temperaturas más

bajas
(completamente sobre los 40ºC)
-A medida que la Tº disminuye, el DNA se une a https://www.youtube.com/watch?v=iQsu3Kz9NYo

secuencias homólogas hasta re-formar una doble hebra ATP
perfecta. PRÁCTICAS DE LAB. ATP
GTP
GTP TTP
CTP GTP
TTP
CTP
CTP
CTP GTP
-Las moléculas homólogas de DNA y RNA hibridan Polimerasa Cebadores: Nucleótidos
Secuencias específicas de oligonucleotidos

DNA/DNA ó DNA/RNA ó RNA/RNA
-PCR: POLYMERASE CHAIN REACTION -Taq DNA polimerasa (de Thermis aquaticus),
-Pfu DNA polimerasa (de Pyrococcus furiosus) muy utilizada porque es de
A. Replicación In Vitro más alta fidelidad al copiar DNA.
B. Altamente específica
APLICACIONES EN LA CLÍNICA II: DERIVADAS DE LA PCR
MUCHAS LIMITACIONES!
HA PERMITIDO DETECTAR MUCHAS MUTACIONES IMPLICADAS EN ENFERMEDAD HUMANA (Y CANCER)

-TIENE UNA SENSIBILIDAD REDUCIDA (NECESITA ENTRE EL 30-100% DE BASES MUTANTES EN LA MUESTRA)
-PERMITE EL ESTUDIO DE FRAGMENTOS DE DNA DE TAMAÑO PEQUEÑO (100-400 BPs)

APLICACIONES EN LA CLÍNICA III: QUIMIOTERAPIA CLASICA
Inhibidores de la Irinotecan, Inhibe la topoisomerase

Topoisomerasa II; etoposido, I, comúnmente utilizado en cancer
doxorubicina de colon y pulmón
Inhibidores de la DNA girasa como

antibióticos:
Ácido nalidixico Acid, novobiocina, y
ciprofloxacino (quinolonas).
DANIEL A. WEST, Fam Physician. 2010 May 15;81(10):1186-1188.

DROGAS CLASICAS DE USO ANTITUMORAL
ANTIMICROTUBULOS AGENTES ALQUILANTES DEL DNA INHIBIDORES DE LA SINTESIS DE DNA/RNA
� Clorambucilo Citarabina
� Vincristina
� Melfalan � Gemcitabina
� Vinblastina
� Busulfan � Fludarabina
� Paclitaxel
� Ciclofosfamida � Cladribina
INHIBIDORES DE TOPOISOMERASA II
� Tiotepa � Tioguanina/6ME
� Daunorubicina
� Cis-platino � Deoxicoformicina
� Idarubicina
� Carboplatino � Bleomicina
� Doxorubicina
� BCNU/Carmustina � Fluorouracilo
� Etopósido
� Nitrosureas
� Mitoxantrona
INHIBIDORES DELA METHYLATION DEL DNA
� Epirubicina
� Azacitidina
INHIBIDORES DE TOPOISOMERASA I INHIBIDORES DE LA SÍNTESIS DE HORMONAS

� Topotecán NUCLEÓTIDOS � Interferones
� Irinotecán � Metrotexato � Glucorticoides
� Hidroxiurea � Acido retinoico
� Tamoxifeno
Antimetabolitos interfieren con lasíntesis de DNA y RNA. Al sustituir los nucleótidos habituales los
agents actúan en la fase S, dañando el DNA .
-Muy communes en tratamientos de leucemias, cánceres de mama, ovario y tracto intestinal entre
otros. .

DROGAS CLASICAS DE USO ANTITUMORAL
ANTIMICROTUBULOS AGENTES ALQUILANTES DEL DNA INHIBIDORES DE LA SINTESIS DE DNA/RNA
� Clorambucilo Citarabina
� Vincristina
� Melfalan � Gemcitabina
� Vinblastina
� Busulfan � Fludarabina
� Paclitaxel
� Ciclofosfamida � Cladribina
INHIBIDORES DE TOPOISOMERASA II
� Tiotepa � Tioguanina/6ME
� Daunorubicina
� Cis-platino � Deoxicoformicina
� Idarubicina
� Carboplatino � Bleomicina
� Doxorubicina
� BCNU/Carmustina � Fluorouracilo
� Etopósido
� Nitrosureas
� Mitoxantrona
INHIBIDORES DELA METHYLATION DEL DNA
� Epirubicina
� Azacitidina
INHIBIDORES DE TOPOISOMERASA I INHIBIDORES DE LA SÍNTESIS DE HORMONAS

� Topotecán NUCLEÓTIDOS � Interferones
� Irinotecán � Metrotexato � Glucorticoides
� Hidroxiurea � Acido retinoico
� Tamoxifeno
Topoisomerases antitumorales : No como otros antibióticos que se utilizan para tartar infecciones.
- Alteran la estructura del DNA en las células de cáncer para prevenir su proliferación.
-Un ejemplo, Las antraciclinas: Interfieren y dañan el DNA. Los inhibidores de las topoisomerasas:
Interfieren con la capacidad de mantaner separadas las hebras de DNA que son copiadas durante la fase S
del ciclo.

CLASE 2.2
2.4- Daño y reparación del DNA.

ORIGENES DE LA REPLICACION DE DNA EN BACTERIAS
Un solo origen de replicación lineal bidirectional en bacterias.

Con secuencias específicas, ricas en AT, y de varios centenares de bases de tamaño.
CADA HORQUILLA DE REPLICACIÓN SINTETIZA DNA A UNA VELOCIDAD DE 500-1000

NUCLEOTIDOS/SEGUNDO.
ORIGENES DE LA REPLICACION DE DNA EN EUCARIOTAS
1. En eucariotas, las horquillas de replicación funcionan a 50 nuc./seg. (1/10 de la de
procariotas) probablemente por la alta compactación de la cromatina.
2. El tamaño medio de un cromosoma humano es de 150 millones de nucleótidos. Si

solo existiese 1 solo origen de replicación en cada cromosoma, se tardarían 800
horas en copiarlo. Típicamente una fase S dura unas 8 horas en humanos por lo que
cada cromosoma debe tener multiples orígenes de replication.
3. El genoma humano tine unos 30.000 orígenes de replicación separados unos 50-
300 Kb. Luego en teoría, la fase S duraría 1h, frente a las 8 hrs. observadas. Se ha
descrito que NO todos los orígenes de replicación se activan al mismo tiempo y que
la compactación de la cromatina afecta esta activación. La heterochromatins se
replica al final de la fase S .
4. Los orígenes de replication están bien definidos en levaduras pero no en
eucariotas superiores. Como comentamos arriba la estructura de la cromatina es
más importante que la secuencia.
5. TODO EL DNA SE DEBE REPLICAR EN CADA CÉLULA UNA VEZ/CICLO CELULAR:
Cada origen de replicación se debe acitvar 1 vez/ciclo.
Un experimento para identificar los orígenes de replicación del DNA
Molecular Biology of the Cell. 5ed. Garland Science 2008.

Un experimento para identificar los orígenes de replicación del DNA
Molecular Biology of the Cell. 5ed. Garland Science 2008.

ORIGENES DE LA REPLICACION DE DNA EN EUCARIOTAS: ARS/ORC
La replicación supone un esfuerzo celular ENORME y requiere una regulación muy fina
(C.10)
En levaduras S. Cerevisiae se ha descritp ARS (Autonomous Replication Site)
-ARS unos 100 nts. Con una
secuencia consenso de 11-nts.
común a muchos ARS.
-Las proteínas ORC (Origin

Recognition Complex) Se unene
a ARS y reclutan otrs proteínas
como las helicasas MCM para
inciar la replication.
-Los ARS no están bien definidos

en otros eucariotas y se piensa
que las ORC NO reconocen
secuencias específicas.

INTEGRANDO LA MAQUINARIA DEL CICLO CELULAR CON LA REPLICACIÓN
-ORC + oros se ensamblan.

-formación del complejo pre-replicativo.
-CDK-media la activación por fosforilación:

Degrada Cdc6.
Fosforila ORC
-Inicio de la replicación

HAY UN PROBLEMA CON LA REPLICACIÓN LINEAL
En el extremo de los cromosomas, no se puede sintetizar un cebador de RNA para
copiar la hebra retrasada (lagging strand) hast el final. Se perdería secuencia en cada
ciclo.
http://www.senescence.info/telomeres_telomerase.html

LOS TELOMEROS COMO UN MEDIDOR INTERNO DE DIVISIÓN CELULAR
Los telómeros hmanos contienen miles de copias de una secuencia de 6-nucleotidos.
http://www.tasciences.com/wp-content/uploads/2010/02/what-we-lose-with-age3.png
http://learn.genetics.utah.edu/content/begin/traits/telomeres/

LOS TELOMEROS COMO UN MEDIDOR INTERNO DE DIVISIÓN CELULAR
Los telómeros hmanos contienen miles de copias de una secuencia de 6-nucleotidos.

MANTENIENDO LA LONGITUD TELOMÉRICA: LA TELOMERASA
La telomerasa forma una complejo de proteina-RNA compuesto de: Una transcriptasa
inversa (sintetiza DNA a partir de RNA) + RNA usado como molde para añadir 6-
nucleotidos al telomero.
La mayoría de las células somáticas
inactivan la telomerasa para que
sus telómeros se acorten en cada
ciclo.
-Sin embargo, las células

especializadas como las germinales
ó las células stem de los tejidos, la
usan para mantener sus telómeros
intectos.
Telomere replication
https://www.youtube.com/w
atch?v=AJNoTmWsE0s
MANTENIENDO LA LONGITUD TELOMÉRICA: LA TELOMERASA
La telomerasa forma una complejo de proteina-RNA compuesto de: Una transcriptasa
inversa (sintetiza DNA a partir de RNA) + RNA usado como molde para añadir 6-
nucleotidos al telomero.
La mayoría de las células somáticas
inactivan la telomerasa para que
sus telómeros se acorten en cada
ciclo.
-Sin embargo, las células

especializadas como las germinales
ó las células stem de los tejidos, la
usan para mantener sus telómeros
intectos.
Telomere replication
https://www.youtube.com/w
atch?v=AJNoTmWsE0s
LA MAYORIA DE LAS CÉLULAS DE CÁNCER ACTIVAN LA TELOMERASA PARA PROLIFERAR INDEFINIDAMENTE


DAÑO Y REPARACIÓN DEL DNA
EL DNA se puede modificar o dañar a través de procesos espontáneos o producidos
por agentes externos diversos.
Las bases modificadas pueden ser “mal-interpretadas” por los mecanismos de

replicación y alterar la preferencia de incorporación de nucleótidos.
Cuando una base modificada se incorpora, puede provocar la incorporación de un

nucleótido erróneo que se transmite. Este proceso se denomina FIJACIÓN y genera lo
que se denomina MUTACIÓN.
Para evitar mutaciones, la células cuenta con una buen número de mecanismos de
reparación del DNA compuesto por >200 genes. Cada tipo de mecanismos se encarga
de detector y reparar aletraciones específicas.
Sólo el daño en el DNA puede ser reparado. Las mutaciones NO pueden ser
reparadas. Una vez que la mutación se transmite a una células hija, los mecanismos de
reparación NO tienen capacidad de detectarla.

FUENTES DE DAÑO EN EL DNA
ESPONTÁNEA INDUCIDA
PUEDE LLEVAR A LA POLIMERASA A CREAR ERRORES

FUENTES DE DAÑO EN EL DNA Y TIPOS/DÍA
TIPO DE DAÑO

FUENTES DE DAÑO EN EL DNA Y TIPOS/DÍA
Agentes endógenos: 10,000 – 100,000 lesiones/día/célula
(Peterson, Genes Dev 2004; Garinis, Nat Cell Biol 2008)
Agente dañino
Tipo de daño
Mecanismo de reparación
Más difícil de reparar

MECANISMOS DE REPARACIÓN DEL DNA
CLASE 2.3
Tipo de daño Mecanismos de reparación
Bases alquiladas Direct reversal: O6-methylguanine-DNA-methyltransferase (MGMT)
MMR: Mismatch Repair

Bases discordantes
(Mismatches)
BER: Base Excision Repair
Aductos voluminosos
(Bulky adducts) NER: Nucleotide Excision Repair
Single Strand Break

(SSB) HR: Homologous Recombination
Double Strand Break

(DSB) NHEJ: Non-Homologous End Joining


Bases discordantes
(Mismatches)
Aductos voluminosos
Single Strand Break

Double Strand Break


DAMAGE DIRECT REVERSAL
Enzimas de-alquilantes: Retiran los grupos alkyl añadidos a las bases.
Retiran grupos metilo (CH3-) ó etilo (CH3-CH2- ).
(MGMT)
Weinberg Figure 12.6 The Biology of Cancer (Garland Science 2007)


Bases discordantes
(Mismatches)
Aductos voluminosos
Single Strand Break

Double Strand Break


MISMATCH REPAIR
Las bases no coincidentes se incorporan durante la replicación y son habitualmente
retiradas por las DNA polimerasas como parte de su actividad proof-reading, aunque
no siempre….
*
*
*
Martin et al. Nat Review Immunol
*: Frecuentemente mutadas en cancer de colon


Bases discordantes
(Mismatches)
Aductos voluminosos
Single Strand Break

Double Strand Break


BASE EXCISION REPAIR (BER)
Las bases no coincidentes se incorporan durante la replicación y son habitualmente
retiradas por las DNA polimerasas como parte de su actividad proof-reading, aunque
no siempre….
•Se reparan lesiones que NO producen grandes

alteraciones estructurales en el DNA.
•Algunas lesiones específicas son:
• Uracilo en el DNA:
Durante la replicación (dUMP) o
deaminación de citosina
• Metil-guanina
• Bases oxidadas
• Bases alkiladas
• Sitios sin base:
Por depurinación espóntánea.
• Nuestras células cuentan con multitude de enzimas

específicas para soluciuonar cada tipo de daño.
wikypedia

DNA-Glicosilasa
Se elimina el enlace N-glicosil y se libera la base
http://www.acsu.buffalo.edu/~kowalsk/dnarepair/ber.html
AP endonucleasa (Apurinica aPirimidinica)

Elimina el enlace fosfodiéster y genera una rotura “nick” en la hebra
de DNA
http://sciencepole.com/ap-endonuclease/
Deoxi ribosa fosfodiesterasa

Elimina el enlace fosfodiéster y genera una rotura “nick” en la hebra
de DNA que libera la deoxy-ribosa
Chapter 2: DNA transmission and repair
http://sciencepole.com/ap-endonuclease/
Chapter 2: DNA transmission and repair
DNA polimerasa beta


Bases discordantes
(Mismatches)
Aductos voluminosos
Single Strand Break

Double Strand Break


NUCLEOTIDE EXCISION REPAIR (NER)
•Repación de lesiones con alteraciones estructurales grandes en el DNA que
deforman su estructura.
• Normalmente estas lesiones etán producidas por agentes externos:
Dímeros de timina, producidas por

radiación UV.
Lesiones producidas por carcinogenos

como los hidrocarburos aromáticos
policiclicos.
Puentes y crosslinks intercatenarios en

el DNA como los producidos por el
Cisplatino.
• Produce SSBs (Single Strand Breaks) 24 nt antes y 5 nt después del daño. El hueco se
rellena por la polimerasas δ y ε.
• Este mecanismos está involucrado en la REPARACIÓN ACOPLADA A LA

TRANSCRIPCIÓN (TCR) Capítulo 2: Transmisión y reparación del DNA.
RPA: Single stranded DNA binding protein

TFHII: Co-transcription factor to initiate transcription
ERCC1: co-factor for endonuclease XPF

NUCLEOTIDE EXCISION REPAIR (NER). TRANSCRIPTION COUPLED REPAIR
DURANTE LA TRANSCRIPCIÓN ACTIVA DE UN GEN,

LA RNA POLIMERASA SE PARA AL ENCONTRARSE
UNA ALTERACIÓN EN EL DNA.
UNA RNA POLIMERASA PARADA RECLUTA CSB AND

CSA (COCKAYNE´S SYNDROME)
CSA AND CSB PUEDEN A SU VEZ RECLUTAR LAS

PROTEÍNAS DEL NER Y PROCEDER A ESCINDIR Y
REPARAR LA SECUENCIA DAÑADA.


Bases discordantes
(Mismatches)
Aductos voluminosos
Single Strand Break

(SSB)
HR: Homologous Recombination
Double Strand Break
(DSB)
NHEJ: Non-Homologous End Joining

ROTURAS DE LA DOBLE CADENA DE DNA
LA RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA: PAREAMIENTO DE SECUENCIAS
COMPLEMENTARIAS
• Reparación de roturas de doble cadena en el
DNA por recombinación homóloga entre
cromátidas hermanas.
• Por ello se reuiqre la existencia de otra

cromátida Hermana y solo puede ocurrir
después de la fase S del ciclo celular (G2-M).
• Está considerada como ERROR FREE.

LA RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA: PAREAMIENTO DE SECUENCIAS
COMPLEMENTARIAS
The Cell 8th ed.
• Reparación de roturas de doble cadena en el
DNA por recombinación homóloga entre
cromátidas hermanas.
• Por ello se reuiqre la existencia de otra

cromátida Hermana y solo puede ocurrir
después de la fase S del ciclo celular (G2-M).
• Está considerada como ERROR FREE.
Las nucleasas digieren en dirección 5´-3´

RecA (E. Coli) / Rad51 (Eucariotas) se
une a 3´ y cataliza el intercambio de
hebras.
BRCA2 contribuye a reclutar Rad51.
-Está delecionada en muchos
cánceres hereditarios (p.e.mama; A.
Jolie).
UNION DE EXTRAMOS NO HOMÓLOGOS (NEHJ)
1.Digestión de extremos de DNA para producir DNA de cadena simple (single
stranded DNA ó ssDNA).
2.Estos segmentos están parcialmente alineados por microhomologías.
3.Los huecos se rellenen por una polimerasa & ligasa (NO HAY SECUENCIA MOLDE).
4.Este mecanismo de reparación induce errores..
LAS PROTEÍNAS PARP Y LA REPACIÓN DEL DNA
Al unirse a SSBs, PARP-1 transfiere ADP-ribosil desde el NAD+ a proteínas aceptoras,
generando largas cadenas de polímeros ADP-ribosilados y reclutamiento de otras.
Mecanismo de letalidad sintética en tunores
deficientes en BRCA e inhibición de PARP.
Krishnansu S. Tewari et al. Clin Cancer Res 2015;21:3829-3835
BRCA1/2 MUTADO CÁNCER DE OVARIAN

BRCA1/2 MUTATED CÁNCER DE MAMA
(Triple Negativo?)
ALGUNOS TUMORES SÓLIDOS
Khanh Do, and Alice P. Chen Clin Cancer Res 2013;19:977-984
AVANZADOS
©2013 by American Association for Cancer Research
ALGUNAS ENFERMEDADES ASOCIADAS A DEFECTOS EN LA REPARACIÓN DEL
DNA
Bloom Syndrome
Xeroderma Pigmentosum (XP) Cockayne Syndrome (CS)

http://www.hxbenefit.com/bloom-syndrome.html
http://www.gfmer.ch/genetic_diseases_v2/gendis_detail_list.php?
offset=15&cat3=317 Werner Syndrome http://shsgdp.wikispaces.com/Cockayne+Syndrome+4
http://geneticdisease2.wikispaces.com/Werner+Syndrome
CAPÍTULO 2. RESUMEN I
REPLICACIÓN DEL DNA
• DURANTE LA FASE S. ES SEMI-CONSERVATIVA.
• SIEMPRE 5´- 3´.

LEADING STRAND SE REPLICA DIRECTAMENTE,
LAGGING STRAND SE REPLICA A TRAVÉS DE
PEQUEÑOS FRAGMENTOS DE RNA/DNA (OKAZAKI
FRAGMENTS)
• MULTIPLES PROTEINAS PARTICIPAN EN LA

REPLICACIÓN Y TIENEN ACTIVIDADES MUY
ESPECÍFICAS.
• MULTIPLES ORIGENSS DE REPLICACION EN

CÉLULAS EUCAROTAS/MAMÍFERO.
• LOS TELOMEROS AL EXTREMOS DE LOS

CROMOSOMAS MANTIENEN LA ESTABILIDAD.
CAPÍTULO 2. RESUMEN II
APLICACIONES IMPORTANTES
• DIAGNÓSTICO DEL DESARROLLO Y LA AGRESIIDAD

DEL CÁNCER.
• PCR (PROTEIN CHAIN REACTION): ES UNA

HERRAMIENTA FUNDAMENTAL PARA APLICACIONES
BIOMÉDICAS EN CLÍNICA E INVESTIGACIÓN.
• LA SECUENCIACIÓN SANGER: HA PERMITIDO LA

DETECCIÓN DE ALTERACIONES EN EL DNA QUE ESTÁN
INVOLUCRADOS EN ENFERMEDAD HUMANA Y PUEDEN
SER CLAVE EN EL MANEJO DEL PACIENTE.
• TERAPIA BASADA EN LA INHIBICIÓN DE MECANISMOS

INVOLUCRADOS EN LA REPLICACIÓN.
CAPÍTULO 2. RESUMEN III
REPARACIÓN DE DAÑO EN EL DNA
• PUEDE OCURRIR ESPÓNTÁNEAMENTE.
P.E. GRUPOS METILO- Ó ETILO QUE MODIFICAN LA
ESTRUCTURA DE NUCLEÓTIDOS
• UN NÚMERO REDUCIDO DE NUCLEÓTIDOS ERRÓNEOS

PUEDE SER CORREGIDO GRACIAS A LA ACTIVIDAD
PROOF-READING DE LAS DNA-POLIMERASAS.
apítulo 2: Transmisión y reparación del DNA.
• REMOVER BASES NITROGENADAS ALTERADAS Y

POSTERIORMENTE LA RIBOSA CORRESPONDIENTE DEL
ESQUELETO DE AZÚCARES DEL DNA
• REMOVER ESTRUCTURAS DE DNA COMO LOS

OLIGONUCLEOTIDOS DE LA HEBRA DE DNA DAÑADA
• REPARACIÓN DE ROTURAS DE LA DOBLE CADENA DEL

DNA (DOUBLE STRAND BREAKS) UTILIZANDO
RECOMBINACIÓN HOMÓLOGAS (SIN ERROR) Ó UNION
DE EXTREMOS NO HOMÓLOGOS (INDUCE MULTIPLES
VARIACIONES DE SECUENCIA)
CHAPTER 2: SOCRATIVE QUESTIONS
ROOM NUMBER: VQVDUSXD

Tema 2 Replicación y Reparación Del DNA

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Tema 2 Replicación y Reparación Del DNA

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Tema 2 Replicación y Reparación Del DNA

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

BIOLOGÍA MOLECULAR DE LA CÉLULA

José Pedro Vaqué, vaquej@unican.es

C. 1: Estructura del material

C. 1: Estructura del material

C. 2: Cómo la información genética

Capítulo 2: Transmisión y reparación del DNA.

Capítulo 2: Transmisión y reparación del DNA.

2.1- Replicación del DNA.

2.2- Orígenes de replicación.

2.3- Replicación de los telomeros.

2.4- Daño y repración del DNA.

Capítulo 2: Transmisión y reparación del DNA.

EUCROMATINA COMPACTACIÓN HETEROCROMATINA

• PARA MANTENER INFORMACIÓN GENÉTICA VITAL.

• PARA MANTENER ACTIVIDADES VITALES

• REDUCIR POTENTIALES ERRORES DE LA ACTIVIDAD DE LA POLIMERASA

• MINIMIZAR OTRAS ALTERACIONES GENÉTICAS POTENTCIALMENTE PELIGROSAS

• GARANTIZAR LA VIABILIDAD DEL ORGANISMO EN EL CONTEXTO DE LA EVOLUCIÓN

Una cromatida de cada cromosoma

S: Fase de síntesis de DNA

Dos cromátidas hermanas = cromosoma

Capítulo 2: Transmisión y reparación del DNA.

Capítulo 2: Transmisión y reparación del DNA.

• Las enzimas que sintetizan DNA se denominan DNA polimerasas:

 Polimerizan una hebra complementaria de DNA

 Sólo sintetizan DNA en dirección 5' → 3’ de la hebra molde.

 IMPORTANTE: Sólo pueden extender oligonucleotidos que ya se encuentran

Capítulo 2: Transmisión y reparación del DNA.

LAS DNA POLIMERASAS SÓLO SINTETIZAN DNA EN DIRECCIÓN 5' → 3'

Capítulo 2: Transmisión y reparación del DNA.

Molecular Biology of the Cell. e5. Garlan Science 2008

-LA HEBRA LÍDER (LEADING STRAND), SE SINTETIZA POR LA DNA POLIMERASA ε

-LA HEBRA RETRASADA (LAGGING STRAND) SE SINTETIZA DE LA FORMA SIGUIENTE:

LA PRIMASA SINTETIZA PEQUEÑOS POLÍMEROS DE RNA EN LA HEBRA

-LA RNAsa H Y LAS EXONUCLEASAS

LOS HUECOS SE RELLENAN GRACIAS A LA

UNA LIGASA DE DNA UNE LOS

Molecular Biology of the Cell. e5. Garlan Science 2008

Capítulo 2: Transmisión y reparación del DNA.

Capítulo 2: Transmisión y reparación del DNA.

La replicación del DNA es muy precisa, aunque las

Habitualmente: 1 error cada 107 -108 nucleótidos.

Este error tan bajo se debe a que la mayoría de las

En general las exonucleasas digieren el DNA desde los

La replicación del DNA es muy precisa, aunque las

Habitualmente: 1 error cada 107 -108 nucleótidos.

PROOF-READING DNA-REPAIR MECHANISMS

Este error tan bajo se debe a que la mayoría de las

En general las exonucleasas digieren el DNA desde los

Capítulo 2: Transmisión y reparación del DNA.

3. RNAsa H degrada el cebador de RNA y la

4. La DNA Ligasa Une

Mark's Basic Biomedical Chemistry.

Capítulo 2: Transmisión y reparación del DNA. Moodle: https://www.youtube.com/watch?v=-mtLXpgjHL0

Clamp o abrazadera (PCNA) y Clamp loader (RPC or RFC)

RPC or RFC en eukariotas reconoce la unión

PCNA forma un anillo alrededor de la hélice de

Capítulo 2: Transmisión y reparación del DNA.

-Las DNA helicasas Son enzimas que