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    Apuntes Cromatografía HPLC 27

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    Javier Hernandez
    Este documento describe dos métodos de programación de solventes en cromatografía HPLC: isocrático y gradiente de elución. El método de gradiente puede ayudar a obtener mejores resoluciones y tiempos de análisis más cortos. La elución en gradiente suele hacerse mediante rampas escalonadas que varían la proporción del solvente móvil. También discute los sistemas de baja y alta presión, los requisitos de los inyectores, y los tipos de rellenos de columna utilizados en HPLC.

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    Este documento describe dos métodos de programación de solventes en cromatografía HPLC: isocrático y gradiente de elución. El método de gradiente puede ayudar a obtener mejores resoluciones y tiempos de análisis más cortos. La elución en gradiente suele hacerse mediante rampas escalonadas que varían la proporción del solvente móvil. También discute los sistemas de baja y alta presión, los requisitos de los inyectores, y los tipos de rellenos de columna utilizados en HPLC.

    Descripción original:

    puntes de HPLC

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    Apuntes Cromatografa HPLC 27/03/2017

    Programacin de solvente
    Se puede operar por dos mtodos de programacin

    Isocrtico
    Gradiente de elucin

    A la hora de usar un sistema u otro se enfoca a la hora de obtener el


    cromatograma, en dnde el mtodo de gradiente nos puede ayudar a
    obtener mejores resoluciones y adems, mejorar los tiempos de anlisis.
    Todo esto llegando a una situacin de compromiso.
    La elucin en gradiente se suele hacer en forma de rampas escalonadas en
    las que variamos la proporcin del solvente de fase mvil.
    Gradientes en alta o baja presin
    Se refiere a que el punto de mezcla est a baja o a alta presin. En alta
    ambos se bombean a una cmara de mezcla llegando estos a una presin
    elevada. En baja los solventes se mezclan antes de ser impulsados por la
    bomba, la mezcla llega a la cmara de mezcla a baja presin. En este ltimo
    paso la mezcla no se suele mezclar del todo de modo que estas cmaras
    proporcionen un mezclador para producir una mezcla intima entre los
    solventes.
    Sistema de Baja Presin vs Alta presin
    El de alta ofrece un mejor servicio ya que se puede controlar el flujo adems
    de que la concentracin del gradiente es exacta. El mayor problema es el
    precio dela bomba para cada disolvente. La baja es ms barata, pero
    necesita un buen sistema de purga y desgasificacin de los disolventes, ya
    que produce problemas en los gradientes programados dando lugar a un
    gradiente errneo.
    Inyectores
    Requisitos

    Fcil de operar
    Ser inerte al ataque qumico (titanio y acero)
    Soportar altas presiones
    Precisin
    Evitar diluciones dela muestra
    En caso especiales han de estar termostatizado
    Vlvula de seis vas

    Para evitar la dilucin de muestra el loop ha de ser del mismo volumen de


    muestra inyectada. Existe dos formas de inyectar, manual y automtica. Las
    ventajas e inconveniente son al igual que en cromatografa de gases, siendo
    el muestreador automtico muy caro.
    Precolumna
    Pequea columna de 3 cm rellena de una fase estacionaria con la misma
    composicin de la fase estacionaria, pero con un dimetro de partcula
    mucho ms pequeo. Se usa para filtrar para eliminar aquellos restos que
    puedan perjudicar al anlisis (protenas, aminas...etc.)
    Columna
    El tamao de partcula ha de estar entre las 5-10 micras y una longitud de
    10-30 cm y un dimetro interno de 4-10 mm. Las columnas han de estar
    termostatizado, ya que la temperatura constante mejora los
    cromatogramas. Los extremos de las columnas contienen unas fritas de
    titanio poroso para evitar que pasen un tamao de partcula definido. Las
    partculas del relleno han de ser esfricas para evitar efectos de remolinos.
    Tipos de Rellenos
    Relleno pelicular
    La fase estacionaria est anclada a la superficie de la fase, ya no se usa por
    que proporciona menor superficie de contacto.
    Relleno Particular
    Se usa macropartculas de silica, almina o polmeros, estas se unen
    qumicamente o fsicamente a la superficie de las esferas

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