Tiamina.

Vitamina B1

La tiamina existe en la naturaleza como tiamina, monofosfato de tiamina, difosfato de

tiamina, trifosfato de tiamina y unida a las proteínas. Las principales fuentes de
vitamina B1son los granos de los cereales, cáscara de arroz, germen de cereales,
levaduras, clara de huevo, vegetales, frutas, papas, huevos, leche, hígado y carne.

Estabilidad

En la ausencia de luz y humedad, las sales de tiamina son relativamente estables al

oxígeno atmosférico incluso cuando tibio. La solución ácida también es estable; sin
embargo, ocurre descomposición en una solución neutra o alcalina.

b) Método del tiocromo (13)

El método más ampliamente utilizado para la determinación de la vitamina B1, incluye

una hidrólisis ácida seguida por una defosforilación enzimática de los èsteres y la
cuantificación de la tiamina liberada. La medición de la vitamina B\ en el extracto final
se realiza mediante fiuorometría después oxidar a tiocromo que es un compuesto
fluorescente. Más recientemente, se han publicado procedimientos por HPLC que se
utilizan para cuantifícar, el propio tiocromo o a través de una derivatización
postcolumna.

Extracción y desfosforilación

La muestra (hasta 25 g) es hidrolizada utilizando ácido sulfúrico 0,1 M durante 15 min

a 121°C. El pH de la mezcla enfriada se ajusta a 4,5 a través de la adición de buffer
acetato. Se agregan 500 mg de Takadiastasa y la suspensión se incuba al menos por
20 minutos a 45°C. Debe mencionarse que las condiciones de incubación dependen
del tipo de enzima y del lote utilizado, así como también del tipo de muestra y pueden
variar considerablemente.

Resumen

1. La tiamina es extraída por hidrólisis ácida seguida por una etapa de

desfosforilación enzimática.
2. Debe tenerse cuidado que la preparación enzimática utilizada esté
funcionando.
3. El protocolo para la oxidación a tiocromo debe ser seguido en forma precisa a
fin de obtener resultados reproducibles.
4. Debe llevarse un blanco durante el ensayo completo.
5. Los procedimientos por HPLC están disponibles tanto para derivatización en
precolumna como también para derivatización postcolumna.
Riboflavina. Vitamina B2

La riboflavina se encuentra en los alimentos como riboflavina libre o como riboflavina-

5'-fosfato (FMN) y como flavin adenina dinucleótido (FAD).

Las principales fuentes de vitamina B2 son hígado, riñón, carne, pescado, leche,
queso, huevos y vegetales. La solubilidad de la riboflavina en el agua es más bien
deficiente (aprox. 7 , mg/100 ml) pero en álcali diluido es fácilmente soluble.

a) Estabilidad

Ambos compuestos son sensibles a la luz y a la radiación UV, pero son estables al
calor y al oxígeno atmosférico.En soluciones alcalinas, la descomposición es rápida,
especialmente si se expone a la luz.

b) Método

Debido a sus propiedades físico-químicas, la riboflavina puede determinarse

fluorométricamente. Este modo de detección posee claras ventajas dado que es más
específico que por ejemplo UV. Sin embargo, todavía existen distintos componentes
en los alimentos que interfieren, lo cual complica el análisis. Se han utilizado diferentes
métodos en el pasado que incluyen la irradiación de un extracto de muestra purificada
con luz lo que lleva a la formación del llamado lumicromo. Este es un compuesto que
tiene fuertes propiedades fluorescentes y puede cuantificarse fácilmente. Sin embargo,
el procedimiento de trabajo requiere tiempo y trabajo. Por lo tanto, los ensayos
microbiológicos son utilizados rutinariamente además de los métodos HPLC lo que
permite una preparación más simple de la muestra que el método del lumicromo.

Extracción y desfosforilación

La muestra (hasta 10 g) se hidroliza utilizando ácido sulfúrico 0,1 M durante 15 min a

121°C. El pH de la mezcla enfriada se ajusta a 4,5 a través de la adición de buffer
acetato. Se agrega 500 mg de Takadiastasa y la suspensión es incubada al menos
durante 20 minutos a 45°C. Debe mencionarse que las condiciones de incubación
dependen del tipo de enzima y el lote utilizado así como también del tipo de muestra y
pueden por tanto variar considerablemente. La reacción enzimática es detenida por la
adición de ácido sulfúrico.

Resumen

1. La vitamina B2 se extrae de la matriz alimentaria mediante hidrólisis ácida

seguida por una etapa de desfosforilación enzimática.
2. Debe tenerse cuidado que funcione la preparación enzimática a utilizar. Esto
puede hacerse inyectando estándar de FMN en la línea de HPLC y controlando
la muestra tratada para FMN residual.
3. La riboflavina liberada debería protegerse de la luz.
4. Se logra la mejor cuantificación y separación utilizando HPLC de fase reversa.
5. El modo de detección es preferentemente realizado por fluorescencia dado que
éste es más selectivo.
Acido nicotínico y nicotínamida (niacina) B3:

El ácido nicotínico y la nicotinamida poseen la misma actividad vitamínica; el ácido

libre se convierte a amida en el cuerpo. Los sinónimos menos usados como vitamina
PP y factor PP se refieren a su actividad preventiva de pelagra. La nicotinamida se
encuentra en todas las células, por lo general en forma unida como el grupo prostético
de coenzimas. El hígado y carne de animales con pezuña son fuentes
nutricionalmente importantes de esta vitamina. También está presente en el maíz y
otros cereales en una forma no utilizada por el hombre.

Ambos compuestos son estables al oxígeno atmosférico, luz y calor en estado seco y
en solución acuosa; la amida es hidrolizada al ácido calentando en soluciones
fuertemente ácidas o alcalinas.

b) Método

La extracción de niacina se realiza mediante hidrólisis ácida (la hidrólisis alcalina

liberaría también nicoti-niléster ligado, el cual no es biodisponible). El ensayo microbio-
lógico es fácil de realizar. El microorganismo de ensayo más comúnmente utilizado
es Lactobacillus plantarum (22). Se describe una prueba colorimétrica basada en la
reacción de Kónigs que utiliza bromuro de cianógeno para la oxidación y procaína (p-
amino-benzoil-dietilaminoetanol) para formar componentes coloreados.

Extracción y digestión enzimática

El material conteniendo aproximadamente 300 μg de niacina es hidrolizado en 125 ml

de ácido sulfúrico 0,1 M durante 15 minutos a 110°C. Después de enfriar, el pH se
ajusta a 4,5 utilizando acetato de sodio, se agregan 500 mg de Takadiastasa y la
mezcla es incubada durante 20 minutos a 45°C. La solución es acidificada con 25 ml
de ácido sulfúrico 30%, es diluida a 250 ml con agua y filtrada. 50 ml del filtrado se
acidifican con 1 ml de ácido sulfúrico 30% y se agrega gota a gota (2-6 ml) de una
solución de permanganato de potasio 3% hasta que permanezca el color rosado. El
exceso de permanganato es destruido por la adición de una solución de peróxido de
hidrógeno 3% hasta que desaparezca el color rosado. Se suspende 1 g de sílice
tratada (tierra de diatomeas) con 25 ml de la solución oxidada, se agita vigorosamente
durante 1 minuto, se centrifuga y se deja decantar. La niacina absorbida en la sílice
tratada es lavada con 25 ml de ácido sulfúrico 0,1 M, se centrifuga y se deja decantar.
Se agregan 25 ml de hidróxido de potasio 0,5 M, se agita durante 1 minuto y se
centrifuga. Se colocan 20 ml del sobrenadante en un vaso precipitado, se cubre con un
vidrio de reloj y se calienta durante 10 minutos en un autoclave a 110°C para hidrolizar
la nicotinamida a ácido nicotínico. La solución enfriada se ajusta a un pH de 4,5 con
ácido clorhídrico (0,1 M), se transfiere a un matraz volumétrico de 50 ml y se agregan
3 ml de una solución de bromuro de cianógeno 3% y se ajusta a volumen con agua.

Precaución: no inhalar el vapor de esta solución. Tomar todas las precauciones

necesarias para trabajar con compuestos tóxicos.

El matraz se coloca en un baño de agua durante 10 minutos a 75-85°C, y se enfria a

temperatura ambiente. 10 ml de la solución se pipetean en la cubeta del fotómetro, se
agrega 1 ml de ácido clorhídrico 1M y el espectrómetro se ajusta a absorbancia cero.
Se agrega 1 ml de una solución de procaína 5% (5 g en 100 ml de HC1 1M), se
mezcla y se mide la absorción dentro de 15-20 segundos a 420 nm.
En una serie paralela, la muestra es "spiked" con aproximadamente la misma cantidad
de ácido nicotínico (300 μg) como estándar interno.

Cáculos

A : absorbancia de la muestra
Z : absorbancia de la muestra + estándar interno
N : cantidad de ácido nicotínico como estándar interno en μg
W : peso de la muestra en g

c) Resumen

1. La determinación de la niacina se realiza mejor por un método microbiológico

2. El microorganismo de ensayo es Lactobacillus plantarum
3. El ensayo que usa la reacción de Königs es muy tedioso, necesita mucha
experiencia y tiene una seria desventaja debido a los reactivos. Sin embargo,
se obtienen resultados buenos y reproducibles.

Piridoxina. Vitamina B6

El hidrocloruro de piridoxina es estable al calor y al oxígeno. La piridoxina es

degradada por la luz en soluciones alcalinas o neutras.

b) Método

Debido a la múltiple presencia de la vitamina B6 en los alimentos es imposible

determinar su actividad midiendo un sólo componente. Aunque puede ocurrir
interconversión entre las diferentes formas debido a reacciones enzimáticas, el
analista encontrará predominantemente una mezcla si el alimento no ha sido
suplementado con hidrocloruro de piridoxina. Por lo tanto, en este momento se
recomienda un método microbiológico para la determinación de la actividad de la
vitamina B6.

Extracción y desfosforilación

La vitamina B6 es extraída de la muestra por hidrólisis ácida. Las condiciones

recomendadas por AOAC (18) son HC1 0,44 M durante 2 h a 121°C para productos de
plantas y HC1 0,055 M durante 5 h a 121°C para productos animales. Debe
mencionarse que la hidrólisis ácida puede liberar vitámeros-B6 a partir de glucósidos y
por lo tanto llevar a una sobrestimación del contenido biodis-ponible. Después de la
hidrólisis, las soluciones son neutralizadas a un pH 5,0 con una solución de hidróxido
de sodio. La dilución del extracto se realiza con agua para obtener concentraciones de
aproximadamente 100 ng/ml.
c) Resumen

1. El ensayo de vitamina B6 se realiza mediante método microbiológico.

2. Es necesaria una hidrólisis ácida prolongada para las muestras de origen
animal.
3. La respuesta del microorganismo de ensayo no es igual para todos los
vitámeros.

Acido pantoténico B5:

El ácido pantoténico libre es un aceite inestable extremadamente higroscópico; por lo

tanto, no es aconsejable para aplicaciones prácticas y se utiliza principalmente en
forma de sales de calcio y de sodio.

En la naturaleza el ácido pantoténico se encuentra raramente al estado libre; sin

embargo, está ampliamente distribuido como un componente de la coenzima A y se
encuentra sobretodo en el hígado, riñón, músculo, cerebro y yema de huevo así como
también en la levadura, cereales, y plantas verdes, especialmente leguminosas.

Los compuestos son higroscópicos, particularmente la sal sódica. Las soluciones

acuosas son termolábiles y sufren ruptura hidrolítica especialmente bajo condiciones
alcalinas o ácidas.

b) Método

El ácido pantoténico en mezclas complejas sólo puede determinarse

microbiológicamente. El ácido pantoténico debe ser liberado previamente. No existe un
procedimiento realmente estándar para esto, de tal modo que el método difiere de un
caso a otro, por ejemplo la extracción con agua o con diferentes mezclas de solventes
con o sin tratamiento enzimático (papaína, diastasa, extracto de hígado, etc.) (20). El
método descrito más adelante intenta medir principalmente los pantotenatos
suplementados en los alimentos.

Extracción

El material es agitado con agua durante 30 minutos a 37°C en un agitador. Si el

material contiene grandes cantidades de grasa, es recomendable remover los lípidos.
Esto se realiza agregando al agua, por ejemplo 20 ml de acetato de etilo. Se utiliza la
capa acuosa para el procedimiento posterior. El extracto acuoso es diluido a un
volumen definido con agua y se filtra.

La leche en polvo y materiales similares son extraídos autoclavando la suspensión

acuosa a 100°C por 30 min. Después de enfriar, el pH se ajusta a 4,5 con ácido
sulfúrico, se diluye con agua a un volumen definido y se filtra. El pH de la solución
filtrada se ajusta a 6,8 con hidróxido de sodio y se ajusta a un volumen definido. Esta
solución es utilizada para el ensayo micro-biológico.

c) Resumen

1. La determinación de D-pantotenato suplementado en los alimentos se realiza

mejor por un método microbiológico.
2. El microorganismo de ensayo es Lactobacillus plantarum
Biotina B8:

La biotina se encuentra parcialmente en estado libre en vegetales, frutas, leche,

salvado de arroz y parcialmente en forma unida a proteína en tejidos animales,
semillas de plantas, levaduras. Fuentes importantes de biotina son el hígado, riñón,
carne, levadura, yema del huevo, leche, hongos y vegetales.

ESTABILIDAD:

La D-biotina seca, en forma de cristales es claramente estable al aire, luz de día y

calor; es gradualmente destruida por la radiación UV. Las soluciones acuosas son
relativamente estables a condiciones alcalinas o ácidas débiles. En soluciones
fuertemente ácidas o alcalinas la actividad biológica se pierde parcialmente por el
calentamiento.

b) Método

El método microbiológico es el método de elección para la biotina. El microorganismo

de ensayo más utilizado es Lactobacillus plantarum. La biotina debe extraerse en la
forma libre de la muestra antes del ensayo. Esto se logra por la combinación de
hidrólisis ácida seguida por una digestión enzimática (21).

Extracción y digestión enzimática

El material de ensayo es calentado en ácido sulfúrico 1M durante 30 minutos a 118°C.

El extracto es luego neutralizado a un pH de 7,5 con hidróxido de sodio 20% y diluido
a un volumen definido con agua. Las alícuotas (5-10 ml), esperando que contengan 5-
30 ng de biotina (0,1-0,6 ng/ml), son diluidas con una solución de papaína (10 mg/ml)
a un volumen de 50 ml e incubadas toda la noche (aproximadamente 18 h) a 37°C. La
enzima es desactivada autoclavando durante 10 minutos a 118°C. Luego el extracto
es centrifugado, filtrado y se utiliza la solución transparente para el ensayo
microbiológico. La papaína usada para el ensayo debe revisarse antes (compuestos
que interfieren dan como resultado un valor alto de blanco).

c) Resumen

1. La determinación de D-biotina se realiza mediante método microbiológico.

2. El microorganismo de ensayo es Lactobacillus plantarum
3. La liberación de la biotina unida es realizada en forma óptima por hidrólisis
ácida seguida por una digestión enzimática con papaína.

Vitamina B12

Los compuestos activos de la vitamina B12 presentan una estructura química

complicada; el más conocido e importante es cianocobalamina. La vitamina B12 se
encuentra sólo en material de origen animal y en los metabolitos de microorganismos.
Las fuentes importantes de B12 son el hígado, riñón y yema de huevo.

Estabilidad: La cianocobalamina cristalina y sus soluciones neutras o débilmente

ácidas son relativamente estables al aire y calor pero son atacadas por la luz y la
radiación UV. La vitamina B12 es sólo levemente estable a álcalis, ácidos fuertes y
agentes reductores.

b) Método

El nivel presente en los alimentos es muy bajo y el método microbiológico es la única

manera de estimar la vitamina B12 en forma satisfactoria.

Extracción

La vitamina B12 es extraida de la muestra con agua o buffer a una temperatura de

aproximadamente 100°C durante 10-30 minutos con la adición de cianuro de potasio.
El pH del extracto se ajusta a 6 ya sea con hidróxido de potasio o ácido clorhídrico. La
dilución del extracto se realiza con agua para obtener concentraciones de
aproximadamente 2 mg/ml.

c) Resumen

1. El análisis de la vitamina B12 se realiza por el método microbiológico.

2. Los ensayos con Lactobacillus leichmanii son los más empleados.

Vitamina C

El ácido L-ascórbico se encuentra en todos los tejidos vivos como un importante

compuesto redox del metabolismo celular. Fuentes importantes de la vitamina C son
las frutas frescas (cítricos, uvas negras, escaramujo, pimiento rojo) y vegetales
(repollo, papas, lechuga, tomates etc.).

El ácido ascórbico cristalino es relativamente estable en el aire en ausencia completa

de humedad, mientras la sal sódica tiende a volverse amarilla. Las soluciones acuosas
son atacadas por el oxígeno atmosférico y otros agentes oxidantes; el primer ácido
formado, el ácido dehidroascórbico es oxidado posteriormente en forma irreversible.
Los álcalis y los iones de metales pesados (por ejemplo, cobre) actúan como
catalizadores.

b) Métodos

El ácido ascórbico (AA) es fácilmente oxidado a ácido dehidroascórbico (ADA) y por lo

tanto, es necesario seleccionar las condiciones de extracción en forma cuidadosa con
el fin de minimizar las posibles pérdidas debido a las etapas de preparación de las
muestras. Las soluciones de extracción más comúnmente utilizadas son las de los
ácidos metafosfórico, oxálico y acético y mezclas de ellos. Se puede agregar EDTA en
ciertos procedimientos para complejar los iones de los metales así como también
agentes reductores como ditiotreitol (DTT).

Básicamente existen dos enfoques diferentes para la determinación del ácido

ascórbico:

- La determinación del ácido ascórbico presente en la muestra o en el extracto de

muestra ignorando alguna presencia posible de ADA.
- La determinación del ácido ascórbico "total" que incluye la suma de AA y ADA
utilizando un método que transforma ya sea AA a ADA o ADA a AA con la
consiguiente cuantifícación de ADAoAA.

Todos los métodos que utilizan las propiedades reductoras de la molécula de ácido
ascórbico pertenecen a la primera categoría. Se pueden utilizar muchos reactivos y de
todos ellos, el 2,6-diclorofenolindofenol (DCFI) es ciertamente el más utilizado debido
a que su uso es simple y los resultados son en general confiables. El DCFI es de color
azul profundo pero incoloro cuando es reducido por AA. Por lo tanto, es fácil titular
volúmenes fijos del extracto de la muestra hasta que permanezca un color rosado y
comparar el volumen de reactivo utilizado con aquellos de una solución estándar de
concentración conocida de AA. En ciertos casos, no se percibe el cambio de color
debido a otros componentes coloreados presentes en el extracto En estos casos, el
punto final de la titulación puede visualizarse midiendo el cambio de potencial en la
solución con un electrodo de platino-plata/cloruro de plata (Pt-Ag/AgCl) (23).

Uno de los métodos más específicos que pertenecen a la segunda categoría fue
desarrollado por Deutsch y Weeks (24) y se basa en la medición de ADA después de
la oxidación de todo el AA utilizando ya sea oxígeno unido a carbón u otro oxidante tal
como iodo. El ADA formado es luego derivatizado con o-fenilendiamina para formar un
derivado fuertemente fluorescente, el que puede cuantificarse fácilmente por la
comparación con soluciones estándares. El método es un procedimiento AOAC de
acción final (25).

En años recientes, diversos investigadores han publicado procedimientos que utilizan

HPLC para separar y cuantificar AA y/o ADA. El siguiente procedimiento de ensayo
permite la determinación simultánea de AA y ácido eritórbico (26) y se ha utilizado
para determinar AA en carne, productos cárnicos, alimentos procesados, alimentos
enriquecidos, verduras, frutas, leche y bebidas.

c) Resumen

1. La determinación del ácido ascórbico puede realizarse fácilmente mediante

titulación con DCFI pero sólo se está determinando AA y en algunos casos
pueden ocurrir interferencias.
2. El método de Deutsch y Weeks con el derivado de quinolina fluorescente
formado con fenilendiamina proporciona una manera confiable de medir la
vitamina C "total".
3. Si ha de determinarse el ácido ascórbico "total", HPLC puede proporcionar una
alternativa confiable suponiendo que utilizan condiciones apropiadas extracción
para la reducción ADA a AA previo a cuantificación con HPLC.