Examen

bactériologique
des hémocultures
 Généralités

• Sang = milieu stérile

• Présence de
– Bactérie(s) = bactériémie
– Champignon(s) = fongémie
 Généralités
• Critères cliniques de gravité
Définitions des syndromes septiques selon la réunion d’experts de l’ACCP/SCCM
[Bone RC et al. Chest 1992 ; 101 : 1644]
Termes Critères de définition
Infection Invasion par des micro-organismes d’un tissu normalement stérile
Réponse Au moins 2 des 4 critères suivants :
systémique - température > 38°C ou < 36°C
inflammatoire - fréquence cardiaque > 90 batt/min
- fréquence respiratoire > 20/min ou PaCO2 < 32 mmHg
- leucocytes > 12 000/mm3 ou < 4 000/mm3
Sepsis Réponse systémique inflammatoire liée à une infection
Sepsis sévère Sepsis associé :
- à une hypotension (PA systolique < 90 mmHg ou < 40 mmHg à la PA
habituelle)
- ou à une hypoperfusion d’organes telle que :
- PaO2/FiO2 < 280 - oligurie (< 0,5 ml/kg/h)
- acidose lactique - altération des fonctions supérieures
Choc septique Sepsis sévère associé à une hypotension persistante (> 1 h) malgré un
remplissage vasculaire adéquat (> 500 ml) ou nécessitant l’administration de
médicaments vasoactifs.
Diagnostiquer une bactériémie
• Clinique
– Syndrome infectieux : fièvre, frissons, foyer
infectieux spécifique
– Signes de sepsis sévère ou de choc septique
– Facteur favorisant ?  Hépatopathie
• Immunodépression  Toxicomanie IV, alcoolisme
• Diabète  Matériel étranger et/ou prothétique
• Grossesse
– Porte d’entrée?
• Matériel étranger
• Existence d’un autre foyer infectieux

• Confirmation biologique : hémocultures

 Indications

• Toute fièvre d’origine indéterminée (>38,5°)

– Isolée (femme enceinte, immuno-déprimé)
– Associée à des signes cliniques évocateurs
d’infection, de sepsis sévère ou de choc
septique
– Associée à la présence d’un foyer infectieux
spécifique : pyélonéphrite, ….
 Objectifs
• Rechercher une cause bactérienne,
responsable de la clinique
– Isoler et identifier dans le sang la bactérie
responsable
– Antibiogramme si nécessaire

• Rechercher et préciser l’étiologie d’une

endocardite infectieuse

• Orienter la recherche d’un foyer infectieux

indéterminé
 Documenter l’implication d’un dispositif intra
vasculaire dans un état septique
 Démarche diagnostique
Prélèvement

Transport

Incubation

Détection de la croissance

Examen bactériologique

Rendu des
résultats
Prelevement sur 2 flacons
 Prélèvement : modalités

• Protocole validé par le CLIN : règles

d’hygiène et antisepsie rigoureuses

• But = éviter la contamination du

prélèvement, réduire les AES
 Conditions de prélèvement
• Porte de chambre fermée
• Port d’un masque chirurgical
• Lavage/désinfection des mains du préleveur
• Port de gants non stériles
• Désinfection de l’opercule des flacons et du
point de ponction avec un produit approprié
• Ne plus palper la veine après cette étape
• Prélever le sang en contrôlant le bon
remplissage des flacons
• Identifier correctement l’ensemble des
flacons
• Recommandé d’utiliser des antiseptiques
alcooliques
 Sites de prélèvement
Ponction veineuse
– Seule méthode valable pour prélever le sang en
vue d’une culture bactériologique
• Prélèvement via dispositif intra-vasculaire
(DIV)
– Présence fréquente de contaminants
– Seul intérêt = déterminer la responsabilité du
DIV dans une bactériémie
– Prélèvement simultané d’hémocultures sur DIV
et en périphérie = hémocultures appariées ou
quantitatives
 Moment du prélèvement
• Au pic fébrile
• À distance de l’administration
d’antibiotiques
– À la vallée
– Fenêtre thérapeutique de 48-72h
• Endocardite infectieuse
– Prélèvement de 3 hémocultures espacées d’1 heure minimum
avant toute prise d’ATB
 Volumes prélevés
• Importance +++ car corrélée au rendement
de la technique, donc à la sensibilité
– Adulte
• Densité bactérienne # 1 UFC/ mL sang
• Paires d’hémocultures : flacon aérobie +
anaérobie
• Volume optimal = 40 à 60 mL soit 2 à 3
paires d’hémocultures par 24 h (volume
minimal = 20 mL)
– Enfant
• Concentration bactérienne plus élevée,
diminuant avec l’âge
• 1 seul flacon pédiatrique
• Volume à adapter en fonction du poids
 Facteur de dilution
 But = diluer les substances inhibitrices présentes
dans le sang (complément, lysozyme, cellules
phagocytaires, antibiotiques)
– Ratio sang/bouillon
• Systèmes manuels : 1/5 à 1/10 (vol/vol)
• Systèmes automatisés : 1/2,5 à 1/5
– Intérêt des flacons pédiatriques (ratio sang-
bouillon adapté au volume de sang prélevé)
non démontré
 Nombre de prélèvements
• Intervalle entre 2 prélèvements
– Nul ou intervalle de quelques heures, à
chaque pic fébrile
– Pas d’influence sur les performances
diagnostiques

• Prélèvements multiples vs prélèvement

unique
– Même sensibilité
 Comparaison des protocoles de
prélèvement d’hémoculture
Prélèvts multiples Prélèvt unique
2 à 3 prélvts de 2 1 seul
flacons prélèvement de
4 à 6 flacons
Nb de prélèvts 2à3 1

Nb total de flac 4à6 4à6

mis en culture
Sensibilité La Sensibilité et la Détection des
bactériémies sont équivalentes lorsque
les prévts sont espacés dans le temps ou
réalisés simultanément
Taux de Modéré Faible (divisé par 2
contamination à 3)
 Comparaison des protocoles de prélèvement d’hémoculture
Prélvt multiples Prvt unique
2 à 3 prlvts de 2 flacons 1 seul prvt de 4 à 6
flacons
Interprétation Interprétation sur la Confrontation
du résultat base de l’espèce isolée, clinico-biologique
du nb de prvt positifs et Interprétation
de bactériémie liées à un inutile pour la
DIV plupart des
contextes cliniques
Avantages Plus simple (un
seul prélèvement)

Antibiothérapie
instaurée plus
rapidement
 Choix des conditions de culture
• Richesse du milieu liquide :
– Trypticase-soja, bouillon cœur-cervelle, peptones,
supplémentés en nutriments et facteurs de croissance,
milieux spécifiques levures

• Atmosphère aérobie (O2 et CO2) et anaérobie (CO2

et H2 ou N2)
  fréquence d’isolement des bactéries anaérobies strictes
Remise en cause du flacon anaérobie
MAIS : facilite la croissance de certains germes
(streptocoques, entérocoques,…)
Important dans les infections gynécologiques et
digestives
Choix des conditions de culture
• Anticoagulant : polyéthanol sulfonate de Na
(SPS)
0 Inhibe l’activité bactéricide du sérum, la phagocytose cellulaire,
l’activité du complément et du lysozyme
0 Inhibe l’activité de certains antibiotiques
0 MAIS risque d’inhibition de certaines souches de Neisseria,
Peptostreptococcus anaerobius, Capnocytophaga,
Gardnerella…

• Produits adsorbants
0 Résine adsorbante de cations ou charbon activé : effet
neutralisant des antibiotiques et des substances toxiques
0 ++ pour la détection de S. aureus et des Entérobactéries
0 MAIS pas pour les bactéries non fermentantes ni les levures
 Types de flacons disponibles
• Flacons pour systèmes manuels
– avec ou sans indicateur de croissance
– Systèmes biphasiques : milieu liquide +
gélose : observation d’un trouble ou de
colonies sur la gélose
– Système Isolator : bactéries
intracellulaires et mycobactéries, levures
et filamenteux.
Procédé hémoculture manuelle
1. Lyse des cellules sanguines (saponine),
2. Inhibition phagocytose et activité
bactéricide du Serum,
3. Centrifugation, mise en culture du culot

Intérêt : - concentration des bactéries dans le

lysat,
- performant
MAIS: Risque de contamination +++ et couteux
avec ou sans indicateur de
croissance
Systèmes biphasiques
Système Isolator
 Types de flacons disponibles
• Flacons pour systèmes automatisés
– Mise en évidence de la croissance bactérienne
grâce à un indicateur coloré

Flacons Bact Alert® Flacons Bactec®

 Transport
• Acheminement le plus rapidement
possible au laboratoire

• En cas de délai
– Incubation manuelle: à l’étuve à 35°C le plus
rapidement possible
– Incubation dans un automate: maintien à T°
ambiante avant l’introduction dans l’automate
 Incubation

• Incubation à l’étuve/dans un automate

• Durée d’incubation
– 7 jours à l’étuve ou 5 jours avec les systèmes
automatisés
– Bactéries détectées au-delà = souvent
contaminants
– Délai prolongé pour les microorganismes à
croissance lente (HACCEK, Brucella spp,
champignons…) n’est pas nécessaire avec les
automates
– Incubation à 35°C
 Détection de la croissance
bactérienne
Systèmes manuels

Flacons inspectés quotidiennement

0 Recherche d’un trouble provoqué par la
croissance bactérienne, de la production de
gaz, d’un coagulum…
0 Bactéries troublant peu le milieu le bouillon de
culture
 Brucella spp, Haemophilus spp, Neisseria spp, campylobacter spp
 Détection de la croissance
bactérienne
Systèmes automatisés à détection continue

 Amélioration de la détection de la croissance bactérienne : plus sensible

et plus rapide (agitation)
 lecture toutes les 10 min

 Principe = détecteur de CO2 au fond du flacon contenant un indicateur

de pH, séparé du bouillon par une membrane ½ perméable au CO2
0 CO2 =  pH (indicateur coloré) mesurée par réflectométrie (BacT ALERT)
ou fluorimétrie (Bactec)

 Flacons déclarés positifs selon un algorithme de

mesure: - concentration initiale en CO2
-- de la vitesse de production de CO2
- - de l’ de la vitesse de production de CO2
Détection de la croissance bactérienne

Bactec®

BacT ALERT ®
 Examen bactériologique
• ED : lame-lamelle + Gram
 Bactériémie: diagnostic d’urgence
– Appel des résultats des ED

• Milieux ensemencés au minimum:

– Milieux supplémentés en sang
– Atmosphères aérobie, anaérobie et sous CO2

• Adaptation selon le résultat de l’ED et le contexte clinique

• Recherches spécifiques
– Mycobactéries
– Micro-organismes non cultivables en flacon d’hémoculture
(Bartonella, Leptospira, Legionella, Coxiella)
– Levures et moisissures
 Levures et moisissures
• Hémoculture = examen clé dans le diagnostic des mycoses
invasives
• Responsabilités dans les infections nosocomiales et
communautaires de + en + démontrée
• Candida++
• Facteurs de risques : ID, utilisation d’AB à large spectre,
cathéter
• Les automates et l’optimisation des milieux de cultures
(flacon aérobie) ont amélioré la rapidité d’isolement des
champignon
• Paramètres de culture:
• T° optimale de culture : 37°C (levures) 27-30°C
(ch.filamenteux),
• Privilégier l’aérobiose
• Incubation 5-7jrs (levures), 3 à 6 semaines (ch.
dimorphiques)
 Interprétation
• Éléments pris en compte
– Critères de pathogénicité
– Nombre d’hémocultures positives
• Différentes situations en faveur d’une étiologie bactérienne
– Plusieurs hémocultures positives avec un même germe
– Plusieurs hémocultures positives avec germes
différents sur terrains particuliers : cirrhose hépatique,
foyer digestif ou cutané
– Dès la première hémoculture si bactérie pathogène
spécifique : S. aureus, S. pneumoniae, entérobactéries,
P. aeruginosa, Haemophilus spp, N. meningitidis,
Listeria, Campylobacter spp, HACCEK, levure, …
• Contamination probable si une seule hémoculture avec
bactérie de la flore cutanéo-muqueuse (SCN,
Corynebacterium spp, Bacillus spp, P. acnes)
 Fréquence des espèces
bactériennes et signification clinique
• Espèces les plus fréquemment isolées
– SCN (majo = contaminants, 10-30% ont une
signification clinique)
– Staphylococcus aureus
– Escherichia coli

• Espèces en augmentation
– Enterococcus spp
– Levures

• Espèces anaérobies: très faible (<3%)

Nature des bactéries identifiées et
signification clinique
1. Germes quasiment tjs pathogènes
– S. aureus, E. coli, Entérobactéries, P. aeruginosa, C.
albicans

2. Germes fréquemment contaminants

– Bacillus spp, Corynebacterium spp, Propionibacterium
spp

3. Germes interprétation difficile

– S. viridans, Enterococcus spp, SCN
– Isolement d’une de ces espèces → rechercher l’absence
de DIV compatible avec une endocardite infectieuse avant
de conclure à un contaminant
 Signification de positivité d’un ou plusieurs flacons
Nature du µ- Nb de Nb total Renseignements Conduite à
organisme flacons d’hémoc cliniques tenir
isolé ou positifs réalisées
identifié
Pas d’orientation Conta
clinique probable
Service Ident + ATB
d’oncohémato, réa, avec la
SCN 1 ou 2 ≥2 cathéter central, mention « à
d’une infection associée interpréter en
même paire aux soins fonction de la
clinique et du
prélèvement
P. acnes,
S. 1 Quel que soit le Ident + ATB
« viridans » contexte avec la
Bacillus spp mention « à
interpréter en
fonction de la
clinique et du
prélèvement

2 ou 3 de ≥2 Quel que soit le Ident + ATB

 Signification de positivité d’un ou plusieurs flacons
Nature du µ- Nb de Nb total Renseignements Conduite à
organisme isolé flacons d’hémoc cliniques tenir
ou identifié positifs réalisées
S. aureus
S.pneumoniae
Strepto β-
hémolytique
Enterococcus
spp
Entérobactéries
P. aeruginosa ≥1 Quel que Quel que soit le Ident + ATB
C.albicans soit le contexte sans
Anaérobies nombre restriction
N.meningitidis total
Haemophilus spp
HACCEK
Brucella spp
Pasteurella spp
Campylobacter
spp
 Cas particuliers
• Hémocultures polymicrobiennes
– 10% des hémocultures pédiatriques
– 30% des hémoc chez immuno-déprimés
– Interprétation: toutes les espèces ont le même potentiel infectieux

• Faux positifs
– Grande quantité de leucocytes
– Flacons trop remplis
– Flacons oxygénés

• Faux négatifs
– Délai avant l’introduction dans le Bact-Alert
 Interprétation des hémocultures
appariées

Concept :
concentration bactérienne concentration bactérienne
dans sang prélevé sur DIV > dans sang prélevé en
périphérie

Signe la responsabilité
du DIV dans la
bactériémie
2 approches
Qualitative : délai différentiel de pousse (>2h)
Quantitative
 Hémocultures appariées
quantitatives
• Modalités
– Prélèvement sur 2 tubes Isolator® pédiatrique de
1,5mL de sang

Kit de prélèvement CHLS

– Ensemencement immédiat : Gélose Sang pur et Gélose

Sang après dilution au 1/10 en bouillon
 Hémocultures appariées
quantitatives
• Interprétation : lecture à 24, 48 et 72h
– Objectifs : comparer les dénombrements des µ-org isolés dans les
tubes « cathéter » et « veineux »

– Si plusieurs espèces bactériennes : dénombrement, identification

et ATB pour chaque espèce

– Détermination d’une différence significative

• Abaque si <55 UFC/mL
• Si > 55UFC/mL : différence significative si le nb d’UFC/mL d’un des
tubes est > à 3 fois celui de l’autre
Hémocultures appariées quantitatives

• Réponses :

 Nb UFC/mL « cathéter » > nb

UFC/mL « veineux » = cathéter sans doute
à l’origine de la bactériémie

 Nb UFC/mL « veineux » > nb

UFC/mL « cathéter » = cathéter à priori
non responsable de la bactériémie

 Nb UFC/mL « cathéter » > nb

UFC/mL « veineux » stérile = cathéter
colonisé
 Conclusion

• Adéquation avec les recommandations du Remic

– Oui pour les milieux de culture
– Variable pour les atmosphères d’incubation
• incubation sous CO2 et anaérobie
• incubation anaérobie fonction du type de flacon
• incubation sous CO2 et anaérobie fonction du résultat de l’ED

• Conduite de l’examen bactériologique différente

– place importante de l’ED
– procédure d’ensemencement systématique,
complétée selon l’ED

• Identification et antibiogramme