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    ADN Recombinante - Colombo

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    El documento describe los principales conceptos y técnicas de la ingeniería genética, incluyendo la obtención de ADN recombinante mediante el uso de enzimas de restricción y ligasas, el uso de vectores plasmídicos para clonar genes en bacterias, y métodos para transferir genes a células procariotas y eucariotas con fines de investigación y terapia.

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    ADN Recombinante - Colombo

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    El documento describe los principales conceptos y técnicas de la ingeniería genética, incluyendo la obtención de ADN recombinante mediante el uso de enzimas de restricción y ligasas, el uso de vectores plasmídicos para clonar genes en bacterias, y métodos para transferir genes a células procariotas y eucariotas con fines de investigación y terapia.

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    ADN_Recombinante.Colombo

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    El documento describe los principales conceptos y técnicas de la ingeniería genética, incluyendo la obtención de ADN recombinante mediante el uso de enzimas de restricción y ligasas, el uso de vectores plasmídicos para clonar genes en bacterias, y métodos para transferir genes a células procariotas y eucariotas con fines de investigación y terapia.

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    ADN RECOMBINANTE

    (Ingeniería Genética)
    ADN Recombinante

    “Molécula de ADN obtenida por unión de


    fragmentos de ADN de diferente origen
    (especies o individuos diferentes)”

    Clonación de ADN:

    - producir muchas copias idénticas de una molécula


    de ADN

    - separación de un fragmento concreto de ADN (ej. gen)


    del resto del ADN de la célula
    Tecnología del ADN Recombinante

    “Procedimientos por los cuales una molécula de ADN


    es cortada en un lugar determinado y luego pegada
    con otro fragmento de ADN mediante el uso de ciertas
    enzimas de existencia natural en microorganismos
    (enzimas de restricción, ligasas)”
    Manipulación del ADN: ENZIMAS

    * Nucleasas: rompen enlaces covalentes fosfodiésteres


    Exonucleasas: sacan nucleótidos desde los
    extremos 5´ o 3´ de una cadena de DNA.
    Endonucleasas: cortan en puntos internos de una
    cadena de DNA. Ej: Enzimas de Restricción.

    * Ligasas: unión covalente entre el 0H 3´y el P04H 5´


    de dos cadenas de ADN . Ej: T4 DNA ligasa.

    *Polimerasas: Agregan nucléotidos a una cadena de


    DNA preexistente. Ej: Taq polimerasa
    Enzimas de Restricción

    • Son de origen bacteriano

    •Restringen la infección por virus (bacteriófagos)

    •Nomenclatura: Eco R I

    Tipo de enzima
    Cepa
    Género y especie

    • Cortan moléculas de ADN internamente (endonucleasas


    y no desde los extremos.
    Sitio de Restricción: PALÍNDROME

    5´............ATCTGTT GAATTCTAGGAT........3´
    3´............TAGACAACTTAAGATCCTA.......5´
    EcoRI
    5´..........GAATTC..........3´
    3´..........CTTAAG.........5´
    Distintos tipos de corte de las
    enzimas de restricción

    Extremos pegajosos Extremos romos


    Corte por la enzima

    Extremos pegajosos
    ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

    Extremos pegajosos

    Extremos pegajosos

    Extremos romos

    Extremos pegajosos

    Extremos romos
    Vectores

    • Son transportadores de fragmentos de ADN.

    • Sirven para incorporar ADNs exógenos en


    células procariotas o eucariotas.

    • Son autorreplicativos
    Vectores Plasmídicos
    Plásmidos: ADN circular de origen bacteriano
    Vector Plasmídico
    Promotor
    Poliligador
    o sitio de
    clonado

    ampr ORI
    Poliligador o Sitio de Múltiple clonado

    Vector Linearizado
    Obtención de un Plásmido Recombinante
    • Cortar el vector plasmídico con
    enzimas de restricción.
    • Aislar y cortar el ADN de interés

    • Unir el ADN de interés al vector


    (ligasas)
    • Obtener el plásmido recombinante

    • Incorporar el plásmido recombinan


    te en una bacteria
    • Amplificar y purificar el plásmido
    Transferencia Génica a Procariotas

    TRANSFORMACIÓN: incorporación de un ADN exó-


    geno en un organismo procariota (bacteria)

    USOS:
    • Aislar e identificar genes

    •Producción de grandes cantidades de ADN


    plasmídico

    • Producción de proteínas recombinantes de uso


    médico
    1.- Obtención del
    Plásmido Recombinante

    2.- TRANSFORMACIÓN
    de bacterias con el P.R.
    3.- SELECCIÓN
    con antibiótico

    4.- AMPLIFICACIÓN DEL


    ADN Y PURIFICACIÓN
    Transferencia Génica a Procariotas

    TRANSFORMACIÓN: incorporación de un ADN exó-


    geno en un organismo procariota (bacteria)

    USOS:
    • Aislar e identificar genes

    •Producción de grandes cantidades de ADN


    plasmídico

    • Producción de proteínas recombinantes de uso


    médico
    INSULINA
    Obtención de Insulina Recombinante
    Producción de Proteínas Recombinantes
    de uso médico

    • Insulina: para diabéticos


    • Factor VIII: para pacientes con hemofilia A
    • Factor IX: para hemofilia B
    • Hormona del crecimiento humana: enanismo
    • Eritropoyetina: para el tratamiento de anemias
    • Interferón: defensa contra infecciones
    • Antígeno de superficie de hepatitis B: vacunas
    • Activador del plasminógeno tisular: disolución
    de coágulos
    Transferencia génica
    a células de mamíferos

    TRANSFECCIÓN: Introducción de un ADN


    desnudo o unido a un plásmido
    en células eucariotas

    INFECCIÓN: Introducción de un ADN


    por medio de un virus
    Métodos de Transfección
    • Con FOSFATO DE CALCIO: el ADN es incorporado
    por la célula por un mecanismo no bien definido

    • ELECTROPORACIÓN: descargas eléctricas de alto


    voltaje que abren poros transientes en la membranas

    • LIPOSOMAS: vesículas artificiales de membrana


    cargadas positivamente.

    •MICROINYECCIÓN: permite introducir ADN en el


    núcleo celular (Ej. microinyección de DNA en óvulos
    fecundados para obtención de animales transgénicos)
    Microinyección
    Métodos de Transfección
    • Con FOSFATO DE CALCIO: el ADN es incorporado
    por la célula por un mecanismo no bien definido

    • ELECTROPORACIÓN: descargas eléctricas de alto


    voltaje que abren poros en la membranas.

    • LIPOSOMAS: vesículas artificiales de membrana


    cargadas positivamente.

    •MICROINYECCIÓN: permite introducir ADN en el


    núcleo celular (Ej. microinyección de DNA en óvulos
    fecundados para obtención de animales transgénicos)
    ELECTROPORACIÓN LIPOSOMAS
    Transferencia génica a células de
    mamíferos
    USOS:

    1. Investigación básica: estudio de la


    funcionalidad de genes y proteínas

    2. Producción de proteínas recombinantes

    3. Terapia Génica

    4. Modelo de enfermedades
    Vectores para expresar proteínas
    fusionadas a la GFP
    Célula de mamífero transfectada con
    plásmido recombinante

    pGFP-LC3 (Green Fluorescent Protein-LC3)


    Autofagosomas marcados con la proteína GFP-LC3

    Células CHO
    GFP-LC3

    + aminoácidos - aminoácidos
    TRANSFERENCIA GÉNICA

    ORGANISMOS ENTEROS
    Transferencia génica
    a organismos enteros

    1.- Obtención de Animales Transgénicos

    2.- Producción de proteínas recombinantes

    3.- Terapia Génica

    4.- Clonación de individuos


    ANIMALES TRANSGENICOS
    Animales a los cuales se les ha transferido un gen foráneo
    Por Ej. GFP-actina

    Células tumo-
    rales marcadas
    con RFP
    Transferencia génica
    a organismos enteros

    1.- Obtención de Animales Transgénicos

    2.- Producción de proteínas recombinantes

    3.- Terapia Génica

    4.- Clonación de individuos


    Producción de
    Proteínas Recombinantes
    en Animales Transgénicos
    “Pampita"

    “Pampita", la vaca argentina transgénica del


    laboratorio Sidus, genéticamente preparada
    para producir hormona de crecimiento
    en su leche
    “Patagonia", la ternera argentina transgénica
    del laboratorio Sidus, genéticamente
    preparada para producir insulina en su leche
    Con apenas 25 vacas como Patagonia se obtienen los
    200 kilos de insulina humana que se necesitan por año
    en la Argentina, que hoy son importados
    Transferencia génica
    a organismos enteros

    1.- Obtención de Animales Transgénicos

    2.- Producción de proteínas recombinantes

    3.- Terapia Génica

    4.- Clonación de individuos


    Enfermedad Gen afectado Producto Célula a Estado
    y vector alterado modificar actual
    Talasemia B-hemoglobina Hemoglobina Células de Modelo en
    médula animales
    cósmidos ósea
    Hipercoleste- r-LDL Receptor de Células Clínica con
    rolemia LDL hepáticas éxito parcial
    retrovirus
    Fibrosis Rtfc Proteína Reg. Células En clínica con
    Quística del transporte de Pulmona- problemas de
    adenovirus cloruros res rechazo

    Distrofia Dis Distrofina Células Estudios


    Muscular Muscular musculares Preliminares
    adenovirus
    Transferencia génica
    a organismos enteros

    1.- Obtención de Animales Transgénicos

    2.- Producción de proteínas recombinantes

    3.- Terapia Génica

    4.- Clonación de individuos


    Clonación de individuos
    1. Obtención de un oocito desnucleado (individuo
    aceptor)

    2. Microinyección del núcleo de una célula somática


    (individuo donador)

    3. Fecundación in vitro.

    4. Implantación del embrión en el individuo aceptor

    5. Nacimiento de un individuo con material génico


    idéntico al individuo donador.
    * Ian Wilmut et al. 1997 (Oveja Dolly)
    Método utilizado para obtener a Dolly en Escocia
    Clonación de Individuos

    Inquietudes...............................

    A Nivel Biológico:

    -Reprodución Asexual

    -Especies Híbridas

    -¿Expectativa de vida y Envejecimiento Precoz?

    -.¿Fertilidad?
    ....................Para Reflexionar

    ¿Hay justificaciones científicas, médicas o éticas


    para generalizar la clonación de la especie humana?

    ¿Hasta dónde pueden influir los factores no genéticos


    (ambientales o herencia mitocondrial) para crear
    variabilidad y diversidad en la especie humana?

    La sociedad en que vivimos ha condenado la clona-


    ción en seres humanos; ya que existe un miedo ge-
    nuino y probablemente justificado a que estas tecno-
    logías se nos “vayan de las manos”.
    Bibliografía

    • INGENIERÍA GENÉTICA Y TRANSFERENCIA GÉNICA.


    Marta Izquierdo Rojo. Ed.Pirámides. 2001

    • BIOLOGÍA MOLECULAR EN MEDICINA. Timothy M. Cox and


    John Sinclair. Ed. Panamericana.1998.

    • RECOMBINANT DNA. James D. Watson. Michael Gilman.


    Jan Witkowski. Mark Zoller. Ed. Schientific American BOOKS. 1997

    • GENÉTICA HUMANA. A. J. Solari. Ed. Panamericana. 2000

    • BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR. Lodish et al.


    Ed. Panamericana. 2002

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