Revista de la Universidad Industrial de

Santander. Salud
ISSN: 0121-0807
saluduis@uis.edu.co
Universidad Industrial de Santander
Colombia

Rodríguez Martínez, Raúl

Empleo de la técnica hibridación in situ fluorescente para visualizar microorganismos
Revista de la Universidad Industrial de Santander. Salud, vol. 43, núm. 3, septiembre-diciembre, 2011,
pp. 307-316
Universidad Industrial de Santander
Bucaramanga, Colombia

Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=343835703013

Cómo citar el artículo

Número completo
Sistema de Información Científica
Más información del artículo Red de Revistas Científicas de América Latina, el Caribe, España y Portugal
Página de la revista en redalyc.org Proyecto académico sin fines de lucro, desarrollado bajo la iniciativa de acceso abierto
Revisión de Tema

Empleo de la técnica hibridación

in situ fluorescente para
visualizar microorganismos
Use of fluorescence in situ hybridization
technique to visualize microorganisms

Raúl Rodríguez Martínez1

RESUMEN

La hibridación in situ fluorescente (FISH), es una técnica que emplea sondas de oligonucleótidos
marcadas con fluorocromos las cuales van dirigidas hacia secuencias específicas del ácido ribonucleico
ribosomal (ARNr), lo que permite la identificación rápida y específica de células microbianas ya sea que
estén como células individuales o se encuentren agrupadas en su ambiente natural. El conocimiento de
la composición y distribución de los microorganismos en los hábitats naturales, proporciona un soporte
sólido para comprender la interacción entre las diversas especies que componen el micro hábitat. El
objetivo de la revisión es presentar la forma como ha evolucionado la hibridación, el empleo del ARNr
como molécula diana, los tipos de marcaje, los marcadores fluorescentes empleados hoy en día, la
metodología, así como las mejoras que se le han hecho a la técnica FISH al emplearse en conjunto con
otras técnicas en la identificación microbiana. Salud UIS 2011; 43 (3): 307-316

Palabras claves: FISH, sonda de oligonucleotidos, ARNr, diagnóstico microbiano,

fluorocromo, hibridación

1. Grupo de Recursos Naturales. Facultad de Salud. Universidad de Pamplona, Norte de Santander, Colombia
Correspondencia: Raúl Rodríguez Martínez. Bacteriólogo y Laboratorista Clínico, MSc, PhD. Grupo de Recursos Naturales.
Docente de la Facultad de Salud. Universidad de Pamplona. Dirección: Pamplona (N.S) Ciudadela Universitaria, Km. 1 vía
Bucaramanga. Teléfono: 3186938622. Correo electrónico: rrodriguez@unipamplona.edu.co
Recibido: 22 de Agosto de 2011 Aprobado: 3 de Septiembre de 2011

307
rODRÍGUEZ R.

ABSTRACT

Fluorescence in situ hybridization (FISH), is a technique that uses oligonucleotides probes labeled with fluorochromes
which are directed to specific sequences of ribosomal ribonucleic acid (rRNA), this allows the rapid and specific
identification of microbial cells whether as individual cells or grouped cells in their natural environment. Knowledge
of the composition and distribution of microorganisms in natural habitats provides a solid support to understand
interaction between different species in the microhabitat. This review shows how hybridization has evolved, the use
of rRNA as target molecule, the type of labeling, the labeled uses today in fluorescent and the methodology, as well
as the improvements that have been made to the FISH technique when is used in conjunction with other techniques
in microbial identification. Salud UIS 2011; 43 (3): 307-316

Keywords: FISH, oligonucleotides, probes, rRNA, microbial diagnostic, fluorochromes, hybridization

INTRODUCCIÓN expresión de antígenos fenotípicos y así mismo, el

tamaño del anticuerpo puede limitar el acceso del
antígeno a los tejidos o biopelículas4,5.
Uno de los objetivos primordiales que se tienen
en cuenta al momento de realizar el diagnóstico En contraste con los métodos expuestos, la identificación
microbiano, es lograr la identificación en tiempos empleando la técnica de FISH combina la precisión
cortos y a la vez con gran precisión de los organismos de la genética molecular, con la información visual
que se encuentran presentes en su ambiente natural. Los de la microscopía, lo cual permite la identificación y
métodos tradicionales basados en el aislamiento del visualización de la célula microbiana individual dentro
microorganismo en medios de cultivo, muchas veces de su microhabitat natural o tejido en el que se encuentre
necesitan de periodos largos de incubación así como el presente6,7.
empleo de medios complejos y enriquecidos, sin que en
ocasiones reflejen la población exacta o la mezcla de las Es necesario destacar que la visión de la sistemática
comunidades bacterianas presentes en el microhabitat1,2. microbiana ha cambiado debido al análisis comparativo
de secuencias homólogas de ácidos nucleicos, en
El análisis microscópico usando tinciones como Gram especial de moléculas de ARN ribosomal (ARNr) y
o Ziehl Nelsen, tienen la ventaja de ser técnicas rápidas los genes que ellos codifican8. Desde su primera
y económicas, permiten la visualización directa y aplicación como “tinción filogenética” en 1989,
proporcionan características básicas de la bacteria al nombre que se dio a la técnica en la que se empleaba
proveer información de la estructura de la pared celular. la sonda de oligonucleótidos marcada con un reactivo
Sin embargo, debido a la escasa diferencia morfológica fluorescente y dirigida hacia la molécula de ARNr 16S,
que se presenta entre familias bacterianas, estos se ha constituido en una herramienta de uso común
métodos de coloración microbiológica no permiten para la identificación directa de células bacterianas
una adecuada identificación, además requieren que el individuales, independientemente de si puedan o no ser
microorganismo se pueda cultivar en el laboratorio. cultivadas9.

Con la llegada de técnicas moleculares como la Reacción Esta revisión se enfoca hacia los desarrollos
en Cadena de la Polimerasa (PCR) y sus diferentes metodológicos de FISH mostrando las diversas formas
variantes, se facilitó la detección rápida y sensible de que se marcan las sondas de ADN que van dirigidas
casi cualquier organismo independiente de si estos hacia una zona específica del ARNr, así mismo los tipos
pudieran ser o no cultivados. Aun así, estos métodos de fluorocromo existentes, los pasos a tener en cuenta al
no dan información acerca de la morfología, número, realizar la técnica de hibridación, y el empleo de FISH
distribución espacial o el microambiente en el que se junto con otras técnicas.
desarrolla el organismo3. Otro método de detección
ha sido mediante técnicas de inmunofluorescencia
que utilizan anticuerpos monoclonales específicos Bases moleculares de la hibridación
para cada especie. Sin embargo, esta técnica es difícil La hibridación se basa en la unión de dos cadenas
de implementar por las uniones inespecíficas que sencillas de ácidos nucléicos que da origen a estructuras
se presentan, a la vez que depende de la variación y de doble hebra, las cuales pueden ser híbridos ADN-

308
 Visualización de microorganismos por FISH

ADN, ARN-ARN (ambos homodúplex) ó ADN- Historia

ARN (heteroduplex). El apareamiento se da por la La hibridación in situ se desarrolló de manera
complementariedad de bases a través de los puentes de independiente por dos grupos de investigadores11,12.
hidrógeno que se forman entre adenina–timina (ADN) ADN o ARNr 28S marcados radiactivamente fueron
o uracilo (ARN) y citosina-guanina (ADN y ARN)10 hibridizados para preparaciones citológicas de oocitos
(Figura 1). de Xenopus y visualizados por micro-autoradiografía.
Esta técnica permitió que la secuencia de ácidos
nucleicos fueran detectados dentro de la célula sin
alterar la morfología celular o la integridad de sus
compartimentos. El uso de Hibridación in situ para
“contar e identificar organismos” fue propuesto por
Olsen13, y luego introducida a la bacteriología en el
año 1988 por el grupo de Giovannoni, quienes fueron
los primeros en utilizar sondas de oligonucleótidos
marcadas radiactivamente y dirigidas al ARNr, para la
detección microscópica de bacterias14.

Con el desarrollo de marcadores fluorescentes, los

marcadores radioactivos fueron sustituidos por
colorantes no isotópicos15. En 1989, DeLong y su equipo
de trabajo emplearon oligonucleótidos marcados con
fluorocromos para detectar células microbianas crecidas
Figura 1. Principios de la hibridación. El apareamiento de manera individual9. Comparada con las sondas
se puede presentar entre nucleótidos complementarios de radiactivas, las sondas fluorescentes son seguras, tienen
moléculas de ADN-ADN o como lo muestra la figura entre mayor resolución y no necesitan ningún paso adicional
cadenas ADN – ARN en la que A se aparea con U y G con C. para su detección. Además, las sondas fluorescentes se
pueden marcar con colorantes de diferente emisión de
En las técnicas de hibridación se parte de dos moléculas longitud de onda, permitiendo de esta manera detectar
de ácidos nucléicos: una homogénea de secuencia varios tipos de sondas en un mismo experimento16.
conocida que actúa como sonda y la otra heterogénea
de secuencia desconocida, la cual contiene la secuencia
ARN ribosomal como molécula diana para FISH
diana que se quiere detectar. Para visualizar si existe
hibridación una de las dos cadenas debe estar marcada. Las bacterias y arqueobacterias contienen ARNr de 5S,
Si se marca la sonda, la hibridación es estándar, pero si 16S y 23S, con tamaños de aproximadamente 120, 1500
lo está la molécula diana, la hibridación es reversa. y 3000 nucleótidos respectivamente. En microbiología
la molécula diana más usada para FISH es el ARNr 16S,
Los ácidos nucléicos de partida son de cadena sencilla, debido a que se puede encontrar en todos los organismos
pueden proceder de ADN clonado y fragmentado por vivos, es relativamente estable y presenta un elevado
enzimas de restricción, o mediante oligonucleótidos número de copias, generalmente algunos miles por
sintéticos. La hibridación puede producirse en medio célula y además contiene regiones tanto variables como
líquido o sobre un soporte sólido, como nitrocelulosa, muy conservadas17.
al que se encuentra unida una de las dos poblaciones de
ácidos nucléicos. Como se comentó antes, las técnicas El incremento de secuencias del gen ARNr 16S
de hibridación se utilizan a menudo para detectar una que aparecen en las bases de datos ha facilitado
molécula diana partiendo de una sonda complementaria la identificación por FISH de la mayoría de
a ella. A raíz de esto, muchas técnicas moleculares están microorganismos, especialmente cuando se quiere
basadas en la hibridación, entre ellas la PCR (reacción identificar poblaciones microbianas que no se pueden
en cadena de la polimersa) o las tecnologías Northern cultivar8-18. El alto número de copias del gen ARNr
Blot, Southern Blot, microarrays de ADN, screening de 16S en cada replicación y en células metabólicamente
genotecas o la hibridación in situ10. activas, ofrecen suficientes moléculas diana que
permiten visualizar células bacterianas individuales,
aun cuando se encuentren formando parte de una
asociación.

309
rODRÍGUEZ R.

Las bases de datos publicas incluyen la secuencia del

ARN 16S de la mayoría de las especies microbianas
cultivadas, así como de muchas secuencias aisladas
directamente del ambiente19,20. Las secuencias del gen
ribosómico se pueden consultar libremente en bases
especializadas, como por ejemplo la del laboratorio
europeo de biología molecular (EMBL), el RDP The
Ribosomal Database Project o el GenBank que es la
base de datos de secuencias nucleotídicas del NCBI.
Por otra parte, se han realizado trabajos los cuales
muestran la factibilidad y las limitaciones del análisis
comparativo de secuencias ARNr 16S y del diseño de
sondas del ARNr21, además del empleo de ARNr 23S22,23,
del uso del gen ribosómico 18S24,25 y recientemente del
ARNm, que también ha sido detectado exitosamente Figura 2. Marcaje de las sondas. a y b directo; c, d y e
por FISH26,27. indirecto usando digoxigenina (DIG), peroxidasa de rábano
(HRS) o amplificando la señal con tiramida (TSA).

Sondas y marcaje Marcadores fluorescentes

En la selección de sondas para FISH se debe El uso de fluorocromos de diferente longitud de onda
considerar la especificidad, la sensibilidad y la de excitación y máxima emisión permite la detección
facilidad para penetrar los tejidos. Una sonda típica de simultánea de dos o más microorganismos, para esto se
oligonucleótidos presenta entre 15-30 bases de longitud debe contar con un microscopio que permita observar
y se construye en un sintetizador automatizado. los diversos espectros de colores del FISH. El empleo
Un ejemplo es la sonda universal EUB 338, que es combinado de fluorocromos debe tener picos de emisión
específica para la mayoría de células del dominio en los que no se presente solapamiento de espectros
bacteria (5’-GCTGCCTCCCGTAGGAGT-3’)28. entre las sondas. Los marcadores que sean más foto-
estables se deben usar en muestras con baja cantidad de
Hay diferentes vías de marcaje (Figura 2). La sitios diana.
marcación directa con fluorescencia, es la más común y
también la vía más rápida, económica y fácil, ya que no Dentro de los marcadores más usados en FISH para
requiere ningún paso adicional para su detección luego estudios microbiológicos (Tabla 1), están los derivados
de la hibridación29. Una o más moléculas teñidas con de la fluoresceína, fluoresceína isotiocianato (FITC)
el compuesto fluorescente son unidas directamente al y 5-(6) carboxifluoresceina-N-hidroxisuccimida ester
oligonucleótido, tanto químicamente durante la síntesis (FluoX). De los derivados de la rodamina se encuentran
a través de uniones amino al extremo 5’ de la sonda la tetrametil rodamina isotiocianato (TRITC) y el rojo
(Figura 2a) o enzimáticamente usando transferasas Texas.
terminales que se unen al extremo 3’ del nucleótido
(Figura 2b)29. Entre los colorantes de cianina de amplia longitud de
onda están Cy5.5- Cy7, los cuales son excitados en la
En la detección indirecta, la sensibilidad de FISH región roja del espectro (675 nm) y emiten en el rojo
se incrementa al unir la sonda a moléculas como lejano (760 nm). Existen además fluoróforos de la
digoxigenina (DIG), la cual es luego detectada por un familia Alexa fluor y partículas de cristal nanométricas
anticuerpo fluorescente (Figura 2c)30. De igual manera, llamados “puntos cuánticos” que son ampliamente
el empleo de enzimas amplifican la señal y por ende la utilizados, estos fluoróforos permiten observar un brillo
sensibilidad del FISH. En este caso, los oligonucleótidos intenso y son más fotoestables33,34.
son marcados con peroxidasa de rábano picante (HRP)
que usa fluoresceína tiramida (TSA) como sustrato La selección de un sitio específico del gen ARNr, el
(Figura 2d). Probablemente la técnica más sensible diseño de la sonda así como el tipo de marcaje se debe
sea el uso combinado de sondas de polirribonucleotidos realizar con especial cuidado porque de esto depende
marcados con digoxigenina y TSA (Figura 2e), ya que en parte, la calidad de la hibridación y la visualización
se ha encontrado que la TSA incrementa entre 10-20 de las células. Generalmente las sondas son diseñadas
veces la intensidad de la señal31,32. empleando la información de la secuencia de las bases

310
 Visualización de microorganismos por FISH

Tabla 1. Propiedades de algunos fluorocromos utilizados para la detección de microorganismos por FISH.
Longitud de onda (nm)
Fluorocromo Color
Excitación Emisión
AMCA (7-amino-4-methylcoumarin-3-acetic acid) 351 450 Azul
FITC (Fluoresceína Isotiocianato) 492 528 Verde
FluoX 5-(-6-)carboxifluoresceina –N-hidroxisuccimida – ester 488 520 Verde
Tetrametil Rodamina Isotiocianato (TRITC) 557 576 Rojo
Rojo Texas 578 600 Rojo
Derivados de la Indocianina
Cy3 indocarbocyanine 550 570 Rojo/
Cy5.5 benzindodicarbocyanine 675 694 naranja
Cy7 indotricarbocyanine 743 767 Infrarojo
Alexa fluor 790 790 810 infrarojo

de datos mediante paquetes informáticos como el de la célula y protege al ARN de la degradación por
ARB35, o el sistema SILVA el cual da información ribonucleasas endógenas. La fijación puede emplear
actualizada de secuencias de ARNr de los dominios agentes precipitantes como etanol o metanol, agentes
Bacteria, Archaea y Eucaria20. que forman entrecruzamientos como paraformaldehído
4%, formaldehído 4%, o glutaraldehído 1%, o una
mezcla de ellos6,36. Se debe considerar que una buena
Aspectos metodológicos de FISH
fijación mantiene muy bien la morfología celular, pero
Un protocolo típico para FISH incluye 4 pasos: fijación el incremento en el entrecruzamiento puede disminuir
y permeabilización de la muestra, hibridación, lavado y la accesibilidad a la molécula diana.
la detección de las células marcadas mediante el uso del
microscopio de epifluorescencia o confocal (Figura 3). Las condiciones de fijación y permeabilización pueden
variar dependiendo del organismo y del tipo de muestra
o de tejido. Aunque la permeabilización es un paso
crucial para obtener resultados satisfactorios a veces
resulta difícil de optimizar y está sujeto al tipo de célula
microbiana o muestra donde se encuentre presente. En
general el empleo de formaldehído o paraformaldehido
entre un 3-4% (v/v) es suficiente para la mayoría de
bacterias Gram negativas. Para organismos Gram
positivos se recomienda el empleo de etanol (50%),
etanol-formalina (9:1 v/v), el tratamiento con calor28, o
el empleo de lisozima y/o lisostafina37.

Previo a la permeabilización, las muestras deben ser

Figura 3. Diagrama de Flujo de un típico procedimiento de puestas en láminas de vidrio, y con el fin de mantener
FISH. una adherencia adecuada y que no se desprendan
durante el procesamiento, se recomienda cubrir la
superficie con ciertos compuestos como gelatina,
Fijación y permeabilización Poly-L.lisina38 o hidruro de silicio (IV)29. Cuando se
Antes de la hibridación, el cultivo, la muestra o tejido trabaja con suspensión de células microbianas, una vez
que contiene microorganismos deben ser fijados fijadas y colocadas en la lámina de vidrio, se dejan secar
para estabilizar las macromoléculas y estructuras al ambiente y luego son deshidratadas en soluciones
del citoesqueleto, evitando así la lisis de las células crecientes de alcohol (50-70-96%) lo cual ayuda a
durante la hibridación. Además, este paso favorece la permeabilizar las células.
permeabilización de las membranas celulares lo cual
facilita la penetración de la sonda fluorescente dentro

311
rODRÍGUEZ R.

Al emplear FISH en cortes de tejidos, los pre- 0.72°C por porcentaje utilizado, así mismo, reduce el
tratamientos se aplican para incrementar el acceso de ruido de fondo en la hibridación. En la hibridación
la sonda al objetivo específico y disminuir las uniones de micro ARN (miARN) en vez de la formamida
a los sitios no específicos39. En cortes realizados en con el cual se presentan pérdidas de miARN, se ha
tejidos incluidos en parafina, primero se debe realizar utilizado el compuesto 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)
el procedimiento de des-parafinado empleando xileno y carbodiimida que inmoviliza las moléculas en su
alcohol40. Además, se puede realizar un pre-tratamiento extremo 5’ fosfato46.
empleando proteinasa K para tejidos con parafina o
para cortes en frío41, o cuando se trabaja con muestras
Lavado
ambientales, se puede utilizar la mezcla de de lisozima
y proteinasa K42. Pasado el tiempo de hibridación, las láminas son
lavadas con agua destilada para remover la sonda que
Se ha usado la técnica de FISH en tejidos que han no se unió. Si se requiere se puede realizar un lavado
sido incluidos en cierto tipo de resinas poliméricas pos-hibridación en condiciones astringentes, en este
en las cuales se obtiene una excelente conservación caso el tampón de lavado se debe preparar variando
histológica, así como una eficiente visualización de las la concentración de sales que de manera estándar
células sin que se requiera de ningún pre-tratamiento de contiene NaCl 5 M, Tris / HCl 1 M, EDTA 0.5 M (sólo
digestión43,44. si se ha usado formamida > 20% en la hibridación)
agua destilada y SDS al 10%47. Vale la pena señalar
que la astringencia en la solución de lavado se logra
Hibridación ajustando la concentración de NaCl, esto evita el uso de
La hibridación es la capacidad que tiene la sonda de cantidades excesivas de formamida.
ADN para aparearse, unirse y formar moléculas de
cadena doble. En este paso se requiere de un tampón de Si se utiliza el tampón de lavado, se adiciona un poco
hibridación el cual de manera estándar contiene NaCl 5 a la lámina con la muestra y la lámina se transfiere a
M, Tris / HCl 1 M, Formamida, agua destilada y SDS un tubo que también contiene tampón de lavado pero
al 10% 45. La muestra fijada se incuba en el tampón que precalentado (48°C) y se incuba durante 25 min a 48 °C
contiene la sonda marcada, sometida a calentamiento (en baño de maría). Finalmente las laminas portaobjetos
y cuando la temperatura alcanza el punto de fusión del son lavadas con agua destilada una vez más y secadas al
ácido nucléico, la sonda de oligonucleótidos de interés ambiente. Para evitar la pérdida de fluorescencia antes
la cual está marcada con un fluorocromo, se une a la de observar al microscopio se debe adicionar al montaje
secuencia escogida del ARNr. La temperatura varía compuestos “antifading” como el gelvatol o citifluor.
para los diferentes organismos, dependiendo sobre todo
del contenido en pares guanina-citosina, G-C, que son
Visualización
los que confieren mayor estabilidad a la molécula27.
El paso final de la hibridación in situ es la detección de la
En el procedimiento de FISH, la hibridación se sonda marcada que hibridó con las células. Se requiere
realiza en la oscuridad en una cámara húmeda, con de un microscopio de epifluorescencia equipado con
temperaturas entre 37ºC a 50ºC y con tiempos que diferentes filtros para los diversos espectros de color, en
oscilan entre 30 minutos y varias horas. La hibridación este caso se debe tener en cuenta el tipo de fluorocromo
se puede llevar a cabo bajo condiciones astringentes con el que fue marcada la sonda y de esta manera
para obtener un óptimo anillamiento, en este caso, emplear la longitud de onda adecuada que excitará el
el tampón de hibridación es precalentado y luego es fluorocromo y emitirá la fluorescencia.
aplicado a la muestra que contiene la sonda marcada.
El nivel de astringencia se puede ajustar variando tanto La tecnología de procesamiento digital de imágenes
la concentración de formamida o la temperatura de mejora la detección de la señal mediante la aplicación
hibridación45. de técnicas, que en últimas, busca procesar una imagen
con el fin de hacerla más adecuada para una determinada
La función que cumple la formamida es debilitar las aplicación o procesamiento posterior. El sistema más
uniones de hidrogeno de los duplex ADN-ADN y ADN- sensible utilizado en FISH es mediante el empleo de la
ARN, permitiendo de esta manera que se pueda bajar la cámara CCD (Charge Coupled Device), la cual detecta
temperatura de anillamiento al incrementar el nivel de fotones con una alta eficacia sobre rangos de amplio
astringencia29. La formamida reduce la Tm entre 0.6- espectro de longitud de onda y que además, mediante
un paquete informático apropiado para el análisis de
312
 Visualización de microorganismos por FISH

imágenes, permite la digitalización y manipulación de Con el fin de mejorar los métodos para detectar y
las mismas. caracterizar variantes de ARN in situ, se ha desarrollado
una técnica que combinan los PNA-FISH con la
Otro equipo usado para FISH es el microscopio láser transmisión de energía de resonancia (FRET) mediante
confocal (CLSM). Al restringir la señal a una sección microscopía confocal52. FRET permite investigar
fina de la muestra que se investiga, la fluorescencia las interacciones moleculares, las cuales dependen
desenfocada es removida, lo cual genera imágenes de la transferencia de energía de un fluoróforo a otro
mas definidas. El sistema es muy sensible y es de gran fluoróforo cuando dos moléculas se encuentran en
ayuda en muestras críticas donde se presenta una baja proximidad cercana. FRET basado en la hibridación
intensidad de la señal como muestras densas de cortes in situ fluorescente de PNA (FP-FISH) ofrece nuevas
de biopsias, tejidos lodos, o bio-películas, así mismo, herramientas que permiten la caracterización a nivel sub-
el CLSM ha permitido el recuento de microorganismos celular tanto de la ubicación o estructura isofórmica del
presentes en la muestra48,49. ARN, como de la amplia variedad de interacciones que
se presentan entre ARN-ARN que estén en distancias
muy cercanas.
Empleo de FISH con otras técnicas
A medida que se ha utilizado FISH en diversas áreas El empleo de FISH con la espectrofotometría de
del conocimiento, se han introducido otras técnicas que masa iónica (FISH- NanoSIMS), facilita el análisis
permiten trabajar con una mayor sensibilidad y a la vez metabólico de células individuales a partir de grupos
corregir inconvenientes que se presentan con el uso de filogenéticos microbianos53,54. La principal ventaja que
la técnica convencional. presenta esta técnica es la capacidad de correlacionar la
identidad filogenética del gen ARNr 16S con la función
Una de las dificultades del empleo de FISH se debe metabólica específica que tiene.
al bajo contenido del ARNr que puedan tener los
organismos, lo que conlleva a que se generen señales de
Por otra parte, con el advenimiento de las tecnologías
fluorescencia muy tenues que podrían no ser detectables
“omicas” los estudios apuntan al empleo de FISH
al enmascararse con la fluorescencia de fondo que
con la metagenómica, transcriptómica y proteómica.
presente la muestra. Esta limitación puede ser mejorada
Con la metagenómica se persigue obtener secuencias
por modificaciones del ensayo, mediante el empleo de
del genoma de los diferentes microorganismos que
CARD- FISH (catalyzed reporter deposition), la cual se
componen una comunidad, mediante la extracción y
basa en la deposición de un gran número de moléculas
análisis del ADN de forma global, lo que hace que en
marcadas con tiramina (componente fenólico) por
conjunto con FISH sea una herramienta útil para acceder
actividad de la peroxidasa la cual está acoplada a
a la elevada biodiversidad de las muestras ambientales,
la sonda de oligonucleótidos, lo que incrementa la
sensibilidad de la detección de las células hasta en 12 obviando las dificultades encontradas en el cultivo en
veces, en el caso de que exista un bajo número de copias laboratorio de determinados microorganismos55.
del ARNr36.

Así mismo, las sondas PNA (Peptide Nucleic Acid) se han CONCLUSIONES
introducido dentro de las técnicas de hibridación. Los
PNAs son análogos del ADN (pseudopéptidos) pero en
lugar del azúcar fosfato tienen un esqueleto de poliamida Es importante destacar que hoy en día los estudios
el cual no tiene carga. Comparado con las sondas tendientes a la identificación de nuevas especies
tradicionales de ADN, son estables a la degradación, microbianas están enfocados a conocer la composición
hibridan con las secuencias complementarias con una y distribución de los microorganismos que se encuentra
alta afinidad y mejoran la cinética de hibridación7,49. presentes en sus diferentes hábitats ya sean tejidos,
Usualmente las sondas de PNAs son mas cortas nódulos, suelo, etc. Gracias a técnicas de identificación
que los oligonucleótidos convencionales requeridos molecular como lo es la hibridación in situ que emplea
para uniones específicas. Debido a su esqueleto de marcadores genéticos y, de manera tradicional el
carga neutra, los PNAs difunden a través de paredes gen ribosómico 16S, ha permitido la localización y
celulares hidrofóbicas y se han utilizados para la exacta cuantificación de células microbianas sin importar el
cuantificación y la distribución espacial de cada una de lugar que se encuentren. Esto es posible debido a que el
las especies que se encuentran presentes en biopelículas alto número de copias del gen ARNr 16S que se obtiene
donde existe una comunidad polimicrobiana51. en cada replicación y en células metabólicamente

313
rODRÍGUEZ R.

activas, ofrecen suficientes moléculas diana que Biotechnol. 1985; 21: 125–128.
permiten visualizar bacterias de manera individual, aun 5. Betscheider D, Jose J. Nile blue A for staining
cuando se encuentren formando parte de una asociación. Escherichia coli in flow cytometer experiments.
Anal Biochem 2009; 384:194-196.
Mediante el uso de sondas específicas de especie, 6. Amann R, Fuchs BM. Single-cell identification in
se favorece la identificación de los diferentes microbial communities by improved fluorescence
microorganismos presentes en el complejo de in situ hybridization techniques. Nat Rev Microbiol
comunidades, lo cual proporciona un soporte sólido 2008; 6: 339-348.
que facilita entender la interacción que hay entre las 7. Cerqueira L, Azevedo NF, Almeida C, Jardim T,
diversas especies que componen el micro-hábitat. En Keevil CW, Vieira MJ. DNA mimics for the rapid
este contexto, la hibridación in situ fluorescente (FISH) identification of microorganisms by fluorescence
es considerada una poderosa herramienta para estudios in situ hybridization (FISH). Int J Mol Sci 2008;
filogenéticos, ecológicos, ambientales y de diagnóstico, 9:1944-1960.
debido que provee información acerca de la presencia, 8. Thiele S, Fuchs B, Amann R. Identification of
número, morfología y distribución espacial de las microorganisms using the ribosomal RNA approach
células microbianas, para lo cual la técnica FISH and fluorescence in situ hybridization. In Treatise on
también se ha valido del apoyo de otras tecnologías que water science. 2011, vol 3, Chap 3.08, Pag171-189.
han surgido y que le permite ser cada vez más selectiva Ed. Frimmel, F. and P. Wilderer. Elsevie, Kidlington,
eliminando los inconvenientes que surgen al aplicarla UK.
en diferentes muestras. 9. Delong EF, Wickham GS, Pace NR. Phylogenetic
stains: ribosomal RNA-based probes for the
identification of single microbial cells. Science
AGRADECIMIENTOS
1989; 243: 1360–1363.
A la Facultad de Salud de la Universidad de Pamplona, 10. Luque J, y Herráez Á. Texto ilustrado de Biología
Norte de Santander y al departamento de Microbiología Molecular e Ingeniería Genética. Ed. Elsevier, 2001.
de la Universidad de Salamanca, España, por todo el Tema 13, Pag. 163-169.
material bibliográfico aportado para la realización del 11. John H, Birnstiel M, Jones K. RNA:DNA hybrids at
artículo. the cytogenetical level. Nature 1969; 223: 582–587.
12. Pardue ML, Gall JG. Molecular hybridization
of radioactive DNA to the DNA of cytological
CONFLICTO DE INTERESES preparations. Proc. Natl. Acad. Sci 1969; 64:600–
Este trabajo no presenta ningún tipo de conflicto de 604.
intereses. 13. Olsen G, Lane DJ, Giovannoni SJ, Pace NR, Stahl
DA. Microbial ecology and evolution: a ribosomal
RNA approach. Annu Rev Microbiol 1986; 40:
REFERENCIAS 337-365.
14. Giovannoni SJ, Delong EF, Olsen GJ, Pace NR.
1. Amann RI, Fuchs BM, Behrens S. The identification
Phylogenetic group-specific oligo deoxynucleotide
of microorganisms by fluorescence in situ
probes for identification of single microbial cells. J
hybridisation. Curr Opin Biotechnol 2001; 12: 231-
Bacteriol 1988; 170: 720–726.
236.
15. Landegent JE, Jansen in de Wal N, Baan
2. Josephson KC, Gerba CP., Pepper IL. Cultural
RA, Hoeijmakers JH, Van Der Ploeg M.
methods. In: Raina MM, Ian LP, Charles PG, Eds.
2-Acetylaminofluorene-modified probes for the
Environmental Microbiology. San Diego California:
indirect hybridocytochemical detection of specific
Elsevier Academic Press, 2009. p.213-217
nucleic acid sequences. Exp Cell Res 1984; 153:
3. Girones R, Ferrús MA, Alonso JL, Rodriguez-
61–72.
Manzano J, Calgua B, Corrêa A, et al. Molecular
16. Pernthaler A, Amann R. Simultaneous fluorescence
detection of pathogens in water--the pros and cons
in situ hybridization of mRNA and rRNA in
of molecular techniques. Water Res 2010; 44: 4325-
environmental bacteria. Appl Environ Microbiol
4339.
2004; 70: 5426-5433.
4. Szwerinski H, Gaiser S, Bardtke D.
17. Woese CR. Bacterial evolution. Microbiol Rev
Immunofluorescence for the quantitative
1987; 51: 221–271.
determination of nitrifying bacteria: interference
18. Cole JR, Wang Q, Cardenas E, Fish J, Chai B,
of the test in biofilm reactors. Appl Microbiol
314
 Visualización de microorganismos por FISH

Farris RJ, et al. The Ribosomal Database Project: 112.

improved alignments and new tools for rRNA 30. Zarda B, Amann R, Wallner W, Schleifer
analysis. Nucleic Acids Res 2009; 37: 141-145. K H. Identification of single bacterial cells
19. Van De Peer Y, De Rijk P, Wuyts J, Winkelmans using digoxigenin-labelled, rRNA-targeted
T, De Wachter R. The European small subunit oligonucleotides. J Gen Microbiol 1991; 137: 2823–
ribosomal RNA database. Nucleic Acids Res 2000; 2830.
28: 175–176. 31. Schönhuber W, Fuchs B, Juretschko S, Amann R.
20. Pruesse E, Quast C, Knittel K, Fuchs B, Ludwig Improved sensitivity of whole-cell hybridization by
W, Peplies J, et al. SILVA: a comprehensive online the combination of horseradish peroxidase-labeled
resource for quality checked and aligned ribosomal oligonucleotides and tyramide signal amplification.
RNA sequence data compatible with ARB. Nuc Appl. Environ Microbiol 2007; 63: 3268-3273.
Acids Res. 2007;35(21):7188-7196 32. http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/
21. Hoshino T, Yilmaz LS, Noguera DR, Daims H, brands/Molecular-Probes/Key-Molecular -Probes-
Wagner M. Quantification of target molecules Products/Tyramide-Signaling-Amplification-TSA.
needed to detect microorganisms by fluorescence html
in situ hybridization (FISH) and catalyzed reporter 33. Berlier JE, Rothe A, Buller G, Bradford J, Gray
deposition-FISH. Appl Environ Microbiol 2008; 74: DR, Filanoski BJ, et al. Quantitative comparison
5068-5077 of long-wavelength Alexa Fluor dyes to Cy dyes:
22. Fernández J, Avendaño-Herrera R. Analysis of Fluorescence of the dyes and their bioconjugates. J
16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer Histochem Cytochem 2003; 51: 1699-1712.
of Vibrio anguillarum and Vibrio ordalii strains 34. Michalet X, Pinaud FF, Bentolila LA, Tsay JM,
isolated from fish. FEMS Microbiol Lett 2009; 299: Doose S, Li JJ, et al. Quantum dots for live cells, in
184-192. vivo imaging, and diagnostics. Science 2005; 307:
23. Splettstoesser WD, Seibold E, Zeman E, Trebesius 538-544.
K, Podbielski A. Rapid differentiation of 35. Wolfgang L, Oliver S, Ralf W, Lothar R, Harald M,
Francisella species and subspecies by fluorescent Yadhukumar, et al. ARB: a software environment
in situ hybridization targeting the 23S rRNA. BMC for sequence data. Nucleic Acids Research 2004;
Microbiol 2010; 10: 72-86. 32: 1363-1371.
24. Spear RN, Li S, Nordheim EV, Andrews JH. 36. Zwirglmaier K. Detection of prokaryotic cells with
Quantitative imaging and statistical analysis fluorescence in situ hybridization. Methods Mol
of fluorescence in situ hybridization (FISH) of Biol 2010; 659: 349-62.
Aureobasidium pullulans. J Microbiol 1999; 35: 37. Lawson TS, Connally RE, Iredell JR, Vemulpad
101–110. S, Piper JA. Detection of Staphylococcus aureus
25. Vaulot D, Eikrem W, Viprey M, Moreau H. The with a fluorescence in situ hybridization that does
diversity of small eukaryotic phytoplankton (< or not require lysostaphin. J Clin Lab Anal 2011; 25:
=3 microm) in marine ecosystems. FEMS Microbiol 142–147.
Rev 2008; 32: 795-820. 38. Lee N, Nielsen PH, Andreasen KH, Juretschko
26. Pilhofer M, Pavlekovic M, Lee NM, Ludwig W, S, Nielsen JL, Schleifer KH, et al. Combination
Schleifer KH. Fluorescence in situ hybridization for of fluorescent in situ hybridization and
intracellular localization of nifH mRNA. Syst Appl microautoradiography a new tool for structure–
Microbiol 2009; 32: 186-192. function analyses in microbial ecology. Appl
27. Pernthaler A. Identification of Environmental Environ Microbiol 1999; 65: 1289–1297.
Microorganisms by Fluorescence in situ 39. Gupta A, Mo YY. Detection of microRNAs
Hybridization. In: Timmis KN, McGenity T, in cultured cells and paraffin embedded tissue
Van der Meer JR, Lorenzo V, eds. Handbook of specimens by in situ hybridization. Methods Mol
Hydrocarbon and Lipid Microbiology. Berlin- Biol 2011; 676: 73-83.
Heidelberg: Springer, 2010. p. 4127-4135. 40. Summersgill BM, Shipley JM. Fluorescence in situ
28. Silverman AP, Kool ET. Oligonucleotide probes for hybridization analysis of formalin fixed paraffin
RNA-targeted fluorescence in situ hybridization. embedded tissues, including tissue microarrays.
Adv Clin Chem 2007; 43: 79-115. Methods Mol Biol 2010; 659: 51-70.
29. Moter A, Göbel UB. Fluorescence in situ 41. Loy JK, Dewhirst FE, Weber W, Frelier PF, Garbar
hybridization (FISH) for direct visualization of TR, Tasca SI, et al. Molecular phylogeny and in
microorganisms. J Microb Methods 2000; 41: 85- situ detection of the etiologic agent of necrotizing

315
rODRÍGUEZ R.

hepatopancreatitis in shrimp. Appl Environ accessibility. Appl Environ Microbiol 2010; 76:
Microbiol 1996; 62: 3439–3445. 922-926.
42. Rodríguez MR. Análisis de la población bacteriana 49. Trujillo ME, Alonso-Vega P, Rodríguez R, Carro L,
endófita presente en nódulos de Lupinus: interacción Cerda E, Alonso P, et al. The genus Micromonospora
y localización in situ. [Tesis de doctorado]. is widespread in legume root nodules: the example
Salamanca: Departamento de Microbiología y of Lupinus angustifolius. ISME J 2010; 4: 1265-
Genética. Universidad de Salamanca. España; 2008. 1281.
43. Sunde Pt, Olsen I, Gobel UB, Theegarten D, 50. Malic S, Hill KE, Hayes A, Percival SL, Thomas
Winter S, Debelian GJ, et al. Fluorescence in situ DW, Williams DW. Detection and identification of
hybridization (FISH) for direct visualization of specific bacteria in wound biofilms using peptide
bacteria in periapical lesions of asymptomatic root- nucleic acid fluorescent in situ hybridization (PNA
filled teeth. Microbiology 2003; 149: 1095-1102. FISH). Microbiology 2009; 155: 2603-2611.
44. Cappitelli F, Principi P, Pedrazzani R, Toniolo L, 51. Almeida C, Azevedo NF, Santos S, Keevil CW,
Solini C. Bacterial and fungal deterioration of the Vieira MJ. Discriminating multi-species populations
Milan Cathedral marble treated with protective in biofilms with peptide nucleic acid fluorescence in
synthetic resins, Sci Total Environ 2007; 385: 172- situ hybridization (PNA FISH). PLoS One 2011; 6:
181. e14786.
45. Fuchs BM, Pernthaler J, Amann R. Single cell 52. Blanco AM, Artero R. A practical approach to
identification by fluorescence in situ hybridization. FRET-based PNA fluorescence in situ hybridization.
In: Reddy CA, Beveridge TJ, Breznak J A, Marzluf Methods 2010; 52: 343-351.
G, Schmidt TM, Snyder LR, eds. Methods for 53. Behrens S, Lösekann T, Pett-Ridge J, Weber PK,
General and Molecular Microbiology. 3rd edition. Ng Wo, Stevenson Bs, et al. Linking microbial
Washington: ASM Press; 2007. p. 886-896. phylogeny to metabolic activity at the single-cell
46. Pena JT, Sohn-Lee C, Rouhanifard SH, Ludwig level by using enhanced element labeling-catalyzed
J, Hafner M, Mihailovic A, et al. miRNA in situ reporter deposition fluorescence in situ hybridization
hybridization in formaldehyde and EDC–fixed (EL-FISH) and NanoSIMS. Appl Environ Microbiol
tissues. Nature Methods 2009; 6: 139 – 141. 2008; 74: 3143–3150.
47. Alfreider A, Pernthaler J, Amann R, Sattler B, 54. Dekas AE, Orphan VJ. Identification of diazotrophic
Glockner F, Wille A, et al. Community analysis of microorganisms in marine sediment via fluorescence
the bacterial assemblages in the winter cover and in situ hybridization coupled to nanoscale secondary
pelagic layers of a high mountain lake by in situ ion mass spectrometry (FISH-NanoSIMS). Methods
hybridization. Appl Environ Microbiol 1996; 62: Enzymol 2011; 486: 281-305.
2138-2144. 55. Lin W, Jogler C, Schüler D, Pan Y. Metagenomic
48. Stoecker K, Dorninger C, Daims H, Wagner M. analysis reveals unexpected subgenomic diversity
Double labeling of oligonucleotide probes for of magnetotactic bacteria within the phylum
fluorescence in situ hybridization (DOPE-FISH) Nitrospirae. Appl Environ Microbiol 2011; 77: 323-
improves signal intensity and increases rRNA 326.

316