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    Levaduras Muertas, Determ. Con Objektträgermethode, 22.11.01

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    levadura cervecera

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    levadura cervecera

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    Levaduras muertas, determ. con Objektträgermethode, 22.11.01

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    DETERMINACIÓN DE % DE CÉLULAS DE LEVADURAS MUERTAS

    CON EL MÉTODO DE PORTAOBJETO

    (Traducción de mail recibido del Dr. Diethard Wagner, Weihenstephan, el


    08.11.01, relativo a ensayos con zaranda de levadura)
    La determinación del porcentaje de células de levadura muertas con el método de azul de
    metileno debe indicar, para el caso de levaduras de siembra saludable, 5 % como máximo. Al
    evaluar este método debe tenerse en cuenta que las levaduras vivas transforman el indicador
    azul de metileno en otro producto incoloro (leucomethylenblau). Pero eventualmente las células
    muertas poseen todavía el poder de reducción para decolorar el azul de metileno. Por lo tanto,
    la confiabilidad del método se vé reducida a medida que se incrementa el porcentaje de células
    muertas.

    Con el método de portaobjeto las células de levadura son llevadas a desarrollarse/procrearse.


    Por lo tanto, lo que se determina es el número real de células vivas (muertas). Luego de aprox.
    16 a 20 horas de incubación a 26 °C las células vivas se multiplican, mientras que las muertas
    permanecen como células individuales. Luego se cuenta el número de células con
    multiplicación y de células individuales sin crecimiento usando microscopio de campo oscuro y
    aumento de 640 x. Con estos datos se calcula el % de células vivas (muertas). El método de
    portaobjetos es más preciso, pero arroja resultados de viabilidad menores que el método de
    azul de metileno. Por ej. si con azul de metileno se determina 95 % de viabilidad, con el de
    portaobjeto se determinaría aprox. 85 – 90 %.

    Desarrollo del método


    Preparar un agar de mosto utilizando la mejor calidad disponible de agar granulado. El % de
    agar en el mosto es de 1,8 % (1 litro de mosto clarificado + 18 g de agar). Se deja humedecer
    el agar en el mosto durante 1 a 2 horas y luego se esteriliza con autoclave.

    A seguir se preparan los portaobjetos. Se colocan una serie de portaobjetos limpios sobre una
    superficie plana. Con una pipeta se vierte en el medio del portaobjeto una camada del agar
    líquido y caliente de 1 mm de espesor, del tamaño de una estampilla. Al verter se debe primero
    hacerlo en forma de rectángulo, para luego rellenar el interior del mismo en una única
    operación. Es importante que la camada de agar resultante quede lo más plana posible.

    Luego que el agar haya solidificado, se coloca cada portaobjeto en una cápsula de Petri en
    cuyo fondo se colocó primeramente un papel de filtro redondo. Antes de la incubación, el papel
    de filtro debe humedificarse para impedir que el agar se reseque y forme grietas.

    Luego se procede a preparar la levadura a ser investigada. Para ello se prepara una suspesión
    acuosa con la levadura (turbidez lechosa), la que se controla microscópicamente con aumento
    de 640 x. Se debe alcanzar 60 células de levadura por campo visual (60 * 106 cél./ml). De esta
    suspensión se coloca 1 ml en 29 ml de agua. De la dilución así preparada se coloca 1 gota
    sobre la camada de agar del portaobjto ya listo, y se cubre con una lámina.

    A seguir se incuban los portaobjetos. Nosotros incubamos a temperatura ambiente


    aproximadamente 20 horas. Si el tiempo de incubación es demasiado largo, las colonias se
    hacen demasiado grandes y crecen entremezclándose, impidiendo el recuento normal. Por el
    contrario, si ese tiempo fuese muy corto, se hallarán muy pocas células con crecimiento,
    falseando también el resultado. Como regla medimos 400 unidades en campo oscuro y 640 x.

    Nosotros en Weihenstephan utilizamos con buen éxito el método de portaobjetos para la


    determinación de la viabilidad de la levadura de siembra (además del método de azul de
    metileno) y muy especialmente para la determinación de la efectividad de desinfectantes. En
    términos generales el método de portaobjeto es más trabajoso que el de azul de metileno, pero
    también mucho más preciso.

    (D.C., 22.11.01)

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