UFRRJ

INSTITUTO DE TECNOLOGIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E
TECNOLOGIA DE ALIMENTOS

TESE

DESENVOLVIMENTO E APLICAÇÃO DO TESTE DESAFIO EM

REFRIGERANTE DE LARANJA ADICIONADO DE CONCENTRADO
DE CENOURA E MAÇÃ

DENISE ROSANE PERDOMO AZEREDO

2016
664.0287
A993d Azeredo, Denise Rosane Perdomo, 1969-
T Desenvolvimento e aplicação do teste
desafio em refrigerante de laranja adicionado
de concentrado de cenoura e maçã / Denise
Rosane Perdomo Azeredo – 2016.
113 f.: il.

Orientador: Adriano Gomes Cruz.

Tese (doutorado) – Universidade Federal
Rural do Rio de Janeiro, Curso de Pós-
Graduação em Ciência e Tecnologia de
Alimentos.
Bibliografia: f. 99-113.

1. Alimentos – Aditivos – Teses. 2.

Alimentos – Conservadores – Teses. 3.
Alimentos – Microbiologia – Teses. 4.
Refrigerantes – Teses. 5. Corantes – Teses.
6. Microbiologia – Teses. I. Cruz, Adriano
Gomes, 19-. II. Universidade Federal Rural do
Rio de Janeiro. Curso de Pós-Graduação em
Ciência e Tecnologia de Alimentos. III.
Título.

I
II
 UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE TECNOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA
DE ALIMENTOS

DESENVOLVIMENTO E APLICAÇÃO DO TESTE DESAFIO EM REFRIGERANTE

DE LARANJA ADICIONADO DE CONCENTRADO DE CENOURA E MAÇÃ.

DENISE ROSANE PERDOMO AZEREDO

Sob a Orientação do Professor

DSc. Adriano Gomes Cruz
DSc. Armando Ubirajara de Oliveira Sabaa Srur
In memorian

e Co-Orientador
PhD. Anderson de Souza Sant’Anna

Tese submetida como requisito parcial

para obtenção do grau de Doutor no
Programa de Pós-Graduação em Ciência
e Tecnologia de Alimentos, Área de
Concentração em Ciência de Alimentos.

Seropédica, RJ
Agosto de 2016.

III
 AGRADECIMENTOS

À Deus, Pai, infinito em bondade e misericórdia. Senhor da Vida, que me sustenta a cada dia
com saúde, coragem e força, agradeço por me presentear com uma família amorosa e amigos
verdadeiros.

À Jesus, nosso amigo, mestre, companheiro incondicional de todas as horas. À querida irmã
Maria Angélica, pela possibilidade do trabalho renovador.

À Lucimar, que muito me auxiliou e que sempre me deu forças para seguir....

A querida amiga Judy, que não mediu esforços para me ajudar! Amiga de longa
caminhada....parte do que sou como profissional devo a você!!!

Ao querido orientador Sabaa, que soube compreender, com muito carinho, a minha vida
multidisciplinar: professora, orientadora, mãe, esposa, filha, dona de casa, aluna de doutorado...e
que confiou em mim, dando-me oportunidade de fazer a primeira disciplina do doutorado, PCA,
ministrada por ele, como ouvinte. Continuo em prece por ele, porque acredito que os laços
fraternos se estendem para sempre.

Ao querido amigo e co-orientador Anderson, de quem muito me orgulho, por toda a ajuda, pela
resposta aos e-mails na madrugada, pelo acolhimento, pelos congressos e cursos que me
oportunizou.

Ao querido amigo Adriano pela resposta aos e-mails na madrugada, pelo incentivo e pela
disponibilidade em me auxiliar sempre.

À querida amiga Andréa Mello, companheira desde o mestrado, que sempre me deu forças para
continuar nesta longa caminhada e dividiu comigo as preocupações de mãe, filha e aluna de
doutorado.

Aos professores (as) da instituição que pelas aulas ministradas muito contribuíram para a minha
formação, em especial ao Sabaa, Cristiane Hess, Kátia Tabai, Stella Reis, Luís Otávio e a
Verônica Lobato.

A equipe de professores do curso de Alimentos do IFRJ- Campus Rio de Janeiro pelo incentivo
e compreensão das ausências nas reuniões, em especial a Lourdes Maria Pêssoa Masson e ao
coordenador José Ricardo Hassel Lopes que me auxiliou sempre que percebeu que a minha carga
horária estava muito alta! Aos Professores Fábio M. Costa e Janaína Nascimento.

Aos técnicos das indústrias que me possibilitaram o desenvolvimento e produção das

formulações: Hélio, Mariana, Edmilson, Rogério, Dona Ruth e Sérgio Becker. Ao Mário Slikita
pela doação do ingrediente natural. Sem vocês eu não teria conseguido!

IV
DEDICATÓRIA

Ao meu querido e amado esposo, as

minhas filhas e aos meus pais, pelo
incentivo nas horas difíceis, pelo auxílio
constante e pela compreensão das
ausências.

V
.....Estamos sempre, face à face, com a banca
examinadora do mundo, pois onde formos aí seremos
convocados à confissão de nossa Fé e valor moral. O
minuto que se esvai é a nossa oportunidade valiosa; o
lugar onde estamos é o anfiteatro de nossas lições
contínuas.
Por isso, caminhar sem Jesus nos domínios humanos, é
sentir que a água não dessedenta, o alimento não sacia,
a melodia não eleva, a página não edifica, a flor não
perfuma, a luz não aquece. Entretanto, amparados no
Cristo, todos somos autossuficientes, porquanto
dispomos de apoio, esclarecimento e fortaleza em
qualquer transe aflitivo com que a vida nos surpreenda.
CAÍRBAR SCHUTEL
(mensagem: Nas culminâncias da luta, do livro Ideal
Espírita – Psicografia de Francisco C. Xavier).

VI
RESUMO

AZEREDO, Denise Rosane Perdomo. Desenvolvimento e aplicação do teste desafio em

refrigerante de laranja adicionado de concentrado de cenoura e maçã. 2016. 113p. Tese
(Doutorado em Ciência e Tecnologia de Alimentos) - Instituto de Tecnologia, Universidade
Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ. 2016.

Atualmente o consumidor anseia por alimentos mais naturais, saudáveis, que promovam
benefícios à saúde e que sejam isentos de aditivos. Nesse sentido, a composição química dos
refrigerantes, especialmente no que concerne aos corantes artificiais e conservadores pode
representar riscos à saúde do consumidor, devido a possibilidade de formação de benzeno,
reconhecido agente carcinogênico ao homem, e a associação entre corantes artificiais, reações
alérgicas e efeitos deletérios ao DNA. Nessa pesquisa, inicialmente, desenvolveu-se uma
formulação de refrigerante de laranja, contendo os conservadores benzoato de sódio e sorbato de
potássio, na qual os corantes artificiais – amarelo tartrazina e amarelo crepúsculo foram
substituídos por concentrado de cenoura e maçã. Em paralelo, desenvolveu-se uma formulação
controle. Foram realizadas análises físico-químicas, microbiológicas e sensorial das formulações
durante o período de armazenamento de 150 dias. Observou-se o atendimento ao padrão de
identidade e qualidade e estabilidade das formulações em relação aos parâmetros físico-
químicos. Entretanto, na análise colorimétrica observou-se uma degradação de cor perceptível
ao consumidor na amostra contendo o concentrado de cenoura e maçã. Em relação as análises
microbiológicas, ambas as formulações atenderam aos parâmetros preconizados pela legislação.
Entretanto, a contagem de bolores e leveduras apresentou crescimento de 1 ciclo log na
formulação contendo o concentrado de cenoura e maçã, sugerindo que a robustez da matriz
desenvolvida pode ser afetada, se as condições de higienização da linha de processamento não
forem observadas. Em relação a análise sensorial, verificou-se que a cor foi a característica
sensorial que mais influenciou os consumidores com relação a aceitabilidade das amostras,
sinalizando que esse parâmetro interferiu, de forma significativa na avaliação do sabor e
aparência. Os resultados referentes a aplicação do teste desafio e a determinação do potencial de
multiplicação microbiana (δ) indicaram que as leveduras e bactérias lácticas são capazes de se
multiplicar na formulação adicionada de concentrada de cenoura e maçã sem conservadores (δ ≥
0,5 log10), sinalizando que a formulação é sensível. As bactérias acéticas, nessas condições,
foram inibidas. Nas formulações preservadas quimicamente com adição de concentrado de
cenoura e maçã e a adicionada de corantes artificiais, os resultados referentes ao potencial de
multiplicação microbiana (δ) indicaram que as leveduras e bactérias lácticas foram inibidas (δ ≤
0,5 log10) em ambas as formulações. Entretanto, as leveduras resistentes a conservadores
apresentaram habilidade de crescimento (δ ≥ 0,5 log10). No ingrediente concentrado de cenoura
e maçã, observou-se que as leveduras, bactérias lácticas e o fungo Penicillium citrinum foram
inibidos, indicando que o concentrado não deve ser considerado uma fonte de nutriente para a
multiplicação microbiana que afetaria a robustez da formulação. Constatou-se a multiplicação
das leveduras resistentes a conservadores, com potencial de multiplicação δ ≥ 0,5 log10 em todas
as formulações e ingrediente avaliados. Os dados obtidos no presente estudo sinalizam que o
desenvolvimento de alimentos mais naturais ainda representa um desafio para a indústria de
alimentos.

Palavras-chave: corantes naturais, aditivos alimentares, bebidas carbonatadas, potencial de

multiplicação microbiana (δ), microbiologia.

VII
 ABSTRACT

AZEREDO, Denise Rosane Perdomo. Development and application of microbiological

challenge test (MCT) in orange soda added with carrot and apple concentrate. 113p. 2016.p.
Thesis (Doctoral Program in Food Science and Technology) – Institute of Technology,
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ. 2016.

Nowadays consumer desired healthy foods that promote benefits and free from food additives.
The chemical composition of soft drinks, artificial colors and preservative, may pose a risk to
consumer health due to the possibility of benzene formation, a recognized carcinogenic agent in
humans and the association between artificial colors, allergic reactions and DNA damage. In this
study, an orange soda formula containing the preservatives sodium benzoate and potassium
sorbate with carrot and apple concentrate was developed. In parallel, we developed a standard
formula containing tartrazine and sunset yellow. Physicochemical, microbiological and sensory
analysis of formulas were carried out during the storage period of 150 days. It was observed that
there were no changes in physicochemical parameters. However, the colorimetric analysis
revealed a short shelf life in the sample containing the carrot and apple concentrate. Regarding
microbiology, both formulations were according to regulation by public health agencies. The
yeasts and molds counts presented 1 log cycle growth in the formula containing the carrot and
apple concentrate, suggesting that the robustness of the developed matrix may be affected, if the
hygiene conditions of processing line sanitation are not observed. It was found that the color was
the sensory characteristic that most influenced consumers regarding the acceptability of the
samples, signaling that this parameter interfered significantly in evaluating flavor and appearance
The results obtained by microbiological challenge test and determination of growth potential (δ)
indicated that yeast and lactic acid bacteria are able to multiply in the formula containing carrot
and apple concentrate without preservatives (δ ≥ 0.5 log10), indicating that the formula is
sensitive. Acid acetic bacteria, in these conditions, were inhibited. A preserved formula with the
addition of carrot and apple concentrate and other formula with the addition of artificial colors
were prepared. The results referring to the growth potential (δ) indicated that yeast and lactic
acid bacteria were inhibited (δ ≤ 0.5 log10) in both formulas. However, the preservative resistant
yeasts presented growth ability (δ ≥ 0.5 log10). In the apple and carrot concentrate, it was
observed that yeast, lactic acid bacteria and fungus Penicillium citrinum were inhibited,
indicating that this ingredient should not be considered a nutrient source for microbial
multiplication that would affect the formula robustness. It was verified the growth of the
preservative resistant yeasts (growth potential δ ≥ 0,5 log10) in all the evaluated formulas and
ingredient. The data obtained, in this study, indicate that the development of more natural foods
still represents a challenge for the food industry.

Key words: food colouring stuffs, food additives, carbonated soft drinks, growth potential (δ),
microbiology.

VIII
 LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Volume de produção do mercado de bebidas não alcóolicas em 2014 07

Figura 2 – Participação de mercado dos produtores brasileiros de refrigerantes 08
Figura 3 – Frequência de consumo de refrigerantes entre homens e mulheres em
diferentes cidades brasileiras 09
Figura 4 – Consumo per capita (litros/habitante/ano) do mercado brasileiro de
refrigerantes dos anos de 2010 a 2014 10
Figura 5 – Processo de industrialização do refrigerante 23
Figura 6 – Texto informativo sobre o corante amarelo tartrazina 58
Figura 7 – Lista de ingredientes retirada do rótulo da amostra testada 59
Figura 8 – Características sócio demográficas da população em estudo 60
Figura 9 – Frequência de escores (positivos/negativos) atribuídos pelos consumidores
nas três sessões 62
Figura 10 – Classificação de corantes de acordo com a Resolução no 44/CNNPA 68
Figura 11 – Produção de refrigerante de laranja 72
Figura 12 – Contagem de bolores e leveduras e bactérias aeróbias totais nas
formulações F 1 e F 2 .......................................................................................................78
Figura 13 – Figura bidimensional do mapa de preferência interno das 8 amostras
de refrigerante de laranja avaliadas 80
Figura 14 – Formulação F 1. Crescimento de leveduras, leveduras resistentes aos
conservadores e bactérias lácticas em refrigerante de laranja adicionado de concentrado
de cenoura e maçã, sem adição de conservadores (pH 3,0; Aa 0,990 e CO2 3,0v) 93
Figura 15 – Formulação F 2. Crescimento de leveduras, leveduras resistentes aos
conservadores e bactérias lácticas em refrigerante de laranja preservado quimicamente,
adicionado de concentrado de cenoura e maçã (pH 3,0; Aa 0,990 e CO2 3,0v) 94
Figura 16 – Formulação F 3. Crescimento de leveduras, leveduras resistentes aos
conservadores e bactérias lácticas em refrigerante de laranja preservado quimicamente,
adicionado de corantes artificiais – amarelo tartrazina e amarelo crepúsculo
(pH 3,3; Aa 0,990 e CO2 3,0v)...........................................................................................94
Figura 17 - Concentrado de cenoura e maçã. Crescimento de leveduras, leveduras
resistentes aos conservadores, bactérias lácticas e fungo ..................................................96

IX
 LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Padrão de Identidade e Qualidade (PIQ) dos refrigerantes 13

Tabela 2 – Exemplo de declaração quantitativa de ingredientes no rótulo do produto 14
Tabela 3 – Quantidades mínimas de suco e polpa de frutas e extratos para
refrigerantes 15
Tabela 4 – Relação dos edulcorantes, poder adoçante e limites máximos preconizados
pela legislação 17
Tabela 5 – Corantes artificiais - nome, cor, código, ingestão diária aceitável e
limites máximos permitidos em bebidas não alcóolicas 19
Tabela 6 – Teor de tartrazina em amostras de bebidas comercializadas no Brasil 22
Tabela 7 – Ingredientes e características físico-químicas das amostras de refrigerantes
comerciais 74
Tabela 8 - Resultados das análises físico-químicas das amostras de refrigerante
produzidas com concentrado de cenoura e maçã (F 1) e controle (F 2),
durante o tempo de armazenamento de 150 dias .............................................................76
Tabela 9 – Segmentação por gênero e idade dos participantes da análise sensorial 79
Tabela 10 – Média das notas atribuídas pelos consumidores para aparência, aroma,
sabor, textura, impressão global e cor para as 8 amostras testadas 80
Tabela 11 – Formulações desenvolvidas para a condução do teste de desafio
microbiológico 88
Tabela 12 – Culturas selecionadas para o teste desafio microbiológico ........................89
Tabela 13 – Fatores intrínsecos característicos das formulações desenvolvidas 92
Tabela 14 – Potencial de multiplicação microbiana de leveduras, leveduras resistentes aos
conservadores e bactérias lácticas em diferentes formulações de refrigerante sabor laranja
e em concentrado de cenoura e maçã 96

LISTA DE QUADROS

Quadro 1: Afirmativas apresentadas no formato de survey.......................................... 57

X
 LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

ABIR Associação Brasileira das Indústrias de Refrigerantes e de Bebidas

não Alcoólicas
ACP Análise de Componentes Principais
AFREBRAS Associação dos fabricantes de refrigerantes do Brasil
AMBEV Companhia de Bebidas das Américas
ANOVA Análise de variância
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ATT Acidez Total Titulável
COMEP Comitê de Ética em Pesquisa
CNNPA Comissão Nacional de Normas e Padrões para Alimentos
DCCR Delineamento Composto Central Rotacional
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
EFSA European Food Safety Authority
FAO Food and Agriculture Organization
FDA US Food and Drug Administration
GRAS Generally Recognized as Safe
IARC International Agency for Research on Cancer
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
IDA Ingestão Diária Aceitável
ICBA International Council of Beverages Associations
IDEC Instituto Brasileiro de Defesa do Consumidor
INS International Numbering System
JAR Just About Right
MAPA Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
OMS Organização Mundial da Saúde
PEPSICO Pepsi Company
PET Politereftalato de etileno
PIQ Padrão de Identidade e Qualidade
PROTESTE Associação Brasileira de Defesa do Consumidor
RTD Read to drink
SICOBE Sistema de Controle de Produção de Bebidas
SST Sólidos Solúveis Totais
SVS/MS Secretaria de Vigilância em Saúde do Ministério da Saúde
TAC Termo de ajuste de conduta
TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
UFC Unidade Formadora de Colônia
VIGITEL Vigilância de Fatores de Risco e Proteção para Doenças Crônicas por
Inquérito Telefônico
WHO World Health Organization

XI
 SUMÁRIO

INTRODUÇÃO GERAL 01

CAPÍTULO I – REFRIGERANTES: CONSUMO, COMPOSIÇÃO E TECNOLOGIA.

Resumo 04
Abstract 05
1. Introdução 06
1.1. Desafios para o setor 10
2. Refrigerantes: Legislação 11
2.1. Classificação / Designação 12
3. Refrigerantes: Composição 16
3.1 Refrigerante de laranja 19
3.1.1 A formação de benzeno em refrigerante de laranja 20
3.1.2 As alergias alimentares e os corantes artificiais empregados em refrigerante de
laranja 21
4.Refrigerantes: Tecnologia 22
4.1.Tratamento da água do processo 22
4.2.Produção de xarope simples 24
4.3.Filtração do xarope 24
4.4.Produção de xarope composto 25
4.5.Processo de diluição, carbonatação e envase 25
5. A perda de qualidade dos refrigerantes................................................................... 26
6. Considerações finais .................................................................................................. 26

CAPÍTULO II - AN OVERVIEW OF MICROORGANISMS AND FACTORS

CONTRIBUTING FOR THE MICROBIAL STABILITY OF CARBONATED SOFT
DRINKS

Abstract 29
1. Introduction 30
2. An overview of soft drink processing 32
3. Microorganisms of importance in carbonated soft drinks 34
3.1. Spoilage Microorganisms 34
3.1.1. Yeasts 35
3.1.2. Filamentous fungi 37
3.1.3. Acid producing bactéria 38
3.2. Pathogenic microorganisms 39
4. Major factors contributing for the microbial stability of carbonated soft drinks 41
4.1. pH 41
4.2. Preservatives 42
4.3. Carbonation 44
5. Final remarks 45

XII
CAPÍTULO III – SEGURANÇA DO ALIMENTO: PERCEPÇÃO DOS CONSUMIDORES
SOBRE OS ADITIVOS ALIMENTARES

Resumo 52
Abstract 53
1. Introdução 54
2. Material e métodos 56
2.1. Estudo I- Percepção do consumidor sobre a segurança dos aditivos em alimentos
processados 56
2.2. Estudo II- Impacto da informação sobre aditivos alimentares, em especial
corantes artificiais, na aceitação de balas mastigáveis 57
2.3. Análise estatística 59
3. Resultados e Discussão 59
3.1. Estudo I- Percepção do consumidor sobre a segurança dos aditivos
alimentares em alimentos processados 59
3.2. Estudo II – Impacto da informação sobre aditivos alimentares, em especial
corantes artificiais, na aceitabilidade de balas mastigáveis 62
4. Conclusão 63

CAPÍTULO IV - DESENVOLVIMENTO DE REFRIGERANTE DE LARANJA

ADICIONADO DE CONCENTRADO DE CENOURA E MAÇÃ

Resumo 65
Abstract 66
1. Introdução 67
2. Material e Métodos 70
2.1. Seleção do corante natural 70
2.1.1 Desenvolvimento das formulações 71
2.1.2 Produção do refrigerante 71
2.2 Análises físico-químicas 73
2.2.1 Análise Colorimétrica 73
2.2.2 Análises microbiológicas 73
2.3 Análise sensorial 74
2.3.1 Amostras 74
2.3.2 Teste afetivo de aceitação 75
2.4 Análise estatística 75
3. Resultados e Discussão 76
3.1 Análises físico-químicas 76
3.2 Análises microbiológicas 77
3.3 Análise sensorial 78
4. Conclusão 81

XIII
CAPÍTULO V - APLICAÇÃO DO TESTE DESAFIO E DETERMINAÇÃO DO POTENCIAL
DE MULTIPLICAÇÃO MICROBIANA (δ) PARA VALIDAÇÃO DE FORMULAÇÃO DE
REFRIGERANTE DE LARANJA ADICIONADO DE CONCENTRADO DE CENOURA E
MAÇÃ.

Resumo 84
Abstract 85
1. Introdução 86
2. Material e Métodos 88
2.1. Desenvolvimento das formulações 88
2.1.1. Produção do refrigerante 88
2.2. Caracterização físico-química das formulações 88
2.3. Teste Desafio 89
2.3.1. Seleção dos micro-organismos 89
2.3.2. Ativação das culturas 89
2.3.3. Preparo do inóculo 90
2.3.4. Inoculação da suspensão de micro-organismos nas amostras de
bebidas 90
2.3.5. Monitoramento do crescimento dos micro-organismos nas amostras
inoculadas 90
2.3.6. Inoculação das suspensões de micro-organismos na amostra de
concentrado de cenoura e maçã 91
2.3.7. Determinação do potencial de multiplicação
microbiana (δ) 92
3. Resultados e discussão 92
4. Conclusão 97

CONCLUSÕES GERAIS 98

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 99

XIV
 INTRODUÇÃO GERAL

Nos últimos anos, as bebidas não alcoólicas ganharam espaço no mercado brasileiro. Os
refrigerantes representam uma parcela significativa desse mercado, refletindo em um volume
de consumo que coloca o Brasil em terceiro lugar no mercado mundial.
De acordo com a legislação, refrigerantes são bebidas não alcoólicas gaseificadas,
obtidas pela dissolução, em água potável, de suco ou extrato vegetal de sua origem, adicionadas
de açúcares ou edulcorantes, acidulantes, aromatizantes, corantes artificiais e conservadores.
No tocante aos conservadores, o benzoato de sódio, sob determinadas condições, em conjunto
com o ácido ascórbico presente em bebidas de laranja pode formar benzeno, reconhecido agente
carcinogênico ao homem. Quanto ao emprego de corantes artificiais, em refrigerantes de laranja
destacam-se os corantes artificiais amarelo tartrazina e amarelo crepúsculo, envolvidos em
reações alérgicas e efeitos deletérios ao DNA, respectivamente. Ainda, estudos demonstram a
relação direta entre o consumo de corantes artificiais e benzoato de sódio e a ocorrência de
outras patologias como o déficit de atenção e hiperatividade.
Por outro lado, para adequada estabilidade microbiológica dos refrigerantes, os
principais parâmetros são pH, carbonatação e a presença de conservadores como benzoato de
sódio e sorbato de potássio.
Observa-se um movimento mundial da sociedade contemporânea em busca de produtos
mais naturais, que se relacionem à saúde e dieta equilibrada, e mais seguros, que não ofereçam
riscos à saúde do consumidor. A indústria de alimentos está reformulando seus produtos,
buscando alternativas aos ingredientes convencionais. A inovação de produto, consistindo na
substituição de aditivos alimentares por ingredientes naturais representa um desafio, pois deve
atender aos aspectos relacionados a regulamentação, a qualidade e a segurança do alimento.
Desta forma, esse estudo teve como objetivo principal avaliar se a substituição dos
corantes artificiais, em formulação de refrigerante de laranja, por concentrado de cenoura e
maçã e a eliminação dos conservadores, afetariam a estabilidade microbiológica do produto,
implicando na diminuição da robustez da fórmula. A aplicação do teste desafio em conjunto
com a determinação do potencial de multiplicação microbiana (δ) permitiu afirmar ser possível
a substituição dos corantes artificiais, contudo, a eliminação dos conservadores resulta em
diminuição da estabilidade da formulação, e consequente sensibilidade à formulação. A
aplicabilidade do estudo está na possibilidade de desenvolver uma bebida que possibilitará o

1
crescimento do mercado de refrigerantes, aliada ao conceito de saúde e segurança do
consumidor.
Essa tese foi estruturada em 5 capítulos, organizados da seguinte forma. O capítulo 1
corresponde a uma revisão bibliográfica acerca do consumo, composição e tecnologia de
fabricação dos refrigerantes. O capítulo 2 se refere ao artigo de revisão, publicado na revista
Food Research International, cujo título é: “An overview of microorganisms and factors
contributing for the microbial stability of carbonated soft drinks. No capítulo 3 são
apresentados os resultados do estudo sobre a percepção dos consumidores em relação aos
aditivos alimentares. No capítulo 4 são apresentados os resultados oriundos do
desenvolvimento de formulação de refrigerante sabor laranja adicionada de concentrado de
cenoura e maçã. O capítulo 5 apresenta os resultados obtidos da aplicação do teste desafio e
determinação do potencial de multiplicação microbiana (δ) para validação de formulação de
refrigerante sabor laranja adicionado de concentrado de cenoura e maçã.

2
 CAPÍTULO I

REFRIGERANTES: CONSUMO, COMPOSIÇÃO E TECNOLOGIA.

3
Resumo

O consumo de refrigerantes no Brasil é bastante significativo, colocando o país em terceiro

lugar no mercado mundial depois dos Estados Unidos e do México. A produção de refrigerantes
no Brasil é dominada por dois grandes fabricantes, entretanto, ressalta-se que as empresas de
menor porte, ganharam competitividade ao longo dos últimos anos, sobretudo com a introdução
da embalagem de polietileno tereftalato (PET). Uma extensa legislação assegura que a
fabricação da bebida esteja em conformidade com padrões nacionais e internacionais. Este
capítulo tem por objetivo fornecer uma revisão sobre o conhecimento científico disponível
acerca dos refrigerantes e ressalta os principais aspectos ligados à saúde pública, no que tange
à segurança do alimento. Especial atenção é dada aos ingredientes, incluindo os conservadores
e corantes artificiais que podem representar um risco à saúde do consumidor. No tocante aos
conservadores, o benzoato de sódio, sob determinadas condições, em conjunto com o ácido
ascórbico presente em bebidas carbonatadas de laranja pode formar benzeno, reconhecido
agente carcinogênico ao homem. Quanto ao emprego de corantes, em refrigerantes de laranja
destacam-se os corantes artificiais amarelo tartrazina e amarelo crepúsculo, envolvidos em
reações alérgicas e efeitos deletérios ao DNA, respectivamente. As principais deteriorações dos
refrigerantes compreendem a turvação do líquido, formação de sedimentos, alterações de sabor
e odor e presença excessiva de gases. Devido as suas características intrínsecas, o refrigerante
é considerado estável, do ponto de vista microbiológico. As etapas críticas de fabricação
constituem a pasteurização/resfriamento do xarope simples e a homogeneização dos
conservadores na preparação do xarope composto.

Palavras-chave: bebidas não alcoólicas gaseificadas, consumo, legislação, composição,

processamento.

4
SOFT DRINKS: CONSUMPTION, COMPOSITION AND TECHNOLOGY

Abstract

Soft drinks consumption in Brazil is quite significant, placing the country in third position in
the global market after the United States and Mexico. Two major manufacturers dominate the
production of soft drinks in Brazil. However, smaller companies gained competitiveness over
the past few years, especially with the introduction of polyethylene terephthalate packaging
(PET). Extensive legislation ensures that the beverage manufacturing is in accordance with
national and international standards. This chapter provides a broad overview of available
scientific knowledge about the soft drinks and highlights the key aspects of public health in
relation to food safety. Particular attention is given to ingredients, including preservative and
artificial colors that can pose a risk to consumer health. As regards preservative, sodium
benzoate, under certain conditions, together with the ascorbic acid present in orange carbonated
beverage can form benzene, a known human carcinogen. The use of artificial colors, such as
tartrazine and sunset yellow in the orange soda, are involved in allergic reactions and
deleterious effects on DNA, respectively. The main deteriorations of soft drinks comprises
turbidity, sediment formation, flavor and odor changes and excessive presence of gases. Due to
its intrinsic characteristics, soft drink is considered stable, from the microbiological point of
view. The critical manufacturing steps are pasteurisation and cooling the syrup and mixing the
ingredients and preservatives.

Key-words: soft drinks, consumption, standards, composition, processing.

5
 1. Introdução

Os últimos anos dez anos foram marcados por transformações na sociedade brasileira.
De uma economia de baixo dinamismo, com taxas de crescimento abaixo da média mundial, o
Brasil passou a fazer parte dos países emergentes que lideram o crescimento mundial. Em 2011,
o Brasil se tornou a sexta economia do mundo. Este cenário alavancou o crescimento de
diversos setores da economia do país, dentre estes, destaca-se o segmento de bebidas não
alcóolicas. Em cinco anos, o segmento aumentou de 51,6% para 53,2% a sua participação de
mercado, e os refrigerantes representaram 41,5% desta fatia (CAMARGO, BONACIO e
ZACARCHENCO, 2014). A produção de refrigerantes desponta como principal item do setor
de bebidas, seguido da produção de cervejas. Juntos, esses dois segmentos refletem
aproximadamente 82% do volume produzido e 76% do valor total das vendas de bebidas no
Brasil (CERVIERI et al., 2014). A Figura 1 retrata a segmentação do mercado. Ressalta-se a
predominância dos refrigerantes, com maior volume de produção (em bilhões de litros) no ano
de 2014. O Brasil é o terceiro maior mercado de refrigerantes do mundo depois dos Estados
Unidos e México (NEVES, 2015).

6
 16,341,934

12,088,245

4,993,326

1,306,441

669,616

503,033

273,273

137,785

113,700
Figura 1: Volume de produção do mercado de bebidas não alcóolicas em 2014.
Fonte: Elaborado pelos autores a partir de dados da ABIR (2014) e SICOBE (2014)
*RTD – Read to drink.

A produção de refrigerantes no Brasil é dominada por dois grandes fabricantes:

sistema Coca-Cola Brasil, formado pela Coca-Cola Brasil em parceria com grupos empresariais
independentes, chamados de fabricantes autorizados e pela Ambev S.A que além de produzir a
sua marca é também responsável pela produção e distribuição dos produtos da PepsiCo no
Brasil (ROSA, COSENZA e LEÃO, 2006; CERVIERI et al., 2014). A esse grupo de grandes
corporações multinacionais junta-se a Brasil Kirin, com capital de participação internacional,
reunindo as três empresas cerca de mais de 80% do faturamento do setor (AFREBRAS, 2015).
As empresas de menor porte, ganharam competitividade ao longo dos últimos anos, praticando
preços baixos e oferecendo marcas conhecidas popularmente como tubaínas1, distribuídas
regionalmente, uma vez que não possuem a complexa logística de distribuição das grandes
marcas (CAMPOS e OLIVEIRA, 2004). A Figura 2 destaca a participação de mercado dos
principais produtores brasileiros de refrigerantes.

1
O verbete “tubaína” não consta nos dicionários Aurélio e Michaelis. Tubaína é o nome de um
refrigerante sabor “tutti frutti”, produzido por indústrias nacionais, com muitas variações regionais.
Fonte: Campos e Oliveira, 2004.

7
 Outros
Ambev/Pepsi
16%
18%

Brasil Kirin
6%

Coca-Cola
60%

Figura 2: Participação de mercado dos produtores brasileiros de refrigerantes. Fonte:

AFREBRAS (2015).

O consumo de refrigerantes no Brasil em 2014 foi de 80,6 litros/habitante/ano (ABIR,

2014). O consumo é prevalente entre adolescentes, seguido da população adulta, tendendo a
diminuir de acordo com a idade (SOUZA et al., 2013; IBGE, 2011). Entretanto, um estudo
conduzido em creches públicas com lactentes (0 a 36 meses) constatou que os refrigerantes e
sucos industrializados foram introduzidos antes do primeiro ano de vida, pela metade da
população em estudo (n=636) e 10% consumiram as bebidas industrializadas antes dos 6 meses
(LONGO-SILVA et al., 2015). A presença de refrigerantes na dieta é cinco vezes maior na
classe de maiores rendimentos do que na classe de menores rendimentos. Comparando-se o
período de 1974-1975 e 2002-2003, observou-se um aumento de 400% na participação do
refrigerante na dieta do brasileiro (IBGE, 2004).
Dados da pesquisa VIGITEL2 BRASIL (2013) relataram que a frequência de adultos
que referiram o consumo de refrigerantes em mais de cinco dias da semana foi de 11,6% em
Natal e de 30,1% em Goiânia. A Figura 3 demonstra a frequência de consumo de refrigerantes
entre homens e mulheres em diferentes cidades brasileiras. Destaca-se a maior regularidade de
consumo em pessoas do gênero masculino. As cidades de Goiânia e Porto Alegre apresentaram
o maior consumo da bebida, dentre as pesquisadas.

2
Vigilância de Fatores de Risco e Proteção para Doenças Crônicas por Inquérito Telefônico.

8
 11.3%
João Pessoa
15.0%

6.9%
Natal
17.2%

11.2%
Salvador
17.7%

24.7%
Porto Alegre
34.5%

27.5%
Goiânia
33.1%

0.0% 5.0% 10.0% 15.0% 20.0% 25.0% 30.0% 35.0% 40.0%

Mulheres Homens

Figura 3: Frequência de consumo de refrigerantes entre homens e mulheres em

diferentes cidades brasileiras. Elaborado pelos autores a partir de dados da Vigitel (2013).

Os dados citados anteriormente são corroborados pela Pesquisa Nacional de Saúde

(IBGE, 2014). De acordo com o estudo, os homens consomem mais refrigerantes (26,6% dos
entrevistados), sendo a maior proporção de consumo no Centro-Oeste. A região Nordeste foi
considerada a de menor consumo (16,8%). Interessante notar que as indústrias de refrigerantes
se concentram na região Sudeste (44%) e Nordeste (24%) (CERVIERI et al., 2014).
Embora seja evidente o consumo de refrigerante pela população brasileira, observa-se
uma tendência de diminuição no consumo. Comparado ao ano de 2010, em 2013 houve uma
retração de 10%, com discreto aumento no ano de 2014 (Figura 4). Nesse sentido, o segmento
vem buscando novos consumidores (idade e classes sociais) e, para atingir este objetivo,
lançaram novas embalagens de tamanhos diferenciados. Essa iniciativa refletiu um crescimento
no consumo (CAMARGO, BONACIO e ZACARCHENCO, 2014).

9
 90

88

86
LITROS/HAB/ANO

84

82

80

78

76

74
2010 2011 2012 2013 2014

Figura 4: Consumo per capita (litros/habitante/ano) do mercado brasileiro de refrigerantes dos

anos de 2010 a 2014. Fonte: ABIR (2014).

O mercado brasileiro de refrigerantes tem preferência pelas embalagens PET

(politereftalato de etileno) de 2 L: 77% das bebidas produzidas no período de 2010 a 2014 foram
acondicionadas nesta embalagem, 16% em latas e 7% em embalagens retornáveis de vidro e
outras. Sob esse aspecto, a possibilidade de utilização da embalagem plástica abriu um espaço
considerável para as empresas regionais atuarem no negócio, pois a embalagem de vidro exigia
uma logística de retorno do vasilhame, pouco acessível (CERVIERI et al. 2014).

1.1 Desafios para o setor

As recentes transformações socioeconômicas observadas no Brasil foram
responsáveis pelo bom desempenho das indústrias de bebidas no país (CERVIERI et al., 2014).
Entretanto, vários são os pontos que demandam atenção do setor, visando o seu crescimento: O
comportamento do consumidor que demonstra uma preocupação em manter um estilo de vida
saudável, o que tem impactado os hábitos alimentares da população e como consequência, o
aumento à procura por alimentos naturais e mais nutritivos. E ainda, estudos evidenciando a
associação entre o consumo de refrigerantes, obesidade, doenças crônicas não transmissíveis e
síndrome metabólica (FERRARI e SOARES, 2003; CARMO et al., 2006, DHINGRA et al.,
2007; NOGUEIRA e SICHIERI, 2009; ESTIMA et al., 2011). Neste cenário, a indústria de
refrigerantes terá que adotar novas estratégias, desenvolvendo sobretudo, bebidas com apelo
mais natural e saudável. De acordo com Neves (2015), uma das tradicionais respostas ao

10
consumidor, foi o desenvolvimento de bebidas dietéticas (diet)3 (BRASIL, 1999). Sob esse
aspecto, a publicação do Decreto n° 8592 de 17 de dezembro de 2015 (BRASIL, 2015), que
permite a mistura de açúcar e adoçante hipocalóricos, resultará no desenvolvimento de bebidas
com menos calorias, oportunizando a entrada de produtos no mercado brasileiro como a Coca-
cola Life, que mistura açúcar com extrato de folhas de stevia, um edulcorante natural. Essa nova
versão fornece 89 Kcal em 330 mL, já a versão original 138 Kcal (NOGUEIRA, 2014). Outras
tendências, no entanto, são observadas e já estão disponíveis para o consumidor, como por
exemplo, o refrigerante com zero açúcar, cujo consumo de 500 mL atende a 25% da necessidade
diária de ingestão de fibras4; e o refrigerante orgânico5. Segundo o IDEC (Instituto de Defesa
do Consumidor), atendendo a pressão da sociedade por alimentos mais saudáveis, os principais
fabricantes de refrigerantes: Coca-Cola Brasil, Ambev e Pepsico realizaram um acordo
voluntário visando restringir a venda da bebida em cantinas escolares para crianças de até 12
anos de idade. Essa ação reforça a imagem junto ao consumidor de que as indústrias não estão
alheias ao problema da obesidade infantil, entretanto, é importante detalhar de que forma essa
iniciativa será implementada, como a fiscalização deverá atuar nesse sentido e qual o
mecanismo de punição aos que infringirem as regras. Necessário se faz ainda refletir sobre o
apoio à essa ação através de medidas legislativas, que visem inclusive banir a propaganda
massiva a que as crianças estão submetidas (PORTAL DO CONSUMIDOR, 2016).

2. Refrigerantes: Legislação

A legislação brasileira define refrigerante como bebida gaseificada, obtida pela

dissolução em água potável, de suco ou extrato vegetal de sua origem, adicionada de açúcares.
O refrigerante deverá ser obrigatoriamente saturado de dióxido de carbono industrialmente puro
(BRASIL, 1998). Cabe esclarecer que de acordo com a Lei n.8918/94 (BRASIL, 1994) o
registro, a padronização, a classificação, e, ainda, a inspeção e a fiscalização da produção e do
comércio de bebidas, em relação aos seus aspectos tecnológicos, competem ao Ministério da

3
De acordo com a Instrução Normativa nº30 de 27 de setembro de 1999, a bebida dietética e a bebida de baixa
caloria são bebidas não-alcoólicas, hipocalóricas, que tenham o conteúdo de açúcares, adicionado normalmente na
bebida convencional, inteiramente substituído por edulcorante hipocalórico ou não-calórico, natural ou artificial,
em conjunto ou separadamente.
4
https://www.brasilkirin.com.br/produto/fibz

5
http://www.natumaker.com.br/

11
Agricultura, Pecuária e Abastecimento – MAPA. À Agência Nacional de Vigilância Sanitária
– ANVISA cabe a inspeção e fiscalização de bebidas, nos seus aspectos bromatológicos e
sanitários.
A classificação e a designação dos vários tipos de refrigerantes são apresentadas
abaixo, conforme a Portaria n.544/1998 (BRASIL, 1998).

2.1. Classificação / Designação

2.1.1 Refrigerante de (nome da fruta), o que contiver por base suco ou polpa da fruta.
2.1.2. Refrigerante de Extrato de (nome do vegetal), o que contiver por base extrato vegetal.
2.1.3. Refrigerante de (nome da fruta ou do vegetal), o que contiver por base suco ou extrato
vegetal ou suco de parte do vegetal de sua origem.
2.1.4. Refrigerante de (nome da fruta ou vegetal) com aroma de (nome da fruta ou do vegetal),
o que contiver por base suco de fruta e aroma natural, tendo predominância do sabor do aroma.
2.1.5. Refrigerante Misto de (nome das frutas), o que contiver por base dois ou mais sucos das
frutas.
2.1.6. Refrigerante Misto de (nome da fruta, ou dos vegetais), o que contiver por base suco(s)
das frutas, extrato(s) de vegetal (is) ou suco(s) de parte do vegetal de sua origem,
2.1.7. Refrigerante de (nome da fruta, ou vegetal) com aroma de (Fruta ou vegetal de origem),
o que contiver sucos de frutas, ou extratos vegetais, ou suco(s)de fruta (s), extrato(s) vegetal(is)
e suco(s) de parte do(s) vegetal(is) e aroma, tendo predominância do sabor do aroma.
2.1.8. Refrigerante de Limão ou Soda Limonada, o que contiver por base suco de limão.
2.1.9. Refrigerante de Guaraná, o que contiver por base semente de guaraná ou seu equivalente
em extrato de guaraná.
2.1.10. Refrigerante de Cola, o que contiver por base a noz de cola ou extrato de noz de cola.
Através da Instrução Normativa n° 30 de 27 de setembro de 1999 (BRASIL, 1999), o
MAPA regulamentou o padrão de identidade e qualidade para bebida dietética e a de baixa
caloria. Sob este aspecto, as bebidas dietéticas devem apresentar teor de açúcares
(monossacarídeos e dissacarídeos) menor que 0,5 g/100mL da bebida pronta para consumo.
Para as bebidas de baixa caloria o teor calórico não deverá ultrapassar 20 Kcal/100mL da
bebida. Quanto ao aspecto da rotulagem, o termo “diet” é permitido nos rótulos de bebidas
dietéticas; nas bebidas de baixa caloria, aplica-se o uso do termo “light”.
As características físico-químicas dos refrigerantes, de acordo com a legislação
brasileira, encontram-se resumidas na Tabela 1.

12
Tabela 1: Padrão de Identidade e Qualidade (PIQ) dos refrigerantes.
Sabor do °Brix % de Acidez Cafeína Tanino Quinino ou
refrigerante do suco suco (g/100mL) (mg/100mL) (mg/100mL) seus sais
(v/v) (mín.) (mg/100mL)
Uva 14 10 0,03* ----- ----- -----
Laranja 10,5 10 0,1 ----- ----- -----
Tangerina ----- 10 ----- ----- ----- -----
Abacaxi 10 10 0,07 ----- ----- -----
Maçã 10 5 0,02** ----- ----- -----
Pêra 10 5 0,03** ----- ----- -----
Maracujá 9 3 0,06 ----- ----- -----
Limão ou ----- 2,5 0,125 ----- ----- ------
soda
limonada
Guaraná*** ----- ----- ----- 0,6 1,0 -----
Cola**** ---- ---- ----- 20 ----- -----
Água ----- ---- ----- ----- ----- máx. 7; mín.
tônica de 3
quinino
Misto de ----- 5,0 ----- ----- ----- -----
frutas (suco
de mais de
uma fruta)
Fonte: Portaria n.544/1998; Decreto-lei 6871/2009 (BRASIL, 2009a). *Expresso em ácido
tartárico; **Expresso em ácido málico. Para as demais frutas, a acidez é expressa em ácido cítrico.
*** O refrigerante de guaraná deverá conter, obrigatoriamente, no mínimo, 0,02 g/100mL de semente
de guaraná (gênero Paullinia) ou seu equivalente em extrato.
**** O refrigerante de cola deverá conter semente de noz de cola ou extrato de noz de cola (Cola
acuminata).

Em conjunto com outros órgãos do governo, o MAPA publicou em 2013, a Instrução

Normativa nº 19 de 19 de Junho (BRASIL, 2013) que estabeleceu em todo o território nacional
a complementação do Padrão de Identidade e Qualidade (PIQ) para refresco, refrigerante,
bebida composta, chá pronto para consumo e soda, com o objetivo de informar a população de
forma mais clara e precisa sobre a porcentagem de suco e polpa de fruta contida nas bebidas
não alcóolicas vendidas no mercado (IDEC, 2014). O capítulo 2, art.12, da referida legislação,
descreve que a quantidade de polpa de fruta e de suco de fruta ou de vegetal (nas bebidas prontas
para o consumo, com exceção das bebidas contendo somente extrato padronizado e/ou aquoso
como ingrediente característico) deve, obrigatoriamente, ser declarada no rótulo. Precisamente,
no painel principal do rótulo, isolada, em destaque, com caracteres em caixa alta, em
porcentagem volume por volume (v/v), com uma cifra decimal, de suco integral ou polpa ou o

13
somatório destes. O valor numérico e o sinal de porcentagem (%) devem ter, no mínimo, o
dobro do tamanho da denominação do produto, e a expressão "DE SUCO" deve ter, no mínimo,
uma vez e meia o tamanho da denominação do produto. Seguem abaixo, exemplos descritos na
legislação (Tabela 2).

Tabela 2: Exemplo de declaração quantitativa de ingredientes no rótulo do produto

6g de suco concentrado de tangerina a 21ºBrix Deve ser escrito no painel principal a
expressão "11,0% DE SUCO”.
1g de suco concentrado de laranja a 66ºBrix e Deve ser escrito no painel principal a
1g de suco concentrado de acerola a 40ºBrix. expressão "13,5% DE SUCO".

5g de suco concentrado de laranja a 50ºBrix e Deve ser escrito no painel principal a

2g de suco concentrado de cana de açúcar a expressão "22,8% DE SUCO”.
30ºBrix.
Fonte: BRASIL (2013)

Destaca-se ainda que, em relação as quantidades mínimas de suco de fruta, suco de

vegetal, polpa de fruta, extrato padronizado e extrato de fruta para refrigerante, a legislação
n°19/2013 (BRASIL, 2013) acrescentou os seguintes itens (Tabela 3).

14
Tabela 3. Quantidades mínimas de suco e polpa de frutas e extratos para refrigerantes.

Quantidades de sucos de fruta, suco de vegetal, polpa de fruta, extrato padronizado e extrato de
fruta para 100 mL de refrigerante.
Fruta Quantidade mínima em mL Quantidade mínima de
sólidos totais do açaí ou
juçara em mL
Açaí fino, médio e grosso e ---- 2,0
polpa de açaí
Açaí fino clarificado 1,8 ----
Açaí médio clarificado 1,6 -----
Açaí grosso clarificado 1,25 2,0
Açaí (polpa de açaí clarificada) 5,0 -----
Cajá 5,0 -----
Cajú 5,0 -----
Juçara (Eutherpe edulis) ---- 2,0
Goiaba 5,0 ----
Manga 5,0 ----
Morango 2,5 ----
Pêssego 5,0 ----
Tomate (suco) 10,0 ----
Duas ou mais frutas 5,0 ----
Suco vegetal (quantidade mínima em gramas)
Caju (castanha) 2,5 ----
Cana- de- açúcar (suco de 20 ----
calda/caldo de cana)
Soja (proteína de soja) 1,0 ----
Dois ou mais vegetais 5,0
Extrato padronizado (quantidade mínima em gramas)
Gengibre (extrato padronizado 0,02
com, no mínimo, 0,03% de
gingerol)
Açaí (extrato padronizado com,
no mínimo, 0,025% de 0,5
antocianinas).
Extrato de fruta (quantidade mínima em gramas)
Cerejas (20ºBrix) 0,5
Framboesa (19ºBrix) 0,5
Kiwi (10ºBrix) 0,5

15
 Notas: (1) O refrigerante de fruta ou de vegetal cuja matéria-prima não conste da Tabela 3 deve
conter uma quantidade mínima de 5%v/v ou 5%m/v de suco ou polpa da fruta ou vegetal. (2) A soma
dos ingredientes característicos que compõem o refrigerante misto, com exceção do extrato
padronizado e do extrato de fruta, deve ser de, no mínimo, 5% m/v.
Outro ponto importante relacionado a classificação e denominação dos refrigerantes, é
que a IN 19/2013 (BRASIL, 2013) se restringe apenas a quatro tipos de refrigerante, conforme
indicado abaixo, ao contrário da legislação anterior – Portaria 544/98 (BRASIL, 1998).
I - Refrigerante de fruta, aquele obtido de suco de fruta ou de polpa de fruta, ou da
combinação destes;
II - Refrigerante de vegetal, aquele obtido de vegetal;
III - Refrigerante de extrato, aquele obtido de extrato padronizado; e
IV - Refrigerante misto, aquele obtido da mistura de dois ou mais ingredientes
característicos.
- ingredientes opcionais:
I - Vitaminas, sais minerais, fibras e outros nutrientes, em conjunto ou separadamente,
desde que em conformidade com o estabelecido em legislação específica da ANVISA, em que
o cloreto de sódio, em quantidades inferiores às consideradas não significativas para sódio; e
II - Ingrediente alternativo.

3. Refrigerantes: Composição
Os refrigerantes constituem um grupo diversificado de bebidas que são classificadas de
acordo com a sua composição, com base no teor de açúcar, tipo de extrato e suco de fruta
(BRASIL, 1998). Os refrigerantes convencionais contêm aproximadamente 90% de água,
enquanto os dietéticos até 99% de água (CRUZ, 2012). Dessa forma, tanto do ponto de vista
físico-químico, pela influência no sabor final da bebida, quanto pelo aspecto microbiológico,
sua qualidade está atrelada ao produto final, requerendo um pré-tratamento a fim de que sejam
eliminados micro-organismos, odores e sabores estranhos, partículas microscópicas e coloidais,
matéria orgânica, carbonatos e bicarbonatos, compostos ferrosos e sulfurosos e excesso de
cloretos (VARNAM e SUTHERLAND, 1994).
Com exceção das bebidas zero calorias, o açúcar é adicionado numa proporção de 8 a
12% do produto final, mas cabe ao fabricante o estabelecimento dessa concentração. A sacarose
é o açúcar utilizado na forma granulada ou líquida (CELESTINO, 2010), podendo sofrer
inversão a glicose e frutose, devido ao baixo pH das formulações, notadamente nos refrigerantes

16
tipo cola (BARNABÉ e VENTURINI FILHO, 2010). O açúcar é adicionado para aumentar o
sabor da bebida e conferir a sensação de saciedade.
A maioria dos refrigerantes dietéticos é adoçada com aspartame, acesulfame K, sacarina
e ciclamato (BARNABÉ e VENTURINI FILHO, 2010; CRUZ, 2012). No Brasil, o decreto
n°8592/2015 (BRASIL, 2015) permite a mistura entre açúcares e adoçantes. As bebidas
formuladas com esses atributos deverão ser rotuladas como “baixo em açúcares” ou “reduzido
em açúcares”. A Tabela 4 apresenta os principais edulcorantes, o potencial adoçante em relação
a sacarose e os limites máximos permitidos pela legislação para bebidas com reduzido teor de
açúcares.
Tabela 4: Relação dos edulcorantes, poder adoçante e limites máximos preconizados
pela legislação.

Edulcorante Poder adoçante Limites máximos

(g/100mL)
Sacarina e seus sais de 300 vezes superior, 0,015
cálcio, potássio e sódio deixando um sabor
residual metálico.
Ácido ciclâmico e seus sais 30 a 60 vezes superior 0,04
de cálcio, potássio e sódio.
Aspartame* 200 vezes superior 0,075
Acesulfame K 200 vezes superior 0,035
Glicosídeos de esteviol 200 vezes superior 0,06
Sucralose 600 vezes superior 0,025**
Fonte: (Brasil, 2008; Gava, Silva e Frias, 2008; Brasil, 2009b). *As bebidas com
aspartame em sua composição devem inserir no rótulo a advertência de que o produto
“CONTÉM FENILALANINA” (BRASIL, 1998). **valor estipulado para bebidas não
alcóolicas gaseificadas e não gaseificadas.

Os refrigerantes são caracteristicamente bebidas carbonatadas com teor de CO2 variando

de 1,5 a 5,0 g/L (LAWLOR et al., 2009). A legislação brasileira estabelece que o refrigerante
deve apresentar gaseificação igual ou superior a 2,5V (volumes) de CO2. O refrigerante que for
adicionado de até 2,5V de CO2 deve ter a inscrição levemente gaseificado no rótulo (BRASIL,
2013). O gás carbônico torna a bebida mais ácida e em conjunto com o pH ácido (faixa de 2,5-
4,0) contribui para a estabilidade microbiológica das formulações. As colas comumente,
apresentam pH na faixa de 2,5 a 2,8 e são acidificadas com ácido fosfórico (SPLITTSTOESSER
e RANSOM, 1992; BARNABÉ e VENTURINI FILHO, 2010; KRIEGEL, 2015). Os ácidos
cítrico, fumárico e málico também podem ser utilizados, porém a concentração máxima

17
permitida para o ácido fosfórico e tartárico é, respectivamente, 0,07 g/100mL e 0,5 g/100mL
(BRASIL, 2007a).
Os acidulantes permitem que os conservadores atuem com maior eficiência em bebidas
que possuam pH ácido ou que possam ser acidificadas (GAVA, SILVA e FRIAS, 2008). Os
conservadores mais comumente utilizados em refrigerantes são o ácido benzoico e seus sais
(benzoato de sódio e potássio) e o ácido sórbico e seus sais (sorbato de sódio e potássio) (DONG
e WANG, 2006; LINO e PENA, 2010). A RDC nº5/2007 da Anvisa (BRASIL, 2007a)
estabelece os limites máximos para bebidas com gás são de 0,03 g/100mL (expressos em ácido
sórbico) e 0,05 g/100mL (expressos em ácido benzoico). A sua principal função é prevenir a
multiplicação de bactérias, fungos filamentosos e leveduras (SANTOS et al., 2015).
Os corantes e os aromatizantes são adicionados aos refrigerantes com o objetivo de
intensificar a cor e o aroma, respectivamente. A adição de corantes às formulações se justifica,
pois, tornam a bebida mais atrativa ao consumo, auxiliam a correção de pequenas variações no
processamento e armazenamento e contribuem para o reconhecimento da identidade do produto
pelo consumidor (KRIEGEL, 2015). Existem basicamente três categorias de corantes: naturais,
artificiais e caramelos. Em refrigerantes de laranja e de uva, destaca-se o uso de corantes
artificiais, dentre eles: amarelo tartrazina, amarelo crespúsculo, amaranto ou Bordeaux S, azul
brilhante. O corante caramelo (caramelo I-simples, caramelo II – processo sulfito cáustico,
caramelo III-processo amônia e caramelo IV – processo sulfito amônia) está presente nas
formulações de guaraná e cola (OS CORANTES..., 2009). Os corantes artificiais são obtidos
através de síntese química e não ocorrem em produtos naturais. Quimicamente os corantes
sintéticos são classificados em cinco categorias: derivados do amarelo de quinoléina, grupo
triaril-metano, xantinas (como a eritrosina), corantes índigo e aminas aromáticas ou estrutura
azoica aromática que apresenta o grupo azo –N=N– (MPOUNTOUKAS et al., 2010) e
dificilmente pode ser sintetizado sem a produção concomitante de contaminantes. O corante
amarelo crepúsculo, o amarelo tartrazina e vermelho 40 são denominados compostos azoicos
(MÍDIO e MARTINS, 2000; FREITAS, 2012).
A Tabela 5 apresenta os nomes comerciais, a cor referente a cada corante, o código de
acordo com o Sistema Internacional de Numeração de Aditivos Alimentares6, a ingestão diária

6
Cabe ao Codex Alimentarius a elaboração do Sistema Internacional de Numeração de Aditivos Alimentares. O
Codex foi criado pela Organização para a Alimentação e Agricultura (FAO) e pela Organização Mundial da Saúde
(OMS) com o objetivo de desenvolver normas alimentares internacionais harmonizadas que protegem a saúde dos
consumidores e promovem as boas práticas no comércio de alimentos. Fonte: CODEX, 2016.

18
aceitável segundo a FAO (Food and Agriculture Organization) e a OMS (Organização
Mundial da Saúde) e os limites máximos preconizados pela legislação para bebidas não
alcóolicas.
Tabela 5: Corantes artificiais - nome, cor, código, ingestão diária aceitável e limites
máximos permitidos em bebidas não alcóolicas.

Nome Cor Código* IDA (mg/kg de Limite máximo

peso corpóreo) (g/100mL)
Amaranto ou Magenta INS 123 0,50 0,005
Bordeaux S
Amarelo Laranja INS 110 2,50 0,01
crepúsculo
FCF, amarelo
Sunset
Azul brilhante Azul turquesa INS 133 10 0,01

Tartrazina Amarelo limão INS 102 7,50 0,01

Fonte: MÍDIO e MARTINS, 2000; BRASIL, 2001; BRASIL, 2007a; OS CORANTES, 2009.
*INS – International Numbering System

3.1 Refrigerantes de laranja

Os refrigerantes à base de sucos de fruta possuem como principal apelo ser fonte de
vários nutrientes e compostos bioativos como fibras, minerais, vitaminas e antioxidantes. Os
sucos naturais ou concentrados além de contribuir para a doçura da bebida, podem representar
importante fonte de contaminação. No caso específico de refrigerante de laranja, o suco pode
vir conservado com benzoato de sódio, de forma a minimizar esse risco. Nesse tipo de bebida
ainda se observa a adição de hidrocolóides ou espessantes como goma guar, goma xantana ou
pectina que objetivam evitar a separação de fases (KRIEGEL, 2015). O padrão de identidade e
qualidade (PIQ) para refrigerante de laranja estabelece que essa bebida deve ter, no mínimo
10% (v/v) de suco de laranja a 10,5ºBrix e acidez titulável maior do que 0,1 grama de ácido
cítrico por 100 mL de refrigerante (BRASIL, 1998; BRASIL, 2009a).

19
3.1.1 A formação de benzeno em refrigerantes de laranja
Os refrigerantes de laranja apresentam em sua composição ácido ascórbico7. Sob
determinadas condições, a sua combinação com ácido benzoico pode resultar na formação de
benzeno8 em bebidas (NYMAN et al., 2008), apesar do ácido benzoico ser reconhecido como
um aditivo seguro ou GRAS (generally recognized as safe) (OGA, 2003). Vários estudos
demonstraram a presença de benzeno em limites acima daqueles considerados seguros em
refrigerantes de laranja e sucos industrializados (FDA, 2006; SYAL, 2006; FDA, 2007; CAO
et al., 2007; PROTESTE, 2009). As condições favoráveis para a formação de benzeno em
bebidas consistem em elevadas temperaturas e exposição à luz (NYMAN et al., 2010). O
mecanismo de reação envolvido propõe que alguns metais de transição como o cobre II (Cu+2)
e o ferro III (Fe+3), presentes, provavelmente, na água utilizada para a fabricação das bebidas,
podem catalisar a redução de um elétron de oxigênio por ácido ascórbico para produzir o radical
ânion superóxido, o qual sofre dismutação espontânea e forma peróxido de hidrogênio, podendo
gerar o radical hidroxila (OH-), capaz de descarboxilar o ácido benzoico, resultando na
formação de benzeno. Cabe destacar que a presença de ambos os sais benzoato e ácido
ascórbico nas bebidas não resulta, necessariamente, na presença de benzeno no produto final
(GARDNER e LAWRENCE, 1993). Algumas medidas podem promover a redução ou
eliminação do benzeno, são elas: adição de agentes quelantes como EDTA e hexametafosfato
de sódio, substituição/eliminação do ácido ascórbico nas formulações, avaliação das condições
de estocagem e prazo de validade das bebidas (ICBA, 2006). A legislação brasileira não
estabelece limites de benzeno em bebidas, tendo sido adotado os mesmos valores estipulados
para água potável (5µg/L). No Brasil, em 2011, foi firmado um termo de ajustamento de
conduta (TAC) entre os maiores fabricantes de refrigerantes e o Ministério Público Federal em
Minas Gerais (MPF/MG). As empresas terão no máximo 5 anos para reduzir os níveis de
benzeno (SOUZA, 2011).

7
O ácido ascórbico aumenta a vida útil da bebida, impedindo a formação de sabor indesejado, pois os componentes
aromáticos da bebida, podem combinar-se com o oxigênio, produzindo modificações no sabor.

8
O benzeno é reconhecido pelo IARC (International Agency for Research on Cancer) como carcinogênico ao
homem e sua presença em alimentos tem sido atribuída a vários fatores: embalagem, ambiente de armazenamento,
água potável contaminada, cozimento, irradiação e degradação do conservador benzoato de sódio. (Fonte: Santos
et al., 2015).

20
3.1.2 As alergias alimentares e os corantes artificiais empregados em refrigerantes de
laranja
Muitos experimentos vêm sendo realizados em animais no intuito de verificar o efeito
dos alimentos com corantes artificiais no surgimento de alergia e/ou intolerância alimentar,
como asma brônquica, rinite e urticária, além de desordens gástricas e neoplasias da glândula
tireoide e do trato gastrointestinal (MAHAN e ESCOTT-STUMP, 2005; SCHUMANN,
POLÔNIO e GONÇALVES, 2008). Em refrescos em pó, balas e refrigerantes de laranja os
corantes sintéticos mais utilizados são o amarelo tartrazina e o amarelo crepúsculo
(OSTROSKI, BARICATTI e LINDINO, 2005).
Merece destaque que a tartrazina é inquestionavelmente um dos corantes artificiais mais
controversos. Estudos associaram seus efeitos deletérios ao fígado (alteração das enzimas
hepáticas), ao sistema reprodutor masculino, a citoxicidade e citostacidade em linfócitos
humanos e danos ao DNA (MEHEDI et al., 2009; AMIN, HAMEID e ELSTTAR, 2010;
MPOUNTOUKAS et al., 2010; AXON et al., 2012). Entretanto, outros estudos consideraram
a tartrazina como um aditivo seguro, respeitando-se o consumo de acordo com a IDA (ingestão
diária aceitável) (MOUTINHO, BERTGES e ASSIS, 2007; TANAKA, 2009; POUL et al.,
2009). Importa considerar também que crianças e adolescentes tendem a consumir mais
corantes artificiais em sua dieta do que adultos, pois observa-se uma maior ingestão de balas,
cereais matinais e bebidas coloridas (STEVENS et al., 2014), podendo, possivelmente,
ultrapassar a IDA.
O corante amarelo crepúsculo, que é produzido a partir de compostos aromáticos
derivados de hidrocarbonetos de petróleo, também tem sido relacionado a genotoxicidade e
efeitos imunomoduladores e xenoestrogênicos (AXON et al., 2012; SAYED et al., 2013;
CEYHAN et al., 2013; YADAV et al., 2013).
Alguns estudos têm sido conduzidos com intuito de avaliar os teores de corantes
artificiais em bebidas, sobretudo do corante amarelo tartrazina, devido ao seu envolvimento em
reações alérgicas (asma, bronquite, rinite, náuseas, broncoespasmos, urticária, eczema e dor de
cabeça) (BRASIL, 2007b) em consumidores. Neste sentido, a Anvisa regulamentou, através da
Resolução n.340/02 (BRASIL, 2002) que as empresas fabricantes de alimentos que contenham
em sua composição o corante amarelo tartrazina devem obrigatoriamente declarar na rotulagem,
na lista de ingredientes, o nome do corante tartrazina por extenso.
Os dados disponíveis na literatura sobre o teor de tartrazina em bebidas encontram-se
sumarizados na Tabela 6. Observa-se que as amostras analisadas se apresentam em

21
concordância com o disposto pela legislação brasileira. Contudo, deve-se considerar que
mesmo as bebidas se apresentando dentro dos limites estabelecidos, o que determinará se a IDA
foi ultrapassada ou não, é a porção consumida, a diluição, a idade/massa corporal e a frequência
de consumo dos alimentos fontes dos corantes (ABRANTES, 2011).

Tabela 6: Teor de tartrazina em amostras de bebidas comercializadas no Brasil.

Teor mínimo Teor máximo
Alimento Fonte
encontrado encontrado
Reis et al. (2010)
Refrigerantes 2,93 mg/ 100ml 3,60 mg/100ml Martins, Oliveira e Kawashima
1,04mg/100ml 1,64 mg/100ml (2010)

Isotônicos 2,10mg/100mL 3,60mg/100mL Piasini et al. (2014)

Martins, Oliveira e Kawashima

Refresco em pó
0,03mg/100mL 0,74mg/100mL (2010)

4. Refrigerantes: Tecnologia

4.1 Tratamento da água do processo

De modo geral, as principais etapas de tratamento da água na indústria de refrigerantes
incluem cloração, abrandamento, floculação e posterior separação de partículas (por decantação
ou flotação), filtração em filtro de areia, supercloração, filtração por carvão ativado e polimento
final (BARNABÉ e VENTURINI FILHO, 2010). É importante esclarecer que a água pode
conter vários íons que promovem a alteração do sabor da bebida, especialmente o íon cloro. Os
fabricantes costumam abrandar a água com esse objetivo. Os métodos mais comuns são resina
de troca iônica e osmose reversa. O ideal é que a concentração de sais de cálcio e magnésio seja
reduzida para 50ppm (KRIEGEL, 2015).
Os padrões de potabilidade da água preconizados pela legislação brasileira exigem
ausência de coliformes totais e Escherichia coli em 100mL. A contagem de bactérias
heterotróficas não deve ultrapassar 500UFC/mL. A legislação ainda estipula o monitoramento
de cistos de Giardia spp. e oocistos de Cryptosporidium spp. As principais análises físico-
químicas indicadas para controle da qualidade da água tratada são: pH, sulfato, alcalinidade,
turbidez, cloretos, dureza, ferro, alumínio, cloro, sólidos totais dissolvidos, cor, odor e gosto
(BRASIL, 2011).
22
 O processamento de refrigerantes, de forma simplificada, envolve as etapas de produção
de xarope simples, produção de xarope composto e fabricação da bebida. O fluxograma descrito
abaixo (Figura 5) resume o processo de industrialização de refrigerante.

Água Açúcar

Diluição Açúcar

Pasteurização xarope simples

Carvão
ativado
Filtração xarope
Terra de
diatomáceas Resfriamento

Xarope simples

Aditivos Mistura e estocagem

Xarope composto

Água
Diluição

CO2
Carbonatação

Envase

Refrigerante

Figura 5: Processo de industrialização de refrigerante. Fonte: SANTOS e RIBEIRO

(2005), modificado.

23
 4.2 Produção de xarope simples
Industrialmente, o preparo do xarope é feito na sala denominada xaroparia. O xarope
simples ou calda base é o produto da diluição do açúcar cristal em água. A concentração usual
para refrigerantes é de 60 ºBrix (60 g de sacarose para 100 gramas de solução). O xarope simples
pode ser obtido de acordo com os seguintes métodos (BARNABÉ e VENTURINI FILHO,
2010):

a) Processo a frio – Consiste na diluição do açúcar em água na temperatura ambiente.

b) Processo a frio acidificado – o produto é obtido com adição de ácido cítrico ao xarope
simples frio, o qual fica menos sujeito a deterioração microbiológica.
c) Processo à quente9 - a mistura de água e açúcar é aquecida para facilitar a dissolução
dos carboidratos e impedir a multiplicação microbiana. A dissolução do açúcar deve
ocorrer sob agitação constante. Após a dissolução completa do açúcar, a temperatura é
elevada para 85ºC ±5ºC. Este processo também pode ser denominado de pasteurização.
d) Processo a quente acidificado – Adiciona-se ácido cítrico ao xarope antes ou durante o
aquecimento, obtendo-se a inversão total ou parcial da sacarose. Com a acidificação, a
estabilidade microbiológica é melhorada.
e) Xarope de alta densidade – Possui concentração de, no mínimo, 67ºBrix, mais
apropriado para estocagem.

A preparação de bebidas com edulcorantes ocorre através da dissolução do produto em

água, em tanque de aço inox; não sendo necessário pasteurizar ou adicionar o carvão ativado
(CELESTINO, 2010).

4.3 Filtração do xarope

O carvão ativado é adicionado nesta etapa objetivando a clarificação do xarope, na
proporção de 2 a 5 gramas por Kg de açúcar. O carvão ativo adsorve impurezas responsáveis
pelo sabor, odor, cor e turvação. Além disso, é adicionado um coadjuvante de filtração (terra
infusória) na mesma quantidade do carvão, para facilitar a filtração do xarope. A etapa seguinte
é a filtração deste xarope, usando terra de diatomácea como auxiliar de filtração. Esta operação
tem por finalidade separar o carvão ativado, a terra infusória e outras partículas, resultando na
sua clarificação. O xarope simples é posteriormente resfriado em trocador de calor até a

9
As médias e grandes indústrias de bebidas utilizam esse processo, enquanto o pequeno industrial utiliza o processo
a frio acidificado (CELESTINO, 2010).

24
temperatura de 15-20ºC em trocadores de calor (BARNABÉ e VENTURINI FILHO, 2010;
CELESTINO, 2010).

4.4 Produção de xarope composto

O xarope composto é o produto obtido da mistura do xarope simples com os demais
ingredientes. Os aditivos incorporados nessa etapa são responsáveis pela caracterização da cor,
sabor e aroma do produto final.
A sequência de adição dos ingredientes deve ser obedecida de forma a evitar
precipitações e turvações: xarope simples, conservador, acidulante, antioxidante, suco de fruta
ou extrato, aromatizantes, corantes e água declorada (BARNABÉ e VENTURINI FILHO,
2010; CELESTINO, 2010).
No caso dos extratos, cita-se o emprego em refrigerantes de cola e guaraná. Este último,
é obtido de sementes de planta de guaraná, que passam por um processo de torrefação, moagem
e depois são encaminhadas para a fabricação de um extrato, com o auxílio de solventes
orgânicos e extratores rotativos. O extrato é então enviado para a fábrica de aromas, e misturado
a aromas, óleos essenciais e corantes, torna-se o concentrado líquido de guaraná. Nas fábricas,
é combinado ao xarope de guaraná, ficando com um sabor mais doce, próximo ao da finalização
da bebida (CAVALCANTI, 2013).
O teor de sólidos solúveis (ºBrix) final da bebida é ajustado e a agitação deve ser mantida
para garantir a homogeneização de todos os ingredientes, especialmente dos conservadores e
evitar a admissão de ar.

4.5 Processo de diluição, carbonatação e envase

Para a fabricação do refrigerante propriamente dito, o xarope composto é adicionado de
água tratada e acrescido de CO2. O equipamento denominado proporcionador é responsável por
combinar as proporções corretas entre a água tratada e o xarope composto. Os elementos chave
do proporcionador são: desaerador, proporcionador, unidade de carbonatação e unidade de
resfriamento. A combinação de CO2 é efetuada em um equipamento denominado carbo-cooler.
Nota-se que o nível de oxigênio dissolvido na água e no xarope deve ser baixo de forma a
melhorar as condições de carbonatação. O nível de carbonatação inicial do refrigerante, ou seja,
o volume de CO2 que está dissolvido no líquido é definido em função do sabor do produto. A
quantidade de gás na bebida afetará a estabilidade microbiológica, o sabor e o aroma do
refrigerante. Em seguida, ocorre o resfriamento da mistura. O resfriamento a 2ºC para o

25
enchimento a frio minimiza a criação de espuma na enchedora (BARNABÉ e VENTURINI
FILHO, 2010, CELESTINO, 2010). Merece destaque que algumas pequenas empresas,
realizam somente esta parte do processo, recebendo o xarope composto para diluição,
carbonatação e envase (SANTOS e RIBEIRO, 2005).
A bebida final é enviada para a enchedora, que recebe as garrafas PET higienizadas,
através de rinser. A enchedora preenche a bebida até o nível correto, transferindo
automaticamente a embalagem para a capsuladora (colocação da tampa de fechamento) e, por
último, para fechamento (CELESTINO, 2010)
Para o envase de garrafas de vidro faz-se necessário antes encaminhá-las para um
equipamento denominado lavadora de garrafas, onde os vasilhames serão lavados com solução
de soda cáustica à quente e posteriormente enxaguados com água para sua adequada
desinfecção (SANTOS e RIBEIRO, 2005).

5. A perda de qualidade dos refrigerantes

De modo geral, as principais deteriorações dos refrigerantes compreendem a turvação do
líquido, formação de sedimentos, alterações de sabor e odor, alteração no teor de sólidos
solúveis (Brix) e presença excessiva de gases (que podem levar ao estufamento do recipiente e
estouro do mesmo) (BARNABÉ e VENTURINI FILHO, 2010). Por outro lado, a perda de
carbonatação também representa um grande inconveniente, especialmente para as bebidas
embaladas em PET. Neste caso, o refrigerante pode se tornar suscetível a contaminação por
fungos filamentosos, embora, devido as suas características intrínsecas, sejam bebidas
consideradas bastante estáveis do ponto de vista microbiológico (LAWLOR et al., 2009). As
etapas críticas do processo de fabricação constituem a pasteurização/resfriamento do xarope
simples e a homogeneização dos conservadores na preparação do xarope composto.

6. Considerações finais

O Brasil ocupa a terceira posição em termos de consumo de refrigerantes no mundo. A

presença do refrigerante na mesa/dieta do brasileiro é evidente. Entretanto, esse mercado denota
ligeira retração, oriunda não só das questões relacionadas ao apelo nutricional, mas também da
situação econômica atual e ainda da existência dos riscos associados à saúde, notadamente ao
consumo excessivo de corantes artificiais e aos conservadores. A indústria de refrigerantes está
sob pressão, tanto dos órgãos regulamentadores quanto dos consumidores, que anseiam por

26
produtos com apelo mais natural, sustentável e saudável. Desse modo, o uso de ingredientes
naturais; a eliminação de corantes artificiais e a diminuição da concentração de conservadores
também podem fazer parte de um planejamento em busca do aumento de consumo e conquista
de novos nichos de mercado. Outro aspecto interessante, é o desenvolvimento de novos sabores
de bebidas de frutas, explorando o potencial da fruticultura brasileira, em atendimento aos
interesses de uma nova geração que se preocupa mais com a relação entre a qualidade de vida
e saúde.

27
 CAPÍTULO II

AN OVERVIEW OF MICROORGANISMS AND FACTORS

CONTRIBUTING FOR THE MICROBIAL STABILITY OF

CARBONATED SOFT DRINKS.

Denise R.P.Azeredoa*, Verônica Alvarengab, Anderson S. Sant’Anab, Armando U.O. Sabaa Srura
a
Department of Food Technology, Federal Rural University of Rio de Janeiro, Seropédica, RJ

– Brazil.

b
Department of Food Science, Faculty of Food Engineering, University of Campinas,

Campinas, SP - Brazil.

Running title: Microbiology of soft drinks.

*Corresponding author: D.R.P. Azeredo (denise.perdomo@uol.com.br).

28
Abstract

Soft drinks, which are largely produced and consumed worldwide, are acidic beverages (pH

2.5-4.0), formulated with water, sucrose, carbonated with 1.5-5.0 volumes of CO2, and added

or not with chemical preservatives and fruit juices. A simplified manufacturing process of soft

drinks consists of water treatment, production of simple syrup, production of compound syrup,

carbonation and filling. As any other food and beverage, soft drinks can be contaminated by

microorganisms; however, the low pH caused by the addition of acidulants, the presence of

preservatives, and the presence of CO2 comprise major barriers to microbial growth. Because

of these characteristics, filamentous fungi and some bacteria, including pathogens, do not pose

spoilage and safety risks for soft drinks. On the other hand, because of their tolerance to acidic

environments and CO2, both yeasts and aciduric bacteria can survive and deteriorate soft drinks.

This review deals with the microorganisms of relevance, as well as with the factors influencing

their survival and role on soft drink spoilage.

Keywords: soft drink, soda, food spoilage, shelf life, food safety, beverages, stability.

29
1) Introduction:

Soft drinks are defined as carbonated or non-carbonated beverages containing sugars or

artificial sweeteners, acidulants, flavorings, colorings and preservatives. Soft drinks are

produced by dissolving juices or vegetable extracts in drinking water. Most soft drinks are

sweetened with aspartame, acesulfame K, saccharin and cyclamate, while regular soft drinks

are sweetened with crystallized or liquid sucrose (Barnabe & Venturini Filho, 2010, Cruz,

2012). In some countries, regulations establish not only the specification but also the minimum

amount of juice or extract to be added to these beverages. Regular soft drinks contain

approximately 90% water, while diet soft drinks contain up to 99% water (Cruz, 2012). Filling

can take place in standard or clean packaging lines (Wareing and Davenport, 2004) and these

products may be available for consumption in post mix machines (soda fountains), polyethylene

terephthalate (PET) bottles, glass or can containers.

Soft drinks have markedly acidic pH (2.5-4.0), 1.5 to 4 volumes of carbon dioxide (CO2),

with typical carbonation level of about 3 volumes. Cola-type soft drinks commonly present pH

in the range of 2.5 to 2.8 and are acidified using a diluted phosphoric acid solution (Barnabé &

Venturini Filho, 2010, Brasil, 2009, Splittstoesser & Ransom, 1992). The low pH caused by the

addition of acidulants, the addition of preservatives and CO2 comprise major barriers to

microbial growth in soft drinks. On the other hand, the presence of sugars represent an

important source of energy for microbial growth (Wareing and Davenport, 2004). Therefore,

microorganisms of concern in soft drinks are usually adapted to grow in acidic environments

in the presence of preservatives and CO2. Nonetheless, with recent changes in consumers’

behavior related to health and wellness (Ares et al., 2008) and regulations by public health

agencies throughout the world, industries have promoted changes in their products and

processes. Innovations in the field of soft drinks comprise the development of new tastes,

addition of not only higher amounts of juices, pulps and fruit cells, but also the addition of

30
health-appealing beverages (containing collagen, herbs, etc.), use of natural colorants, low

calorie formulations (reduction in sugar content), addition of proteins, and removal of chemical

preservatives from soft drinks formulations, among others (DataMonitor, 2013). While

addressing consumer’s and health authorities concerns, these changes will certainly influence

the microbiology of soft drinks. Therefore, the aforementioned changes in soft drink processing

and formulation have the potential to greatly impact on the entire soft drink production chain.

For example, in order to produce soft drinks with no preservatives, the use of raw materials and

ingredients of very high microbiological quality will be mandatory. In addition, extremely high

hygienic standards and validated sanitation practices will have to be in place to ensure the shelf

life of these products. Even transportation conditions and shelf life of these products might

require further improvements.

Ensuring the microbiological safety of soft drinks is a challenge for both the industry and

microbiologists. Although filling technology coupled with preservation methods are applied to

ensure shelf-stable products, a few groups of microorganisms can still compromise the

microbial stability of these beverages. The limited literature on the subject has motivated this

article, which aims at focusing on the microbiology (contaminants) of soft drinks. Thus, in this

review, the microorganisms of relevance in soft drinks and the major factors contributing for

their microbial stability as well as the main sources of microbiological contamination are

reviewed. Taking into consideration the characteristics of relevant microorganisms and factors

influencing their fate in soft drinks comprises very valuable information to deal with the

aforementioned challenges and to advance our understanding of the microbiological aspects

related to these products.

31
2) An overview of soft drink processing:

In order to understand the impacts of processing on microorganisms, a general overview

of the production of carbonated soft drinks is presented (Figure 1). The manufacturing process

of carbonated soft drinks, in a simplified form, consists of water treatment, production of simple

syrup, production of compound syrup, carbonation and filling Specific steps and conditions can

vary depending on the factory, country and type of carbonated soft drink produced.

Insert Figure 1 here.

The raw materials used in the manufacture of soft drinks should be stored as

recommended by the good manufacturing practices in order to avoid contamination of

chemical, physical and microbiological nature. At the reception, the reports of the suppliers

should be checked to assess conformity with internal and regulation standards, and a sampling

program should be established to verify the accuracy of the information through analysis

performed in an outsourced laboratory. A major concern at this step is the microbiological

contamination of raw materials by spoilage microorganisms, for instance by preservative-

resistant yeasts, such as Zygosaccharomyces bailii and Z. rouxii (Frisón et al., 2015, Stratford

et al., 2013). As preservative-resistant yeasts are present in the processing plant, given their

resistance to certain sanitizers (Frisón et al., 2015, Davidson and Harrison, 2002), they may

remain in the environment and be responsible for spoilage. Alyciclobacillus represents another

bacterium of concern in raw materials intended for soft drink production. Alyciclobacillus is a

sporeforming, acidophilic and thermophilic bacterium that is highly associated with spoilage of

fruit juices and concentrates (Oteiza et al., 2011, Oteiza et al., 2015). Other ingredients used for

soft drinks production, such as flavorings, have also recently proved to be potential sources of

Alyciclobacillus spores (Oteiza et al., 2014). The concerns with the presence of Alyciclobacillus

in raw materials is explained by the fact that Alyciclobacillus strains survive through harsh

thermal processing conditions (Spinelli et al., 2009, 2010) and are capable of deteriorating

32
acidic foods and beverages (Chang and Kang, 2004). Although Alyciclobacillus does not grow

in the presence of high CO2 levels, such as soft drinks (Chang and Kang, 2004), there is a

concern that this bacterium may be able to deteriorate low-carbonated beverages.

The production of soft drinks requires the preparation of the simple syrup (Figure 1).

The simple syrup is produced by mixing water and sucrose in a stirring tank. After mixing, the

simple syrup is pasteurized at 85 °C for 5 minutes (or equivalent) to facilitate the sugar

dissolution and to inactivate spoilage microorganisms potentially present in the ingredients.

Thereafter, microbial contamination is very critical because there will be no further killing

treatments (Figure 1). This fact highlights the pivotal importance of appropriate ingredient

selection and the application of good manufacturing practices to build and select equipment that

will allow in maximum efficiency of sanitization procedures as well as the application of

validated hygienic and sanitization procedures. After pasteurization of the single syrup, single

syrup is pasteurized, activated charcoal is added aiming at clarifying the syrup, followed by

filtration using diatomaceous earth. Then, the simple syrup is maintained cooled at 20°C until

mixed with other ingredients to result in the compound syrup. To avoid precipitation and

turbidity, the ingredients should be added in the following order: simple syrup, preservative

(when added), acidifying agent, antioxidant, fruit juice or extract, flavoring, coloring and

dechlorinated water. The total soluble solids content (°Brix) of soft drinks are then adjusted,

and the mixture should be stirred to mix all ingredients, especially the preservatives, thus

preventing air incorporation (Figure 1). The mixture containing the compound syrup and water

is previously prepared in a carbo-cooler beverage processor, which automatically doses the

amounts of each ingredient. The level of dissolved oxygen in water and syrup should be low to

improve the carbonation process. Then, the mixture is cooled, followed by the carbonation step.

The carbonation process consists of injecting CO2 in soft drinks. The initial carbonation level,

i.e., the amount of CO2 dissolved in the liquid, is established according to the desired taste of

33
the product. The CO2 level affects the microbiological stability (pH related), taste perception,

and aroma release of soft drinks. After the carbonation step, the soft drink is filled into PET

bottles, glass, cans or other containers (post mix, for example), which are further sealed and

stored (Figure 1). The filling procedure comprises another critical step for microbial

contamination of soft drinks. Filling machines that are not properly cleaned and sanitized may

comprise potential sites for adhesion of microbial contaminants capable of spoiling soft drinks,

such as lactic acid bacteria and preservative-resistant yeasts (Frisón et al., 2015, Stratford et al.,

2013, Tribst et al., 2009).

3) Microorganisms of importance in carbonated soft drinks:

3.1) Spoilage Microorganisms:

Microbial spoilage of soft drinks is typically characterized by visual changes and off-

flavors (Juvonen et al., 2011). The spoilage becomes apparent when the microbial concentration

is higher than 105 CFU/mL (Stratford, 2006, Tribst et al., 2009).

Microorganisms must be able to grow in the presence of CO2, and to withstand acidic

conditions and presence of chemical preservatives to spoil soft drinks (Stratford, 2006, Lawlor

et al, 2009, Tribst et al., 2009). Although these factors exert a selective pressure on acidophilic

and anaerobic microorganisms, the addition of some ingredients, such as fruit juices, proteins,

and other natural ingredients can result in less microbiologically stable formulations of soft

drinks. Although the presence of essential oils in some soft drinks, especially essential oil from

citrus fruits, may confer antimicrobial effects, it does not seem to be an effective barrier to

microbial growth (Beuchat and Golden, 1989). In the absence of carbohydrates, other

compounds, for instance, aspartame and citric acid can be nitrogen and carbon sources for

microbial growth, respectively (Lawlor et al., 2009).

34
3.1.1) Yeasts:

Yeasts are the main contaminants and spoilers of soft drinks because of their natural

occurrence in ingredients used for soft drink production, such as sucrose and fruit juices, as

well as because of their ability to grow in acidic and carbonated environments (Stratford, 2006).

Although yeasts do not represent a risk to consumer’s health (Ndagijimana et al., 2004), they

compromise the image of the company (perceived safety) and can lead to serious economic

losses (Loureiro and Queirol 1999).

The spoilage of soft drinks by yeasts is usually characterized by abundant CO2 production,

which can lead to bulging and bursting of the bottle, excessive effervescence when opening the

bottle, turbidity, sediments, production of undesirable flavor and aroma compounds, such as

"fruity", "keto", and "alcoholic" odors (Stratford et al, 2000, Lawlor et al, 2009, Juvonen et al,

2011). A significant decrease in total soluble solids (°Brix) in soft drinks spoiled by yeasts is

also observed.

The spoilage of processed and packaged foods seems to be restricted to ten yeast species

– Dekkera bruxellensis, D. hansenii, Issatchenkia orientalis, Kloeckera apiculata, Pichia

membranifaciens, Zygosaccharomyces bailii, Z. rouxii, Z. bisporus, S. cerevisiae,

Schizosaccharomyces pombe, and Saccharomyces exiguous, which are commonly associated

with soft drinks spoilage (Pitt & Hocking, 1999). Davenport (2006) proposed a division of

yeasts into four groups depending on the risk they pose for soft drink spoilage. Fermentative

and preservative-resistant yeasts represent group 1 (the high risk group), while group 2 consists

of yeasts that spoil soft drinks because of deficiencies in processing conditions, such as

sanitation problems. The yeasts from group 3 are not spoilers of soft drinks but serve as

indicators of inadequate hygiene, whereas group 4 embraces yeasts that can be isolated from

soft drinks, but are not common contaminants and do not grow in these products (Davenport,

2006, Stratford and James, 2003). This division may be important for a suitable classification

35
of ingredients in terms of potential impacts on soft drink microbial stability, supplier’s

selection, to define strategies for improvement of soft drinks formulations and to improve

hygienic practices applied in processing environment. Nonetheless, the concepts behind this

division will be better used for management of soft drink microbial stability if yeasts isolates

are characterized for their growth and spoilage potential as well as phenotypical characteristics

(resistance to preservatives and sanitizers). This is highlighted because the behavior and

characteristics of yeasts may be strain-dependent and new species may be identified with a

certain behavior that is not yet known.

Soft drink contamination by yeast may be originated from several sources, including

ingredients, returnable bottles, equipment, food handlers, and air vectors. In addition, some

insects, such as the fruit fly Drosophila spp, may carry spoilage yeasts (Lachance, 2001).

Despite this, it is known that yeasts are mostly linked to poor hygiene during the manufacturing

process. High yeast populations may be associated with inappropriate use of sanitizing

products, incorrect frequency, and problems of heat transfer during cleaning in place (CIP)

system (Lawlor et al., 2009). The CIP procedure conducted with hot water is required each time

the production line is prepared to process a soft drink of a different flavor. The chemical CIP

should be performed daily both at the beginning and in the end of the production process.

Moreover, the process water can be a potential carrier for yeasts, so the analysis should also be

considered for controlling the entire process. The ambient air sampling at specific points (filler,

rinser, stock and transportation of bottles, syrup production room, stock and transportation of

caps, filling line) is relevant, since filamentous fungi and yeasts are carried by air streams and

may contaminate soft drinks. It is recommended to monitor the air quality and the critical

production sites in order to identify the areas of greatest risk and, therefore, to implement

appropriate preventive actions accordingly. According to Lawlor et al. (2009), sucrose is the

primary source of fermentable carbohydrate for the growth of microorganisms in acidic medium

36
and in the presence of CO2. If not stored properly, sucrose can be a vector of spoilage yeasts.

The main sources of yeasts associated with soft drinks manufacture are summarized in Table 1.

Insert Table 1 here.

3.1.2) Filamentous fungi:

Conidia or spores of filamentous fungi and mycelial fragments present in the

environment can contaminate soft drinks environment in response to hygienic failures along

the processing line, poor quality of raw materials and/or use of contaminated packaging

(Filtenborg et al. 2004, Juvonen et al., 2011, Delgado et al., 2012a,b). The packages caps may

also be a contamination source. Sato (2010) investigated filamentous fungi in a factory of

plastic caps for soft drinks and found that 47 filamentous fungi species were isolated from 52

swabs and air samples. The most contaminated areas were the cover checking room followed

by the storage room of resins.

Although some species can grow under anaerobic conditions, such as Fusarium,

Rhizopus (Filterborg et al., 2004, Scholte et al., 2004), Byssochlamys and other heat resistant

molds (Sant’Ana et al., 2010a,b), most molds are aerobic (Pitt & Hocking, 1999) and therefore

inhibited in environments with low oxygen tension. In soft drinks, the CO2 loss in PET

(polyethylene terephthalate) packaging due to improper storage can promote spore germination

of filamentous fungi and consequent spoilage. Therefore, glass and metal packagings provide

less gas exchange. According to Mislivec et al. (1992), the presence of visible mycelium may

be the main reason for consumers rejecting these products. According to Hara-Kudo et al.

(2009), filamentous fungi are the major cause of claims registered on the customer care service

in Japan, with 91 cases related to the closed packaging and 138 cases involving opened

packages.

37
 The spoilage of soft drinks by filamentous fungi can result in off-flavor. The numerous

enzymes resulting from fungal metabolism (lipases, proteases, carbohydrases) can promote the

discoloration of the beverage (Juvonen et al., 2011) and some fungi strains are able to produce

toxigenic compounds, such as aflatoxins (Sant’Ana et al., 2008, Sant’Ana et al., 2010b, Pitt and

Hocking, 2009).

3.1.3) Acid producing bacteria:

The two major groups of acid producing bacteria associated with soft drink spoilage are

lactic acid bacteria and acetic acid bacteria (Back et al., 1999, Juvonen et al., 2011, Tribst et al.,

2009).

Lactic acid bacteria include Carnobacterium, Enterococcus, Lactococcus, Lactobacillus,

Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus, and Weissella,

among others. In the group of acetic acid bacteria, Acetobacter, Gluconobacter,

Gluconoacetobacter and Asaia stand out as the major concerns for soft drink spoilage (Juvonen

et al., 2011, Tribst et al., 2009, Yamada and Yukphan, 2008). Lactobacillus and Leuconostoc

seem to be the most important genera of lactic acid bacteria associated with soft drink spoilage

(Back et al., 1999). For example, Lactobacillus perolens was isolated from a fruit soft drink

(orange and lemon), conferring off-flavor to the beverage ( production of high amounts of

diacetyl) (Back et al., 1999). Leuconostoc mesenteroides is commonly found in sugar cane

fields is of paramount concern because it is capable of fermenting sucrose, producing dextrans

that block pipes and lead to economic losses. Lactobacillus and Streptococcus may also produce

lower molecular weight dextrans (Aquino and Franco, 2008), thus forming biofilms. In the

acetic acid bacteria group, Gluconobacter oxydans and Gluconacetobacter sacchari seem to be

the concerns for carbonated soft drinks and flavored water spoilage (Battey and Schaffner,

38
2001, Moore et al., 2002b). Asaia species have been described as spoilage organisms of fruit-

flavored bottled water (Moore et al., 2002a, Horsáková et al., 2009).

The sources of contamination of soft drinks by lactic acid bacteria are ingredients (mainly

fruit juices), packaging materials and surface of equipment (Lawlor et al., 2009, Tribst et al.,

2009). Acetic bacteria are present in nature, such as flowers and particularly in environments

containing carbohydrates and ethanol. It is worth mentioning their ability to form biofilms, so

their presence in soft drinks is frequently associated with poor hygiene during the process

(Raspor and Goranovic, 2008).

Although the lactic acid fermentation often converts carbohydrates into lactate,

depending on the species and environmental conditions, other by-products can be formed, such

as CO2, ethanol, acetic acid, diacetyl, formic acid, and extracellular polysaccharides.

Interestingly, the production of diacetyl, which confers a buttery smell, can be associated with

a putrid odor by the consumer. On the other hand, acetic bacteria are capable of oxidizing

sugars, organic acids and alcohols with production of acetic acid, gluconic acid, lactic acid,

succinic acid, and acetaldehyde. The presence of these products leads to changes in viscosity,

presence of sediments, turbidity, packaging distension and modifications in flavor (Juvonen et

al., 2011, Raspor and Goranovic, 2008, Tribst et al., 2009).

3.2) Pathogenic microorganisms:

Pathogenic microorganisms, such as Salmonella and Listeria monocytogenes, do not

grow in carbonated soft drinks. Pathogens loose viability rapidly when exposed to acidic and

carbonated environments. Strains of Salmonella Derby SD37, S. Derby SD81 and L.

monocytogenes inoculated in orange soft drink were not detected after 35 h inoculation when

pH was 3.0, although they survived at pH 4.9 and 6.8 (Massa et al., 1998).

39
 Although carbonated soft drinks are not adequate substrates for the growth of pathogenic

microorganisms, their presence can be related to the microbiological quality of water used for

processing these products. It is known that pathogens such as Salmonella and E. coli are enteric

microorganisms commonly transmitted through water (Levantesi et al., 2012). Carbonated soft

drinks can be contaminated with Salmonella spp. (at numbers ranging from 2 to 90 CFU/100

mL), total coliforms, and faecal coliforms if the water used for processing these products is not

of high microbiological quality (Akond et al., 2009). Therefore, the importance of water used

for processing soft drinks concerns not only from the physicochemical standpoint but also from

the microbiological perspective. Water pretreatment should be applied so that microorganisms,

strange flavors, microscopic and colloidal particles, organic matter, carbonates and

bicarbonates, ferrous and sulfur compounds, and excess chlorides are eliminated (Varnam and

Sutherland, 1994). Generally, the main steps of water treatment in the industrial plant of soft

drinks include chlorination, softening, flocculation and subsequent separation of particles (by

flotation or sedimentation), slow sand filtration, super chlorination, activated carbon filtration,

and polishing filtration (Barnabé and Venturini Filho, 2010). Although the treatment of water

for drinking purposes may allow the survival of non-pathogenic microorganisms, soft drink

manufacturers cannot take any risk related to the presence of these microorganisms in the final

product. Therefore, the microbiological quality of water is a major issue for soft drink

producers, which is normally addressed by ensuring the application of disinfection treatments

at the point of use, i.e., in soft drink processing plants.

Pathogenic microorganisms loose viability in soft drinks and contamination by these

microorganisms may be prevented by the use of high microbiological quality water. However,

contamination by pathogenic microorganisms can also take place before consumption, such as

in packages or soda fountains. Opportunistic pathogenic microorganisms, such as

Chryseobacterium meningosepticum, Klebsiella species, Staphylococcus, Stenotrophomonas,

40
Candida, and Serratia can be persistent contaminants of soda fountain machines (White et al.,

2010). In addition, these microorganisms may harbor antimicrobial resistance genes that may

constitute a concern for health risk sub-populations such as immunocompromised people

(White et al., 2010). External contamination of packages by potentially pathogenic

microorganisms suggests inadequate storage conditions (Mata et al., 2010).

1. Major factors contributing for the microbial stability of carbonated soft

drinks:

Carbonated soft drinks are stable products at room temperature, chemically preserved

and cold filled. The major barriers to microbial growth in these products are: (i) low pH due to

the addition of acidulants (citric acid and/or phosphoric acid), (ii) presence of preservatives,

such as potassium sorbate and sodium benzoate, and (iii) CO2 level.

4.1) pH

Acidulants are substances that increase acidity or confer a sour taste to food products.

As the pH is invariably reduced, acidification is quite effective in controlling microorganisms,

which increases the effectiveness of preservatives. It is known that the microorganisms are more

sensitive to changes in the internal cellular pH than in the external pH. The extent of the

inhibitory effect of pH is related to the ability of the microorganism to expel internal protons

and repel external ions. However, the ability to maintain the internal pH close to neutrality can

overload the cell, especially in an environment with low extracellular pH. If the pH is not

balanced, the cell is unable to synthesize cellular components, and thus unable to divide and

multiply, resulting in cellular death (Beales, 2004). Once weak acids are inside the cells, they

reduce the internal pH. In contrast, strong acids cannot permeate the cell membrane, thus their

antimicrobial effect relies on the denaturation of enzymes present on the cell surface and on the
41
acidification of cytoplasmic pH due to the migration of H+ ions from the external layer to the

internal environment. This change in turn leads to an increased lag phase. If essential nutrients

cannot be metabolized, the microbial growth will be inhibited by reducing the ion transport

(Hill et al., 1995, Brown et al., 1997, Davidson et al., 2005).

Unlike most bacteria, filamentous fungi and yeasts can multiply in a wide pH range,

specifically below pH 2 and above pH 9. Over time and in the absence of an effective buffer

system, these microorganisms are able to shift the pH of the substrate to a value that is close to

the optimum pH, usually 4 to 6.5 (Mislivec et al. 1992). Filamentous fungi become prevalent

in environments with a water activity value lower than 0.9, regardless of the pH (Pitt and

Hocking, 1999). Aciduric bacteria exhibit optimum growth at a pH range of 1.0 to 5.0 (Beales,

2004), and are able to grow in soft drinks. Lactic and acetic bacteria are suitable examples of

these phenomena.

4.2) Preservatives

Preservatives are substances that prevent or slow food spoilage caused by

microorganisms or enzymes. The preservatives commonly used in the manufacture of soft

drinks are benzoic and sorbic acids, and their sodium, potassium and calcium salts. Not only

these compounds but also acetic and propionic acids are considered weak monocarboxylic

acidsthat are able to inhibit the growth of filamentous fungi and yeasts, although their

effectiveness depends on the initial cell concentration (Tfouni & Toledo, 2001, Machado et al.,

2007). In this regard, it is noteworthy that the effectiveness of the preservative depends on other

factors, including the composition and pH of the product, redox potential of the medium, and

the amount of free water for microbial growth (Barnabé and Venturini Filho, 2010).

Weak acids partially dissociate in aqueous solution, leading to a dynamic equilibrium

(pH-dependent) between the undissociated and dissociated forms. The optimum inhibitory

42
activity occurs at low pH, which favors the undissociated molecule that is liposoluble and

therefore permeable through the plasma membrane. The diffusion mechanism is relatively fast,

occurring between 1 and 3 min. The molecule will dissociate upon entering the cell, resulting

in the release of anions and protons in the cytoplasm, which cannot cross the plasma membrane

(Figure 2). At high concentrations of preservatives, the release of protons is enough to cause

cytoplasmic acidification, affecting the ability of cells to maintain the internal pH (Loureiro,

2000, Forsythe, 2002, Beales, 2004).

Insert Figure 2 here.

The theory that the inhibitory effect of weak acids has been attributed to intracellular

accumulation of protons and anions from the acid dissociation and subsequent acidification

suggests that all weak acids behave in a similar manner. However, propionic, sorbic and benzoic

acids present more lipophilic structures than acetic acid. These higher hydrophobic acids are

more effective in their inhibitory effect over the membrane as they become more lipophilic

(Piper, 2011, Stratford et al 2013a). To evidence this fact, high levels of acetic acid (80-150

mM) are required to inhibit the growth of Saccharomyces cerevisiae at pH 4.5, while only 1-3

mM sorbic acid presents similar effect under the same conditions (Mollapour and Piper, 2006).

One major cause of inhibition of S. cerevisiae cells caused by sorbic acid or benzoic acid is due

to the oxidative stress caused by the generation of free radicals in the mitochondria (Piper et

al., 2001, Stratford et al, 2013a). Moreover, benzoic acid is a potent inhibitor of both the

substrate transport across the membrane and the microautophagy (Piper, 2011).

Although preservatives inhibit most species of filamentous fungi and yeasts, some species

can grow in chemically preserved foods (Pitt and Hocking, 1999). Saccharomyces cerevisiae,

Candida lipolytica, Candida krusei and Zygosacharomyces bailli are examples of yeasts

presenting this behavior (Battey et al., 2002, Lawlor et al., 2009). Martorell, et al. (2007)

isolated Z. bailii and Z. rouxii from a factory environment with high sucrose concentration and

43
found that Z. bailii isolates exhibited high resistance to preservatives including ethanol, sorbic,

benzoic, acetic, and cinnamic acids . Although these yeasts isolates were preservative-resistant,

no resistance to sanitizers, such as peracetic acid or hypochlorite, was observed. Therefore, the

adoption of appropriate sanitation procedures for equipments can be effective in controlling

these yeasts in soft drinks processing environment.

The preservative-resistance mechanism of Zygosacharomyces species can be associated

not only to its ability to metabolize benzoate and sorbate as a single carbon source in the

presence of oxygen, but also to a small number of resistant cells in the population (Stells et al

2000, Mollapour and Piper, 2001, Stratford et al, 2013b). Members of Saccharomyces genus

are able to decarboxylate sorbic acid, producing 1,3-pentadiene, a volatile organic compound

(Stratford et al., 2007). S. cerevisiae also plays a role in the decanoic acid detoxification through

the production of decanoate ethyl ester by β-oxidation routes (Legras et al., 2010).

Other bacteria, such Acinetobacter calcoaceticus and Gluconobacter oxydans, are able to

grow in non-carbonated beverages containing sodium benzoate and potassium sorbate (Battey

and Schaffner, 2001). Among molds, Aspergillus niger and Penicillium spinulosum are

considered preservative-resistant, being able to tolerate acidic and low water activity

environments (Battey and Schaffner, 2001).

4.3) Carbonation

Carbon dioxide molecules are water soluble, leading to formation of H2CO3, which

releases H+ that is able to reduce the extracellular pH. This phenomenon contributes to the

increased permeability of the cell membrane, allowing CO2 to enter into the cell, creating a

toxic environment and modifying the internal pH (Damar and Balaban, 2006). Garcia- Gonzalez

et al. (2007) presented a hypothetical mechanism for the lethal effects of CO2 (Figure 3). Even

44
though this proposed mechanism applies for high pressure carbon dioxide processing, it

provides details on how this gas can be inhibitory or lethal for microorganisms.

Insert Figure 3 here.

The aerobic spoilage microorganisms do not grow in the presence of CO2. The tolerance

to carbonation provides a selective advantage to certain facultative anaerobic yeasts, such as

Dekkera spp, including Dekkera anomala, which is able to grow in the presence of up to 4.45

volumes of CO2 (Ison and Gutteridge, 1987). Z. bailli and Hansenula anomala are tolerant up

to 3.34 volumes of CO2, while Kluyveromyces lactis, S. cerevisiae, Schizossacaharomyces

pombe and Z. microellipsoides are moderately tolerant up to 2.23 volumes of CO2. Lactic

bacteria are microaerophilic, displaying the ability to grow in an atmosphere containing above

1.5 volumes of CO2, which is similar to the environment of most soft drinks (Lawlor et al.,

2009).

2. Final remarks

Soft drinks have intrinsic characteristics that provide conditions for the growth of a select

group of microorganisms. Oxidative and fermentative yeasts are the main spoilage

microorganisms, since they withstand acidic pH, high CO2 concentrations, and some species

are even resistant to the usual amounts of preservatives used in the formulation of soft drinks.

Lactic acid bacteria also survive at low-pH and low oxygen-tension environments and are

normally associated with quality of ingredients and with hygienic conditions of the process (as

they are capable of forming biofilms). Both filamentous fungi and acetic bacteria will multiply

in case of carbonation losses that mainly occur in PET bottles.

Measures to ensure the microbial stability of soft drinks must consider aspects related to

ingredients, formulation and processing. Introduction of contaminated ingredients can result in

product contamination even when validated CCPs (critical control points) are employed in the

45
process. In this context, juice is the ingredient that turns carbonated soft drink more vulnerable

to spoilage. Juice can introduce most of microbial contaminants in the process environment and

in the beverage per se, such as yeast and molds, heat resistant molds, lactic acid bacteria and

Alicyclobacillus. Given this, the juice must be pasteurized prior to be added to soft drinks.

Despite this, it is known that Alicyclobacillus spores are able to survive through the heat

pasteurization process applied in fruit, vegetable, and fruit/vegetable-based juices, fruit

concentrates and purees, sugar, sugar syrups, tea, isotonic drinks and other acidic products

(Chang and Kang, 2004, Spinelli et al., 2009, McKnight et al., 2010). Despite this, the

carbonation of soft drink avoids the germination of spores and hinders the outgrowth of

Alicyclobacillus, preventing spoilage of these products by these microorganisms.

When formulating soft drinks, the control of the pH, the carbonation process and the

concentration of preservatives comprise essential measures for inhibiting the growth of

potential spoilage microorganisms present in the product. Other critical aspects that

complement the range of measures applied in order to ensure the production of shelf-stable soft

drinks comprise the control of hygiene of equipment, process environment and packaging.

Failure to clean and sanitize equipment, gasket, valves, filler heads components, and filler

valves could lead to biofilm formation, providing substrates for the growth of aciduric

microorganisms (Lawlor et al., 2009, Clavero, 2010), for example, lactic acid bacteria,yeast

and molds (Srey et al., 2013). Additionally to the recontamination of final products, biofilm can

also enhance the resistance of microorganisms to disinfectants (Sidhu et al., 2001). Improper

sanitation practices, particularly in filling machine-associated equipment, including the filler

itself, tanks and pumps, have generally contributed to spoilage incidents (Clavero, 2010). Thus,

the development of an efficient sampling and testing program of product contact surfaces before

operations can provide a good indication of the efficacy of cleaning and sanitation program

(Kornacki, 2010). This is highly important as most spoilage problems and recalls arise from

46
contamination of the processing environment. Further developments in microbiology of

carbonated soft drinks should take place in the upcoming years considering all challenges

imposed by consumers’ aspirations toward naturalness, food safety and wellness.

Acknowledgements

The authors would like to thank the support provided by Conselho Nacional de

Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) and Coordenação de Aperfeiçoamento de

Pessoal de Nível Superior (CAPES).

Figure captions

Figure 1: General flowchart for soft drink processing.

Water
treatment

Extract or juice Sugar Water CO2 Additives

Sugar Reception
Reception
Storage Reception
Storage
Mixing (simple syrup)
Storage
Pasteurization

Filtration

Refrigeration

Mixing (compound syrup)

Dilution

Carbonation
47
Filling
Figure 2: Schematic representation of the mode of action of organic acids in the yeast cell. The

weak acid undissociated in the extracellular acidic environment diffuses through the membrane

into the cytoplasm (neutral pH), occurring the dissociation that results in intracellular

acidification and accumulation of protons and anions. The preservative resistance mechanism

includes: (1) reduction of the acid into the cell, (2) increasing the ability of expelling H+, (3)

converting the conservative into an innocuous compound, and (4) inducing anions extrusion.

Reproduced from Loureiro (2000), with permission.

48
Figure 3: Schematic diagram of the lethal effect of CO2 on bacteria. The numbers in the circles

mean: 1) phospholipids layer, 2) integrating membrane proteins 3) H +-ATPase enzyme, and 4)

intracellular substances. Reproduced from Garcia-Gonzales et al (2007), with permission.

49
Table 1: Yeasts associated with soft drink ingredients, processing, environment and final
products.

Source Specie Reference

Wasps Candida davenportii sp Stratford et al., 2002.
Fruit soft drinks, and Z. rouxii, Rhodotorula Morais et al., 2003.
guarana mucilaginosa, Criptococcus
albidus
Soft drink orange flavor S. cerevisiae Ndagijimana et al., 2004.
without essential oils and
artificial coloring
Glass bottle, cork, rinse Saccharomyces, Pichia, Rocha, 2006.
water, process water, sugar, Hansenula,
ambient air, filler spout, Zygosacharomyces,
metal plug Kloeckera and Rhodotorula.
Soft drink orange flavor, Debaromyces hansenii, D. Ancasi et al., 2006.
apple polymorphus, Z. bailii,
Pichia anômala, P.
subpelliculosa, P. jadinii

50
 CAPÍTULO III

SEGURANÇA DO ALIMENTO: PERCEPÇÃO DOS CONSUMIDORES SOBRE OS

ADITIVOS ALIMENTARES.

51
Resumo

O objetivo do presente estudo foi avaliar a percepção dos consumidores no tocante a segurança
dos aditivos em alimentos. O projeto de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética em
Pesquisa (COMEP) da Universidade Castelo Branco, sob o protocolo 015/2016. A partir da
aplicação de um conjunto de afirmativas estruturadas, na forma de survey, os respondentes
tiveram acesso a questões e a uma escala de respostas, baseada em cinco pontos, de acordo com
Likert. Dados demográficos referentes a gênero, idade, educação e renda familiar foram
incluídos na pesquisa. Em um segundo momento, avaliou-se o impacto da transmissão das
informações sobre aditivos alimentares, em especial o corante artificial amarelo tartrazina, na
aceitação de balas mastigáveis. Foram recrutados 100 voluntários, que participaram de três
sessões. Em todas as sessões, o julgador recebeu uma ficha para cada amostra em que foi
solicitado indicar em escala hedônica de 7 pontos sua aceitação do produto. Os resultados
obtidos foram analisados pelo teste do qui-quadrado (χ2) e ANOVA. De acordo com o teste do
χ2, constatou-se diferença significativa (p<0,05) no tocante ao gênero e renda. As mulheres
demonstraram menor confiança no consumo de alimentos que contêm aditivos e nas instituições
regulamentadoras do que os homens. Os consumidores com renda acima de 10 salários mínimos
concordaram que os aditivos podem formar compostos tóxicos nos alimentos. Os consumidores
reconheceram o papel dos aditivos, bem como as reações adversas promovidas pelos corantes
artificiais. Entretanto, possuem dificuldade na interpretação dos rótulos dos alimentos.
Observou-se que a percepção do risco não impacta diretamente a atitude assumida pelo
consumidor. Destaca-se a necessidade de uma comunicação de risco mais efetiva por parte dos
órgãos regulamentadores.

Palavras-chave: rótulo, educação do consumidor, tartrazina, benzeno, 4-metil imidazol.

52
FOOD SAFETY: CONSUMER´S PERCEPTION ABOUT THE FOOD ADDITIVES

Abstract

The aim of this study was to evaluate consumers’ safety perception of additives in processed
foods, via survey questionnaire based on five points according to Likert. The research project
was approved by the Research Ethics Committee (COMEP) of the Castelo Branco University,
under protocol 015/2016. Demographic data on gender, age, education and household income
were included. This study also evaluated the impacts of information transmission on food
additives, particularly tartrazine, in a candies’ liking. Hundred consumers were recruited to
participate in three sessions. In all sessions, the judge received a leaflet for each sample to
indicate in 7-point hedonic scale liking of the product. The results were analyzed by chi-square
test (χ2) and ANOVA. According to χ2 test, it was found a significant difference (p <0.05) with
respect to gender and income. The women showed less confidence in the consumption of foods
containing additives and the food regulatory than men. Consumers with incomes above 10
minimum agreed that additives could form toxic compounds in food. Consumers have
recognized the role of the additives as well as adverse reactions promoted by artificial colorants.
However, they have difficulty in interpreting food labels. It was observed that the perception of
risk does not affect the attitude assumed by the consumer. This study suggests that a effective
risk communication by the governement must be developed.

Key-words: label, consumer’s education, tartrazine, 4- methylimidazole.

53
1 Introdução

A partir da segunda metade do século XX, observou-se uma redução no consumo de

alimentos in natura e o consequente aumento da demanda por alimentos industrializados. Essa
mudança foi influenciada por diversos fatores, como melhoria do poder aquisitivo das famílias,
a influência da mídia, a urbanização das cidades, a globalização, a atuação profissional da
mulher e a praticidade que tais produtos proporcionam. Desse modo, os aditivos químicos
tornaram-se cada vez mais prevalentes na dieta, reforçando a necessidade de uma
regulamentação rigorosa, suscitando dúvidas e discussões envolvendo a comunidade científica,
os consumidores, a indústria e os órgãos regulamentadores quanto aos efeitos adversos à saúde
desencadeados por essas substâncias, a partir do elevado número de estudos que produzem
resultados conflitantes. Pode-se afirmar que a controvérsia dos aditivos alimentares reside entre
a necessidade e a segurança do uso (POLÔNIO e PERES, 2009; TOLONI et al., 2011;
VARELA e FISZMAN, 2013).
De fato, os produtos industrializados geralmente vêm acompanhados de quantidades
excessivas de açúcares, gorduras, sódio e aditivos que podem causar doenças tais como as
crônico-degenerativas, alergias e intolerâncias alimentares, alterações neurocomportamentais e
carcinogenicidade (McCANN et al., 2007; KEMP, 2008; MEHEDI et al., 2009; POLÔNIO e
PERES, 2010; CONCEIÇÃO e SOUSA, 2011). Entretanto, importa considerar que o emprego
dos aditivos só se justifica por razões tecnológicas, nutricionais ou sensoriais (BRASIL, 1997),
não devendo substituir as boas práticas de fabricação e não exceder os limites estabelecidos de
Ingestão Diária Aceitável (IDA). A IDA é a quantidade de um aditivo alimentar, que pode ser
ingerida diariamente e de forma crônica, expressa em miligramas por quilo de peso corpóreo,
sem provocar danos à saúde (BRASIL, 2009). A IDA é baseada na dose de uma substância que
quando administrada num extenso período de tempo, não produza efeitos tóxicos aparentes ou
nível de efeito não observável – NOEL (no observed effect level), que pode ser extrapolado
para o homem, através de um fator de segurança (100, por exemplo). Cabe acrescentar que esse
fator leva em consideração a heterogeneidade da população humana e ainda a diferença entre
animais e homens (MÍDIO e MARTINS, 2000).
Para a aprovação do uso de aditivos alimentares, com seus respectivos limites máximos
e categorias de alimentos permitidas, faz-se necessário uma avaliação toxicológica, sendo as
principais referências: as monografias toxicológicas do Joint FAO/WHO Expert Committee on
Food Additives (JECFA), que é um comitê científico que realiza a avaliação de segurança de
uso de aditivos; assessorando o Codex Alimentarius em suas decisões, a Autoridade Europeia
54
em Segurança Alimentar – European Food Safety Authority (EFSA) e o FDA (Food and Drug
Administration) nos Estados Unidos (CAROCHO et al., 2014). É importante esclarecer que as
harmonizações internacionais servem de base para a internalização de legislações nacionais e
no âmbito do MERCOSUL- Mercado Comum do Sul.
A Portaria nº 540 de 27/10/1997 (BRASIL, 1997) estabelece os princípios fundamentais
referentes ao emprego de aditivos alimentares. De acordo com esta legislação, aditivo alimentar
é qualquer ingrediente adicionado intencionalmente aos alimentos, sem propósito de nutrir, com
o objetivo de modificar as características físicas, químicas, biológicas ou sensoriais, durante a
fabricação, processamento, preparação, tratamento, embalagem, acondicionamento,
armazenagem, transporte ou manipulação de um alimento. Ao agregar-se, poderá resultar em
que o próprio aditivo ou seus derivados se convertam em um componente de tal alimento.
Ainda, de acordo com o Codex (CODEX/GSFA, 2015), aditivo alimentar é qualquer substância
que não se consome como alimento nem tampouco se utiliza como ingrediente básico.
A declaração de aditivos alimentares deve fazer parte da lista de ingredientes, na
rotulagem dos alimentos, constando nesta a função principal ou fundamental do aditivo no
alimento e seu nome completo ou seu número INS (Sistema Internacional de Numeração, Codex
Alimentarius FAO/OMS), ou ambos (Resolução RDC n.º 259/2002 – ANVISA) (BRASIL,
2002).
As informações presentes nos rótulos dos alimentos industrializados constituem em
uma fonte auxiliar às escolhas alimentares e conferem à rotulagem o caráter de uma atividade
de promoção da saúde, configurando-se num elo de comunicação entre as indústrias e os
consumidores. A rotulagem dos alimentos orienta o consumidor sobre a quantidade e a
qualidade dos constituintes nutricionais dos produtos, auxiliando escolhas alimentares mais
apropriadas (TABAI et al., 2006).
Vários episódios, veiculados na mídia, têm levado os consumidores a questionarem a
segurança dos alimentos, em especial dos refrigerantes. Em 2009, a PROTESTE - Associação
de Consumidores, ao analisar 24 amostras de bebida sabor laranja, de diferentes marcas,
detectou a presença de benzeno em 7 amostras; em duas amostras, a concentração de benzeno
estava acima dos limites considerados aceitáveis para a saúde humana (PROTESTE, 2009). O
ministério público federal se mobilizou em conjunto com os órgãos de defesa do consumidor,
resultando na assinatura de um termo de ajustamento de conduta (TAC) pelos maiores
fabricantes da bebida, que se comprometeram a manter o teor de benzeno nas bebidas
semelhante ao estipulado pela legislação para água potável (5 µg/L) (PROTESTE, 2011).

55
 Em 2012, o PROTESTE divulgou dados de análises conduzidas pelo CSPI (Center for
Science in the Public Interest), que revelaram que refrigerantes tipo cola, vendidos no Brasil
contêm 267 µg (microgramas) em 355 mL de 4-MI (4- metil imidazol), sendo essa concentração
cerca de 5 vezes maior do que a encontrada nas bebidas comercializadas na China, por exemplo.
Esse composto pode ser encontrado no corante caramelo classe IV10ou 150d (obtido pelo
processo sulfito-amônia) utilizado para conferir cor em bebidas tipo cola e guaraná. O 4-MI foi
avaliado pela IARC (International Agency for Research on Cancer) como possivelmente
carcinogênico ao homem (IARC, 2010; PROTESTE, 2012).
Tendo em vista a importância do tema e a escassez de pesquisas com esse enfoque, o
presente estudo objetivou (i) avaliar a percepção dos consumidores com relação a segurança
dos aditivos em alimentos processados; (ii) investigar o efeito da transmissão de informações
sobre os aditivos alimentares, em especial o corante amarelo tartrazina, na aceitabilidade de
balas mastigáveis utilizadas como estímulo.

2 Material e Métodos

2.1 Estudo I- Percepção do consumidor sobre a segurança dos aditivos em alimentos

processados.

A partir de perguntas e respostas sobre aditivos alimentares disponibilizadas no site da

Anvisa11 - Agência Nacional de Vigilância Sanitária, elaborou-se um conjunto de afirmativas
estruturado na forma de survey. A aplicação do questionário foi realizada através do envio por
e-mail, solicitando o preenchimento, disponível através de um link de acesso direto ao usuário
entrevistado. A difusão da pesquisa foi caracterizada como uma amostra não probabilística por
conveniência (CARRILO, VARELA e FISZMAN, 2012) e foi obtida por meio das redes de
contatos pessoais da equipe de pesquisa. O estudo ainda coletou dados socioeconômicos e

10
Os corantes caramelos são misturas complexas de componentes, elaborados a partir do aquecimento
de carboidratos (como glicose ou frutose), com ou sem ácidos, substâncias alcalinas ou sais, sendo
classificados de acordo com os reagentes usados na sua fabricação. O caramelo IV é preparado pelo
aquecimento de carboidratos com ou sem substâncias ácidas ou alcalinas, na presença de compostos
amônia e sulfitos, cujo teor de 4 MI não deve exceder a 200mg/kg de produto (BRASIL, 2015).
11
Disponível em :
http://portal.anvisa.gov.br/wps/portal/anvisa/anvisa/busca/!ut/p/c4/04_SB8K8xLLM9MSSzPy8xBz9CP0os3jvQ
A9PdwMDI0v_EAsXA0-
TkPerCAPS29nfzdDQ_2CbEdFAMdr5_s!/?1dmy&urile=wcm%3Apath%3A//Anvisa%20Portal/Anvisa/Pergunt
as%20Frequentes/Alimentos/a9fa1e00404f94f9a364ab89c90d54b4. Acesso em 13 Jan.2013

56
demográficos dos participantes. Os respondentes leram cada uma das afirmativas (Quadro 1) e
expressaram o grau de concordância e discordância de cada item através da escala de Likert12
de 5 pontos.

Quadro 1. Afirmativas apresentadas no formato de survey

Questões

É seguro o uso de aditivos alimentares autorizados pela Anvisa.

É seguro comprar alimentos que contenham aditivos.

Os aditivos servem para melhorar o valor nutritivo, conservação, estabilidade e

aparência dos alimentos.

Os aditivos alimentares são informados no rótulo dos alimentos.

Aditivos podem formar compostos tóxicos nos alimentos.

Corantes artificiais podem causar reações alérgicas nos consumidores.

Após a coleta das respostas, os itens da escala receberam os valores atribuídos a cada
categoria: na categoria “concordo totalmente” foi computada a nota 5; na categoria “concordo”
foi computada a nota 4, a nota 3 foi computada como “não concordo nem discordo (não sei); a
nota 2 foi computada como discordo e a nota 1 na categoria “discordo totalmente”.

2.2 Estudo II- Impacto da informação sobre aditivos alimentares, em especial corantes
artificiais, na aceitação de balas mastigáveis.

Os dados foram coletados em uma amostra obtida por conveniência, composta por
alunos de graduação em Nutrição de uma universidade particular localizada no Rio de Janeiro.
O critério de seleção da amostra foi a facilidade de acesso a esses alunos. Os 100 alunos,
maiores de 18 anos, foram recrutados aleatoriamente e divididos em cinco grupos. Houve
predominância do gênero feminino, característico dos estudantes dessa área de formação. Para
a condução do teste, utilizou-se uma amostra de bala mastigável recheada e drageada, de
diferentes sabores, colorida e aromatizada artificialmente como estímulo.

12
Embora a escala de Likert possua limitações em relação ao seu uso como variável intervalar, ela é amplamente
utilizada para a análise de comportamento do consumidor (BEARDEN e NETEMEYER, 1999).
57
 Os testes de aceitação foram realizados em cabines individuais, divididos em três
sessões, que foram aplicadas com intervalo de uma semana cada.
Na primeira sessão, os voluntários degustaram a amostra do produto, codificada com 3
dígitos, sem obter qualquer informação prévia sobre a sua composição. Na segunda sessão foi
apresentado ao voluntário um texto informativo sobre o corante amarelo tartrazina (Figura 6),
com base no informe técnico n.30 de 24 de Julho de 2007 (BRASIL, 2007) da Anvisa.
Posteriormente, o voluntário recebeu um cartão (Figura 7) que descrevia a lista de ingredientes
do produto, de acordo com o rótulo. Na terceira sessão, o voluntário recebeu a mesma amostra
de bala mastigável (da sessão 1) e o cartão com a lista de ingredientes.
Em todas as sessões, o julgador recebeu uma ficha para cada amostra em que foi
solicitado indicar em escala hedônica de 7 pontos (com extremos entre gostei extremamente-
desgostei extremamente) sua aceitação do produto. A escala hedônica foi utilizada com o
objetivo de reconhecer as atitudes do consumidor antes e após ter acesso ao conteúdo técnico
descrito no rótulo da bala.
Para a realização da análise de frequência dos escores hedônicos para cada amostra e
sessão, considerou-se os escores entre 5-7 como positivos, sinalizando que os consumidores
gostaram da amostra e os escores de 1-4 como negativos, indicando que os consumidores não
gostaram da amostra, de acordo com o proposto por Milagres et al., 2014.
É importante esclarecer que o projeto de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética em
Pesquisa (COMEP) da Universidade Castelo Branco sob o número de protocolo 015/16.

Estudos realizados demonstraram casos de reações alérgicas

ao corante amarelo tartrazina como asma, bronquite, rinite,
náusea, broncoespasmos, urticária, eczema e dor de cabeça.
A declaração do nome tartrazina por extenso nos rótulos dos
alimentos que o contém é obrigatória segundo a resolução
n.340/2002 da Anvisa – Agência Nacional de Vigilância
Sanitária.
Figura 6: Texto informativo sobre o corante amarelo tartrazina.

58
 Ingredientes: açúcar, xarope de glicose, gordura vegetal,
maltodextrina, gelatina bovina, acidulantes (ácido cítrico,
ácido málico, ácido láctico), aromatizantes, estabilizante
lecitina de soja, espessante goma arábica, glaceante cera de
carnaúba, corante inorgânico dióxido de titânio, corantes
artificiais (vermelho 40, amarelo tartrazina, amarelo
crepúsculo, azul brilhante).
Figura 7: Lista de ingredientes retirada do rótulo da amostra testada.

2.3 Análise Estatística

O programa xlstat-sensory analysis and costumer insight versão 2014 (Addinsoft Inc.)
foi usado para a avaliação dos dados coletados na pesquisa. O teste de Qui-quadrado (χ2) e a
análise de variância (ANOVA) foram empregados para a significância estatística de p<0,05.
O coeficiente alfa de Cronbach calculado foi de aproximadamente 0,7. O alfa de
Cronbach é um coeficiente de confiabilidade utilizado para medir a consistência interna do
questionário. Seu valor pode variar de 0 – 1. Valores entre 0,6 – 0,7 indicam confiabilidade
aceitável (KLINE, 1999).

3. Resultados e Discussão
3.1. I- Percepção do consumidor sobre a segurança dos aditivos alimentares em
alimentos processados.
Dos 110 respondentes, 6 foram descartados pois não atenderam aos critérios de inclusão.
A adesão ao questionário foi de 94,5%. Os dados socioeconômicos e demográficos são
apresentados na Figura 8.

59
 Pós-graduação
Superior
Ensino médio
Ensino Fundamental

Acima de 20 salários mínimos

11 a 20 salários mínimos
4 a 10 salários mínimos
1 a 3 salários mínimos

mais de 51 anos
mais de 31 a 50 anos
mais de 15 a 30 anos

Masculino
Feminino
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80%

(*) sm= 1 salário mínimo que na época da entrevista correspondia a R$802,53.

Figura 8. Características sócio demográficas da população em estudo (n=104).

Do total de participantes, 72% era composto de mulheres com idade de 21 a 30 anos.

Em relação a variável renda familiar, a maioria (53,9%) pertencia ao estrato de 4 a 10 salários
mínimos e somente 6% possuía renda superior a 20 salários mínimos. Quanto a escolaridade,
observou-se que um percentual representativo havia cursado o ensino superior, sendo que a
maioria dos respondentes (54,8%) cursou pós-graduação.
De acordo com o teste do χ2, constatou-se diferença significativa (p<0,05) na percepção
da segurança do uso de aditivos no tocante ao gênero e renda. Observou-se que as mulheres
demonstraram menor confiança no consumo de alimentos que contenham aditivos do que os
homens. Fonseca e Salay (2005) verificaram que os homens possuem maior preocupação
referente aos perigos químicos, destacando-se os agrotóxicos, conservadores, corantes e
produtos químicos em geral. Por outro lado, as mulheres são mais preocupadas com a saúde e
com a segurança do alimento do que os homens (MENDES, 2002; SHIM et al., 2011). Neste
sentido, as mulheres têm atitude mais reticente em relação a novas tecnologias no processo de
industrialização, especialmente no tocante aos OGMs (Organismos Geneticamente
Modificados) e a irradiação do que os homens (COSTA-FONT et al., 2008; BIEBERSTEIN e
ROOSEN, 2015). No presente estudo, a percepção negativa das mulheres se estendeu ainda a
regulamentação dos aditivos pela Anvisa, pois discordaram (escore médio =2,04) que os
aditivos aprovados sejam seguros, refletindo a perda de confiança nas instituições relacionadas
as questões da segurança dos alimentos. Neste contexto, a percepção do risco por parte do
consumidor torna-se maior. Para Hansen et al. (2003) a avaliação de risco de um aditivo

60
alimentar é um processo complexo, de âmbito científico e de difícil entendimento para o
consumidor leigo.
Os respondentes com renda acima de 10 salários mínimos, independente do gênero,
concordaram que os aditivos podem formar compostos tóxicos nos alimentos. Pode-se inferir
que pessoas com alta renda e consequentemente maior escolaridade (SALVATO, FERREIRA
e DUARTE, 2010) tem uma percepção melhor acerca da relação entre a dieta e saúde. O
consumidor atual, em face ao aumento do acesso às informações, tornou-se mais exigente
(SPERS, 2003) apresentando a preocupação em adquirir alimentos que não causem danos à
saúde, principalmente quando tem notícia de que algum produto colocado no mercado não está
em conformidade com as normas de higiene e segurança. Há uma relação direta entre as
divulgações desfavoráveis veiculadas na mídia e o consumo de determinado alimento envolvido
em uma crise de segurança (BARRETO, 2014).
Levando-se em consideração o total de respondentes (62,5%), observou-se que os
mesmos reconheceram a função, ou seja, a que se destinam os aditivos nos alimentos,
destacando-se como um dado positivo. Pesquisa realizada com universitários demonstrou que
64,6% desconheciam o que era um aditivo e admitiram (58,8%) que não pagariam mais caro
por um produto sem aditivo, justificando que o preço seria um fator determinante para a sua
escolha negativa (PIMENTA, 2003). Este fato evidencia que consumidores mais conscientes
apresentam um melhor poder de escolha.
Um dado interessante é que 86,5% dos entrevistados apresentaram conhecimento a
respeito das reações adversas promovidas pelos corantes artificiais, entretanto, desconhecem
que o rótulo é a principal fonte de informação sobre os aditivos. Este resultado sugere que os
consumidores não buscam a informação sobre os ingredientes e aditivos no rótulo.
Adicionalmente, o consumidor tem dificuldade em compreender o código através do qual o
aditivo é representado, de acordo com o sistema numérico internacional de aditivos ou mesmo
o nome específico do aditivo. Embora o consumidor tenha por hábito a leitura do rótulo,
observando como primeira informação a data de validade, seguido das calorias e composição
nutricional e por fim, o modo de preparo do produto (MACHADO et al., 2006) a dificuldade
em pronunciar o nome dos aditivos, confere as pessoas leigas, uma impressão de
desconhecimento e consequentemente aumenta a percepção de risco à saúde (SONG e
SCHWARZ, 2009; KOYRATTY, AUMJAUD e NEELIAH, 2014).

61
 3.2. Estudo II – Impacto da informação sobre aditivos alimentares, em especial
corantes artificiais, na aceitabilidade de balas mastigáveis.
O resultado da análise de frequência (Figura 9), permitiu observar que houve um
aumento do percentual de escores negativos quando foi fornecida a informação sobre o corante
amarelo tartrazina e quando os voluntários foram apresentados ao rótulo do produto. Na
primeira sessão, o escore médio de aceitação foi de aproximadamente 6, sinalizando que os
consumidores gostaram da amostra testada. Após terem acesso as informações sobre a tartrazina
e ao conteúdo do rótulo, o escore médio de aceitação foi aproximadamente 5, correspondente
ao termo hedônico não gostei/nem desgostei. Na terceira sessão, o mesmo escore se manteve.
A análise de variância (ANOVA) não indicou diferença significativa (p>0,05) nas três sessões
realizadas.

88%
90%
80%
80% 71%
70%

60%

50%

40%
29%
30%
20%
20% 12%

10%

0%
escore escore escore escore escore escore
positivo negativo positivo negativo positivo negativo
1a sessão 2a sessão 3a sessão

Figura 9: Frequência de escores (positivos/negativos) atribuídos pelos consumidores nas três

sessões.

Pode-se afirmar que os voluntários não se mostraram suficientemente sensibilizados a

respeito do risco, que a presença do corante, em especial a tartrazina pode representar à saúde
deles, conferindo maior importância ao sabor do produto. Isto reflete a distância entre a
percepção do risco e a atitude assumida pelo consumidor. Cabe considerar se o comportamento
apresentado pelo grupo analisado é cultural. Em estudo conduzido na Alemanha, BEARTH,
COUSIN e SIEGRIST (2014) observaram uma preocupação por parte dos consumidores, com

62
os corantes artificiais, até superior a existente em relação aos edulcorantes, tendo sido relatadas
reações negativas e termos como inúteis, nocivos e prejudiciais, principalmente às crianças,
fraude e camuflagem.
Outro ponto a ser considerado é que o grupo pesquisado envolveu estudantes
universitários, que habitualmente ingerem uma quantidade acentuada de doces, chocolates e
biscoitos em períodos de maior atividade acadêmica como forma de aliviar o estresse físico e
mental (DUARTE, ALMEIDA e MARTINS, 2013). Neste contexto, a presença de corantes
artificiais nos alimentos consumidos adquire uma importância secundária.

4.Conclusão

Os resultados obtidos no presente estudo podem servir como incentivo para a criação de
mecanismos que resultem em uma comunicação de risco mais efetiva por parte dos órgãos
regulamentadores, de forma a tornar o consumidor capaz de tomar decisões mais acertadas no
momento da compra de um alimento. A interatividade com o consumidor pode ser delineada
através de campanhas de esclarecimento com vistas à função dos aditivos alimentares,
rotulagem, toxicidade e aspectos relacionados a regulamentação. O papel da mídia neste
contexto é de fundamental importância, devendo-se atentar, entretanto, para divulgações que
reflitam opiniões tendenciosas e/ou alarmistas.
Outro ponto a se considerar é a adoção de estratégias relacionadas a educação para o
consumo, um dos direitos fundamentais previstos no Código de Defesa do Consumidor (CDC).
Os consumidores, uma vez conscientes, podem ter papel fundamental no estímulo à produção
de alimentos com apelo mais natural e saudável, adequados ao conceito clean label. Neste
sentido, não há uma definição legal para este termo, porém tem como premissa o uso de nomes,
na lista de ingredientes, que pareçam familiar ao consumidor, transmitindo a percepção da
ausência de “químicos” como ingredientes.
Espera-se que pesquisas como esta possam contribuir na consolidação de um
mecanismo eficiente para a construção das políticas públicas de segurança dos alimentos,
através do maior acesso à alimentação segura, especialmente aumentar o consumo seguro de
aditivos alimentares.
Apesar dos avanços, a inocuidade dos alimentos no Brasil ainda é um desafio. Por isso,
se faz necessário legitimar algumas políticas que estão sendo feitas nessa área.

63
 CAPÍTULO IV

DESENVOLVIMENTO DE REFRIGERANTE DE LARANJA ADICIONADO DE

CONCENTRADO DE CENOURA E MAÇÃ

64
Resumo
A cor é um dos atributos mais importantes na aquisição do alimento pelo consumidor. Embora
de caráter subjetivo, é fundamental na indução da sensação global resultante de parâmetros
como o aroma, o sabor, textura e a doçura dos alimentos. O objetivo do presente estudo foi
desenvolver uma formulação de refrigerante de laranja adicionado de concentrado de cenoura
e maçã. Em paralelo, desenvolveu-se uma formulação controle contendo corantes artificiais
(amarelo tartrazina e amarelo crepúsculo). O projeto de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de
Ética em Pesquisa (COMEP) da Universidade Castelo Branco sob o protocolo 016/16. Foram
realizadas análises físico-químicas, microbiológicas e sensorial das formulações durante o
período de armazenamento de 150 dias. Observou-se o atendimento ao padrão de identidade e
qualidade e estabilidade das formulações em relação aos parâmetros físico-químicos.
Entretanto, na análise colorimétrica observou-se uma degradação de cor perceptível ao
consumidor na amostra contendo o concentrado de cenoura e maçã. No que se refere as análises
microbiológicas, ambas as formulações atenderam aos parâmetros preconizados pela
legislação. A contagem de bolores e leveduras apresentou crescimento de 1 ciclo log na
formulação contendo o concentrado de cenoura e maçã, sugerindo que a robustez da matriz
desenvolvida pode ser afetada, se as condições de higienização da linha de processamento não
forem observadas. Em relação a análise sensorial, os provadores (n=120) selecionados eram em
sua maioria, homens (78%), adolescentes, habitualmente consumidores de refrigerantes. Os
voluntários avaliaram 8 amostras durante cada sessão, sendo 6 amostras oriundas do comércio.
Utilizou-se escala hedônica estruturada de 9 pontos, em que 9 representava a nota máxima
“gostei muitíssimo” e 1 a nota mínima “desgostei muitíssimo”. Para avaliação da cor, utilizou-
se escala JAR ancorada nos termos 1 “extremamente menos do que o ideal” a 9 “extremamente
mais do que o ideal”. Verificou-se que a cor foi a característica sensorial que mais influenciou
os consumidores com relação a aceitabilidade das amostras, sinalizando que esse parâmetro
interferiu, de forma significativa na avaliação do sabor e aparência. Este estudo demonstra que
os consumidores ainda não estão habituados ao emprego de corantes naturais nas formulações
de alimentos e bebidas, mantendo como parâmetro para avaliação de cor, os corantes sintéticos
comumente empregados.

Palavras-chave: bebida carbonatada, carotenoide, cor, amarelo crepúsculo, tartrazina.

65
DEVELOPMENT OF AN ORANGE SODA WITH APPLE AND CARROT
CONCENTRATE.

Abstract
Color is one of the most important attributes in the acquisition of food by consumers. Although
its subjective character, it induces the sensation resulting from global parameters such as the
aroma, the taste, texture and sweetness of the food. The aim of this study was to develop an
orange soda formula with carrot and apple concentrate. In parallel, we developed a standard
formula containing tartrazine and sunset yellow. This research project was approved by the
Research Ethics Committee (COMEP) of the Castelo Branco University under protocol
016/2016. Physicochemical and microbiological parameters were performed during the period
of 150 days. It was observed that there were no changes in physicochemical parameters.
However, the colorimetric analysis revealed a short shelf life in the sample containing the carrot
and apple concentrate. Regarding microbiology, both formulations were according to regulation
by public health agencies. The yeasts and molds counts presented 1 log cycle growth in the
formula containing carrot and apple concentrate, suggesting that the robustness of the
developed matrix may be affected, if the hygiene conditions of processing line sanitation are
not observed. Regarding sensory analysis, the consumers (n = 120) selected were mostly men
(78%), in the age group of teenages, usually soft drinks consumer’s. The volunteers rated 8
samples during each session; 6 samples were come from the trade. It used 9-point hedonic scale,
in which 9 represented “like extremely” and 1 “dislike extremely”. JAR scales were used to
color evaluate anchored under 1"extremely less than ideal" and 9 "extremely more than ideal”.
It was found that the color was the sensory characteristic that most influenced consumers
regarding the acceptability of the samples, signaling that this parameter interfered significantly
in evaluating flavor and appearance. This study demonstrates that consumers are not yet
accustomed to the use of natural colours in food and beverage formula, keeping as a parameter
for color evaluation the commonly used artificial colors.

Key-words: carbonated beverages, carotenoid, color, sunset yellow, tartrazine.

66
 1. Introdução
A cor é uma propriedade sensorial com uma forte influência sobre a aceitação dos
alimentos e bebidas. Embora de caráter subjetivo, é fundamental na indução da sensação global
resultante de parâmetros como o aroma, o sabor, textura e a doçura dos alimentos. Isto pode
estar associado ao fato do homem “enxergar” sabores através da cor. Adicionalmente, a cor das
bebidas também pode influenciar a sensação de saciar a sede e refrescância (WEI et al., 2013).
É senso comum que durante o processamento vários fatores como luz, ar, temperatura, pH,
umidade e condições de armazenamento podem interferir na cor do produto final. Assim, surge
a necessidade do uso de aditivos alimentares que contribuam para restaurar, ou ainda,
uniformizar a cor dos produtos cujo tom original foi afetado (CEJUDO-BASTANTE et al.,
2014).
A Resolução da Comissão Nacional de Normas e Padrões para Alimentos – CNNPA –
nº 44 de 1977 definiu corante como a “substância ou mistura de substâncias que possuem a
propriedade de conferir ou intensificar a coloração do alimento e bebida”. A Portaria da
Secretaria de Vigilância em Saúde do Ministério da Saúde – SVS/MS – nº 540 de 1997, define-
o como a “substância que confere, intensifica ou restaura a cor de um alimento” (BRASIL,
1977; 1997). A classificação dos corantes é apresentada abaixo (Figura 10). A legislação
brasileira supracitada prevê o uso de 16 corantes artificiais, divididos em corantes que
propiciam tons amarelos (amarelo tartrazina, amarelo de quinoleína e amarelo crepúsculo), tons
vermelho a alaranjado (azorrubina, amaranto, vermelho 40, vermelho 2G, Ponceau, Litol rubina
BK), tons azul a esverdeado (azul patente, indigotina, azul brilhante, verde rápido FCF) e tons
marrom a preto (negro brilhante BN e marrom HT).

67
 Figura 10: Classificação de corantes de acordo com a Resolução no 44/CNNPA (1977).
Fonte: BRASIL (2015).
*Estrutura química semelhante a isolada de corante orgânico natural.
O corante caramelo classe I (INS 150a) é obtido através do aquecimento de carboidratos com
ou sem substâncias ácidas ou alcalinas, não sendo utilizados componentes de amônia e sulfitos,
portanto é um corante natural. Os corantes caramelo II, III e IV (respectivamente INS 150b, INS
150c e INS 150d) são classificados como corantes orgânicos sintéticos idênticos ao
natural, uma subcategoria distinta dos corantes artificiais.

Os corantes artificiais são extensamente utilizados pela indústria de alimentos, devido a

sua boa estabilidade e a seu poder de coloração, variedade de cores e tonalidades e sobretudo,
por apresentarem baixo custo. Entretanto, estudos demonstram que do ponto de vista
toxicológico, os corantes artificiais são mais danosos à saúde do que os corantes naturais,
devido a sua complexidade química, processo de síntese e presença de metais tóxicos
(LINDINO et al., 2008). Além das reações alérgicas, existem evidências relacionadas ao
consumo de corantes artificiais, como o amarelo tartrazina, e a ocorrência de patologias como
o déficit de atenção e a hiperatividade (McCANN et al., 2007; MASONE e CHANFORAN,
2015). Nesse contexto, o estudo conduzido por McCann ou Southampton Study deu origem as
novas diretrizes sobre a rotulagem de alimentos na União Europeia, que preconiza que os
alimentos fontes dos corantes artificiais sejam rotulados com a seguinte informação: pode ter
efeito adverso na atividade e atenção de crianças (EFSA, 2008), promovendo um aumento
considerável no mercado de corantes naturais na Europa (GHIDOUCHE et al., 2013).
Atualmente há uma grande demanda por ingredientes naturais, dado o apelo por uma
alimentação mais saudável, ausente de efeitos tóxicos e que promova benefícios à saúde. O uso

68
de pigmentos naturais em substituição aos corantes artificiais pela indústria de alimentos vem
sendo fomentado, embora ainda não haja um consenso sobre a segurança relacionada ao seu
uso, especialmente no que concerne ao pigmento carmim cochonilha, associado a reação
anafilática (MARTINS et al., 2016). Uma outra perspectiva para o uso de corantes naturais é a
necessidade de uma comunicação transparente entre consumidor e rótulo (KATZ e WILLIAM,
2011) seguindo o movimento clean-label, iniciado na Europa, que verificou que o novo
consumidor revela maior aceitação sobre produtos rotulados como orgânico, natural, livre de
aditivos e conservadores (INGREDION CONSUMER RESEARCH, 2014).
Pigmentos naturais são aqueles obtidos através de organismos vivos, sendo extraídos de
plantas, insetos, algas, cianobactérias, bactérias e fungos (SHAHID; SHAHID-UL-ISLAM;
MOHAMMAD, 2013). Além de colorir, as principais vantagens advindas do seu uso residem
nas suas propriedades antioxidantes, antimicrobianas, antidiabéticas e efeito
anticolesterolêmico (RODRIGUEZ-AMAYA, 2010; ALI E EL-MOHAMEDY, 2011;
PATAKOVA, 2013).
Os carotenoides são considerados os compostos bioativos de maior distribuição na
natureza (RODRIGUEZ-AMAYA, 2016). O principal papel dos carotenoides na dieta é a sua
capacidade de atuarem como precursores da vitamina A, função atribuída especialmente ao β-
caroteno, devido aos seus dois anéis β-ionona, que proporcionam 100% de atividade. Como os
carotenoides não são sintetizados pelo organismo humano, a obtenção desses compostos é
realizada pela dieta (RODRIGUEZ-AMAYA, KIMURA e AMAYA-FARFAN, 2008).
As propriedades biológicas envolvendo a atividade antioxidante dos carotenoides,
através da capacidade de sequestrar formas altamente reativas de oxigênio e desativar radicais
livres, têm sido objeto de estudo (RIOS, ANTUNES e BIANCHI, 2009). Adicionalmente, os
carotenoides são reconhecidos pelas suas atividades antiinflamatória, fotoprotetora da pele,
anticarcinogênico, na prevenção da catarata e na degeneração da mácula (SOMMER e VYAS,
2012; ELDAHSHAN e SINGAB, 2013).
A capacidade de colorir dos carotenoides também é bastante apreciada, sendo
particularmente aplicados em alimentos como margarinas, produtos extrusados, confeitos e
drageados, produtos lácteos, preparado de frutas, bebidas não alcóolicas, molhos, marinados,
coberturas e misturas de especiarias (CAROCHO, MORALES e FERREIRA, 2015).
Entretanto, a substituição dos corantes artificiais pelos naturais representa um desafio para a
indústria. Nesse contexto, os corantes naturais estão associados a proteínas e carboidratos que
podem interagir com matriz do alimento e promover reações secundárias, comprometendo,

69
dentre outros parâmetros, a estabilidade das formulações e consequentemente, o tempo de
prateleira do produto final (GHIDOUCHE et al., 2013). Por outro lado, o mercado global de
carotenoides alcançou 1.5 bilhões de dólares em 2014. A expectativa é de que até 2019 este
mercado alcance 1.8 bilhões de dólares, com uma taxa anual de crescimento de 3,9%, indicando
que possivelmente os corantes naturais possam ultrapassar os sintéticos em valor de mercado.
O β-caroteno ainda constitui o produto mais relevante desse segmento (MÄRZ, 2015),
representando uma oportunidade para a indústria de alimentos desenvolver produtos mais
naturais.
Face ao exposto, o objetivo do presente estudo foi (i) desenvolver um refrigerante de
laranja adicionado de concentrado de cenoura e maçã em substituição aos corantes artificiais
(amarelo crepúsculo e amarelo tartrazina) comumente utilizados; (ii) desenvolver uma
formulação convencional de refrigerante de laranja adicionado de corantes artificiais; (iii)
caracterizar as bebidas desenvolvidas quanto aos parâmetros físico-químico, microbiológico e
sensorial.

2. Material e Métodos
O trabalho experimental para elaboração da bebida foi dividido em 3 fases: i) seleção
do corante natural, ii) desenvolvimento das formulações, iii) produção do refrigerante.

2.1 Seleção do corante natural

Os critérios para a seleção do corante natural foram obtidos através de consulta a
literatura e em entrevista com gestores da indústria de bebidas, das áreas de qualidade,
desenvolvimento de produtos e gerente industrial. Os critérios elencados foram: Não
pertencer a classe de um corante sintético idêntico ao natural; não conter conservadores na
formulação. Nesse aspecto, alguns corantes naturais contêm sorbato de potássio; apresentar-se
na forma líquida, para aplicação em bebidas; apresentar boa solubilidade em água, pois a bebida
representa uma matriz aquosa; ser estável em pH ácido e a luz e fornecer tom amarelo
alaranjado para aplicação em bebida sabor laranja.
A partir das características citadas, elaborou-se uma lista com os principais fornecedores
de corantes naturais e realizou-se o contato com os mesmos através de participação em um
grande evento do setor de ingredientes alimentícios. Optou-se pelo concentrado de cenoura e
maçã (nome comercial: Exberry Laranja Outono) da empresa GNT.

70
2.1.1 Desenvolvimento das formulações
Os ingredientes das formulações testadas foram: água carbonatada, açúcar cristal, suco
de laranja, suco de limão, ácido cítrico, concentrado de cenoura e maçã, emulsão sem corantes,
emulsão com corante amarelo tartrazina e amarelo crepúsculo, sorbato de potássio, benzoato de
sódio e aroma natural de laranja.
As formulações foram desenvolvidas em um laboratório de uma indústria de
refrigerantes. Foram elaboradas duas formulações: a primeira contendo o concentrado de
cenoura e maçã denominada F 1 e a segunda caracterizada como controle (F 2) contendo os
corantes artificiais amarelo tartrazina e amarelo crepúsculo. A concentração adequada de cada
matéria-prima foi consensada através de testes de triagem sensorial realizados pelo grupo de
pesquisa e por técnicos da indústria supracitada. Ambas as formulações foram padronizadas
com teores de sólidos solúveis em 12 °Brix com adição de sacarose, pH fixado em 3,3 com a
utilização de ácido cítrico e carbonatadas com teor de CO2 igual a 3 volumes.

2.1.2 Produção do refrigerante

As formulações foram produzidas de acordo com o fluxograma (Figura 11).

71
 Água Açúcar

Ácido cítrico

Xarope simples

Xarope
acidificado
Ingredientes e
aditivos
Mistura

Xarope composto

Dosagem do xarope
composto em cada
embalagem PET

Adição de água
carbonatada

Arrolhamento

Estocagem

Figura 11. Produção de refrigerante de laranja.

As bebidas foram carbonatadas através de um post mix, conforme sugerido por ARORA
e AGGARWAL (2009) e imediatamente arrolhada em garrafas PET (polietileno tereftalato) de
600 mL. As bebidas carbonatadas foram estocadas por 150 dias a temperatura ambiente em
ausência de luz e foram analisadas no tempo zero e a cada 30 dias, a partir da data de produção.
O tempo de 150 dias foi selecionado por representar a extensão de 1 mês do prazo de validade
do refrigerante de laranja. Cinco amostras (n=5) dos lotes produzidos foram retiradas
aleatoriamente, para realização das análises microbiológicas e físico-química nos tempos
assinalados.

72
2.2 Análises físico-químicas
A estabilidade das bebidas desenvolvidas foi determinada através de análises de pH,
ATT - acidez total titulável (expressos em g/ 100 mL de ácido cítrico), sólidos solúveis totais
(SST), determinado à 20 °C com o auxílio de um refratômetro de bancada (ABBE EEQ-9001)
e o resultado expresso em (°Brix). As amostras foram descarbonatas e analisadas, em triplicata,
conforme metodologia descrita por Adolfo Lutz (2005). O volume de gás carbônico, foi
avaliado através de medidor do grau de carbonatação (ZEGLA).
Os resultados das análises físico-químicas foram avaliados estatisticamente por meio da
análise de variância (ANOVA), considerando valor de p<0,05. Médias com diferença
significativa entre si foram comparadas ao teste de Tukey, utilizando-se o software XLSTAT-
versão 2014 (Addinsoft Inc.).

2.2.1 Análise Colorimétrica

Os parâmetros colorimétricos foram determinados em colorímetro digital CR-400
(Konica Minolta Japão), com sistema CIELAB, escala L*a*b* e fonte de luz D65 (ângulo de
observação de 10º). Para cada amostra, cinco determinações foram realizadas. O sistema
CIELAB é composto pela variável L*, que significa luminosidade (brilho) e varia entre os
valores 0 a 100, tendo como limite o preto e o branco, respectivamente; a*, indica as
coordenadas cromáticas, sendo que a*+ direciona para o vermelho e a*- para o verde; e b*,
onde b*+ direciona para o amarelo e b*- para o azul. A partir das coordenadas de cores,
calculou-se o (∆Eab*), usando a fórmula: ∆Ea𝑏∗ = √∆L2 + ∆a2 + ∆𝑏 2

2.2.2 Análises microbiológicas

As bebidas desenvolvidas foram avaliadas de acordo com os parâmetros
microbiológicos para refrigerantes segundo a RDC nº12 de 02 de Janeiro de 2001(BRASIL,
2001). A metodologia executada foi a preconizada por DOWNES e ITO (2001). Além da
determinação de coliformes a 35 ºC adotada pela legislação supracitada, as contagens de bolores
e leveduras, bactérias lácticas, bactérias aeróbias estritas e leveduras resistentes a conservadores
foi executada. As amostras foram analisadas de acordo com a técnica de membrana filtrante.
Para a análise de coliformes a 35 ºC foram filtradas 5 porções de 10 mL do refrigerante
de forma a atender a especificação da legislação: ausência em 50 mL. O meio de cultura
utilizado foi o agar Chromocult (incubação a 35 °C/48h). Para a contagem de bactérias lácticas,

73
 a incubação do meio MRS (Man, Rogosa e Sharp) foi realizada em condições de microaerofilia
a 35 °C/72h. A contagem de bactérias aeróbias estritas foi conduzida em meio PCA (Plate Count
Agar) e incubação a 35 °C/48h. A contagem de bolores e leveduras foi realizada em Agar BDA
(Batata Dextrose Agar) acidificado até pH 3,5 com ácido tartárico 10 % e a incubação a
temperatura de 25 °C/3-5dias. O meio de cultura PRY (Preservative Resistant Yeasts Medium)
foi utilizado na contagem de leveduras resistentes a conservadores e incubado a 30 ºC/48-72h.

2.3 Análise sensorial

2.3.1 Amostras
Avaliou-se as duas formulações produzidas (F 1 e F 2) e outras seis amostras comerciais
adquiridas em supermercados. É importante esclarecer que essas amostras são representativas
do grupo de produtos sabor laranja, disponíveis nos supermercados, da cidade do Rio de
Janeiro. Os ingredientes e as características físico-químicas das amostras comerciais são
apresentados na Tabela 7.
Tabela 7. Ingredientes e características físico-químicas das amostras de refrigerantes
comerciais.

Marca % de* Corantes* Volume Sólidos %ATT (g/ pH

suco CO2 Solúveis 100 mL
ác.cítrico)
(°Brix)
Fanta Laranja 5,0 Amarelo 3,0 10 0,12 3,0
crepúsculo FCF
Laranja 5,0 Amarelo 3,0 11 0,21 2,4
Convenção crepúsculo INS
110
Schin Laranja 5,1 INS 110 3,4 10 0,15 2,7
Sukita 5,1 Amarelo 3,1 9,2 0,13 2,9
crepúsculo FCF
Xamego 5,0 Amarelo 3,3 11,1 0,2 3,2
crepúsculo,
ponceau 4R,
corante natural
antocianinas
H2OH 5,0 Corante amarelo 2,0 0,6 0,2 2,6
crepúsculo FCF
*Informações adquiridas no rótulo (lista de ingredientes).
** As amostras possuíam açúcar em sua composição, com exceção do refrigerante H2OH (24mg/100mL de
aspartame e 6,5mg/100mL de acessulfame K).
***As amostras foram adquiridas em embalagens PET (polietileno tereftalato) de 1,5L e 2L, com exceção do
refrigerante Schin Laranja (embalagem de 250mL).
**** Os resultados representados por volume de CO2, °Brix, %ATT e pH foram obtidos através da realização de
análises.

74
2.3.2 Teste afetivo de aceitação
Os 120 consumidores foram selecionados através de um protocolo de triagem, onde
responderam questões sobre hábitos de consumo de refrigerantes, marca preferida, frequência
de consumo e se possuíam alguma restrição alimentar. Ao final, responderam se gostariam de
participar de uma degustação de refrigerante sabor laranja. Antes da apresentação das amostras,
os voluntários preencheram o termo de consentimento livre e esclarecido - TCLE. O projeto de
pesquisa teve sua aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa (COMEP) da Universidade
Castelo Branco, sob o protocolo 016/2016.
As amostras foram servidas em blocos completos balanceados, em copos plásticos de
50mL codificados com algarismos de 3 dígitos. Foram servidos 15 mL das amostras à
temperatura de refrigeração (9 °C ± 1 °C). Os voluntários avaliaram as 8 amostras durante cada
sessão. Junto com as amostras foi servido um copo de água filtrada a temperatura ambiente e
um biscoito água e sal para os provadores durante as avaliações, visando minimizar o efeito
carryover. Os testes foram realizados em cabines sensoriais com luz branca apropriadas para
análise sensorial. Utilizou-se escala hedônica estruturada de 9 pontos, em que 9 representava a
nota máxima “gostei muitíssimo” e 1 a nota mínima “desgostei muitíssimo”. Para o atributo cor
laranja, utilizou-se uma escala JAR (Just About Right) onde o consumidor deveria indicar a
intensidade de cor da amostra, em relação a uma intensidade ideal, onde 9 correspondia a
“extremamente mais do que o ideal” e 1 a “extremamente menos que o ideal”.

2.4 Análise estatística

Os resultados do teste afetivo de aceitação foram analisados por análise de variância
(ANOVA) e testes de média de Tukey, considerando um nível de 5% de significância.
Para uma melhor compreensão das características sensoriais aplicou-se a técnica
multivariada de Análise de Componentes Principais (ACP). Mapas de preferência interno foram
obtidos utilizando-se os dados de aceitação. Os dados foram organizados numa matriz de
amostras (em linhas) e consumidores (em colunas), sendo avaliados a partir da matriz de
covariâncias. Os resultados foram expressos em gráficos de dispersão das amostras
(tratamentos) e de cada consumidor em relação às duas primeiras dimensões principais (REIS
et al., 2010).
Todas as análises foram realizadas utilizando-se o software xlstat-sensory analysis and
costumer insight versão 2014 (Addinsoft Inc.)

75
3 Resultados e Discussão
3.1 Análises físico-químicas
As características relacionadas ao Padrão de Identidade e Qualidade (PIQ) dos
refrigerantes sabor laranja estabelecidas pela legislação brasileira (BRASIL,1998; BRASIL,
2013) devem ser usadas como parâmetro para avaliação da sua estabilidade. Nesse sentido,
várias modificações podem iniciar imediatamente após o envase, especialmente aquelas
relacionadas a alteração do volume de gás da bebida e a cor. Os resultados das análises físico-
químicas dos refrigerantes referentes as formulações F 1 e F 2, encontram-se disponíveis na
Tabela 8.
Tabela 8: Resultados das análises físico-químicas das amostras de refrigerante
produzidas com concentrado de cenoura e maçã (F 1) e controle (F 2), durante o tempo de
armazenamento de 150 dias.
Amostras Dias de Sólidos % ATT pH Volume
armazenamento Solúveis (g/ 100 mL de CO2
(ºBrix) ác. cítrico)
aA
F1 0 11,83 0,15aA 3,36aA 3,05aA
30 11,77aA 0,14bA 3,38bA 3,02bA
60 11,83aA 0,14aA 3,37bA 2,98aA
90 11,63aCD 0,15aA 3,35aA 2,91aA
120 11,57aCDE 0,15aA 3,39aA 3,00 aA
150 11,77aA 0,15aA 3,35bA 2,99ab
F2 0 11,80aA 0,15aA 3,45aAB 3,11aA
30 11,67aAE 0,15aA 3,42aAB 3,07aA
60 11,76aA 0,15aA 3,44aAB 3,09aA
90 11,70aAF 0,15aA 3,43aAB 3,00aA
120 11,60aBDE 0,14aB 3,47aB 2,89aB
150 11,70aAF 0,14aA 3,43aAB 2,87aA
*Médias com letras iguais numa mesma coluna indica que não há diferença significativa entre
as amostras pelo teste de Tukey (p>0,05).

Não houve variação significativa nos parâmetros físico-químicos (p≥0,05) de acordo

com o período de tempo (150 dias) e as condições de estocagem estudadas, sugerindo que
ambas as formulações são estáveis. Embora a literatura seja escassa, alguns estudos conduzidos
com amostras de refrigerantes à base de frutas (laranja, maracujá e acerola) também obtiveram
os mesmos resultados (SALATA, 2003; BARNABÉ e VENTURINI-FILHO, 2004;
CRIVELETTO, 2012). Cabe notar ainda que, o teor de CO2 nas bebidas não variou durante o
76
tempo de estocagem, isto se deve ao fato das garrafas não terem sido expostas a condições que
promovam a perda de gás. Segundo LOPES (2013) o transporte das garrafas e a exposição ao
sol são fatores que concorrem para alterações no teor de CO2 em refrigerantes.
Em relação a alteração de cor sofrida durante o tempo de armazenamento, observou-se
através do cálculo da diferença de cor (∆E*) que a formulação contendo concentrado de cenoura
e maçã (F 2), apresentou um valor acima de 5,0. Segundo GHIDOUCHE (2013), deve-se
considerar que quando (∆E*) é maior do que 3-5 unidades, a variação de cor pode ser percebida
pelo consumidor, e resultar em rejeição do produto. Em relação a formulação controle (F 1), a
cor manteve-se estável, o que era esperado, devido a maior estabilidade dos corantes artificiais.
Destaca-se que a estocagem do refrigerante referente a formulação F 2 poderia ser realizada sob
refrigeração, o que resultaria na melhor estabilidade do carotenoide. Entretanto, deve-se
considerar que a baixa condição de temperatura representaria um custo elevado que refletiria
em um aumento no valor do produto final.

3.2 Análises microbiológicas

De acordo com os resultados da análise microbiológica de coliformes a 35 ºC, as
formulações F 1 e F 2 atenderam aos parâmetros preconizados pela legislação, apresentando-se
seguras para consumo. De fato, os coliformes a 35 °C não se multiplicam devido as condições
físico-químicas da bebida, entretanto, se a água industrial não foi tratada adequadamente, os
coliformes, especialmente as espécies termotolerantes, podem representar um risco (AKOND
et al., 2009). A análise de coliformes se justifica especialmente para refrigerantes vendidos em
post mix, pois a sua presença estará intimamente relacionada a qualidade da água utilizada no
ponto de venda (WHITE et al., 2010) e a higiene empregada na limpeza e manutenção do
equipamento. A estabilidade microbiológica das formulações também foi avaliada durante o
tempo de prateleira (150 dias). Os dados obtidos podem ser observados na Figura 11.
A contagem de bolores e leveduras apresentou um aumento equivalente a 1 ciclo log,
na formulação F 1 durante o período de 150 dias de armazenamento, indicando que a robustez
da matriz desenvolvida pode ser afetada quando adicionado o ingrediente - concentrado de
cenoura e maçã, tornando a bebida mais suscetível a multiplicação microbiana. Ressalta-se, no
entanto, que as características visuais do refrigerante em relação a formação de sedimento,
diminuição significativa do brix, formação de odores indesejáveis e turvação não foram
observadas. É importante mencionar que os bolores só se multiplicarão na bebida se houver
perda de CO2 durante o armazenamento, uma vez que a maior parte das espécies são aeróbias

77
estritas. Nesse sentido, a embalagem PET pela sua permeabilidade, pode influenciar nesta
contaminação (AZEREDO et al., 2016). No entanto, as leveduras constituem o principal grupo
deteriorante de bebidas carbonatadas, devido a sua habilidade de se multiplicar em soluções
com alta concentração de açúcar e tolerarem ambiente ácido. Desse modo, a higienização
rigorosa da linha de processamento, é uma medida de controle importante (CLAVERO, 2010).

2.5

2
F 1 Contagem de bolores e
log UFC/ 100 mL

leveduras
1.5
F 1 Contagem de bactérias
aeróbias
F 2 Contagem de bolores e
1 leveduras
F 2 Contagem de bactérias
aeróbias
0.5

0
0 30 60 90 120 150
Tempo de armazenamento (dias)

Figura 12: Contagem de bolores e leveduras e bactérias aeróbias totais nas formulações
F 1 e F 2.

A contagem de bactérias aeróbias estritas, em ambas formulações, apresentou um

declínio ao longo do tempo observado. Este fato pode ser justificado, pois as características do
refrigerante como baixo teor de oxigênio, pH ácido e presença de conservadores tornam-se um
meio inadequado para a multiplicação dessas espécies. A contagem de bactérias lácticas e de
leveduras resistentes a conservadores se manteve inalterada durante o tempo avaliado, ou seja,
ausente em 100 mL, o que demonstra que a bebida foi produzida de acordo com as Boas Práticas
de Fabricação.

3.3 Análise sensorial

Os provadores (n=120) selecionados para a análise sensorial são consumidores habituais
de refrigerante; 61% consomem a bebida regularmente (2 a 4 vezes por semana). Os sabores

78
preferidos são cola, guaraná, laranja, uva e limão. O estrato por gênero e idade dos participantes
pode ser observado na Tabela 9.
Tabela 9: Segmentação por gênero e idade dos participantes da análise sensorial

<20 20-29 >30 Total (%)

Homens 60 3 15 78
Mulheres 21 14 7 42
81 (67,5%) 17 (14,2%) 22 (18,3%) 120
(100%)

A maior parte dos interessados em participar do estudo pertencia ao gênero masculino,

confirmando dados da literatura que atestam que os homens consomem mais refrigerantes do
que as mulheres (IBGE, 2014). Nesse aspecto, também pode-se levar em consideração a faixa
etária. Os resultados referentes ao teste afetivo de aceitação encontram-se na Tabela 10.
As amostras comerciais de Fanta laranja, Sukita, Schin laranja, Xamego e Laranja
Convenção e a amostra F 2 apresentaram médias relacionadas a impressão global dentro da
região de aceitabilidade, acima do valor de 5,0 – referente ao conceito indiferente. As amostras
H2OH e F 1 foram menos preferidas em relação as demais. Observou-se que a cor foi a
característica sensorial que mais influenciou os consumidores com relação ao grau de aceitação
das amostras, sinalizando que esse parâmetro interferiu, de forma significativa na avaliação de
aspectos relacionados ao sabor e aparência, corroborando dados da literatura (FERNÁNDEZ-
VÁZQUEZ, 2011). Nota-se uma rejeição das amostras consideradas mais claras, de acordo
com o indicado pelos provadores, com base na escala JAR proposta, onde 5 é a intensidade de
laranja ideal. Esse resultado foi confirmado pelo Mapa de Preferência interno (Figura 13).

79
 Tabela 10: Média das notas atribuídas pelos consumidores para aparência, aroma, sabor,
textura, impressão global e cor para as 8 amostras testadas.

Amostra Aparência Aroma Sabor Textura Impressão Cor

global
Fanta
Laranja 7,30 a 7,26 a 7,43 a 6,95 a 7,02a 4,97 cd
Sukita 6,85 ab 6,10 b 5,64b 6,27 ab 6,11b 5,21 bcd
Schin
Laranja 6,76 ab 5,86 bc 5,29bc 6,22 b 5,73 b 5,34bc
Xamego 6,79 ab 5,72 bcd 4,73cd 6,03 bc 5,48 b 5,63 b
Laranja
Convenção 6,33 b 5,39 cde 4,82 cd 5,86 bc 5,46b 4,66d
F 2** 6,18 b 4,96 ef 3,64 e 5,47 cd 5,58 c 6,33 a
H2OH 4,24 c 5,20 def 4,42 de 5,10de 4,71 c 3,10 e
F 1*** 4,56 c 4,56 f 4,23 de 4,54 e 4,74 c 2,81 e
*Médias com letras iguais numa mesma coluna indica que não há diferença significativa entre
as amostras pelo teste de Tukey (p>0,05).
** Controle
*** Formulação adicionada de concentrado de cenoura e maçã

F1 e F2: 64,10 %
20

15
Componente Principal 2 (21,37 %)

10
F1

F2 Fanta Laranja
Sukita
Xamego
0 Schin
Convenção

-5

-10
H2OH

-15
-20 -15 -10 -5 0 5 10 15 20 25
Componente Principal 1 (42,73 %)

Figura 13: Figura bidimensional do mapa de preferência interno das 8 amostras de

refrigerante de laranja avaliadas.

80
 O Mapa de Preferência interno das amostras foi construído de forma a considerar as
preferências individuais de cada um dos 120 consumidores. A primeira e a segunda dimensões
geradas explicam conjuntamente cerca de 64,10% da variabilidade das respostas.
Evidencia-se três segmentos distintos das amostras com referência aos níveis de
aceitação. As amostras situadas à direita no mapa, concentram o maior grupo de consumidores,
constituindo àquelas que obtiveram melhores notas, nos atributos avaliados, de acordo com a
escala hedônica. Nesse aspecto, é importante sinalizar que esse grupo de amostras possuem
corantes artificiais em sua formulação (Tabela 7). Quanto as amostras situadas à esquerda; a
amostra F 1 obteve aceitação intermediária, ao passo que a bebida H2OH representa o último
grupo de preferência, ou seja, a amostra que teve a menor aceitação. O que pode ser observado
pela menor concentração de consumidores e pela distância das demais amostras. Este fato pode
ser explicado, pois ambas as bebidas representam características bem diferenciadas das demais,
não só relacionadas a cor, mas especialmente a bebida H2OH por ser levemente gaseificada.
De acordo com estudos conduzidos por Kaushal, Kaushal e Sharma (2004) em refrigerantes de
maçã e pera, a carbonatação melhora o corpo da bebida, o sabor, a intensidade do aroma e
otimiza a acidez, contribuindo para uma maior aceitabilidade da bebida. Outro ponto a
considerar é que essa bebida é adoçada com edulcorantes, o que pode conferir um sabor
metálico, amargo, comumente associado aos adoçantes artificiais (LEKSRISOMPONG et al.,
2013).

4. Conclusão
Os resultados obtidos permitem observar que, nas condições testadas, ambas as
formulações atenderam ao padrão de identidade e qualidade e se apresentaram estáveis em
relação aos parâmetros físico-químicos. Entretanto, a análise colorimétrica revelou uma
degradação de cor perceptível ao consumidor na amostra contendo o concentrado de cenoura e
maçã durante o tempo de prateleira avaliado.
De acordo com os parâmetros preconizados pela legislação microbiológica, as
formulações se mostraram seguras para consumo, demonstrando que as mesmas foram
produzidas de acordo com as boas práticas de fabricação. A formulação adicionada de
concentrado de cenoura e maçã apresentou um aumento equivalente a 1 ciclo log na contagem
de bolores e leveduras, sugerindo que a robustez da matriz desenvolvida pode ser afetada se as
condições de higienização da linha de processamento não forem observadas.

81
 Verificou-se que a cor foi a característica sensorial que mais influenciou os
consumidores com relação a aceitabilidade das amostras, sinalizando que esse parâmetro
interferiu de forma significativa na avaliação de aspectos relacionados ao sabor e aparência,
bem como na impressão global.
Este estudo demonstra que os consumidores ainda não estão habituados ao emprego de
corantes naturais nas formulações de alimentos e bebidas, mantendo como parâmetro para
avaliação de cor, os corantes sintéticos comumente empregados.
É provável que se os provadores soubessem acerca dos benefícios dos corantes naturais
à saúde, a aceitabilidade da amostra contendo concentrado de cenoura e maçã teria sido superior
as demais.

82
 CAPÍTULO V

APLICAÇÃO DO TESTE DESAFIO E DETERMINAÇÃO DO POTENCIAL DE

MULTIPLICAÇÃO MICROBANA (δ) PARA VALIDAÇÃO DE FORMULAÇÃO DE
REFRIGERANTE DE LARANJA ADICIONADO DE CONCENTRADO DE
CENOURA E MAÇÃ

83
Resumo
O teste desafio é utilizado para prever a multiplicação microbiana em uma determinada matriz
alimentícia. O potencial de multiplicação microbiana (δ) pode ser determinado através da
diferença entre a população de micro-organismos ao final do tempo de prateleira e sua
população inicial, com o propósito de assegurar a robustez das formulações. O objetivo do
presente estudo foi aplicar o teste desafio e determinar o potencial de multiplicação microbiana
em diferentes formulações de refrigerante de laranja e no ingrediente - concentrado de cenoura
e maçã. O teste desafio foi conduzido inoculando 104 UFC/mL de micro-organismos isolados
de amostras deterioradas de refrigerantes, oriundas de um banco de culturas de uma indústria
de bebidas. Os resultados referentes ao potencial de multiplicação microbiana (δ) indicaram
que as leveduras e bactérias lácticas são capazes de se multiplicar na formulação adicionada de
concentrada de cenoura e maçã sem conservadores (δ ≥ 0,5 log10), sinalizando que a formulação
é sensível. As bactérias acéticas, nessas condições, foram inibidas. Nas formulações
preservadas quimicamente com adição de concentrado de cenoura e maçã e a adicionada de
corantes artificiais, os resultados referentes ao potencial de multiplicação microbiana (δ)
indicaram que as leveduras e bactérias lácticas foram inibidas (δ ≤ 0,5 log10) em ambas as
formulações. Entretanto, as leveduras resistentes a conservadores apresentaram habilidade de
crescimento (δ ≥ 0,5 log10). No ingrediente concentrado de cenoura e maçã, observou-se que as
leveduras, bactérias lácticas e o fungo Penicillium citrinum foram inibidos, indicando que o
concentrado não deve ser considerado uma fonte de nutriente para a multiplicação microbiana
que afetaria a robustez da formulação. Constatou-se a multiplicação das leveduras resistentes a
conservadores, com potencial de multiplicação δ ≥ 0,5 log10 em todas as formulações e
ingrediente avaliados. Os dados obtidos sinalizam que o desenvolvimento de alimentos mais
naturais ainda representa um desafio para a indústria de alimentos.

Palavras-chave: microbiologia, corante natural, conservadores, ingrediente, bebida

carbonatada.

84
MICROBIAL CHALLENGE TEST (MCT) AND DETERMINATION OF GROWTH
POTENTIAL (δ) TO VALIDATE AN ORANGE SOFT DRINK ADDED WITH
CARROT AND APPLE CONCENTRATE.

Abstract
Microbiological challenge test (MCT) is used to predict microbial growth in a particular food
matrix. The growth potential (δ) can be defined as the difference between the population of a
microorganism at the end of shelf life and its initial population, in order to ensure the formula
robustness. The aim of this study was to apply the MCT and to determine the growth potential
in different formulas of orange soft drink and in the ingredient - carrot and apple concentrate.
The MCT was conducting inoculating ± 4 log CFU / mL of microorganisms isolated from
spoiled soft drinks. Growth potential (δ) indicated that yeast and lactic acid bacteria are able to
multiply in the formula containing carrot and apple concentrate without preservatives (δ ≥ 0.5
log10), indicating that the formula is sensitive. Acid acetic bacteria, in these conditions, were
inhibited. A preserved formula with the addition of carrot and apple concentrate and other
formula with the addition of artificial colors were prepared. The results referring to the growth
potential (δ) indicated that yeast and lactic acid bacteria were inhibited (δ ≤ 0.5 log10) in both
formulas. However, the preservative resistant yeasts presented growth ability (δ ≥ 0.5 log10).
In the apple and carrot concentrate, it was observed that yeast, lactic acid bacteria and fungus
Penicillium citrinum were inhibited, indicating that this ingredient should not be considered a
nutrient source for microbial multiplication that would affect the formula robustness. It was
verified the growth of the preservative resistant yeasts (growth potential δ ≥ 0,5 log10) in all
the evaluated formulas and ingredient. The data obtained indicate that the development of more
natural foods still represents a challenge for the food industry.

Key-words: microbiology, natural color, preservative, ingredient, carbonated soft drink

85
1. Introdução
Atualmente o consumidor anseia por alimentos mais naturais, saudáveis, a preços
acessíveis, que promovam benefícios à saúde e que sejam isentos de aditivos (SPILLMANN,
SIEGRIST e KELLER, 2011; BEARTH, COUSIN e SIEGRIST, 2014; KOOIJMANS e
FLORES-PALACIO, 2014). Nesse contexto, a composição química dos refrigerantes,
especialmente no que concerne aos corantes artificiais e conservadores pode representar riscos
ao consumidor (McCANN et al., 2007; MASONE e CHANFORAN, 2015). Por outro lado, os
desafios tecnológicos enfrentados pela indústria de alimentos, em um mercado bastante
competitivo, demandam muitas questões, além das relacionadas a melhoria dos aspectos
sensoriais do produto final. A inovação de produto, consistindo na substituição de aditivos
alimentares por ingredientes naturais representa um desafio, pois deve atender aos aspectos
relacionados a regulamentação, a qualidade e a segurança do alimento.
De acordo com a legislação, refrigerantes são bebidas gaseificadas, obtidas pela
dissolução, em água potável, de suco de fruta ou extrato vegetal de sua origem, adicionados de
açúcares ou edulcorantes, acidulantes, aromatizantes, corantes e conservadores. São
preservados quimicamente, possuindo pH ácido (faixa de 2,5-4,0) e acima de 2,5 volumes de
CO2 (BRASIL, 1998; BRASIL, 2013). Os refrigerantes são envasados a frio em garrafas PET,
de vidro ou latas de alumínio (CERVIERI et al. 2014), sendo considerados produtos tipicamente
estáveis a temperatura ambiente.
No que tange aos aspectos de qualidade e segurança, a estabilidade microbiológica dos
refrigerantes está relacionada a obstáculos como pH ácido, conservadores e teor de gás
carbônico. Além disso, são bebidas adicionadas de açúcar, suco, dissolvidos em uma matriz
aquosa, representando alta atividade de água e fonte de carbono significativa para o crescimento
microbiano, restringindo somente a multiplicação de espécies patógenas (MASSA et al., 1998).
As leveduras oxidativas e fermentativas, constituem o principal grupo deteriorador de
refrigerantes, uma vez que suportam pH ácido, altas concentrações de CO2 e ainda algumas
espécies apresentam comportamento de resistência aos conservadores usuais de bebidas
(STRATFORD, 2006; MARTORELL et al., 2007). Esse mesmo comportamento é exibido
pelas bactérias acéticas - Acinetobacter calcoaceticus e Gluconobacter oxydans (BATTEY &
SCHAFFNER, 2001), que só se multiplicarão, se houver perda de gás pela bebida. As bactérias
lácticas também sobrevivem em ambientes com baixa tensão de oxigênio e pH ácido,
relacionando-se aos ingredientes da bebida e as condições de higienização da linha de processo,
uma vez que são capazes de formar biofilmes (LAWLOR, 2009). Os esporos e fragmentos de

86
micélios de fungos filamentosos podem contaminar o refrigerante, como resultado da qualidade
inadequada dos ingredientes, higienização inadequada da linha de processamento e sobretudo
da qualidade microbiológica do ar ambiente, em especial da área de envase (DELGADO et al.,
2012). A multiplicação dos fungos filamentosos só ocorrerá se houver perda de CO2 pela bebida
(AZEREDO et al., 2016). Contudo, é importante considerar que os micro-organismos citados
irão exibir esse comportamento, em função de determinada matriz alimentícia. Caso haja
modificações na formulação, temperatura de armazenamento, substituição ou adição de novos
ingredientes, a segurança do alimento e consequentemente a saúde do consumidor pode ser
comprometida.
A indústria de alimentos conduz testes desafio para verificar a multiplicação microbiana
numa determinada matriz. Para isso, faz-se necessário descrever o produto e a tecnologia;
conduzir a análise de perigos biológicos e determinar a etapa específica envolvida do processo,
que pode inibir ou promover o crescimento microbiano. Algumas considerações devem ser
feitas em relação aos fatores intrínsecos e extrínsecos que afetam a multiplicação microbiana,
métodos de conservação usados para a destruição de patógenos e análise dos dados sobre a
segurança do produto (NACMCF, 2010).
Outros objetivos também podem ser alcançados com a aplicação do teste desafio, como
a extensão do tempo de prateleira de um produto sob determinadas condições de estocagem,
determinar o comportamento microbiano quando o produto permanece em temperaturas de
abuso, caracterizar alimentos produzidos localmente (local food), avaliar a eficácia de um
conservador ou quando o conhecimento a respeito do perigo biológico em potencial ainda não
está completamente elucidado (GOMES, FLORIANI e MURAKAMI, 2012; SERRAINO e
GIACOMETTI, 2014; PEREIRA et al., 2015). A literatura aborda estudos associando teste
desafio e patógenos, especialmente Listeria monocytogenes (UYTTENDAELE et al., 2009;
AUGUSTIN et al., 2011; SANT’ANNA et al., 2012; EVERIS e BETTS, 2013). Entretanto,
estudos envolvendo micro-organismos deterioradores são escassos.
O potencial de multiplicação microbiana (δ) pode ser determinado através de estudos
de teste desafio durante o desenvolvimento de produtos, com o objetivo de assegurar a robustez
e a qualidade das formulações. Esse potencial pode ser determinado pela diferença entre as
contagens (log10 UFC/g) final e inicial de cada micro-organismo durante a vida de prateleira do
alimento (BEAUFORT, 2011).
De acordo com o exposto, o presente estudo teve por objetivo aplicar o teste desafio em
diferentes matrizes, a saber: (i) refrigerante de laranja adicionado de concentrado de cenoura e

87
maçã sem adição de conservadores (ii) refrigerante de laranja adicionado de concentrado de
cenoura e maçã com conservadores (iii) refrigerante de laranja adicionado de amarelo tartrazina
e amarelo crepúsculo com adição de conservadores – formulação controle (iii) ingrediente -
concentrado de cenoura e maçã.

2. Material e Métodos
2.1 Desenvolvimento das formulações
Para a condução do teste desafio foram desenvolvidas as formulações, conforme indicado
na Tabela 11. Os conservadores sorbato de potássio e benzoato de sódio foram ajustados de
forma a atender ao teor de benzeno na bebida final (5µg/L). Todas as formulações foram
padronizadas com teores de sólidos solúveis em 12°Brix com adição de sacarose, pH fixado em
3,3 com a utilização de ácido cítrico e carbonatadas com 3,0 volumes de CO2.

Tabela 11: Formulações desenvolvidas para a condução do teste de desafio microbiológico

Amostras Corantes artificiais - amarelo Concentrado de Conservadores
tartrazina e amarelo cenoura e maçã sorbato de potássio
crepúsculo e benzoato de sódio
F1 X
F2 X X
F3 X X
Nota: X significa o ingrediente presente na formulação
O concentrado de cenoura e maçã (nome comercial: Exberry Laranja Outono) foi
gentilmente cedido pela empresa GNT.

2.1.1 Produção do refrigerante

As formulações foram produzidas de acordo com o fluxograma disposto na Figura 11.

2.2 Caracterização físico-química das formulações

As amostras foram caracterizadas de acordo com o PIQ (Padrão de Identidade e
Qualidade) estabelecido pela legislação brasileira (BRASIL, 1998; BRASIL, 2013). Foi
realizada a determinação do pH através de um pHmetro (Digimed model DM-20), Acidez Total
Titulável (ATT) expressa em % de ácido cítrico/100 mL, Atividade de água (Aa) (Aqualab
model 4TE water activity analyser), SST (sólidos solúveis totais) usando um refratômetro de

88
bancada ATAGO, determinado à 20 °C e o resultado expressos em (°Brix). As amostras foram
descarbonatas e analisadas, em triplicata, conforme metodologia descrita por Adolfo Lutz
(2005). O volume de gás carbônico, foi avaliado através de medidor do grau de carbonatação
(ZEGLA).

2.3 Teste Desafio

Na condução do teste desafio, determinados fatores devem ser levados em consideração,
isso inclui: (i) seleção apropriada de patógenos ou micro-organismos substitutos. Nesse aspecto,
o “pool” de micro-organismos deve ter sido isolado de uma formulação similar; patógenos
envolvidos em surtos alimentares devem ser incluídos; (ii) concentração do inóculo; (iii)
preparação do inóculo e método de inoculação; (iv) tempo de duração do estudo e (v) fatores
intrínsecos da formulação e estocagem (IFT, 2003; NACMCF, 2010).

2.3.1 Seleção dos micro-organismos

As culturas selecionadas para o teste foram cedidas por um banco de culturas de uma
indústria de refrigerantes. Os micro-organismos são relacionados na Tabela 12.

Tabela 12: Culturas selecionadas para o teste desafio microbiológico.

Micro-organismos
Leveduras Rhodotorula glutinis
Saccharomyces cerevisiae
Leveduras resistentes a conservadores Candida krusei
Zygossacharomyces baillii

Bactérias lácticas Lactobacillus plantarum

Lactobacillus mali
Bactérias acéticas Gluconobacter oxydurans
Acetobacter pasteurianus

2.3.2 Ativação das culturas

As culturas selecionadas eram mantidas em biofreezer a - 80 ºC. Para sua ativação, as
cepas de leveduras foram inoculadas em caldo extrato de malte e incubadas a 25 ºC/5dias. As
cepas de bactérias lácticas foram inoculadas em leite desnatado a 5 % e incubadas a 30 ºC/3

89
dias. Para as cepas de bactérias acéticas, utilizou-se o caldo soro de laranja e incubação a 30
ºC/3 dias.

2.3.3 Preparo do inóculo

As culturas ativadas em caldo foram estriadas em meio de cultura sólido. As leveduras
foram inoculadas em Agar Batata Dextrose (BDA) acidificado com ácido tartárico 10 % até pH
3,5; as bactérias lácticas e as bactérias acéticas foram inoculadas em OSA (Agar Soro de
Laranja). A incubação seguiu os mesmos parâmetros relatados acima. Após esse período, as
culturas foram suspensas em solução salina a 0,85 % acidificada, com o objetivo de
permanecerem no pH da bebida. Nesse sentido, é muito importante a manutenção das
características do alimento durante o preparo do inóculo. As culturas foram preparadas para
que chegassem a uma turvação correspondente ao nível de inóculo de 2x107 UFC/mL. A
suspensão de leveduras foi padronizada de acordo com unidade 5 da escala de McFarland
(Densimat, bioMérieux). Os inóculos de bactérias lácticas e acéticas foram padronizados de
acordo a unidade 1,5 da escala de Mcfarland (Densimat, bioMérieux). Experimentos prévios
foram realizados correlacionando-se a contagem padrão em placas das cepas utilizadas e a
leitura no Densimat.

2.3.4 Inoculação da suspensão de micro-organismos nas amostras de bebidas

As amostras foram inoculadas em triplicata, com as suspensões dos micro-organismos
de forma a alcançar um nível desejado de 104 UFC/ mL. Após a inoculação, as garrafas foram
homogeneizadas. No momento da inoculação, as amostras (acondicionadas em garrafas de 600
mL) foram mantidas em banho de gelo visando minimizar a perda de gás. Após a inoculação,
as amostras foram mantidas à 25 ºC-30 ºC.

2.3.5. Monitoramento do crescimento dos micro-organismos nas amostras inoculadas

Para o monitoramento do crescimento dos micro-organismos inoculados, alíquotas de
refrigerante foram descarbonatadas e inoculadas por profundidade em agar BDA acidificado
até pH 3,5 (para enumeração de bolores e leveduras), seguido de incubação a 25 ºC durante 5
dias. As bactérias lácticas foram contadas através de inoculação de 1 mL de amostra em
profundidade em OSA, seguido de incubação, em condições de microaerofilia, a 30 ºC/3 dias.

90
As bactérias acéticas foram contadas em agar OSA, através da inoculação de 1mL de amostra.
A incubação ocorreu a 30 ºC/3 dias.
Nas amostras não inoculadas (denominadas BR) foi feita a contagem por plaqueamento
em profundidade em meios de cultura BDA e OSA, incubado nas condições mencionadas. Para
a contagem de bactérias acéticas, a contagem foi realizada por plaqueamento em superfície em
meio OSA e seguidas as mesmas condições de incubação mencionadas.
Todas as amostras foram avaliadas no tempo zero e em triplicata em cada ponto. O IFT-
Institute of Food Technologists (2003) recomenda que cinco ou sete pontos sejam retirados
durante a condução do estudo. Seguindo essa recomendação, os tempos estudados foram 0,14,
28, 35, 42 e 60 dias.
As contagens microbiológicas assinaladas no presente estudo foram realizadas em
conformidade com o preconizado por DOWNES e ITO (2001).

2.3.6 Inoculação das suspensões de micro-organismos na amostra de concentrado de

cenoura e maçã
As cepas selecionadas para o teste desafio em amostras de concentrado de cenoura e
maçã foram igualmente isoladas de bebidas envolvidas em problemas de deterioração,
consistindo em “pool”de leveduras, “pool” de leveduras resistentes a conservadores, bactérias
lácticas e o fungo Penicillium citrinum. Cabe a ressalva de que a concentração de inóculo
referente as leveduras, leveduras resistentes a conservadores e bactérias lácticas foi de 101
UFC/mL. O procedimento adotado foi semelhante ao anteriormente relatado, porém a ativação
dos esporos fúngicos requereu técnica diferenciada. A cepa mantida em biofreezer a -80 ºC foi
ativada em agar extrato de malte, mantido em garrafas Roux. Após a incubação por 7 a 10 dias,
procedeu-se a lavagem do inóculo com cerca de 20 mL de solução salina (0,85 %) acidificada
adicionada de tween 80, através do auxílio de uma alça de drigalsky. As hifas e esporos
desprendidos foram submetidos a filtração, inicialmente em filtro estéril com porosidade de 100
µm e em seguida em filtro com porosidade de 40µm, com o objetivo de selecionar somente os
esporos. Após, realizou-se a contagem de esporos, em câmara de Neubauer. A concentração de
esporos em torno 105 células/mL foi inoculada em 100 mL de concentrado de cenoura e maçã,
em triplicata.
De igual modo, a enumeração dos micro-organismos selecionados seguiu o descrito no
item 2.3.5.

91
 Entretanto, nas amostras não inoculadas (BR) foram feitas contagens de micro-
organismos acidófilos, através da técnica de inoculação de 0,1mL da amostra em superfície de
agar mGreen e por inoculação de 1mL da diluição 101 da amostra, em profundidade, em agar
BDA acidificado, seguido de incubação a 25 ºC/5 dias. Adicionalmente, foram realizadas
contagens por inoculação de 1 mL da diluição 101 da amostra, por plaqueamento em
profundidade em OSA seguido de incubação a 30 ºC/3 dias em microaerofilia.

2.3.7 Determinação do potencial de multiplicação microbiana (δ)

O potencial de crescimento microbiano das formulações foi calculado pela diferença
entre as contagens (log10 UFC/g) final (60 dias) e inicial (tempo zero) de cada micro-organismo
inoculado. A formulação foi considerada sensível quando o crescimento do micro-organismo
foi > 0,5 log10, o que corresponde a incerteza dos métodos microbiológicos. A formulação foi
considerada robusta quando o valor de δ for negativo ou < 0,5log10 (AFSSA, 2004).

3. Resultados e Discussão

No presente estudo, de acordo com as características das bebidas formuladas (pH < 4,2
e a atividade de água > 0,92) (Tabela 13), a aplicação do teste desafio refere-se a segurança
percebida pelo consumidor, que implica nos aspectos relacionados a deterioração do produto,
resultando em perdas econômicas e na rejeição do consumidor.

Tabela 13. Fatores intrínsecos característicos das formulações desenvolvidas.

Parâmetros físico-químicos Valoresa

pH 3,3±0,03
Atividade de água (Aa) 0,990±0,001
Acidez Total Titulável (% g/ 100 0,15±0,06
mL de ácido cítrico)
Volume CO2 3,0±0,14
Sólidos Solúveis Totais (°Brix) 11,93±0,23
a
Média e desvio-padrão correspondentes as amostras em triplicata.

A aplicação do teste desafio na formulação (F 1) (Figura 13), resultou em um aumento

de 1 ciclo log (UFC/ mL) para as bactérias lácticas e 2 ciclos log (UFC/ mL) para as leveduras
e leveduras resistentes a conservadores, durante o período de 14 dias. Em consequência,
observou-se o abaulamento das embalagens PET e a formação de odores indesejáveis. Os

92
resultados referentes ao potencial de multiplicação microbiana (δ) (Tabela 14), indicaram que
as leveduras e bactérias lácticas são capazes de se multiplicar na formulação sem conservadores
(δ ≥ 0,5 log10), sinalizando que a formulação é sensível. As bactérias acéticas foram inibidas,
razão pela qual, nos experimentos posteriores, esse grupo microbiano não foi mais utilizado.

Figura 14. Formulação F 1. Crescimento de leveduras, leveduras resistentes aos

conservadores e bactérias lácticas em refrigerante de laranja adicionado de concentrado de
cenoura e maçã, sem adição de conservadores (pH 3,3; Aa 0,990 e CO2 3,0 v).

Atentos a questão da necessidade da adição dos conservadores no desenvolvimento das

formulações, aplicou-se o teste desafio nas matrizes F 2 e F 3 (Figuras 14 e 15), com o objetivo
de avaliar se o ingrediente, concentrado de cenoura e maçã, agregava sensibilidade a fórmula.

93
Figura 15. Formulação F 2. Crescimento de leveduras, leveduras resistentes aos conservadores
e bactérias lácticas em refrigerante de laranja preservado quimicamente, adicionado de
concentrado de cenoura e maçã (pH 3,3; Aa 0,990 e CO2 3,0v).

Figura 16. Formulação F 3. Crescimento de leveduras, leveduras resistentes aos

conservadores e bactérias lácticas em refrigerante de laranja preservado quimicamente
adicionado de corantes artificiais – amarelo tartrazina e amarelo crepúsculo (pH 3,3; Aa 0,990
e CO2 3,0v).

Nas condições testadas, os resultados referentes ao potencial de multiplicação

microbiana (δ) (Tabela 14) indicaram que as leveduras e bactérias lácticas foram inibidas (δ ≤
0,5 log10) em ambas as formulações. Entretanto, as leveduras resistentes a conservadores
apresentaram habilidade de crescimento (δ ≥ 0,5 log10). A presença desse grupo de
deterioradores está relacionada, especialmente a ingredientes com altas concentrações de
açúcar, como no caso dos xaropes utilizados e ainda estão associados a resistência a certos
sanificantes, indicando que a higienização da linha de processo pode encontrar-se em condições
bastante insatisfatórias (FRISÓN et al., 2015). Sendo assim, as leveduras resistentes aos
conservadores podem ser controladas através de um programa de asseguração da qualidade das
matérias-primas e ainda pelo uso de recursos efetivos no planejamento da higienização da
planta de processo. Nesse sentido, recomenda-se a troca periódica do princípio ativo dos
sanificantes, a adoção do CIP (cleaning in place) à quente entre as operações de envase e o uso
da bioluminescência, para controle da última água de enxágue oriunda da higienização dos
equipamentos.
94
 Destaca-se ainda que, em relação as bactérias lácticas, na formulação adicionada de
concentrado de cenoura e maçã, potencial de multiplicação microbiana (δ) (Tabela 14) é
superior ao detectado na formulação controle, não alcançando, contudo, o valor ≥ 0,5log10,
sugestivo de que a formulação não seria robusta o suficiente. Nesse sentido, considera-se a
adoção de medidas de controle mais rígidas, quando do processamento da formulação contendo
o concentrado de cenoura e maçã. Ainda, o controle das matérias-primas, sobretudo dos sucos,
constitui aspecto de fundamental importância. A higienização de equipamentos, sobretudo da
enchedora, realizando-se swabs periódicos e a análise da última água de enxágue constituem
medidas efetivas. Um plano de higienização que enfoque o planejamento de desmontagem
periódica da linha de processamento, com vistas a prevenção da formação de biofilmes, também
representa um item crucial.
Aplicou-se o teste desafio no concentrado de cenoura e maçã (Figura 16), com o objetivo
de avaliar a habilidade de crescimento e/ou sobrevivência dos micro-organismos testados em
um ingrediente natural. Observou-se que as leveduras, bactérias lácticas e o fungo Penicillium
citrinum foram inibidos, indicando que o concentrado não deve ser considerado como uma fonte
de nutriente para o crescimento microbiano que afetaria a robustez da formulação. Entretanto,
constatou-se a multiplicação das leveduras resistentes a conservadores, com potencial de
multiplicação δ ≥ 0,5 log10 (Tabela 14). Esses micro-organismos representaram um perigo
significativo para todas as formulações e ingrediente avaliado, podendo colocar em risco a
imagem da empresa junto aos consumidores e ocasionar perdas econômicas. Dessa maneira,
todos os esforços devem ser voltados ao controle desses micro-organismos, especialmente
quando do planejamento de alimentos seguros.

95
Figura 17. Concentrado de cenoura e maçã. Crescimento de leveduras, leveduras resistentes
aos conservadores, bactérias lácticas e fungo.

Tabela 14: Potencial de multiplicação microbiana de leveduras, leveduras resistentes aos

conservadores e bactérias lácticas em diferentes formulações de refrigerante sabor laranja e em
concentrado de cenoura e maçã.
Formulação Micro-organismos Potencial de multiplicação
microbiana (δ)(log10)
F1 Leveduras 2,29
Leveduras resistentes a 2,78
conservadores
Bactérias lácticas 1,19
Bactérias acéticas inibidas

F2 Leveduras -3,22
Leveduras resistentes a 1,21
conservadores
Bactérias lácticas 0,17
F3 Leveduras -3,12
Leveduras resistentes a 1,12
conservadores
Bactérias lácticas -1,60
Concentrado de cenoura e
maçã
Leveduras resistentes a 1,40
conservadores
Leveduras inibidas
Bactérias lácticas -1,70
Fungo -3,09

96
4. Conclusão

Os resultados obtidos permitem observar que, nas condições testadas, não foi possível
desenvolver um refrigerante de laranja adicionado de concentrado de cenoura e maçã livre de
conservadores. Cabe frisar que o refrigerante constitui uma bebida que não sofre tratamento
térmico, sendo os conservadores o principal obstáculo a multiplicação microbiana.
A formulação adicionada de concentrado de cenoura e maçã e conservadores se mostrou
tão robusta quanto a formulação controle, considerando-se os dados relativos ao potencial de
multiplicação microbiana (δ). Ainda, o ingrediente concentrado de cenoura e maçã não foi
considerado uma fonte de nutriente para o crescimento microbiano, que afetaria a robustez da
formulação.
As leveduras resistentes aos conservadores apresentaram habilidade de se multiplicar em
todas as formulações desenvolvidas e ingrediente. Destaca-se que esse grupo microbiano é raro
no ambiente de processo, contudo deve-se assegurar que as medidas de controle relativas ao
plano de higienização da indústria sejam efetivas.

97
 CONCLUSÕES GERAIS

Os corantes artificiais e conservadores presentes nos refrigerantes, sobretudo, no sabor

laranja, podem representar um risco à saúde do consumidor. Nessa pesquisa, inicialmente,
desenvolveu-se uma formulação, contendo os conservadores benzoato de sódio e sorbato de
potássio, na qual os corantes artificiais – amarelo tartrazina e amarelo crepúsculo foram
substituídos por concentrado de cenoura e maçã. Em paralelo, desenvolveu-se ainda uma
formulação controle. Foram realizadas análises físico-químicas, microbiológicas e sensorial das
formulações durante o período de armazenamento de 150 dias. Observou-se o atendimento ao
padrão de identidade e qualidade e estabilidade das formulações em relação aos parâmetros
físico-químicos. Entretanto, na análise colorimétrica observou-se uma degradação de cor
perceptível ao consumidor na amostra contendo o concentrado de cenoura e maçã. Em relação
as análises microbiológicas, ambas as formulações atenderam aos parâmetros preconizados pela
legislação, e no que se refere aos corantes artificiais, a sua substituição pelo concentrado de
cenoura e maçã não impactou a estabilidade microbiológica do produto. Em relação a análise
sensorial, verificou-se que a cor foi a característica sensorial que mais influenciou os
consumidores com relação a aceitabilidade das amostras, sinalizando que esse parâmetro
interferiu, de forma significativa na avaliação do sabor e aparência. Através da aplicação do
teste desafio e da determinação do potencial de multiplicação microbiana, em uma formulação
contendo o concentrado de cenoura e maçã, livre de conservadores, constatou-se que os
refrigerantes de laranja não se mostraram estáveis. Nesse sentido, cabe considerar que os
refrigerantes não sofrem tratamento térmico, constituindo os conservadores o principal
obstáculo à multiplicação microbiana. O concentrado de cenoura e maçã também não se
mostrou uma fonte de nutriente para o crescimento microbiano, de forma a afetar a robustez da
formulação. Este estudo sinalizou que os consumidores ainda não estão habituados ao emprego
de corantes naturais nas formulações de alimentos e bebidas, mantendo como parâmetro para
avaliação de cor, os corantes sintéticos comumente empregados. Espera-se que pesquisas como
esta possam contribuir na consolidação de mecanismos eficientes para a construção das
políticas públicas de segurança dos alimentos, especialmente possibilitar o consumo seguro de
aditivos alimentares.

98
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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