UE1 : Biochimie Biologie molculaire

Chapitre 4 :

Maintenance et variations du matriel gntique

Professeur Jol LUNARDI
Anne universitaire 2010/2011 Universit Joseph Fourier de Grenoble - Tous droits rservs.

Chapitre 4. Maintenance et variations du matriel gntique I. Maintenance de lADN

1- Altration 2- Mcanismes de correction 3- Correction immdiate 4- Correction secondaire 5- Correction translsionnelle

II. Variations
1-Types de variations 2- Consquences des variations 3- Principaux polymorphismes

III. Recombinaisons
1- Modle procaryote 2- Recombinaison homologue des eucaryotes 3- Recombinaison homologue et rparation 4- Recombinaison intra-brin

IV. Transpositions
1- Transposition dADN 2- Rtrotransposition

I. Mcanismes de maintenance de l ADN I. Mcanismes de maintenance de

ractifs gnotoxiques accidents spontans

l ADN
DOMMAGES

erreurs de rplication

by-pass polymrases

dtection des dommages check-point du cycle cellulaire

mutations

systmes de rparation

maladies gntiques, cancers...

ADN rpar

apoptose

1. Altrations
physiques : chaleur, rayonnement cosmique, radioactivit, UV ...

UV dimre cyclobutane

UVB 280 300 320

UVA 340 360 380 Longueur donde (nm) 400

Visible 420 440

Absorption directe (dimres de pyrimidines)

Photosensibilisation / stress oxydant (bases oxydes, cassures)

 chimiques : - ractifs alkylants (EMS, dimthylnitrosamine) - ractifs pontants interbrins (psoralne, cis-platine) - molcules intercalantes - analogues de bases (5-bromouracile, 2-aminopurine.)

ADN

Benzo[a]pyrne

BPDE-10-N2-dG

 physiologiques : - erreurs de rplication - phnomne de tautomrisation - oxydation (ions superoxyde, 8-oxo guanine) - dsamination: (cytosine uracile; adnine - acidification cellulaire et dpurination

hypoxanthine)

Exemple : linflammation est lorigine despces ractives de loxygne et despces ractives du chlore et de lazote elles aussi lorigine de lsions de lADN
O HN NH

H N O

NH2 N O
dR

O
Cl

HN
N dR

N NO2 N N dR

H2N

8-oxo G

5-chloro C

8-nitro G

5 incorporation duracile
U X

site abasique
X

modification de base
X

coupure simple-brin

alkylation adduits volumineux

(CH3)n X

A A

T T

dimre de thymine

pontage intra-brin

X X

X X

pontage inter-brin

coupure double-brins

msappariement 5

Principaux types de lsions de lADN

2. Correction des dommages

2.1. prvention

2. Correction des dommages

- superoxyde dismutase, catalase, peroxydases O2-, H2O2, OH - antioxydants (NADPH, glutathion, vit E) oxydation - tampons physiologiques acidification

2.2. mcanismes de correction

correction immdiate

excision de base (BER)

excision de nuclotides (NER) +/- TCR

correction des msappariements

rparation des cassures

excision excision longue courte

(Transcription Coupled Repair)

lsions oxydatives adduits monofonctionnels

lsions UV adduits chimiques

rparation secondaire

5 incorporation duracile
U X

site abasique
X

BER

modification de base
X

coupure simple-brin

alkylation adduits volumineux

(CH3)n X

A A

T T

dimre de thymine

NER

pontage intra-brin

X X

X X

pontage inter-brin

HR/NHEJ
coupure double-brins

msappariement 5

MMR

Principaux types de lsions de lADN

3. correction immdiate
photolyases

Correction immdiate

rversion directe par des alkyltransfrases (ex: O6-mthylguanine- DNA mthyl transfrase = MGMT) activit 3-5 exonuclase des polymrases

erreurs dincorporations 1/104 pb vs 1/108 pb final

arrt de la polymrase activit 3-5 exonuclase

reprise de synthse 5- 3

4. correction secondaire
5
5 3

4.1. rparation par excision de bases (BER)

2.4. correction secondaire

1. reconnaissance
- excision de la base par une glycosylase spcifique: formation dun site AP (apurique/apyrimidique) - coupure du brin d ADN aprs reconnaissance du site AP par AP endonuclases

5
OH

5 3 5

3 5 5

2.a - rparation short patch : ADN pol , XRCC1 2.b - rparation long patch : exonuclases, ADN pol, PCNA, RF-C, FEN1 endonuclase 3. DNA ligase

5 3 5

5 3

4.2. rparation par excision de nuclotides (NER) Global Genome Repair (GGR)
1. phase de reconnaissance, douverture du double brin et dexcision par le complexe excinuclase : - activit endonuclase ATP dpendante - 16 protines chez lhomme (XPA--XPG, ERCC1---ERCC6, TFIIH)

2. synthse rparatrice et ligation (PCNA, DNA pol et , ligase)

tir de Friedberg EC, Nature Reviews Cancer, 2001

 Transcription Coupled Repair (TCR, rparation couple la transcription)

Machinerie de transcription

ARN

1.

phase de reconnaissance de la lsion situe sur le simple brin en cours de transcription par la machinerie de transcription

2.

formation du complexe de rparation coupl la transcription avec pause de la transcription

3.

rparation avec mise en uvre des facteurs protiques responsables du NER puis synthse rparatrice et ligation. reprise de la transcription

adapt de Friedberg EC, Nature Reviews Cancer, 2001

4.3. rparation des cassures double brin

Rparation des cassures double brin

Rparation des cassures double brin

raboutage double-brin

recombinaison homologue

Ku70, Ku80

DNA-PKcs Nbs1, Mre11, Rad50, XRCC4 ligase

NHEJ: non homologous end joining

Rparation des cassures double brin

raboutage double-brin

recombinaison homologue

Ku70, Ku80

DNA-PKcs Nbs1, Mre11, Rad50, XRCC4 ligase

4.4. correction des msappariements

3 3

Correction des msappariements G

T
ATP ADP

MSH2 3 MSH6/MSH3

G T G T G

3
ATP ADP

1. reconnaissance du msappariement par MSH2 et MSH6 ou MSH3

MLH1

PMS2

2. recrutement de MLH1 et PMS2 et ouverture du brin ls

T
3

Exo 1 RPA 3

3. dplacement du complexe et recrutement de lexonuclase 1 au niveau du site de coupure 4. digestion 3-5 par exo 1 et protection du simple brin par le facteur RPA

G G C

4. re-synthse du brin complmentaire par ADN pol en prsence des facteurs PCNA et RF-C puis finition par ADN ligase

Le mcanisme de correction des msappariements avait t initialement dcrit chez la bactrie ( MutS = dimre MSH2-MSH6 Mut L = MLH1-PMS2) puis dcouvert chez les eucaryotes et lhomme

5. Polymrases translsionnelles ou by pass polymrases

bypass polymrases

les dficits des systmes de rparation sont l origine de prdispositions +Les des systmes de rparation aux dficits cancers - mutation des gnes XP et sensibilit aux UV : xeroderma pigmentosum - dficit du NER : syndrome de Cockaine, trichiodystrophie - dficit des systmes de rparation des cassures: syndrome de Bloom, syndrome de cassure de Nijmegen - dficit des systmes de rparation des msappariements (gnes MLH1, MSH2, MSH6 ) : HNPCC - dficit des systmes de reconnaissance: - gne ATM & ataxie tlangiectasique - mutation du gne p53 & tumeurs multiples - dficit du contrle du cycle cellulaire : gnes BRCA1, BRCA2 & cancers du sein

La rparation de lADN : facteur de rsistance vis--vis de certains anticancreux

Une rparation trop importante peut diminuer lefficacit du traitement

tir de Neidle et coll, Nature Reviews Cancer, 2005

II. Variations de l ADN

1. Type de variants molculaires
modifications : - substitutions

Variations de l ADN

A ou G > T ou C = transversion A > G, C > T = transition - dltions : 1 plusieurs milliers de pb - insertions: 1 plusieurs milliers de pb

modifications entre 2 gnomes pris au hasard chez 2 individus non apparents soit 1 variation / 2000 pb soit 2 000 000 au total par gnome haplode
ex: mise en dfaut des systmes de sauvegarde :
mthylation ---T-C-G-T---A-G-C-ACH3 ---T-C-G-T---A-G-C-Adsamination ---T-T-G-T---A-A-C-A---T-C-G-T---A-G-C-A-

2. Consquence dune variation : mutation vs polymorphisme

la modification ne change pas le message exprim : allle polymorphe (polymorphisme) gne A gne B

la modification change le message exprim : allle mut (mutation)

3. Polymorphismes frquents

3.1. Les SNPs (pour Single Nucleotide Polymorphism) : variation d1 nuclotide ( 1 tous les 2-3000 pb ! ) 5--ATCGCTATC----TAGCGATAG--5 squence de rfrence ou --ATCGATATC----TAGCTATAG-squence polymorphe C > T

Consquence dune variation

La modification peut ventuellement altrer le site de reconnaissance dun enzyme de restriction : polymorphisme de restriction (voir chapitre 8) Si la prsence dun polymorphisme donn chez un individu se rvle sans consquence sur lexpression du message gntique, la prsence simultane de plusieurs polymorphismes particuliers peut dans certains cas saccompagner dune modification de lexpression gntique: on parlera alors de polymorphismes modificateurs

3.2. Les polymorphismes de rptitions de type microsatellites

Les polymorphismes de rptitions de type microsatellites allle 1a = 99 CA

53 53

5 ---ATCGTCACACACA--CACACACACTGGTCA-----TAGCAGTGTGTGT--GTGTGTGTGACCAGT---5

5 ---ATCGTCACACACA--CACACACACACACACTGGTCA-----TAGCAGTGTGTGT--GTGTGTGTGTGTGTGACCAGT---5

chr 1a chr 1b

allle 1b = 102 CA

- groupe des VNTR courts (Variable Number Tandem Repeats) - motifs de 2, 3 ou 4 nuclotides - nombreux ( > 50 000 dans le gnome humain) - le nombre de rptition varie suivant le microsatellite tudi - le nombre dallles est gnralement compris entre 2 et 10 - le nombre de rptitions ne varie gnralement pas lors de la transmission - les squences de part et dautre du microsatellite sont en principe identiques pour les diffrents allles dun microsatellite et permettent lanalyse du nombre de rptitions par amplification PCR et squenage (voit chapitre 8)

3.3. Les polymorphismes de rptitions de type minisatellites

Les polymorphismes de rptitions de type minisatellites (VNTR*) allle 7a = 3 rptitions

53 53
5 5

chr 7a chr 7b

5 5

allle 7b = 5 rptitions

- groupe des VNTR longs (Variable Number Tandem Repeats) - squences de 9 80 de paires de bases - un motif central rcurent riche en GC - le nombre de rptition varie suivant le mini satellite tudi - le nombre de rptitions ne varie gnralement pas lors de la transmission entre 2 gnrations - concentrs 90% chez lhomme au niveau des extrmits tlomriques et sub-tlomriques

Recombinaison gnrale : modle 1. Recombinaison gnrale : modle procaryote procaryote

A a
5 5 5 5

III. Recombinaison

B b

2 double brins (A-B et a-b) comportant dimportantes homologies de squence

5 5

5 5

fixation de Rec B,C,D

droulement du double brin puis coupure d1 brin et fixation de Rec A

A a

B b appariement entre simples brins en raison de lhomologie importante de squence

A a

B Recombinaison gnrale : modle structure en chi de Holliday b procaryote

A a

B b

rotation de 180 de A-B

B a
coupure dans le plan oblique

A b
coupure dans le plan horizontal

B A

a b
ADN recombin (a-B et A-b )

B a

A b
change partiel dune partie de simple brin

2. Modle eucaryote de recombinaison homologue lors de la mose

Chromosomes homologues apparis Intervention de protines spcifiques Coupure des 2 brins au niveau dun chromosome

Activit exonuclase

Double jonction de Holliday

Chez lhomme :

90%

10%

Recombinaison lors de la prophase meotique chez lhomme chr 1 paternel

Recombinaison lors de la prophase meotique chez lhomme
(2 chromatides surs)

chr 1 maternel
(2 chromatides surs)

crossing-over par recombinaison entre deux chromatides

divisions motiques I et II

formation de 4 gamtes

gamtes recombins

60 recombinaisons / meose pour les 2n chromosomes existence de points chauds de recombinaison distance gntique : f (nb de recombinaisons vs nb de moses)

 recombinaison quilibre et recombinaison non quilibre

Recombinaison quilibre et non- recombinaison quilibre : la quantit de matriel chang est la mme quilibre
5 --CATCTATGCGTACAAGTCTCCTA---GTAGATACGCATGTTCAGAGGAT-- 5 5 --CATCTATGCGTACAAGTCTCCTA---GTAGATACGCATGTTCAGAGGAT--5

x
1b 5 --CATCTATGCGTACAAGTCTCCTA---GTAGATACGCATGTTCAGAGGAT-- 5 5 --CATCTATGCGTACAAGTCTCCTA---GTAGATACGCATGTTCAGAGGAT-- 5

- recombinaison non-quilibre
1 2
5 --CATCTATGCGTACAAGTCTCCTA------------------CATCTATGCGTACAAGTCTCCTA-----GTAGATACGCATGTTCAGAGGAT------------------GTAGATACGCATGTTCAGAGGAT- 5

1b

2b

5 --CATCTATGCGTACAAGTCTCCTA---------------- --CATCTATGCGTACAAGTCTCCTA-----GTAGATACGCATGTTCAGAGGAT---------------- --GTAGATACGCATGTTCAGAGGAT- 5

Recombinaison entre la squence rpte 2 et 1b

5 --CATCTATGCGTACAAGTCTCCTA------------------CATCTATGCGTACAAGTCTCCTA---------CATCTATGCGTACAAGTCTCCTA-----GTAGATACGCATGTTCAGAGGAT------------------GTAGATACGCATGTTCAGAGGAT---------GTAGATACGCATGTTCAGAGGAT- 5 5 --CATCTATGCGTACAAGTCTCCTA-------------------------------GTAGATACGCATGTTCAGAGGAT------------------------------ 5

Une recombinaison non quilibre au niveau du gne du rcepteur des LDL est lorigine de certaines formes dhypercholestrolmie familiale :
1 8 9 18

Recombinaison illgitime non quilibre

1 2 18

prsence de squences alu dans introns 1 et 8

si une recombinaison survient entre la squence alu de lintron 8 et celle de lintron 1:

1 8 9 18

x
1 2 18

8 2

18

Rcepteur des LDL anormal

19 18

3. Recombinaison homologue et mcanismes de rparation

- cassures double brin, pontages inter brins - nombreux facteurs impliqus : Mre11, BRCA2, Dmc1, Rad 50,51,52,54, Hop2, Mnd1

rparation des lsions par recombinaison

recombinaison rparative post-rplicationnelle

4. Recombinaison sur le mme double brin dADN

squences similaires

 Une recombinaison spcialise est lorigine de la grande diversit des immunoglobulines ncessaire la reconnaissance des nombreux antignes auxquels est confront lorganisme

Recombinaison spcialise

rgion de reconnaissance de l antigne chane lgre

partie variable: V partie de jonction: J partie constante: C chane lourde

nombreux antignes

ncessit de nombreux anticorps

nombre de gnes ?

Exemple de la synthse des chanes lgres de type

Chr 2

40 squences V

5 squences J

1 squence C

chaine
V
23 12

rarrangement somatique dans les lymphocytes par recombinaison

ADN du lymphocyte 1 ADN du lymphocyte 18 nombreuses combinaisons possibles

chane lgre n 1 chane lgre n 18

IV. Transposition
lments mobiles de contrle chez le mas

Transposition

transposons procaryotes et rsistance aux antibiotiques

transposons des cellules eucaryotes - lments P - transposons dADN, rtrotransposons

1. Transposition dADN

< 2000 pb

squences cibles rptition directe Transposition dADN lments IS : squences inverses transposase

5--ATCGCATGCAT-----TAGCGTACGTA----

5--TACGTACATCG-----ATGCATGTAGC----

transposase gnes additionnels lments Tn IS transposons composites transposon type de transposition conservative rgion centrale (n gnes) IS

rplicative

2. Rtrotransposition

Rtrotransposition rtrotransposon
transcription
ARN

rverse transcription

ADNc

rintgration

copie de rtrotransposon

LTR

gag gag ?

pol pol

env

LTR

lments rpts de type LTR poly A LINE poly A SINE

Lactivation et la rtrotransposition dune squence de type rtrotransposon peut tre lorigine de mutations lorsque linsertion se fait dans un gne

Que faut il retenir Que faut il retenir a :

- retenir que le gnome est susceptible de variations en raison de modifications qui sont soit le rsultat dune agression par des processus physiques ou des agents chimiques, soit le fruit dvnements physiologiques de la cellule. - connatre lintrt de lactivit exonuclase des polymrases, connatre les diffrents mcanismes de rparation : il nest pas demand de savoir le nom des diffrentes protines impliques (ERCC1, XPA) mais plutt de savoir quelle peut tre la fonction dune glycosylase, dune nuclase (endo ou exo), dune ligase ou quelle est la squence des vnements des diffrents mcanismes (ex pour la BER: reconnaissance et excision de la base, synthse et rparation, ligation). - savoir quoi correspondent les termes SNP, polymorphisme microsatellite, polymorphisme minisatellite. - connatre le principe gnral de la recombinaison, savoir expliquer la diffrence entre recombinaison quilibre et recombinaison non-quilibre, savoir ce que signifie recombinaison homologue. - connatre le principe de la transposition et de la rtrotransposition, ce quest un lment IS, un lment Tn ou un transposon composite, connatre la diffrence entre transposition conservative et rplicative.
a

: les exemples numriques et de pathologies sont destins illustrer le cours et permettre une meilleure intgration des connaissances, de mme les dtails des squences ou des protines ainsi que les noms des mdicaments cits titre dexemples ne sont pas apprendre systmatiquement

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