Cromatografia Liquida de Alta Resolucion-2022-Parte2

CURSO DE CAPACITACION
INTRODUCCION A LA CROMATOGRAFIA
LIQUIDA
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)
MSC. Favio Palaviccini

Parte 2
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
3. SISTEMA DE BOMBEO.
Una bomba cromatográfica es un instrumento electrónico que
produce altas presiones para empujan o trasladan los disolventes o
fases móviles a través del sistema de HPLC.
Existen en el mercado muchos modelos de bombas los que

pueden ser adquiridos de forma individual o acopladas a un
sistema de HPLC.
•Producir un flujo constante, reproducible y libre de

fluctuaciones.
•Generar presiones por encima de los 6000 psi.
•Ser capaz de producir caudales o velocidades de flujo desde
0.1 a 10.0 mL/min.
•Poseer componentes resistentes a la corrosión (juntas de
acero inoxidable o de teflón).
Un bomba de HPLC debe •Poseer un sistema de control y reproducibilidad de los flujos
tener las siguientes de fase móvil.
características: •Tener un sistema de apagado automático en caso de que la
presión aumente excesivamente.
•Tener un sistema de purga automático o manual de solventes.
En HPLC se usan básicamente 3 tipos de bombas:

a) Recíprocas.
b) De jeringa o desplazamiento.
c) Neumáticas o de presión constante.
3.1 BOMBAS RECÍPROCAS

Consisten de una pequeña cámara en la que el disolvente es
empujado por el movimiento en vaivén de un pistón accionado por
un motor de arrastre.
Dos válvulas con cierre de bola, que se abren y cierran

alternativamente controlan el flujo del disolvente hacia dentro y
hacia fuera de un cilindro.
Motor y leva Cabeza de bomba
Válvulas de
retención
Embolo
Sello del émbolo 10 -100µL
EJEMPLO. Bomba con dos pistones de zafiro, que producen un caudal
programable constante, de 10 mL/min, a presiones de hasta de 400 atm
(5878.4 psi). Se forman gradientes hasta con cuatro disolventes,
ajustando los volúmenes de los líquidos a través de una válvula de baja
presión, e impulsando la mezcla con la bomba a alta presión. El proceso
de formación de gradiente se controla eléctricamente y se puede
programar con una precisión del 0.1 % en volumen.

Desventaja
producen un flujo pulsado, el que debe ser amortiguado, puesto que se

manifiesta como un ruido en la línea base del cromatograma.
•Proporcionan una alta presión de salida (por

encima de los 10,000 psi)
•Se adaptan fácilmente a la elución con
ventajas: gradiente
•Proporcionan caudales constantes que son
independientes de la contrapresión de la
columna y de la viscosidad del disolvente.
3.2 BOMBAS DE DESPLAZAMIENTO
Son grandes cámaras como una jeringa equipadas con un émbolo

que se activa por un mecanismo de tornillo accionado mediante un
motor paso a paso.
•Tienen una capacidad limitada de
desventajas disolventes (aproximadamente 250 mL)

•Son notablemente incomodas para el
cambio de disolvente.
•Producen un flujo que es independiente
ventajas
de la viscosidad de los solventes y de la
contrapresión de la columna.
•El flujo que producen es libre de
pulsaciones.
3.2 BOMBAS DE DESPLAZAMIENTO
Dentro de las bombas de desplazamiento las mas conocidas son
las de émbolo, en las el líquido es forzado por el movimiento
de uno o mas pistones ajustados a sus respectivos cilindros
tal y como lo hace un compresor.
3.3 BOMBAS NEUMÁTICAS

Son las más simples, la fase móvil se encuentra en un recipiente
plegable colocado en una vasija que puede presurizarse mediante
gas comprimido.
Desventajas
•Tienen capacidad limitada capacidad y presión de salida.
•El caudal depende la viscosidad del disolvente y de la contrapresión de la columna.
•No pueden ser usadas en elución con gradiente.
•Están limitadas a presiones menores de 2,000 psi.
ventajas
• Son baratas.
• Están libres de pulsaciones o impulsos.
3.4 BOMBAS BINARIAS Y CUATERNARIAS

Existen tres tipos de bombas de HPLC las que pueden “servir” el flujo
de fase móvil de distinta manera.
BOMBAS SIMPLES.
Son aquellas que únicamente pueden
introducir en el sistema de HPLC un único
flujo de solvente.
Son bombas baratas, no pueden ser usadas

en modo de gradiente y no pueden ser
programadas para realizar combinaciones
de diferente proporción de fases móviles

BOMBAS BINARIAS.
Son aquellas que pueden introducir en
el sistema de HPLC uno o dos flujos
de solventes o fases móviles en
distinta proporción.
Son un poco más caras y pueden ser

programadas para ser usadas en
modo de gradiente.
Son las más comunes en los sistemas

cromatográficos comerciales.

BOMBAS CUATERNARIAS.
Son aquellas que pueden introducir
en el sistema de HPLC uno, dos,
treo o cuatro flujos de solventes o
fases móviles en distinta proporción.
Son mucho más caras y pueden ser
programadas para ser usadas en
modo de gradiente.
Son menos comunes en los
sistemas cromatográficos
comerciales, pero son las que mejor
desempeño ofrecen al trabajo
cromatográfico.
4. SISTEMA DE TUBERIAS.
Todo equipo de HPLC está constituido además de sus

componentes principales de una serie de válvulas, tuberías,
empaques, arandelas, ajustes, sellos, filtros, restrictores y
tuercas, que conducen, direccionan o encausan el flujo de
fase móvil a través de todo el sistema cromatográfico, desde
su entrada hasta su salida.
Cualquier desajuste, sobrepresión, desgaste u obstrucción de

algunos de estos componentes puede hacer que el flujo de fase
móvil se modifique, se produzcan perdidas de volumen que hacen
que la presión del sistema disminuya o se produzcan sobre
presiones, afectando el trabajo cromatográfico.
En general todo equipo de HPLC, trae por defecto condiciones de

presión que hacen que el equipo se detenga cuando exista una
disminución o aumento de la presión por encima de estas
condiciones. Estas condiciones pueden ser definidas por el
cromatografista en base a su experiencia de trabajo.
4. SISTEMA DE TUBERIAS.
El material de las tuberías de un equipo de HPLC puede ser de:
acero inoxidable
teflón o
PEEK.
La tubería de acero inoxidable, puede tener
diámetros externos de 1/32 a 1/16 de pulgada
y diámetros internos desde 0.004 a 0.05
pulgadas y generalmente se adquieren en un
largo de 50 pies.
La tubería de PEEK (Poliéter éter cetona) son
de un termoplástico muy resistente a la
corrosión y a las altas presiones. Son de
diferentes colores en base a su diámetro
interno. Su diámetro externo es en general de
1/16. Se adquieren en dos largos 10 y 50
pies.
5. SISTEMA DE INYECCION.
El medio más simple y antiguo para la introducción de las muestras
implicaba la inyección con una jeringa a través de un elastómero (septum)
que cierra herméticamente la cabeza del inyector.
Con esta finalidad se utilizaban microjeringas capaces de resistir presiones

de hasta 1.500 psi.
INYECCION A FLUJO DETENIDO

En las inyecciones aflujo detenido, el flujo del disolvente se detiene
momentáneamente, se retira el conector de la cabeza de la columna y la
muestra se inyecta directamente en el relleno de la cabeza de la columna
después se retira el accesorio y el sistema se vuelve a presurizar.
La ventaja de esta técnica es su sencillez. Desafortunadamente, la

reproducibilidad de la inyección con jeringa rara vez es mejor de un 2 o un
3% y con frecuencia es considerablemente peor.
Las jeringas de inyección manual o automática de muestra, en
HPLC en la mayoría de los casos son de vidrio y pueden ser de
distinta capacidad desde 10 μL hasta 200 μL. La aguja puede ser
removible y alcanza un largo de 51 mm.
En cromatografía de líquidos el método de inyección más ampliamente
utilizado para la introducción de la muestra utiliza bucles (loops) de
muestra. Este sistema de inyección puede ser manual o automático.
SISTEMA DE INYECCION MANUAL
En el sistema de inyección manual se inyecta frontalmente la muestra
mediante una jeringa.
Bucle, loop o lazo de
muestra
Vista de frente Inyección

Cargar
- Inyectar
PARTES DE UN INYECCTOR MANUAL

CARGA E INYECCION DE UNA MUESTRA
De la bomba Entrada de Solvente Entrada de la
Hacia la
Salida de solvente
muestra
columna
CARGADO DE LA
MUESTRA
De la bomba Entrada de Solvente Entrada de la

Hacia la muestra
Salida de solvente
columna
con la muestra
INYECCIÓN DE LA MUESTRA
INYECCIÓN MANUAL DE LA MUESTRA
Los inyectores de Rheodyne o de bucle son los más populares.
Este presenta las siguientes ventajas:
a) Es un inyector fácil de operar ya que tiene 2 posiciones: cargar e
inyectar.
b) La muestra es cargad mediante una jeringa externa.
c) El bucle puede ser cambiado por uno de mayor capacidad.
d) Es de bajo costo.
e) Es robusto.
f) Tiene pocas partes movibles.
g) Puede inyectar tamaños de muestra de 20 a 500 μL
h) No interfiere con la presión del sistema
i) Pueden incluir un sistema electrónico que inyecte la muestra una
vez que es cargada.
INYECCIÓN MANUAL DE LA MUESTRA
Presenta las siguientes desventajas:

a) Afecta la precisión del equipo.
b) Bajo rendimiento de las inyecciones en el bajo volumen.
c) Alto remanente de muestra.
d) Puede producir una pérdida de la muestra.
e) El operador debe tener mucha pericia y experiencia al realizar
las inyecciones.
INYECCION AUTOMÁTICA DE LA MUESTRA
Se carga la muestra
Aguja
Jeringa
Vial con muestra
Entrada Entrada
Salida
Salida
Paso 2
Paso 1
Desecho Desecho
Brazo
robotizado
Se inyecta la muestra
Entrada
Salida
Paso 3
Desecho
CARGADO DE LA
MUESTRA
INYECCIÓN DE LA
MUESTRA
Todo el volumen
cargado en la aguja va a
la columna
Lavado de los puertos 5 y
6 por un flujo de líquido
por una válvula de alta
presión.
La muestra es aspirada
por el puerto 5.
Si hay aire alrededor del
puerto 5 la
reproducibilidad de la
inyección será baja.
El líquido de enjuague ser
desgasificado.
Los inyectores automáticos o automuestreadores, presentan las

siguientes ventajas:
a) Inyectan un volumen continuo.
b) Pueden variar la cantidad inyectada entre 1 μL y 1 mL.
c) Pueden ser programados para inyecciones en el tiempo.
d) Pueden controlar la temperatura ambiente para las reacciones
de derivatización.
e) El bucle de carga de la muestra y la aguja son una sola pieza
de tubería.
f) La tubería del bucle y la aguja son limpiados durante la corrida.
g) La muestra es inyectada con mucha precisión.
Los inyectores automáticos o automuestreadores, presentan las

siguientes desventajas:
a) Alto costo.
b) Mayor volumen muerto cuando se trabaja con gradientes.
c) Mayor cantidad de piezas, removibles.
d) Necesita de mantenimiento por personal especializado.
6. COLUMNAS Y PRECOLUMNAS
Las columnas para cromatográfica de líquidos se
construyen generalmente a partir de tubos de acero
inoxidable de diámetro interno uniforme para
soportar grande presiones.
Aunque es posible encontrar columnas de vidrio de
paredes resistentes, aunque éstas últimas sólo se
utilizan a presiones menores de unos 600 psi.
Actualmente se comercializan cientos de columnas
rellenas por distintos fabricantes, las que difieren en
el tamaño y el relleno.
El costo de una columna de HPLC puede variar, por
lo general, de unos US$ 1000 a US 1500, o más, en
dependencia de la finalidad de la columna de HPLC.
6. COLUMNA Y PRECOLUMNA
COLUMNAS ANALÍTICAS
La mayoría de las columnas para cromatografía de líquidos tienen una
longitud entre 10 y 30 cm. Por general, las columnas son rectas y se
pueden alargar, si es necesario, acoplando dos o más columnas.
En algunas ocasiones se pueden encontrar columnas configuradas
con forma helicoidal aunque el resultado es una cierta pérdida de
eficacia.
El diámetro interno de las columnas es a menudo de 4 a 10 mm y los
tamaños de las partículas de los rellenos más comunes son 5 a 10
μm.
La columna analítica más frecuentemente utilizada es la de 25 cm de
longitud, 4.6 mm de diámetro interno y relleno de partículas de 5 μm.
Este tipo de columnas tiene una eficacia de 40,000 a 60,000 platos
teóricos/metro.
Generalmente el relleno de las columnas depende del tipo de modalidad
de HPLC que se vaya a aplicar.
Así si, la modalidad es de Fase Reversa, el material del relleno debe ser
apolar. Generalmente se parte de una fase estacionaria de sílica la que es
modificada químicamente enlazándole grupos apolares.
R
Me Me R
Donde R puede variar
típicamente de:
Me Me C8, C18, -CH2-C6H5, -CN, NH2
Cl
OH OH OH OH O Así si grupo enlazado es C18,

hablamos comúnmente de
SiO2 una columna de C18,
independientemente del
fabricante.
Si el grupo enlazado es: ciano (-CN), diol (-OH), amino (-NH2),
simplemente se deja sin enlazar a la sílica (-SiOH), se esta
trabajando en la modalidad de Fase Normal.
Las columnas con grupos enlazados –CN, son robustas, tienen
una moderada polaridad y son de uso general. Estas pueden ser
usadas también en la modalidad de fase normal.
Las columnas con grupos enlazados –OH, son más polares y
permiten una mayor retención.
Las columnas con grupos enlazados –NH2, altamente polares y
son menos estables.
Las columnas sin grupos enlazados (Sílica), son muy robustas, son
de bajo costo y son muy adsorbentes.
COLUMNAS DE ALTA EFICACIA
Recientemente, se han empezado a fabricar columnas de alta
eficacia, más rápidas, las cuales tienen menores dimensiones que
las anteriormente descritas.
Estas columnas pueden tener diámetros internos que oscilan entre

1 y 4.6 mm y se rellenan con partículas de tamaño de 3 ó 5 μm. A
menudo su longitud es de 3 a 7.5 cm. Tienen hasta 100,000
platos/metro y presentan la ventaja de la rapidez y del mínimo
consumo de disolvente.
La última propiedad es de considerable importancia, puesto que

los disolventes de alta pureza que se requieren en cromatografía
de líquidos son muy caros.
COLUMNAS DE ALTA EFICACIA
Cromatograma que ilustra la rapidez con la que se puede realizar una
separación con este tipo de columnas. Así, ocho componentes
distintos se separan en unos 15 s. La columna es de 4 cm de longitud
y un diámetro interno de 4 mm; está rellena con partículas de 3 μm.
Fase móvil 4.1% de acetato

de etilo en hexano
(1) p-xileno
(2) Anisol
(3) Acetato de bencilo
(4) Ftlato de dioctilo
(5) Ftlato de dipentilo
(6) Ftalato de dibutilo
(7) Ftalato de dipropilo
(8) Ftalato de dietilo
COLUMNAS DE INTERCAMBIO IÓNICO
La fase estacionaria contiene grupos cargados. Según el tipo de
grupo pueden ser:
a) SAX (Fuerte intercambio de aniones): NH3+

b) WAX (Débil intercambio de aniones): NR2H+ (DEAE)
c) SCX (Fuerte intercambio de cationes): SO3-
d) WCX (Débil intercambio de cationes): Carboximetil (CM)
Cuanto más fuertemente esté cargado el analito mayor será su

retención en las columnas.
Cuanto más voluminosa es la fase estacionaria más débil será la
retención.
PRECOLUMNAS
En muchas ocasiones, para aumentar la vida de la columna analítica,
se coloca delante una precolumna que elimina no sólo la materia en
suspensión y los contaminantes de los disolventes sino también
componentes de la muestra que se unen irreversiblemente a la fase
estacionaria.
Además, en cromatografía líquido-líquido, la precolumna sirve para
saturar la fase móvil con la fase estacionaria y así minimizar las
pérdidas de ésta en la columna analítica.
Guard
column
Injector
Precolumn Analytical
Filter Column
PRECOLUMNAS
El longitud de la precolumna es mucho menor que el de la
columna analítica.
La composición del relleno de la precolumna deberá ser
semejante al de la columna analítica; sin embargo, el tamaño de
partícula es por lo común mayor para minimizar la caída de
presión.
Cuando la precolumna se contamina se vacía y se rellena de
nuevo o se remplaza por otra nueva del mismo tipo.
Así, la precolumna se sacrifica para proteger a la columna
analítica, que es más cara.
HORNO DE COLUMNAS
En algunas ocasiones es necesario realizar el
análisis cromatográfico a una temperatura
mayor que la ambiental. En estas condiciones
se emplean los llamados hornos de columna
cuya función es mantener la temperatura de la
columna durante todo el tiempo de análisis.
Existen en el mercado muchos modelos de
hornos, los hay para una o dos columnas,
programables, etc.
Con un horno de columna se puede realizar una
rampa de temperatura durante al análisis de
forma tal que en determinadas condiciones un
analito que sale muy tarde, sale a un menor
tiempo.
HORNO DE COLUMNAS
2.1 mm ID Column, 0.35 mL/min, 50/50 MeOH/Water
50°C
45°C
40°C
35°C
30°C
25°C
20°C
Los tiempos de retención disminuyen, y el aumento velocidad de flujo son posibles

7. DETECTORES EN HPLC
A diferencia de la cromatografía de gases, en la cromatografía de líquidos
no hay detectores tan aplicables universalmente ni tan fiables como los
detectores de ionización de llama (FID) y de conductividad térmica (TCD).
Uno de los mayores retos en el desarrollo de la cromatografía de líquidos
ha sido el perfeccionamiento de los detectores.
CARACTERÍSTICAS DE UN DETECTOR IDEAL
1. Adecuada sensibilidad (10-15 a 10-8 )
2. Buena estabilidad y reproducibilidad
3. Respuesta lineal.
4. Intervalos de temperatura de trabajo adecuados.
5. Tiempo de respuesta corto.
6. Alta fiabilidad y manejo sencillo.
7. Respuesta semejante para todos los solutos o por el contrario
respuesta selectiva y altamente predecible para uno o mas
solutos.
8. No destructivo de la muestra.
No existe en la actualidad un detector que cumpla con todas estas
características, aunque algunos cumplen muchas de ellas. Por otra
parte los detectores en HPLC, no deben tener intervalos de
temperatura tan grandes como en CG.
CARACTERÍSTICAS DE RENDIMIENTO DEL DETECTOR
1. Sensibilidad (bajos LOD, LOQ)
2. Selectividad
3. Linealidad
4. Que proporcione información cualitativa
5. Confiabilidad
6. Facilidad de uso
7. Universalidad
LÍMITE DE DETECCIÓN (LOD)
El límite de detección de un detector puede ser caracterizado por
su relación señal (S), ruido (N) para un analito determinado bajo
ciertas condiciones dadas.
Pico (señal)
Ruido
LOD = 3 (S/N)
LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN (LOQ)
El límite de cuantificación de un detector puede ser también
caracterizado por su relación señal (S), ruido (N) para un analito
determinado bajo ciertas condiciones dadas.
Pico (señal)
Ruido
LOD = 10 (S/N)
LÍMITE DE DETECCIÓN (LOD) Y LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN (LOQ)
• El límite de detección (LOD) es una resultado de todo el sistema cromatográfico,

no sólo del funcionamiento del detector.
• El límite de cuantificación (LOQ) es un límite definido por un método utilizado
para un propósito específico.
TIPOS DE DETECTORES
Los detectores en cromatografía de líquidos son de dos tipos básicos.
a) LOS QUE SE BASAN EN LA MEDIDA DE UNA PROPIEDAD DE

LA DISOLUCIÓN.
Estos responden a una propiedad de la fase móvil, tal como el índice
de refracción, la constante dieléctrica, o la densidad, que se modifican
por la presencia de los analitos.
b) LOS QUE SE BASAN EN UNA PROPIEDAD DEL SOLUTO.

Estos responden a alguna de las propiedades del soluto, como la
absorbancia en el UV, fluorescencia, o corriente límite, que no son
inherentes a la fase móvil.
DETECTORES MÁS COMUNES EN HPLC
• Detectores de UV-VIS
• Detectores de arreglo de diodo (Diode Array)
• Múltiples longitudes de onda
• Variable longitud de onda
• Detectores de Espectrometría de masas
• Detectores de Índice de Refracción
• Detectores de Fluorescencia
• Detectores de luz dispersada tras evaporación
• Detectores Electroquímicos
• Detectores de Radioactividad
• Detectores de Conductividad
¿QUÉ DETECTOR UTILIZAR?
ne
e
en
re
ne
py
th
yle
ne ne
ne
an
d)
er
e
re
or
-c
i)p
yr
py
flu
23
Pe e)p
e
gh
a)
k)
(1
en
ne
o(
o(
o(
o(
no
le
ys
nz
nz
nz
nz
ry
re
de
hr
Be
Be
Be
Be
Py
In
C
UV-signal
248/411
270/388
241/394
247/504
302/420
WL
WL
WL
Fluorescence
WL
WL
PAH's extracted from soil;
Sup.LC-PAH 150x4.6mm; EL MÁS SENSIBLE!!!!
Solv.: H2O/CH3OH= 10:90
¿QUÉ DETECTOR UTILIZAR?
Flecainide in
Serum
UV signal
FL signal
Therapeutic concentration: 1.8mg/l, 20ul injected

UV and fluorescence signal EL MÁS SELECTIVO!!!!
NECESIDAD DE MÁS DE UN DETECTOR
Para información cualitativa
Clortoluron Atrazina
? ?
Toma de espectro del pico Toma espectro de masa del pico

Detector UV Detector de Espectrometría de masa
200
58
215
44
68 172
96 104 132 138158
60 80 100 120 140 160 180 200 220
Longitud de onda (nm) Masa/Carga

DETECTORES UV
Estos detectores están basados en el principio de que la fracción de la luz
transmitida a través de la celda del detector está relacionada con la
concentración de soluto de acuerdo con la Ley de Beer. Esto es la
concentración es directamente proporcional a la concentración.
Celda de flujo del detector
I0 c I
Log I0 = A = ɛlc
I
Estos detectores son para concentraciones específicas, son sensibles,

presentan buena estabilidad y tienen la capacidad de gradiente.
Los de tecnología de arreglo de diodos tienen capacidad espectral.

DETECTORES UV OTRAS CARACTERÍSTICAS
1. Se basan en las transiciones electrónicas dentro de las
moléculas.
2. Es el tipo más común de detector en LC.
3. Su límite de detección es de 1 picogramo (pg = 10-12)
4. Presentan limitaciones con disolvente que absorben en UV-vis.
5. Los de longitud de onda fija, suelen ser usados a 254 nm.
6. Los de longitud de onda ajustable, pueden ser usados para
seleccionar longitudes de onda específicas, poseen
monocromadores o filtros. Aunque están limitados a longitudes de
onda específicas.
7. Los detectores en forma de Z, pueden tener flujos de celda de 1
a 10 μL, y una longitud de paso de 2 a 10 mm.
DETECTORES UV
Para incrementar la sensibilidad de los detectores de UV, se suelen
utilizar micro celdas en forma de Z, cuyo objetivo es aumentar el camino
del recorrido del haz de luz que entra en la celda, con lo cual la señal se
incrementa, permitiendo detectar analitos a concentraciones más bajas.
El paso de luz en esta

microcelda es de 0.5 cm, y
su capacidad es de sólo 8
μL
PARTES PRINCIPALES DE UN DETECTOR DE UV
DETECTOR DE
Lámpara UV Filtro Cut-off
LONGITUD DE ONDA
oxido de Holmium
VARIABLE
Abertura
Diodo de muestra CARACTERÍSTICAS:
Espejo 1 1. Detección de longitud
de onda única de todas
Rejilla
las múltiples longitudes
Celda de flujo de onda posibles.
Espejo 2 2. La calibración de
Diodo de referencia longitud de onda se
realiza
automáticamente
mediante un filtro de
holmio.
PARTES PRINCIPALES DE UN DETECTOR DE UV
Lámpara DETECTOR DE
Visible
Lente
ARREGLO DE DIODOS
Acromatica
Celda de flujo Arreglo de Diodos
del Detector
Lámpara
UV
Flitro de
Holmium
Rejilla
Abertura
óptica
CARACTERÍSTICAS:
1. El detector de arreglo de diodos permite la medición en línea de los espectros.
2. Su rango de longitudes de onda va de 190 a 950 nm.
3. La resolución de longitudes de onda es de hasta 1 nm.
4. La longitud de onda se ce calibra con un filtro óxido holmio.
CARACTERÍSTICAS DE DETECTOR DE FLUORESCENCIA
1. Son basados en la emisión de moléculas en estado excitado.
2. Su límite de detección es de 10 femtogramos (fg = 10-15), por
lo que son más sensibles que los detectores de UV-Vis.
3. Pueden utilizar una lámpara de Hg o de Xe.
4. Se pueden encontrar dos tipos Fluorómetro (más sencillos) y
Espectrofluorómetro (más complejos).
5. Son específicos para especies fluorescentes o derivados
fluorescentes.
PROCESO DE DETECCIÓN DE DETECTOR DE FLUORESCENCIA
PARTES PRINCIPALES DE UN DETECTOR DE FLUORÓMETRO
PARTES PRINCIPALES DE UN DETECTOR DE ESPECTROFLUORESCENCIA
AFLATOXINAS ANALIZADAS CON DETECTOR DE FLUORESCENCIA
Immunoaffinity column clean-up Determination of aflatoxins in

techniques in food analysis: A review peanuts by matrix solid-phase
dispersion and liquid
chromatography
AFLATOXINAS ANALIZADAS CON DETECTOR DE FLUORESCENCIA
DETECTOR ELECTROQUÍMICO
1. Están basados en la respuesta amperométrica del analito hacia
un electrodo fijado a un potencial constante.
2. Puede ser altamente sensible, si el analito es electro activo, ya
que la respuesta se basa en un fenómeno de superficie en lugar
de una propiedad de la solución (por ejemplo, absorbancia UV-
vis).
3. Son de aplicación simple, conveniente y de amplia difusión.
4. La celda de flujo es de una capa delgada de teflón de 50 μm de
espesor, con un volumen de 1 a 5 μL.
5. El electrodo indicador es de Pt, Au o C.
6. Los multielectrodos son usados en detección simultánea o
indicación pureza de la muestra.
PARTES DE UN DETECTOR ELECTROQUÍMICO
PARTES DE UN DETECTOR ELECTROQUÍMICO
Diseño de capa fina Diseño de Wall-jet Diseño de membrana porosa
• Electrodos de oro para carbohidratos.

• Electrodos de platino para cloruros, sulfatos, hidrazinas, etc.
• Electrodos de carbón para fenoles, aminas.
• Electrodos de plata para cloruros, bromuros y cianuros.
DETECTOR ELECTROQUÍMICO
DETECTOR DE ÍNDICE DE REFRACCIÓN
Son detectores de índice de refracción se basan en la
capacidad que tienen algunos compuestos de rotar cuando son
expuestos a luz polarizada. Estos tienen las siguientes
características:
1. Son influenciados por los cambios de presión, la
temperatura y el pulso del flujo.
2. La elución de gradiente no es posible en este tipo de
detectores.
3. Son casi universales.
4. Presentan pobre límites de detección de 10 ng (ng = 10-9).
DETECTOR DE ESPECTROMETRÍA DE MASAS
Estos detectores pueden usar dos tipos de sondas según el tipo
de ionización requerida:
APCI: Ionización química a presión atmosférica

Para moléculas de hasta 1000 Dalton (Da)
Iones de cargas individuales
Mejor para el análisis de moléculas no polares
ESI: Ionización por electroespray

Puede ser uasada para grandes biopolímeros
Forma múltiples iones cargados
Mejor para el análisis de moleculas no polares, especialmente
productos farmacéuticos y proteinas.
Direccionadores Detector
Capilar
Octapolo Multiplicador de electrones
calentado
Fuente de geometría Analizador de masa cuadrupolo

ortogonal
ESPECTROMETROS DE MASAS DE AFLATOXINAS
8. INTEGRADORES EN HPLC
Los integradores son una versión mejorada de
los registradores ya que tienen algunas
capacidades de procesamiento de datos.
Pueden registrar los picos individuales con

tiempo de retención, la altura y la anchura de
los picos, el área del pico, el porcentaje de las
áreas, los picos integrados, etc.
Proporcionan más información sobre los picos

que los registradores.
Actualmente las computadoras e impresoras

se utilizan para el registro y procesamiento de
los datos obtenidos y para el control de varias
operaciones, cromatograficas.
9. INTERFASES O TRAJETAS DE COMUNICACIÓN EN HPLC
Las interfaces o tarjetas de comunicación, son sistemas que
transforman la señal analógica ampliada de los detectores a señales
digitales que son procesadas por software especializados.
10. SOFTWARE EN HPLC
Los software, permiten procesar la información obtenida de los
detectores, estos permiten realizar muchas actividades de
procesamiento de datos tales como: integración de picos,
obtención de espectros, cálculos de concentraciones,
determinación de purezas de picos, etc.
Así mismo, es posible “manejar” o controlar todas las funciones

del equipo de HPLC, desde la composición de la fase móvil, el
tiempo de “corrida”, la temperatura de la columna, la velocidad de
fase móvil, la cantidad y tiempo de inyección, el vial que se va a
inyectar, el informe a ser generado, el tipo de método a ser
desarrollado, etc.
10. SOFTWARE EN HPLC
Perkin Elmer Agilent
Waters Shimadzu
10. DERIVATIZACION EN HPLC
Con el fin de aumentar la detección de diversas clases de
compuestos (para los cuales no están disponibles
detectores sensibles) se realiza un proceso químico
denominado derivatización.
El fin de la derivatización es aumentar y/o desarrollar
propiedades cromóforas y fluróforas de compuestos que
no las tenían, con lo que se aumentan las posibilidades de
detección con detectores UV-Vis y fluorímetros.
En HPLC existen 2 tipos importantes de derivatización.
1. Derivatización precolumna.
2. Derivatización postcolumna.
10. DERIVATIZACION EN HPLC
DERIVATIZACION PRECOLUMNA
La reacción se realiza antes de ser inyectado a la columna el
derivado formado. Esta presenta una desventaja, ya que es
necesario realizar lo más rápidamente la reacción de
derivatización, especialmente en aquellos casos en los que los
derivados se descomponen con el tiempo, la luz o la
temperatura.
DERIVATIZACION POSTCOLUMNA
La reacción se realiza antes inmediatamente después que el
compuesto sale de la columna. Esta presenta la ventaja, de que
esta se realiza en un aparato destinado para estos fines y por lo
tanto es mas preciso que el caso de la derivatización
precolumna. Presenta la desventaja de aumentar el tiempo de
retención de los derivados, ya que se aumenta el recorrido
desde que sale de la columna hasta que llega al detector.
DERIVATIZACION EN HPLC
Las aflatoxinas B1 y G1 pueden ser derivatizadas con el ácido
trifluoroacético (TFA), para convertirlas en aflatoxinas
hidróxiderivadas B2a y G2a, respectivamente.

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3.1 BOMBAS RECÍPROCAS

Dos válvulas con cierre de bola, que se abren y cierran

Motor y leva Cabeza de bomba

3.1 BOMBAS RECÍPROCAS

producen un flujo pulsado, el que debe ser amortiguado, puesto que se

•Proporcionan una alta presión de salida (por

3.2 BOMBAS DE DESPLAZAMIENTO

Son grandes cámaras como una jeringa equipadas con un émbolo

•Tienen una capacidad limitada de

desventajas disolventes (aproximadamente 250 mL)

•Producen un flujo que es independiente

3.3 BOMBAS NEUMÁTICAS

3.4 BOMBAS BINARIAS Y CUATERNARIAS

Son bombas baratas, no pueden ser usadas

3.4 BOMBAS BINARIAS Y CUATERNARIAS

Son un poco más caras y pueden ser

Son las más comunes en los sistemas

3.4 BOMBAS BINARIAS Y CUATERNARIAS

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60 80 100 120 140 160 180 200 220

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